專利名稱：：Cd34干細(xì)胞相關(guān)方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：在整個(gè)本申請中，引用了各種出版物。這些出版物以及上面所述的臨時(shí)申請的公開內(nèi)容，通過引用合并入本申請以更全面地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。干細(xì)胞介導(dǎo)再生和遺傳信息至后來細(xì)胞世代的傳遞。它們可自我更新和產(chǎn)生分化的后代。近年來，在我們對干細(xì)胞與它們的組織微生態(tài)環(huán)境(tissueniche)之間的相互作用背后的分子機(jī)制的理解中已取得了進(jìn)步。這已導(dǎo)致對在干細(xì)胞中起作用的分子調(diào)控機(jī)制有了更好的理解。雖然基因療法仍然是試驗(yàn)性方法，但該技術(shù)有希望對人健康產(chǎn)生重大影響。在過去數(shù)年中，基因療法的范圍和定義已發(fā)生了變化并且得到擴(kuò)展。除了矯治遺傳的遺傳性障礙例如囊性纖維化、血友病和其他實(shí)體(entities)夕卜，基因治療法還已發(fā)展至抵抗獲得性疾病例如癌癥、AIDS、慢性血管缺血(chronicvascularischemia)、骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病、帕金森病和阿爾茨海默病。目前，種系基因療法由于其復(fù)雜技術(shù)性質(zhì)和倫理考慮而未被涉及。然而，只對單個(gè)個(gè)體有益的(不能代代相傳的)體細(xì)胞基因療法是干細(xì)胞研究的主要焦點(diǎn)。從至鼠類造血干細(xì)胞內(nèi)的成功基因轉(zhuǎn)移的最初描述至先天患有x-連鎖聯(lián)合免疫缺陷(SCID)和腺苷脫氨酶缺陷(ADA)-缺陷的患者中的第一例明確成功的臨床試驗(yàn)花費(fèi)了15年以上的時(shí)間(Aiuti等人，2002;Cavazzana-Calvo等人，2000;Gaspar等人，2004)。干細(xì)胞療法的許多方面正在研究中。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在許多情況下已被用于將基因轉(zhuǎn)移入干細(xì)胞中以修復(fù)突變的或不完善的基因。此類情況包括嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷、范可尼貧血(Fanconianemia)和其他血紅蛋白病(Herzog等人，2006)。干細(xì)胞工程的中心議題是用于將治療性基因?qū)胱婕?xì)胞的特殊方法學(xué)。因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒傾向于插入活性基因(據(jù)認(rèn)為凝縮的染色質(zhì)在這些區(qū)域是打開的)，有人提出，它們的使用還可能增加癌癥的風(fēng)險(xiǎn)(Yo皿g等人，2006)，因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒載體插入?yún)⑴c細(xì)胞增殖的基因附近在理論上可產(chǎn)生前體癌干細(xì)胞(precursorcancerstemcell)。然而，該類型事件的總體風(fēng)險(xiǎn)難以確定?，F(xiàn)在有許多在慢性肉芽腫病(CGD)患者中取得完全成功的實(shí)例，其中NADra氧化酶的活性在輸注經(jīng)遺傳改變的血液干細(xì)胞后得到恢復(fù)(Barese等人，2004)。富有成效的基因療法的最低要求是在矯治生物學(xué)背景中治療性基因產(chǎn)物的持續(xù)產(chǎn)生，同時(shí)有害副作用最小。為了達(dá)到該目的，基因療法中干細(xì)胞的應(yīng)用將需要發(fā)展調(diào)節(jié)治療性基因表達(dá)的新策略以及用于將外源基因有效遞送至干細(xì)胞的方法。通過在確定的組織環(huán)境中分化干細(xì)胞來選擇性控制治療性基因的表達(dá)是干細(xì)胞工程的重要目標(biāo)。該方法可以7分化成特定的譜系、維持它們的未分化狀態(tài)以待日后移植、增殖，以及調(diào)控治療性基因例如自殺基因、細(xì)胞因子或生長因子在確定的組織環(huán)境中的表達(dá)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于治療患有胃腸障礙的受試者的方法，該方法包括將治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞導(dǎo)入受試者的血流，其中(a)CD34—干細(xì)胞未被遺傳修飾，(b)在導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除(myeloablation)，和(c)胃腸障礙以胃腸內(nèi)皮中需要細(xì)胞增殖為特征。本發(fā)明還提供了用于治療糖尿病受試者或前驅(qū)糖尿病受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞，其中(a)CD34—干細(xì)胞未被遺傳修飾，和(b)在導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。本發(fā)明還提供了用于治療患有肌營養(yǎng)不良(musculardystrophy)的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的非自體CD34—干細(xì)胞，其中(a)CD34—干細(xì)胞未被遺傳修飾，和(b)在導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。本發(fā)明還提供了用于改善將要經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷手術(shù)(surgery)的受試者的微循環(huán)和/或急性傷口愈合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞，其中(a)在即將經(jīng)歷手術(shù)之前、手術(shù)期間和/或手術(shù)后立即向受試者的血流中導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞，(b)CD34—干細(xì)胞未被遺傳修飾，和(c)在導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。本發(fā)明還提供了用于改善將要經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或已經(jīng)歷身體創(chuàng)傷(physicaltrauma)的受試者的微循環(huán)和/或急性傷口愈合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞，其中(a)在即將經(jīng)歷身體創(chuàng)傷之前、身體創(chuàng)傷期間和/或身體創(chuàng)傷之后立即向受試者的血流中導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞，(b)CD34—干細(xì)胞未被遺傳修飾，和(c)在導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。本發(fā)明還提供了用于治療患有腫瘤的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼細(xì)胞毒性蛋白的區(qū)域(其與(ii)啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接)，由此當(dāng)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞接近正在經(jīng)歷血管生成的腫瘤組織和在其鄰近分化時(shí)，選擇性表達(dá)細(xì)胞毒性蛋白，和(b)在導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。本發(fā)明提供了用于治療患胃腸障礙的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，(b)在導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除，和(c)胃腸障礙以胃腸內(nèi)皮中需要細(xì)胞增殖為特征。本發(fā)明還提供了用于治療糖尿病受試者或前驅(qū)糖尿病受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，和(b)8在導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。本發(fā)明提供了用于治療患肌營養(yǎng)不良的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼在受試者的肌肉細(xì)胞中不存在的或表達(dá)不足的或其在受試者的肌肉細(xì)胞中過表達(dá)是期望的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)肌肉特異性啟動子或肌肉特異性啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，和(b)在導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。本發(fā)明還提供了用于改善將要經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷手術(shù)的受試者的微循環(huán)和/或急性傷口愈合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，和(b)在導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。最后，本發(fā)明還提供了用于改善將要經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷身體創(chuàng)傷的受試者的微循環(huán)和/或急性傷口愈合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，和(b)在導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。根據(jù)結(jié)合附圖考慮的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他目的和特征將變得明顯。然而，應(yīng)理解，附圖只用于舉例說明目的而不是對本發(fā)明的界限的界定，關(guān)于本發(fā)明的界限應(yīng)當(dāng)參考所附的權(quán)利要求。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解，附圖不必按照比例繪制，并且除非另外指明，否則它們只用于概念性地說明本文中描述的結(jié)構(gòu)和方法。附圖概述在附圖中Sl頂行在四氧嘧啶(ALX)處理之前(左)和之后(右)(胰島素幾乎完全耗盡)，胰島素在正常鼠的e-胰島中的表達(dá)。底行不同放大倍數(shù)(20x;40x)下的正常的產(chǎn)生胰島素的P-胰島的大?。挥肅D34-陰性干細(xì)胞(SC)治療ALX處理后的胰島素耗盡的P-胰島完全恢復(fù)胰島素的產(chǎn)生，同時(shí)產(chǎn)生肥大的跡象(20x和40x)。圖2來自在ALX誘導(dǎo)糖尿病后并且通過SC恢復(fù)胰島素產(chǎn)生的鼠胰腺的分離細(xì)胞。用組成型表達(dá)的綠色熒光蛋白標(biāo)記移植的CD34-陰性干細(xì)胞，產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞顯示紅色熒光。不存在兩種標(biāo)記的共表達(dá)，這表明移植的干細(xì)胞本身不表達(dá)胰島素而是促進(jìn)內(nèi)源性再生。圖3左圖在經(jīng)過ALX處理后，無SC移植(上)、具有SC移植但未矯正血糖水平(中)的小鼠和在SC移植后具有正?；难撬?下)的小鼠的血糖水平。右圖只有顯示在它們的胰腺(經(jīng)勻漿用于FACS分析和綠色熒光的檢測)中存在干細(xì)胞的小鼠(E3;紅圈)顯示正常化的血糖水平，這表明移植的細(xì)胞在矯正胰島素的產(chǎn)生中的中樞作用。圖4上皮惡性腫瘤從原位癌發(fā)展至侵襲性癌并連接至內(nèi)源血管系統(tǒng)的示意圖。CD34-陰性干細(xì)胞歸巢至此處顯示的新血管形成部位，從而可用作遞送細(xì)胞毒性劑或免疫調(diào)節(jié)劑的特洛伊木馬。圖5檢測乳腺腫瘤中的RFP-陽性細(xì)胞。Tie2-RFP轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞分化成內(nèi)皮并且轉(zhuǎn)錄RFP。(A)用DAPI復(fù)染。(B)形成血管的RFP-陽性細(xì)胞。圖6在GCV處理下減少的腫瘤進(jìn)展。(A)干細(xì)胞-GCV應(yīng)用方案。如所示分別施用細(xì)胞懸浮液(第0天)和GCV-溶液(第5-8天)。在小鼠的治療過程中體重的增加反映總的腫瘤負(fù)荷，因?yàn)樗腥橄俣急簧婕?。在每一輪治療的?和第5天以及解剖的當(dāng)天測量體重。(B)小鼠的組，治療始于第22周，顯示標(biāo)準(zhǔn)差的平均數(shù)。將小鼠分選在一個(gè)治療組和兩個(gè)對照組中，第一對照組接受lxPBS而不接受干細(xì)胞懸浮液并且無藥物注射(虛線)；第二對照組接受用Tie2-RFP轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞懸浮液但不接受GCV(點(diǎn)線)。治療組如圖A中所示接受干細(xì)胞和GCV(實(shí)線)。(C)治療始于第18周的組，平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。圖7解剖時(shí)的年齡。在第22周開始治療的小鼠的對照組對治療組。注意達(dá)到相似的腫瘤大小的時(shí)間的顯著差異(參見表l)和在用MSCTK-媒介物和GCV成功治療后小鼠的延長的壽命。圖8腫瘤再生長模型在第18周切除原發(fā)性乳腺腫瘤和在腫瘤的再生長期間起始MSC/tk治療。圖9表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的MSC歸巢至正在生長的胰腺腫瘤。在平行實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)工程改造表達(dá)處于Tie2啟動子/增強(qiáng)子的控制之下的紅色熒光蛋白(RFP)的MSC顯示在腫瘤血管系統(tǒng)中的定向表達(dá)。上行經(jīng)工程改造表達(dá)處于CMV啟動子的控制之下的GFP的MSC在i.v.注射后歸巢至腫瘤。下行經(jīng)工程改造表達(dá)處于Tie2的控制之下的RFP的MSC。圖10然后在注射C57Bl/6MSC(Tie2-tk)細(xì)胞后評估tk/GCV治療的效果。治療方案基本上與對于乳腺癌研究所述的一樣。在第一天注射500，000個(gè)細(xì)胞，在之后的3天，讓所述細(xì)胞募集至正在生長的腫瘤并且分化成表達(dá)內(nèi)皮樣Tie2的細(xì)胞，從而表達(dá)TK自殺基因。然后用GVC治療小鼠，進(jìn)行4天。在l天的休息后，在實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間中重復(fù)循環(huán)。圖11圖顯示用治療性干細(xì)胞和GCV—起治療原位胰腺腫瘤的效果的另外的實(shí)例。與未治療組相比較，觀察到腫瘤大小的顯著減小(50%)以及減少的腹膜癌病(peritonealcarcinosis)。目前優(yōu)選的實(shí)施方案的詳述術(shù)語在本申請中，使用具有如下所示的意義的某些術(shù)語。如本文中所使用的，"急性傷口愈合"將包括，但不限于，在生物學(xué)和機(jī)械信號的控制下被激活以從受傷的時(shí)刻開始修復(fù)組織的細(xì)胞和分子過程。當(dāng)貫穿臨時(shí)基質(zhì)的負(fù)荷與修復(fù)的細(xì)胞的反饋之間達(dá)到動態(tài)平衡時(shí)，發(fā)生成功的急性傷口愈合。如本文中所使用的，細(xì)胞對于受試者來說是"同種異體的"，如果其或任何其前體細(xì)胞來自相同物種的另一個(gè)受試者的話。如本文中所使用的，細(xì)胞相對于所述受試者是"自體的"，如果其或其前體細(xì)胞來自該相同的受試者的話。如本文中所使用的，"CD34—干細(xì)胞"表示在其表面上不存在CD34的干細(xì)胞。例如，在LangeC.等人，Acceleratedandsafeexpansionofhumanmesenchymalstromalcellsinanimalser咖—freemedi咖fortransplantationandregenerativemedicine.J.CellPhysiol.2007，Apr.25[在印刷之前電子公開]中描述了CD34—干細(xì)胞和用于分離其的方法。如本文中所使用的，"細(xì)胞增殖"應(yīng)指細(xì)胞的分裂、大小上的生長和/或分化。如本文中所使用的，"細(xì)胞毒性蛋白"應(yīng)表示當(dāng)存在于細(xì)胞中、細(xì)胞上和/或與細(xì)胞鄰近時(shí)，直接和/或間接引起該細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)。細(xì)胞毒性蛋白包括例如自殺蛋白(例如HSV-tk)和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。細(xì)胞毒性基因包括用于基因抑制的零基因(nullgene)，siRNA或miRNA(例如CCR5-/-)。許多自殺基因系統(tǒng)已被鑒定，包括單純皰疹病毒胸苷激酶基因、胞嘧啶脫氨酶基因、水痘_帶狀皰疹病毒胸苷激酶基因、硝基還原酶基因、大腸桿菌(Escherichiacoli)gpt基因和大腸桿菌Deo基因。胞嘧啶脫氨酶；細(xì)胞色素P450;嘌呤核苷磷酸化酶；羧肽酶G2;硝基還原酶。如在YazawaK，F(xiàn)isherWE，BrunicardiFC:Currentprogressinsuicidegenether即yforcancer.WorldJSurg.2002Jul;26(7):783-9中所詳細(xì)描述的。細(xì)胞毒性因子包括下列因子(i)歸巢因子(homingfactor)例如趨化因子和粘蛋白趨化因子GPI融合物(趨化因子衍生的試劑(chemokinederivedagent)可用于促進(jìn)經(jīng)工程改造的干細(xì)胞的定向募集，參見，例如，PCT國際申請?zhí)朠CT/EP2006/011508，關(guān)于用GPI錨定的粘蛋白融合物)；(ii)作為細(xì)胞毒性蛋白的病毒抗原(麻疹，禽痘)；和(iii)可在經(jīng)工程改造的干細(xì)胞的表面上呈遞的Her2/neu抗原，然后施用her-2/neu抗體，和抗CD52表位的CamPath(阿侖珠單抗)。如本文中所使用的，"內(nèi)皮細(xì)胞"應(yīng)包括但不限于在稱為血管生成的過程期間或之后形成血管中的內(nèi)膜的襯里的細(xì)胞?？刂圃撨^程的因子稱為血管生成因子。內(nèi)皮細(xì)胞還通過受體_配體相互作用與循環(huán)血細(xì)胞發(fā)生作用。如本文中所使用的，"內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合"分別是當(dāng)在內(nèi)皮細(xì)胞中或在內(nèi)皮細(xì)胞鄰近時(shí)，引起有效連接的編碼區(qū)的表達(dá)(多于其在受試者的任何其他微環(huán)境中引起的表達(dá))的啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合。如本文中所使用的，核酸對于細(xì)胞來說是"外源的"，如果其已被人工導(dǎo)入該細(xì)胞或任何該細(xì)胞的前體細(xì)胞的話。如本文中所使用的，"胃腸障礙"應(yīng)表示胃、小腸和/或大腸的任何障礙。如本文中所使用的，干細(xì)胞是"經(jīng)遺傳修飾的"，如果其或任何其前體細(xì)胞已具有11人工導(dǎo)入其的核酸的話。用于產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的干細(xì)胞的方法包括病毒或非病毒基因轉(zhuǎn)移(例如，質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、噬菌體整合酶、轉(zhuǎn)座子、AdV、AAV和慢病毒)的使用。如本文中所使用的，"在即將經(jīng)歷事件之前"包括例如在所述事件之前5、10或30分鐘之內(nèi)或在所述事件之前1、2、6、12或24小時(shí)之內(nèi)。"在事件之后立即"包括例如在所述事件之后5、10或30分鐘之內(nèi)或在所述事件之后1、2、6、12或24小時(shí)之內(nèi)。如本文中所使用的，核酸至細(xì)胞內(nèi)的"整合"可以是瞬時(shí)的或穩(wěn)定的。如本文中所使用的，將CD34—干細(xì)胞"導(dǎo)入受試者的血流"應(yīng)包括但不限于通過注射將此類細(xì)胞導(dǎo)入受試者的靜脈或動脈之一。這樣的施用還可進(jìn)行例如一次或多次，和/或持續(xù)一個(gè)或多個(gè)延長的時(shí)期。單次注射是優(yōu)選的，但在一段時(shí)間內(nèi)(例如，每季、每半年或每年)的重復(fù)注射在一些情況下可能是必需的。還優(yōu)選使用CD34—干細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體的混合物來進(jìn)行這樣的施用。藥學(xué)上可接受的載體對于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員來說是熟知的，包括但不限于0.01-0.1M和優(yōu)選0.05M的磷酸鹽緩沖液或0.8%的生理鹽溶液。此外，此類藥學(xué)上可接受的載體可以是水性的或非水性的溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油和可注射的有機(jī)酯類例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳劑和懸浮液，包括生理鹽溶液和經(jīng)緩沖的介質(zhì)。胃腸外媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸鹽林格氏溶液和不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)媒介物包括流體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑例如林格氏葡萄糖、基于林格氏葡萄糖的補(bǔ)充劑等。常用于i.v.施用的流體見于例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版，第808頁，LippincottWilliams&Wilkins(2000)中。還可存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。如本文中所使用的，"微循環(huán)"應(yīng)包括但不限于從微動脈至毛細(xì)血管或竇狀隙(sinusoid)至小靜脈的血液流動。在某些情況下，術(shù)語微循環(huán)也用于淋巴管。如本文中所使用的，"骨髓清除"應(yīng)表示因例如高劑量的化療或放射治療的施用而引起的骨髓細(xì)胞的嚴(yán)重或完全耗盡。骨髓清除是標(biāo)準(zhǔn)方法，且描述于例如DeegHJ，Klingema皿HG，PhilipsGL，AGuidetoBoneMarrowTransplantation.Springer—VerlagBerlinHeidelberg1992中。如本文中所使用的，干細(xì)胞是"未被遺傳修飾的"，如果其和任何其前體細(xì)胞都不具有人工導(dǎo)入其的核酸的話。如本文中所使用的，"核酸"應(yīng)表示任何核酸分子，包括但不限于DNA、RNA和其雜交體(hybrid)。形成核酸分子的核酸堿基可以是堿基A、C、G、T和U以及其衍生物。此類堿基的衍生物在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，并且在PCRSystems,ReagentsandConsumables(PerkinElmerCatalogue1996-1997，RocheMolecularSystems,Inc.,Branchburg，N.J.，USA)中進(jìn)行了舉例說明。如本文中所使用的，編碼細(xì)胞毒性蛋白的核酸區(qū)域"有效連接"至啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合，如果這樣的啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合引起所述細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)的話。如本文中所使用的，"多肽"表示氨基酸殘基的聚合物。"肽"通常指較短的多肽(例如，10個(gè)氨基酸殘基)，"蛋白質(zhì)"通常指較長的多肽(例如，200個(gè)氨基酸殘基)。氨基酸殘基可以是天然存在的或其化學(xué)類似物。多肽還可包括修飾例如糖基化、脂質(zhì)附著、硫酸12化、羥基化和ADP-核糖基化。如本文中所使用的，"前驅(qū)糖尿病"受試者包括但不限于具有標(biāo)志其將可能發(fā)生胰島素依賴型糖尿病的癥候群的受試者。前驅(qū)糖尿病受試者具有比正常胰島素水平更高的胰島素水平。如本文中所使用的，"啟動子"包括但不限于內(nèi)皮素-1啟動子、前內(nèi)皮素原-1(pre-proendothelin-l)啟動子、myoD啟動子、NeuroD啟動子、CD20啟動子、胰島素啟動子、Pdx-l啟動子、VEGF啟動子、VEGF-R啟動子、SCL啟動子、Scal啟動子、BDNF(-R)啟動子、NGF(-R)啟動子和EGF-R啟動子。如本文中所使用的，"啟動子/增強(qiáng)子"包括但不限于Tie2啟動子增強(qiáng)子以及Flkl啟動子禾口內(nèi)含增強(qiáng)子(int皿icenhancer)。如本文中所使用的，與組織"鄰近"包括例如在組織的lmm內(nèi)，在組織的0.5mm內(nèi)以及在組織的O.25mm內(nèi)。如本文中所使用的，當(dāng)編碼毒性蛋白的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞鄰近正在進(jìn)行血管生成的腫瘤組織，以及在其鄰近分化時(shí)，如果所述細(xì)胞毒性蛋白在該微環(huán)境中的表達(dá)超過其在該受試者中的任何其他微環(huán)境中的表達(dá)，那么所述細(xì)胞毒性蛋白被"選擇性表達(dá)"。優(yōu)選，細(xì)胞毒性蛋白在該微環(huán)境中的表達(dá)比其在受試者的任何其他微環(huán)境中的表達(dá)多至少10倍。如本文中所使用的，"受試者"應(yīng)表示任何動物，例如人、非人靈長類動物、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。如本文中所使用的，"治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞"包括但不限于下列量和量的范圍(i)大約lx102至大約lx108個(gè)細(xì)胞/kg體重；(ii)大約lx103至大約lx107個(gè)細(xì)胞/kg體重；(iii)大約lxl(^至大約lxl()6個(gè)細(xì)胞/kg體重；(iv)大約lxl(^至大約lxl()5個(gè)細(xì)胞/kg體重；(v)大約lx105至大約lx106個(gè)細(xì)胞/kg體重；(vi)大約5xl04至大約0.5xl05個(gè)細(xì)胞/kg體重；(Vii)大約lx103個(gè)細(xì)胞/kg體重；(Viii)大約lx104個(gè)細(xì)胞/kg體重；(ix)大約5xl04個(gè)細(xì)胞/kg體重；(x)大約lx105個(gè)細(xì)胞/kg體重；(xi)大約5xl05個(gè)細(xì)胞/kg體重；(xii)大約lxl()6個(gè)細(xì)胞/kg體重；和(xiii)大約lxl()7個(gè)細(xì)胞/kg體重。設(shè)想的人體重包括但不限于大約50kg、大約60kg、大約70kg、大約80kg、大約90kg和大約100kg。這些數(shù)目基于臨床前動物實(shí)驗(yàn)和CD34+造血干細(xì)胞移植的標(biāo)準(zhǔn)方案。單核細(xì)胞(包括0034+細(xì)胞)通常包含l:23，000至1:300,000的CD34—細(xì)胞。如本文中所使用的，"治療"患有障礙的受試者表示減慢、終止或逆轉(zhuǎn)障礙的進(jìn)程。在優(yōu)選實(shí)施方案中，治療患有障礙的受試者表示逆轉(zhuǎn)障礙的進(jìn)程，理想地達(dá)到消除障礙本身的點(diǎn)。如本文中所使用的，改善障礙和治療障礙是等同的。如本文中所使用的，"腫瘤"應(yīng)包括但不限于形成血管的腫瘤例如前列腺腫瘤、胰腺腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、乳腺腫瘤、黑色素瘤、基底細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、睪丸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或惡性星形細(xì)胞腫瘤例如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastmamultiforme)、結(jié)腸直腸腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、卵巢腫瘤、宮頸腫瘤(cervicaltumor)、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤/平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、尤文氏肉瘤/PNET和惡性淋巴瘤。此類腫瘤包括原發(fā)性腫瘤以及轉(zhuǎn)移性疾病。如本文中所使用的，細(xì)胞相對于受試者是"異種的"，如果其或任何其前體細(xì)胞來13自不同物種的另一個(gè)受試者的話。輛,輔錄本發(fā)明提供了用于治療某些狀況的新型的基于干細(xì)胞的方法。此類方法使用CD34—干細(xì)胞(與更晚期干細(xì)胞相反)并且具有眾多有利方面，因?yàn)樗鼈儗τ诖委煹氖茉囌卟恍枰M(jìn)行骨髓清除。用于本方法的CD34—干細(xì)胞可被遺傳修飾或可不被遺傳修飾，取決于治療的障礙。下面詳細(xì)描述本方法，從使用未經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞的方法開始，然后是使用經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞的方法。具體地，本發(fā)明提供了用于治療患胃腸障礙的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞，其中(a)CD34—干細(xì)胞未被遺傳修飾，(b)在導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除，和(c)胃腸障礙以胃腸內(nèi)皮中需要細(xì)胞增殖為特征。在本方法中，胃腸障礙包括但不限于結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸障礙、克羅恩病、由于急性和慢性腸缺血引起的結(jié)腸炎、乳糜瀉(celiacdisease)、惠普爾病(Whippledisease)或干細(xì)胞移植后的移植物抗宿主病。本發(fā)明還提供了用于治療糖尿病受試者或前驅(qū)糖尿病受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞，其中(a)CD34—干細(xì)胞未被遺傳修飾，和(b)在導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是I型糖尿病或II型糖尿病的前驅(qū)糖尿病患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是遭受I型糖尿病或II型糖尿病的糖尿病患者。本發(fā)明還提供了治療患肌營養(yǎng)不良的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的非自體CD34—干細(xì)胞，其中(a)CD34—干細(xì)胞未被遺傳修飾，和(b)在導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。在本方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者患有杜興肌營養(yǎng)不良(Duchennemusculardystrophy)或貝克肌營養(yǎng)不良(Becker'smusculardystrophy)，并且CD34—干細(xì)胞對于受試者是同種異體的。本發(fā)明還提供了用于改善將要經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷手術(shù)的受試者的微循環(huán)和/或急性傷口愈合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞，其中(a)在即將經(jīng)歷手術(shù)之前、手術(shù)期間和/或手術(shù)后立即向受試者的血流中導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞，(b)CD34—干細(xì)胞未被遺傳修飾，和(c)在導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。本方法適合用于任何類型的手術(shù)，包括但不限于腹部手術(shù)、胸部手術(shù)(thoracicsurgery)、神經(jīng)夕卜禾斗手術(shù)(neurosurgery)、整型手術(shù)或倉寸傷手術(shù)(traumasurgery)。此夕卜，手術(shù)可以是腹腔鏡手術(shù)或開放手術(shù)(opensurgery)。本發(fā)明還提供了用于改善將要經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷身體創(chuàng)傷的受試者的微循環(huán)和/或急性傷口愈合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞，其中(a)在即將經(jīng)歷身體創(chuàng)傷之前、身體創(chuàng)傷期間和/或身體創(chuàng)傷后立即向受試者的血流中導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞，(b)CD34—干細(xì)胞未被遺傳修飾，和(c)在導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。本方法適合于任何類型的身體創(chuàng)傷。特別預(yù)期的是(i)分娩，其中在即將經(jīng)歷該事件之前、該事件期間或該事件之后立即向受試者的血流中導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞，(ii)由劇烈動作引起的皮肉傷，其中在身體創(chuàng)傷后立即向受試者的血流中導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞，和(iii)燒傷，其中在身體創(chuàng)傷后立即向受試者的血流中導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞。在使用未經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞的上述方法中，治療的受試者可以是任何受試者。在優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者是人。此外，在使用未經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞的方法中，除非另外說明或指出，否則CD34—干細(xì)胞對于受試者來說可以是同種異體的、自體的或異種的。本發(fā)明提供了用于治療患有腫瘤的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼細(xì)胞毒性蛋白的區(qū)域(其與(ii)啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接)，由此當(dāng)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞接近正在經(jīng)歷血管生成的腫瘤組織和在其鄰近分化時(shí)，選擇性表達(dá)細(xì)胞毒性蛋白，和(b)在導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。預(yù)期該方法可用于所有腫瘤類型，包括例如前列腺腫瘤、胰腺腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、乳腺腫瘤、黑色素瘤、基底細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、睪丸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或惡性星形細(xì)胞腫瘤例如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸直腸腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、卵巢腫瘤、宮頸腫瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤/平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、尤文氏肉瘤/PNET和惡性淋巴瘤。還預(yù)期許多啟動子/增強(qiáng)子組合和細(xì)胞毒性蛋白可用于該方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動子/增強(qiáng)組合是Tie2啟動子/增強(qiáng)子，細(xì)胞毒性蛋白是單純皰疹病毒胸苷激酶，并且以允許單純皰疹病毒胸苷激酶呈遞更昔洛韋⑧(ganciclovir)細(xì)胞毒性的方式用更昔洛韋@治療受試者。更昔洛韋③和其使用方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。本發(fā)明還提供了用于治療患有胃腸障礙的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，(b)在導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除，和(c)胃腸障礙以胃腸內(nèi)皮中需要細(xì)胞增殖為特征。在該方法中，胃腸障礙優(yōu)選是結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸障礙或克羅恩病。預(yù)期許多啟動子/增強(qiáng)子組合和增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白可用于該方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動子/增強(qiáng)子組合是Tie2啟動子/增強(qiáng)子，增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。除了VEGF外，還預(yù)期其他血管生成因子例如HIF-la和碳酸酐酶IX。本發(fā)明還提供了用于治療糖尿病受試者或前驅(qū)糖尿病受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，和(b)在導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是I型糖尿病或II型糖尿病的前驅(qū)糖尿病患15者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是遭受I型糖尿病或II型糖尿病的糖尿病患者。預(yù)期許多啟動子/增強(qiáng)子組合和增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白可用于該方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動子/增強(qiáng)子組合是Tie2啟動子/增強(qiáng)子，增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白是與血管生成相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。本發(fā)明還提供了用于治療患肌營養(yǎng)不良的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼在受試者的肌肉細(xì)胞中不存在的或表達(dá)不足的或其在受試者的肌肉細(xì)胞中過表達(dá)是期望的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)肌肉特異性啟動子或肌肉特異性啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，和(b)在導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。在本方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者患有杜興肌營養(yǎng)不良或貝克肌營養(yǎng)不良，并且CD34—干細(xì)胞對于受試者是同種異體的或自體的。預(yù)期許多肌肉特異性啟動子/增強(qiáng)子組合可用于該方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，肌肉特異性啟動子/增強(qiáng)子組合是MyoD啟動子/增強(qiáng)子。在杜興肌營養(yǎng)不良的優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者的肌肉細(xì)胞中不存在的蛋白質(zhì)是肌養(yǎng)蛋白(dystrophin)。本發(fā)明還提供了用于改善將要經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷手術(shù)的受試者的微循環(huán)和/或急性傷口愈合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，和(b)在導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。該方法適合于任何類型的手術(shù)，包括但不限于腹部手術(shù)、胸部手術(shù)、神經(jīng)外科手術(shù)或整形手術(shù)。此外，手術(shù)可以是腹腔鏡手術(shù)或開放手術(shù)。預(yù)期許多啟動子/增強(qiáng)子組合和增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白可用于該方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動子/增強(qiáng)子組合是Tie2啟動子/增強(qiáng)子，增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白是與血管生成相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。最后，本發(fā)明提供了用于改善將要經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷身體創(chuàng)傷的受試者的微循環(huán)和/或急性傷口愈合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，和(b)在導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。本方法適合于任何類型的身體創(chuàng)傷。特別預(yù)期的是(i)分娩，(ii)由劇烈動作引起的皮肉傷，其中在身體創(chuàng)傷后立即向受試者的血流中導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞，和(iii)燒傷，其中在身體創(chuàng)傷后立即向受試者的血流中導(dǎo)入CD34—干細(xì)胞。預(yù)期許多啟動子/增強(qiáng)子組合和增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白可用于該方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動子/增強(qiáng)子組合是Tie2啟動子/增強(qiáng)子，增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白是與血管生成相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。在使用經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞的上述方法中，治療的受試者可以是任何受試者。在優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者是人。此外，在使用經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞的方法中，除非另外說明或指出，否則CD34—干細(xì)胞對于受試者來說可以是同種異體的、自體的或異種的。在使用經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞的本方法中，當(dāng)干細(xì)胞(i)鄰近靶組織中的適當(dāng)細(xì)胞，(ii)分化和/或(iii)與靶組織中的適當(dāng)細(xì)胞融合時(shí)，外源基因表達(dá)，即"打開"。用于本發(fā)明的各種蛋白質(zhì)和調(diào)控序列可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地獲得。例如，Tie2啟動子增強(qiáng)子的內(nèi)皮細(xì)胞特異性示于SchlaegerTM，BartunkovaS，LawittsJA，Teichma皿G，RisauW，DeutschU，SatoTN.Uniformvascular_endothelial_cell_specificgeneexpressioninbothembryonicandadulttransgenicmice.ProcNatlAcadSciUSA.199794:3058-63中。對于胸苷激酶，可使用HSVTK-V00467皰疹基因(ATP:胸苷5'磷酸轉(zhuǎn)移酶，e.c.2.7.1.21)(I型株系CL101)。通過參考下面的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)可更好地理解本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解，所述的特定實(shí)驗(yàn)只是在其后的權(quán)利要求中更詳盡描述的本發(fā)明的舉例說明。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)(ExperimentalDetail)第I部分脂臺m牛細(xì)歴白條劍紅跑腦條細(xì)CD34-隨f麵干細(xì)胞和基因療法極有希望用于開發(fā)治療許多威脅生命的疾病的新工具。干細(xì)胞療法與選擇性基因療法的結(jié)合增加了患病或丟失的細(xì)胞的再生或替代的治療選擇。CD34-陰性、體外貼壁生長的干細(xì)胞的分化背景中的組織特異性基因表達(dá)可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因CD34-陰性祖細(xì)胞，這將導(dǎo)致細(xì)胞的選擇性以及基因表達(dá)的可誘導(dǎo)性(也出于安全原因)。病毒和非病毒基因遞送技術(shù)已獲得詳細(xì)地描述，同樣地也詳細(xì)描述了用于在干細(xì)胞募集和分化的背景中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的技術(shù)。該新治療策略的潛在臨床應(yīng)用描述為，將轉(zhuǎn)基因祖細(xì)胞導(dǎo)入癌癥或組織再生的部位，從而誘導(dǎo)抗腫瘤治療或促進(jìn)組織改建(remodeling)和傷口愈合。轉(zhuǎn)基因祖細(xì)胞用作有效的基因遞送媒介物。作為基因遞送媒介物的干細(xì)胞干細(xì)胞提供了為其他療法難以治療的疾病提供細(xì)胞療法的潛能。對于每一種類型的干細(xì)胞，最終目標(biāo)是一樣的所述細(xì)胞應(yīng)當(dāng)表達(dá)特定的基因庫(r印ertoireofgene)，從而改變細(xì)胞身份以維持、替代或拯救特定組織。為了幫助支持特定組織環(huán)境中的分化，正在嘗試改變干細(xì)胞的"細(xì)胞核編程(nuclearprogramming):多能干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和多能成體祖細(xì)胞(multipotentadultprogenitorcell，MAPC)代表有希望的干細(xì)胞群體，因?yàn)樗鼈兡軌蜓刂煌淖V系分化。它們代表驅(qū)動成年哺乳動物組織的更新的"細(xì)胞引擎"。此類細(xì)胞在整個(gè)生命周期中連續(xù)分裂而產(chǎn)生經(jīng)歷分化和成熟的程序的新后代細(xì)胞來取代更老的死亡的組織細(xì)胞。在一些情況下，所述細(xì)胞更新程序被認(rèn)為提供了用于成體組織的修復(fù)和再生的細(xì)胞源。不同干細(xì)胞類型的再生潛能構(gòu)成了當(dāng)前使人們對使此類細(xì)胞適用于細(xì)胞替代療法(r印lacementtherapy)產(chǎn)生興趣的用于治療的干細(xì)胞的潛在來源包括骨髓、外周血、CNS、肝、胰腺、肌肉、皮膚、肺、腸、心臟禾卩月旨肪(KoerblingM，EstrovZ，Adultstemcellsfortissuerepair—anewther即euticconc印t)NEJM2003349:570-582)。對于臨床應(yīng)用，干細(xì)胞的來源應(yīng)當(dāng)容易得到和容易收獲(同時(shí)對于患者風(fēng)險(xiǎn)最小)并且提供充足的細(xì)胞。在這點(diǎn)上，脂肪組織代表了很有希望的組織來源。(AdiposederivedstemcellsfortheregenerationofdamagedtissueParkerM，AdamK，ExpertOpionBiolTherap，2006，567-568)。月旨肪來源的干細(xì)胞和骨髓來源的干細(xì)胞共有相似的生長動力學(xué)、細(xì)胞衰老的特征、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、CD表面標(biāo)記表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄特征譜(CellsTissuesOrgans.2003;174(3):101-9.Comparisonofmulti—lineagecellsfromhumanadiposetissueandbonemarrow.DeUgarteDA，MorizonoK，ElbarbaryA，AlfonsoZ，ZukPA，ZhuM，Dragoo幾，AshjianP，ThomasB，BenhaimP，ChenI，F(xiàn)raserJ，HedrickMH，MolBiolCell.2002Dec;13(12):4279—95.Humanadiposetissueisasourceofmultipotentstemcells.ZukPA，ZhuM，AshjianP，DeUgarteDA，HuangJI，MizunoH，AlfonsoZC，F(xiàn)raserJK，BenhaimP，HedrickMH)。還對不同來源的干細(xì)胞用作用于抵抗疾病的細(xì)胞和基因特異療法的潛在媒介物進(jìn)行了評價(jià)。它們的高自我更新潛能使它們成為恢復(fù)或替代器官系統(tǒng)和/或遞送基因產(chǎn)物的極有希望的候選物。雖然祖細(xì)胞在體外可顯示良好的增殖和分化潛能，但它們在體內(nèi)的生物學(xué)特性仍不明確。體外擴(kuò)增的干細(xì)胞代表異質(zhì)群體，其包括缺乏大多數(shù)分化標(biāo)記如CD34的表達(dá)的多代間充質(zhì)(基質(zhì))細(xì)胞后代。此類群體可能仍然保留有限的增殖潛能和對沿著間充質(zhì)和非間充質(zhì)細(xì)胞譜系的終末分化和成熟的應(yīng)答性。將來，多能干細(xì)胞群體的更好的標(biāo)記將有望提高區(qū)分此類干細(xì)胞與其他祖細(xì)胞群體的能力。用于在矯治生物學(xué)背景中遞送治療性基因表達(dá)的組織特異性啟動子。干細(xì)胞介導(dǎo)的治療最終需要進(jìn)行核重編程-改變不同組織和器官中的細(xì)胞類型的獨(dú)特的基因表達(dá)模式。在許多遺傳性干細(xì)胞疾病中，遺傳缺陷將存活的不利方面賦予受影響的干細(xì)胞群體。在此類疾病中，"矯正的"干細(xì)胞群體的移植據(jù)認(rèn)為在不存在任何外加的選擇壓力的情況下進(jìn)行自發(fā)的體內(nèi)選擇。例如，在X-連鎖SCID中，治療性轉(zhuǎn)基因的導(dǎo)入為經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞群體提供了持續(xù)增殖和存活有利方面(Neff等人，2006)。然而，相似的體內(nèi)選擇作用在大部分疾病中通常不是直接可能的。在其中治療性基因的過表達(dá)不提供存活有利方面的情況下，可將第二選擇基因(理想地處于藥物調(diào)控之下的)整合入載體(Tirona和Kim，2005)。允許受藥物調(diào)控的選擇的系統(tǒng)包括使用所謂的"二聚化的化學(xué)誘導(dǎo)齊U"(chemicalinducersofdimerization，CID)的可逆蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用。此類系統(tǒng)依賴于兩個(gè)組分。第一組分是配體或藥物，第二組分是結(jié)合配體結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(通常為生長因子受體的細(xì)胞內(nèi)部分)的融合蛋白。效應(yīng)結(jié)構(gòu)域通過藥物結(jié)合而被激活，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)二聚化。從而，信號融合用作在CID存在時(shí)打開和在CID撤出后關(guān)閉的開關(guān)。將象這樣的系統(tǒng)整合入干細(xì)胞群體可以使得能夠藥物依賴性地控制所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞群體的增殖(Neff等人，2006;NeffandBlau，2001)?？梢钥吹剑杉?xì)胞作為治療性基因的遞送媒介物的用途提供了一系列有利方面。干細(xì)胞通常被活躍地募集至損傷的組織，在組織修復(fù)過程中它們在該處進(jìn)行分化。例如CD34+骨髓來源的祖細(xì)胞通過分化成內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、造血細(xì)胞和可能地其他細(xì)胞類型來促成組織修復(fù)。然而，循環(huán)祖細(xì)胞歸巢至改建組織的機(jī)制仍然不清楚。Jin等人已證明整聯(lián)蛋白a4l31(VLA-4)可促進(jìn)循環(huán)祖細(xì)胞歸巢至在活躍改建的新生血管上表達(dá)的a4P1配體VCAM和細(xì)胞纖連蛋白。已顯示，表達(dá)整聯(lián)蛋白a4P1的祖細(xì)胞歸巢至活躍的18腫瘤新血管形成位置，但不歸巢至正常組織。整聯(lián)蛋白a4Pl但非其他整聯(lián)蛋白的拮抗劑可阻斷此類細(xì)胞與內(nèi)皮的粘附和發(fā)展成分化的細(xì)胞類型。(Jin等人，2006)除了整聯(lián)蛋白外，趨化因子和它們的受體也顯示在干細(xì)胞的組織特異性歸巢中起著中心作用。基于它們的趨化因子受體表達(dá)譜，預(yù)測CD341SC將歸巢至次級淋巴器官(CCR7)、皮膚(CCR4，CCR10)、小腸(CCR10)和唾液腺(CCR10)。在用CMFDA短暫地標(biāo)記CD34-MSC或穩(wěn)定地導(dǎo)入綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)質(zhì)粒后，將細(xì)胞注射入同基因型健康小鼠，然后在1、3和7天后測定細(xì)胞的組織分布。有趣地，干細(xì)胞不回歸至骨髓，而是根據(jù)它們的趨化因子受體表達(dá)譜遷移至次級淋巴器官、唾液腺、腸和皮膚。假定干細(xì)胞在正常以及患病情況下可顯示至不同組織微環(huán)境的選擇性遷移，那么在理論上可使用與在被募集的干細(xì)胞中啟動的分化途徑相關(guān)的組織特異性啟動子來驅(qū)動治療性基因只在確定的生物學(xué)背景中選擇性表達(dá)。被募集至其他組織微生態(tài)環(huán)境，但不進(jìn)行相同的分化程序的干細(xì)胞將不表達(dá)所述治療性基因。該方法允許在顯著的程度上潛在地控制治療性基因在確定的微環(huán)境中選擇性表達(dá)并且已成功地用于在新血管形成過程中調(diào)節(jié)治療性基因表達(dá)。許多啟動子已就它們的組織特異性表達(dá)進(jìn)行了表征。該信息的詳細(xì)來源可見于轉(zhuǎn)基因文獻(xiàn)，或例如見于各種數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù)庫列出了CRE轉(zhuǎn)基因表達(dá)(用于驅(qū)動小鼠的組織特異性CRE/Lox靶向基因缺失模型)的組織特異性啟動子活性(例如http:〃www.mshri.on.ca/nagy/Creiorks.htm)?？蓪?dǎo)入在炎癥或新血管形成的背景中被選擇性調(diào)控的啟動子。在這點(diǎn)上，已就內(nèi)皮特異性表達(dá)研究了Tie2-啟動子、Flkl啟動子和內(nèi)含啟動子、內(nèi)皮素-l啟動子和前內(nèi)皮素原-1啟動子(Huss等人，2004)。特定報(bào)告基因和新成像技術(shù)的應(yīng)用可用于確定候選啟動子在干細(xì)胞移植背景中的組織特異性表達(dá)。關(guān)于基因遞送的其他選擇包括將內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)信號用于從單個(gè)啟動子表達(dá)多個(gè)基因(Jackson，2005)，例如，可將與報(bào)告基因連接的治療性基因用于在實(shí)驗(yàn)背景下更好地跟蹤治療性基因表達(dá)的分布。重要地，許多啟動子可顯示在其他組織類型中的表達(dá)"滲漏"或在經(jīng)工程改造的細(xì)胞中的低水平基礎(chǔ)表達(dá)。啟動子工程改造是項(xiàng)新技術(shù)，其可允許人們"調(diào)節(jié)"啟動子特異性以限制跨組織活性，從而允許將表達(dá)更好地限制至特定細(xì)胞類型(Fessele等人，2002;Werner等人，2003)?；蜻f送方法目前可用于干細(xì)胞工程的各種基因遞送方法包括病毒和非病毒載體以及轉(zhuǎn)染的生物學(xué)或化學(xué)方法。所述方法可在所使用的系統(tǒng)中產(chǎn)生穩(wěn)定的基因表達(dá)或瞬時(shí)基因表達(dá)。病毒基因遞送系統(tǒng)由于經(jīng)遺傳修飾的病毒的高轉(zhuǎn)染效率，它們已被廣泛用于將基因遞送至干細(xì)胞內(nèi)。DNA病毒載體(i)腺病毒腺病毒是雙鏈、無包膜二十面體病毒，其包含36kb的病毒基因組(Kojaoghlanian等人，2003)。取決于其表達(dá)是在DNA復(fù)制之前還是之后發(fā)生，它們的基因被分類為早期(E1A、E1B、E2、E3、E4)、延遲(delayed)(IX，IVa2)和主要晚期(Ll、L2、L3、L4、L5)基因。迄今為止，已描述了51個(gè)可在多種器官中感染和復(fù)制的人腺病毒血清型。病毒被分類為下列亞型A-以高頻率和短潛伏期誘導(dǎo)腫瘤，B-具有微弱的致癌性，和C-是不致癌的(Cao等人，2004;Kojaoghlanian等人，2003)。此類病毒已用于產(chǎn)生一系列用于基因轉(zhuǎn)移細(xì)胞工程的載體。第一代腺病毒載體是通過缺失E1基因(病毒復(fù)制所必需的)，從而產(chǎn)生具有4kb克隆容量(cloningcapacity)的載體來產(chǎn)生的。E3(負(fù)責(zé)宿主免疫應(yīng)答)的額外缺失提供了8kb的克隆容量(Bett等人，1994;Danthinne和Imperiale，2000;Danthinne和Werth，2000)。第二代載體是通過缺失E2區(qū)域(病毒復(fù)制所必需的)和/或E4區(qū)域(參與宿主細(xì)胞細(xì)胞凋亡的抑制)以及缺失El或E3來產(chǎn)生的。所得的載體具有10-13kb的克隆容量(Armentano等人，1995)。第三"gutted"代的載體是通過缺失除了反向末端重復(fù)(ITRs)和順式作用包裝信號外的全部病毒序列來產(chǎn)生的。此類載體具有25kb的克隆容量(Kochanek等人，2001)并且保留它們在靜止和分裂細(xì)胞中的高轉(zhuǎn)染效率。重要地，腺病毒載體通常不整合入宿主細(xì)胞的基因組，但它們已顯示將基因瞬時(shí)遞送入成體干細(xì)胞的功效。此類載體具有一系列有利和不利方面。重要的有利方面是它們可以以高滴度擴(kuò)增并且可感染多種細(xì)胞(Benihoud等人，1999;KanervaandHemminki，2005)。一般地，載體由于它們在各種貯存條件下的穩(wěn)定性而容易操作。腺病毒5型(Ad5)已被成功用于遞送基因至人和小鼠干細(xì)胞中(Smith-Arica等人，2003)。腺病毒不整合入宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)在許多情況下可視為不利方面，因?yàn)槠涞氖褂弥辉试S治療性基因的瞬時(shí)表達(dá)。例如在評估當(dāng)TGF-P1和骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2(BMP-2)通過腺病毒介導(dǎo)的表達(dá)遞送時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行軟骨形成的能力的研究中，發(fā)現(xiàn)軟骨形成與瞬時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)的水平和持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)。所有聚集體(aggregate)中轉(zhuǎn)基因表達(dá)是高度短暫的，顯示在7天后顯著減少。軟骨形成在經(jīng)修飾表達(dá)>100ng/mlTGF-P1或BMP-2的聚集體中被抑制；然而，這部分是由于暴露于高腺病毒負(fù)荷的抑制作用(MolTher.2005Aug;12(2):219—28.Gene—inducedchondrogenesisofprimarymesenchymalstemcellsinvitro.PalmerGD，SteinertA，PascherA，GouzeE，GouzeJN，Betz0，JohnstoneB，EvansCH，GhivizzaniSC.)。在使用用攜帶重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白_7(BMP-7)基因的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的大鼠脂肪來源的干細(xì)胞的第二模型中，顯示了干細(xì)胞的自體來源用于BMP基因治療的極具前景的結(jié)果。然而，通過體外測量堿性磷酸酶來估量的活性是短暫的，其在第8天達(dá)到峰值。因此結(jié)果與在軟骨形成模型中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似(Cytother即y.2005;7(3):273-81)。因此，對于不需要穩(wěn)定的基因表達(dá)的治療或?qū)嶒?yàn)，腺病毒載體可以是良好的選擇。使用腺病毒載體的另外的重要問題是它們可在經(jīng)工程改造的細(xì)胞轉(zhuǎn)移入宿主后引起針對所述經(jīng)工程改造的細(xì)胞的強(qiáng)免疫應(yīng)答。顯然，當(dāng)考慮在治療情況下應(yīng)用經(jīng)工程改造的細(xì)胞時(shí)，這可以是重要的問題。(J.N.Glasgow等人，Transductionalandtranscriptionaltargetingofadenovirusforclinical鄰plications.CurrGeneTher.2004Mar54(1):1-14).Invitroandinvivoinductionofboneformationbasedonexvivogenether即yusingratadipose—derivedadultstemcellsexpressingBMP_7，YangM，MaQJ，DangGT，MaK，ChenP，ZhouCY.)已顯示，基于Ad5型的腺病毒載體通過主受體(primaryrec印tor)柯薩奇病毒20和腺病毒受體(CAR)有效且短暫地導(dǎo)入外源基因。然而，一些類型的干細(xì)胞例如MSC和造血干細(xì)胞因?yàn)椴淮嬖贑AR表達(dá)而明顯不能用基于Ad血清型5(Ad5)的常規(guī)腺病毒載體來有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了克服該問題，已開發(fā)了纖維修飾(fiber-modified)腺病毒載體和基于另一種腺病毒血清型的腺病毒載體。(MolPharm.2006Mar_Apr;3(2):95-103.Adenovirusvector—mediatedgenetransferintostemcells.KawabataK，SakuraiF，KoizumiN，HayakawaT，MizuguchiH.LaboratoryofGeneTransferandRegulation,NationalInstituteofBiomedicalInnovation,Osaka567-0085，Japan.)(ii)腺伴隨病毒腺伴隨病毒(AAV)是細(xì)小病毒科的ssDNA動物病毒的普遍存在的、非致細(xì)胞病變的、不會g復(fù)制的成員(G.Gao等人，NewrecombinantserotypesofAAVvectors.CurrGeneTher.2005Jun;5(3):285-97)。AAV是具有4.7kb基因組的小二十面體病毒。此類病毒具有由折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的回文重復(fù)組成的特征末端。它們在輔助病毒的幫助下復(fù)制，所述輔助病毒通常是腺病毒的許多血清型之一。在輔助病毒不存在的情況下，它們在第19號染色體的特定基因座(AAVS1)上整合入人基因組并且保持潛伏態(tài)直至輔助病毒感染發(fā)生(Atchison等人，1965，1966)。AAV可轉(zhuǎn)導(dǎo)來自不同物種包括小鼠、大鼠和猴子的細(xì)胞類型。在血清型中，AAV2的研究最詳盡并且被廣泛用作基因遞送載體。其基因組編碼兩個(gè)巨大的開放讀框(0RF)r印和c即。R印基因編碼在病毒生命周期的不同階段(例如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄控制、位點(diǎn)特異性整合、用于病毒包裝的單鏈基因組的積累)起著重要作用的4種蛋白R印78、R印68、R印52和R印40。c即基因編碼3種病毒殼體蛋白VP1、VP2、VP3(Becerra等人，198S;B皿ing等人，2003)?；蚪M3'末端用作第二鏈合成的引物并且具有用作病毒的整合序列的末端斷裂位點(diǎn)(terminalresolutionsite,TRS)，因?yàn)樵撔蛄信c第19號染色體上的序列相同(Young和Samulski，2001;Young等人，2000)。此類病毒與腺病毒的相似之處在于它們能夠感染廣泛的分裂和非分裂細(xì)胞。與腺病毒不同，它們具有在人基因組的特定位置整合入宿主基因組的能力。不幸的是，由于它們的基因組相當(dāng)大，因此AAV載體具有有限的轉(zhuǎn)移外源基因插入物的容量(Wu和Ataai，2000)。RNA病毒載體(i)逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組由兩個(gè)相同的單鏈有義RNA拷貝組成，其長度為7-10kb，編碼3個(gè)基因gag、pol和env，側(cè)翼有長末端重復(fù)(LTR)(Yu和Schaffer，2005)。gag基因編碼包含基質(zhì)和核殼體元件(其為gag前體蛋白的切割產(chǎn)物)的核心蛋白殼體。pol基因編碼來源于gag-pol前體基因的病毒蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。env基因編碼介導(dǎo)病毒進(jìn)入的包膜糖蛋白。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的重要特征是在基因組的每一末端存在LTR。此類序列有助于病毒DNA合成的起始、調(diào)節(jié)前病毒DNA至宿主基因組的整合以及用作病毒基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的啟動子。逆轉(zhuǎn)錄病毒被細(xì)分為3個(gè)大組致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒(莫洛尼鼠白血病病毒，MoMLV)、慢病毒(HIV)禾口泡沫病毒(spumavirus)(泡沫病毒(foamyvirus))(Trobridge等人，2002)?；谀孓D(zhuǎn)錄病毒的載體是最常使用的基因治療整合載體。此類載體通常具有大約8kb的克隆容量，且通常通過完全缺失除了LTR和順式作用包裝信號外的病毒序列來產(chǎn)生。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因組的隨機(jī)位置上整合。與此相關(guān)的問題包括潛在的插入誘變和由LTR驅(qū)動的潛在的致癌活性。LTR的U3區(qū)域具有啟動子和增強(qiáng)子元件，因此該區(qū)域，當(dāng)從載體缺失時(shí)，可導(dǎo)致其中LTR驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄被阻止的自失活載體(self-inactivatingvector)。內(nèi)部啟動子然后可用于驅(qū)動轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。小鼠干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的初步研究產(chǎn)生了這樣的希望，即至人中的基因轉(zhuǎn)移將同樣是有效的(0'Co皿or和Crystal，2006)。不幸的是，使用可獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染多譜系長期再生的干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移在小鼠中仍然顯著更有效率。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在人中基因轉(zhuǎn)移功效的減少以及不受控制的整合代表了在干細(xì)胞工程背景中將此類載體用作治療手段的重要障礙。(ii)慢病毒慢病毒是病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒科的成員(M.Scherr等人，Genetransferintohematopoieticstemcellsusinglentiviralvectors.CurrGeneTher.2002Feb;2(1):45-55.)。它們具有與致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒相比較更復(fù)雜的基因組和復(fù)制周期(Beyer等人，2002)。它們與較簡單的逆轉(zhuǎn)錄病毒的不同之處在于它們具有額外的調(diào)控基因和元件，例如介導(dǎo)病毒轉(zhuǎn)錄的反式激活的tat基因(Sodroski等人，1996)和介導(dǎo)未剪接的病毒RNA的細(xì)胞核輸出的rev(Cochrane等人，1990;Emerman和Temin，1986)。通過除去病毒復(fù)制所必需的基因(而使病毒無活性)來從人免疫缺陷病毒(HIV-1)獲得慢病毒載體。盡管它們?nèi)狈?fù)制基因，但載體仍然能夠有效整合入宿主基因組，從而使得轉(zhuǎn)基因能夠穩(wěn)定表達(dá)。此類載體具有額外的有利方面，低細(xì)胞毒性和感染不同細(xì)胞類型的能力。也已從猿猴、馬科和貓科動物來源開發(fā)出慢病毒載體，但來源于人免疫缺陷病毒(HIV)的載體是最常用的(Yo皿g等人，2006)。慢病毒載體通過缺失除了LTR和順式作用包裝信號外的全部病毒序列來產(chǎn)生。所得的載體具有大約8kb的克隆容量。此類載體與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一個(gè)不同的特征是它們轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂和非分裂細(xì)胞以及終末分化的細(xì)胞的能力(Kosaka等人，2004)。慢病毒遞送系統(tǒng)能夠在人間充質(zhì)和胚胎干細(xì)胞中具有高感染率。在由Clements等人進(jìn)行的研究中，慢病毒的主鏈經(jīng)改造表達(dá)單和雙順反子轉(zhuǎn)基因，并且還可用于遞送用于在人干細(xì)胞中特異性沉默基因表達(dá)的短發(fā)夾核糖核酸。(TissueEng.2006Jul;12(7):1741-51.Lentiviralmanipulationofgeneexpressioninhumanadultandembryonicstemcells.ClementsMO，GodfreyA，CrossleyJ，WilsonSJ，TakeuchiY，BoshoffC.)表1概述了上述病毒載體。載體插入容量(kb)向性載體基因組形式表達(dá)炎癥潛力效率包膜的22<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>非病毒基因遞送系統(tǒng)(i)用于促進(jìn)基因整合的方法除了上面論述的基于病毒的載體外，目前正在開發(fā)缺乏病毒序列的其他載體系統(tǒng)。備選策略包括常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和利用整合酶或轉(zhuǎn)座酶技術(shù)進(jìn)行的靶向基因整合的應(yīng)用。這些策略代表了用于載體整合的重要的新方法并且在它們的整合中具有有效和通常位點(diǎn)特異性的有利方面。目前3種重組酶系統(tǒng)可獲得用于遺傳工程來自噬菌體PI的ere重組酶(Lakso等人，1992;0rban等人，1992)、來自酵母2微米質(zhì)粒的FLP(翻轉(zhuǎn)酶)(Dymecki，1996;Rodriguez等人，2000)和從鏈霉菌噬菌體(str印tomysesphage)fIC31分離的整合酶(GinsburgandCalos，2005)。這些重組酶的每一種識別特異性耙整合位點(diǎn)。Cre和FLP重組酶分別在稱為loxP(用于交換的基因座)和FRT(FLP重組酶的靶)的34bp回文序列上催化整合。噬菌體整合酶催化哺乳動物基因組中的兩個(gè)短att識別位點(diǎn)之間的位點(diǎn)特異性單向重組。重組導(dǎo)致整合(當(dāng)att位點(diǎn)存在于兩個(gè)不同的DNA分子上時(shí))和缺失或倒位(當(dāng)att位點(diǎn)存在于相同分子上時(shí))。已發(fā)現(xiàn)其在組織培養(yǎng)細(xì)胞(體外)和小鼠(體內(nèi))中起作用。睡美人(Sle印ingBeauty,SB)轉(zhuǎn)座子由兩個(gè)各自340個(gè)堿基對的反向末端重復(fù)組成(Izsvak等人，2000)。該系統(tǒng)指導(dǎo)特定構(gòu)建體從供體質(zhì)粒精確轉(zhuǎn)移至哺乳動物染色體內(nèi)。轉(zhuǎn)座子從質(zhì)粒載體至染色體位點(diǎn)的切割和整合由SB轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)，該轉(zhuǎn)座酶可以以順式23或反式方式被遞送至細(xì)胞(Kaminski等人，2002)。染色體整合的轉(zhuǎn)座子中的基因可在細(xì)胞中終生表達(dá)。SB轉(zhuǎn)座酶隨機(jī)地在TA-二核苷酸堿基對上整合，雖然側(cè)翼序列可影響整合。雖然迄今為止的結(jié)果不表明SB轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)整合代表了相同的對于病毒載體所觀察到的風(fēng)險(xiǎn)水平，但在該系統(tǒng)可安全地用于人試驗(yàn)之前需要更多的數(shù)據(jù)。將載體導(dǎo)入細(xì)胞的物理方法(i)電穿孔電穿孔依賴于通過克服膜電容在膜上產(chǎn)生瞬間小孔的短暫的、高電壓電脈沖的使用。該方法的一個(gè)有利方面是其可用于大多數(shù)細(xì)胞類型的穩(wěn)定和瞬時(shí)基因表達(dá)。該技術(shù)依賴于磷脂膜中疏水和親水相互作用的相對弱的性質(zhì)以及其在擾亂后恢復(fù)其原始狀態(tài)的能力。當(dāng)膜被擊穿時(shí)，極性分子可以以高的效率被遞送入細(xì)胞。大的帶電荷分子如DNA和RNA通過由它們的電泳梯度驅(qū)動的過程移入細(xì)胞。脈沖的振幅控制細(xì)胞表面上被擊穿的總面積，脈沖的持續(xù)時(shí)間確定擊穿的程度(Gabriel和Teissie，1997)。細(xì)胞的穿透狀態(tài)取決于脈沖的強(qiáng)度。強(qiáng)脈沖可導(dǎo)致對細(xì)胞的不可逆的擊穿、不可修復(fù)的損傷和最終細(xì)胞死亡。為此，電穿孔可能是最劇烈的基因遞送方法，其通常需要更大數(shù)量的DNA和細(xì)胞。該方法的效率取決于許多至關(guān)重要的因素如細(xì)胞的大小、脈沖應(yīng)用期間的重復(fù)次數(shù)(implication)和溫度(Rols和Teissie，1990)。該技術(shù)最有利的方面是可將DNA直接轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，從而增加其整合入宿主基因組的概率。甚至難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也可使用該方法穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染(Aluigi等人，2005;Zernecke等人，2003)。電穿孔期間使用的轉(zhuǎn)染方法的改進(jìn)已導(dǎo)致稱為核轉(zhuǎn)染(皿cleofection)的有效的基因轉(zhuǎn)移法的開發(fā)。NucleofectorTM技術(shù)是非病毒的基于電穿孔的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，已證明該技術(shù)是轉(zhuǎn)染難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系和原代細(xì)胞(包括MSC)的有效工具(MichelaAluigi，StemCells第24巻，No.2，F(xiàn)ebruary2006，pp.454-461)。基于生物分子的方法(i)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)PTD是不利用胞吞途徑或蛋白質(zhì)通道而被運(yùn)送入細(xì)胞的短肽。它們進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制還不十分清楚，但其即使在低溫下亦可發(fā)生(Derossi等人1996)。兩種最常用的天然存在的PTD是人免疫缺陷病毒轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域的反式激活蛋白(TAT)和觸角足基因(Antenn即edia)轉(zhuǎn)錄因子的同源域。除了此類天然存在的PTD夕卜，存在許多具有自發(fā)穿過細(xì)胞膜的能力的人工肽(Joliot和Prochiantz，2004)。這些肽可共價(jià)連接至PNA(肽核酸)的假肽主鏈以幫助將它們遞送入細(xì)胞。(ii)脂質(zhì)體脂質(zhì)體是與細(xì)胞膜相似的合成媒介物。當(dāng)用水?dāng)噭又|(zhì)分子時(shí)，它們自發(fā)地形成圍繞水性中心的球形雙層膜區(qū)室，從而形成脂質(zhì)體。它們可與細(xì)胞融合并且允許"包裝的"物質(zhì)轉(zhuǎn)移入細(xì)胞。脂質(zhì)體已成功地用于將基因、藥物、報(bào)告蛋白和其他生物分子遞送入細(xì)胞(Felnerova等人，2004)。脂質(zhì)體的有利方面是它們由天然的生物分子(脂質(zhì))制造并且無免疫原性?？稍谛纬善陂g將不同的親水分子整合入其中。例如，當(dāng)將具有帶正電荷的頭部基團(tuán)(headgroup)的脂質(zhì)與重組DNA混合時(shí)，它們可形成其中帶負(fù)電荷的DNA與脂質(zhì)分子的帶正荷的頭部基團(tuán)復(fù)合的脂質(zhì)體復(fù)合物(lipoplexe)。此類復(fù)合物然后可利用胞吞途徑進(jìn)入細(xì)胞并且將DNA遞送入溶酶體區(qū)室。DNA分子可在二油酰乙醇胺(DOPE)的幫助下逃離該區(qū)室并且被運(yùn)送入細(xì)胞核，在細(xì)胞核中它們可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄(Tranchant等人，2004)。盡管它們非常簡單，但脂質(zhì)體遭受低轉(zhuǎn)染效率的詬病，因?yàn)樗鼈円蜓獫{蛋白的吸附而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)快速清除。已使用許多穩(wěn)定脂質(zhì)體的方法，包括用寡糖修飾脂質(zhì)體表面，從而在立體上穩(wěn)定脂質(zhì)體(Xu等人，2002)。(iii)免疫脂質(zhì)體免疫脂質(zhì)體是具有插入它們的膜的特異性抗體的脂質(zhì)體。抗體選擇性結(jié)合靶細(xì)胞上的特定表面分子以促進(jìn)吸收。被抗體靶向的表面分子是優(yōu)選被細(xì)胞內(nèi)化的表面分子，從而在結(jié)合后，整個(gè)復(fù)合物被吸收。該方法通過增強(qiáng)脂質(zhì)體組分的細(xì)胞內(nèi)釋放來增加轉(zhuǎn)染效率?？蓪⒋祟惪贵w插入脂質(zhì)體表面(通過不同的脂質(zhì)錨)或附著在脂質(zhì)體表面上接枝的聚乙二醇末端上。除了提供基因遞送的特異性外，抗體還可為脂質(zhì)體提供在吸收后幫助限制它們被內(nèi)源性RNA酶或蛋白酶降解的防護(hù)層(protectivecovering)(Bendas，2001)。為了進(jìn)一步防止脂質(zhì)體和它們的內(nèi)容物在溶酶體區(qū)室中被降解，可使用pH敏感性免疫脂質(zhì)體(Torchilin，2006)。此類脂質(zhì)體通過與細(xì)胞器內(nèi)的內(nèi)體膜融合來增加脂質(zhì)體內(nèi)容物至細(xì)胞溶膠的釋放，因?yàn)樗鼈冊谒嵝訮H下變得不穩(wěn)定且易于融合。—般來說，非病毒基因遞送系統(tǒng)不如病毒基因遞送系統(tǒng)一樣被廣泛用作將基因遞送入干細(xì)胞的工具。然而，在著眼于成體神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)染成活力、增殖和至3種神經(jīng)譜系神經(jīng)元的分化的研究中顯示了富有希望的結(jié)果。非病毒、非脂質(zhì)體基因遞送系統(tǒng)(ExGen500和FuGene6)具有16%(ExGen500)至11%(FuGene6)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。FuGene6-處理的細(xì)胞在它們的成活力或增殖率上與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不同，然而此類特征在ExGen500轉(zhuǎn)染后顯著減少。重要地，沒有一種試劑在轉(zhuǎn)染后影響分化的模式。兩種試劑都可用于遺傳標(biāo)記細(xì)胞，從而在離體移植入器官型海馬腦切片(organotypichi卯ocampalslice)培養(yǎng)物后追蹤它們至3種神經(jīng)譜系的分化(JGeneMed.2006Jan;8(1):72-81.Efficientnon_viraltransfectionofadultneuralstem/progenitorcells,withoutaffectingviability,proliferationordifferentiation.TinsleyRB，F(xiàn)aijersonJ，ErikssonPS)。(iv)基于聚合物的方法多聚L-賴氨酸(PLL)的質(zhì)子化的e-氨基與帶負(fù)電荷的DNA分子相互作用，從而形成可用于基因遞送的復(fù)合物。此類復(fù)合物相當(dāng)不穩(wěn)定并且顯示聚集的傾向(Kwoh等人，1999)。聚乙二醇(PEG)的綴合經(jīng)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致增加的復(fù)合物的穩(wěn)定性。(Lee等人，2005，Harada-Shiba等人，2002)。為了提供一定程度的組織特異性，還利用了靶向性分子例如組織特異性抗體(Trubetskoy等人，1992，Suh等人，2001)。已用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的另外的基因載體是也與DNA形成復(fù)合物的聚乙烯亞胺(PEI)。由于存在具有不同pKa值的胺，其具有逃脫內(nèi)體區(qū)室的能力(Boussif等人，1995)。發(fā)現(xiàn)接枝至PEI復(fù)合物上的PEG減少了此類復(fù)合物的細(xì)胞毒性和聚集。還可將其與綴合的抗體組合使用以提供組織特異性(Mishra等人，2004，Shi等人，2003，Chiu等人，2004，Merdan等人，2003)。用于藥物的暗示(Implicationsformedicine)干細(xì)胞不僅具有分化成不同組織的能力，而且由于它們固有的歸巢至受損組織的能力，它們具有將治療性基因的表達(dá)遞送至特定組織環(huán)境的潛能。通過使用分子工程方法，干細(xì)胞可用作在缺陷或需要的區(qū)域中選擇性表達(dá)基因，從而只在需要其的地方釋放轉(zhuǎn)染的治療性產(chǎn)物的媒介物。其中經(jīng)遺傳工程改造的干細(xì)胞在將來可能起重要作用的疾病是其中蛋白質(zhì)或整個(gè)酶丟失或無功能或其中某些因子在特定的組織中提供改善的功能的疾病。對于許多疾病包括癌癥、神經(jīng)變性障礙例如帕金森病或阿爾茨海默病，缺血性心臟病和肌營養(yǎng)不良的治療，已進(jìn)行了一系列在治療背景中使用干細(xì)胞的研究。藥物抗性基因至造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移顯示，其有希望用于治療許多遺傳疾病。此類遺傳疾病包括X-連鎖嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷、腺苷脫氨酶缺陷、地中海貧血。聯(lián)合的干細(xì)胞和基因療法有可能進(jìn)行定制以用于獲得性障礙例如乳腺癌、淋巴瘤、腦瘤和睪丸癌的治療。在這點(diǎn)上，已開始了使用聯(lián)合療法治療癌癥的研究。這些研究的范圍從提高移植的造血干細(xì)胞的藥物抗性至使用經(jīng)遺傳修飾的干細(xì)胞靶向癌癥。將藥物抗性基因轉(zhuǎn)移入造血干細(xì)胞以提供抗化學(xué)治療誘導(dǎo)的骨髓抑制的骨髓保護(hù)作用(myeloprotection)或選擇用矯治遺傳性障礙的另一種基因共同轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血干細(xì)胞。(CancerGeneTher.，2005Nov;12(11):849-63.Hematopoieticstemcellgenetherapywithdrugresistancegenes:anupdate.Budak—AlpdoganT，BanerjeeD，BertinoJR)。使用干細(xì)胞靶向癌癥的實(shí)例包括通過使用經(jīng)遺傳工程改造的神經(jīng)干細(xì)胞治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤，和使用攜帶核糖核酸酶抑制劑基因的造血干細(xì)胞靶向黑色素瘤的血管系統(tǒng)來增強(qiáng)旁觀者效應(yīng)介導(dǎo)的基因療法。用于癌癥的另外的方法利用干細(xì)胞被募集至腫瘤血管系統(tǒng)并且分化成內(nèi)皮樣細(xì)胞的能力。取決于腫瘤類型，腫瘤中大約30%的新血管內(nèi)皮細(xì)胞可來源于骨髓祖細(xì)胞(Hammerling和Ganss，2006)。因此，從外周循環(huán)募集的經(jīng)遺傳修飾的祖細(xì)胞的使用可代表用于腫瘤的基因治療的潛在媒介物(Reyes等人，2002)。已將單純皰疹病毒1(HSV)胸苷激酶(tk)自殺基因和更昔洛韋@(GCV)—起成功地用于各種實(shí)體瘤的體內(nèi)治療(Dancer等人，2003;Pasahen等人，2003)。內(nèi)皮細(xì)胞在新血管形成過程中對HSV-tk的選擇性表達(dá)與GCV的tk修飾一起產(chǎn)生了增殖細(xì)胞的致死環(huán)境。已鑒定了一系列啟動子，所述啟動子在新血管形成過程中被誘導(dǎo)，從而使得在經(jīng)工程改造的前體細(xì)胞被募集和分化后能夠選擇性激活自殺基因。"旁觀者效應(yīng)"被描述為細(xì)胞介導(dǎo)對遠(yuǎn)距離細(xì)胞的細(xì)胞損傷的能力。在Li等人進(jìn)行的最近的研究中，檢查到用HSV-tk基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCtk)對大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的旁觀者效應(yīng)。無胸腺裸小鼠或Sprague-Dawley大鼠中的顱內(nèi)共植入實(shí)驗(yàn)顯示，用NSCtk和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞共植入，然后用更昔洛韋@(GCV)治療的動物顯示無顱內(nèi)腫瘤并且存活100天以上，而用生理鹽水(PS)治療的動物死于腫瘤進(jìn)展。(CancerGeneTher.，2005Juls12(7):600_7.Bystandereffect_mediatedgenether鄰yofgliomasusinggeneticallyengineeredneuralstemcells.LiS，TokuyamaT，YamamotoJ，KoideM，YokotaN，NambaH)。人核糖核酸酶抑制劑(hRI)可抑制胰腺RNA酶(RNA酶A)的活性，已表明RI可用作潛在的抗血管生成劑。Fu等人檢查了將RI基因轉(zhuǎn)染入鼠類造血細(xì)胞，然后誘導(dǎo)表達(dá)以阻斷實(shí)體瘤中的血管生成的可行性。將人胎盤的RI克隆和插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX。26然后用pLNCX-RI逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染鼠骨髓造血細(xì)胞。然后將感染的細(xì)胞注射入經(jīng)致死性輻射處理的小鼠。在施用攜帶RI基因的造血細(xì)胞后，將B16黑色素瘤植入小鼠并讓腫瘤生長21天。對照組的腫瘤變得很大并且形成豐富的血管。相反地，用攜帶RI基因的造血細(xì)胞處理的小鼠的腫瘤較小并且具有密度相對低的血管。(CancerGeneTher.2005Mar:12(3):268-75.Anti-t咖orefrectofhematopoieticcellscarryingthegeneofribo皿cleaseinhibitor.FuP，ChenJ，TianY，WatkinsT，CuiX，ZhaoB.)聚焦在帕金森病上的許多研究利用細(xì)胞移植或基因療法(GeneTher.，2003S??；10(20):1721-7.Genetherapyprogressandprospects:Parkinson'sdisease.BurtonEA，GloriosoJC，F(xiàn)inkDJ)。然而，迄今為止，少數(shù)研究組合這兩種方法。Liu等人使用骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞來遞送治療性基因至大腦。作者使用腺伴隨病毒(AAV)載體來遞送酪氨酸羥化酶(TH)基因至骨髓基質(zhì)細(xì)胞。然后將表達(dá)TH基因的MSC移植入帕金森病大鼠的紋狀體(striatum)。發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)效率為大約75%。在經(jīng)TH工程改造的骨髓基質(zhì)細(xì)胞植入后檢測到患病大鼠的功能性改善。組織學(xué)檢查顯示，TH基因在移植點(diǎn)周圍表達(dá)，并且大鼠的受損紋狀體中多巴胺水平比對照中高。觀察到動物的功能性改善(BrainResBrainResProtoc.，2005May;15(1):46-51.Epub2005，Apr22.TherapeuticbenefitofTH_engineeredmesenchymalstemcellsforParkinson'sdisease丄uL，ZhaoC丄iuY，SunX，DuanC，JiM，ZhaoH，XuQ，YangH.)。缺血性心血管疾病是經(jīng)工程改造的干細(xì)胞治療的另外的靶。Chen等人使用從人臍帶血獲得的純化的CD34(+)細(xì)胞，然后使用AAV載體用人血管生成素-l(Angl)和VEGF(165)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將經(jīng)工程改造的細(xì)胞和VEGF—起在左前游離壁進(jìn)行心肌內(nèi)注射，這導(dǎo)致治療后減少的梗塞面積和顯著增加的毛細(xì)血管密度，以及在心肌梗塞后4周使用超聲心動圖測得的改善的長期心功能。(EurJClinInvest.，2005Nov;35(11):677_86.Combinedcordbloodstemcellsandgenether即yenhancesangiogenesisandimprovescardiacperformanceinmouseafteracutemyocardialinfarction.ChenHK，HungHF，ShyuKG，WangBW，SheuJR，LiangYJ，ChangCC，KuanP.)肌營養(yǎng)不良代表了特征在于進(jìn)行性肌肉萎縮的神經(jīng)肌肉障礙的異質(zhì)群體。迄今為止，對于此類患者沒有適當(dāng)?shù)闹委煼桨?。已就其矯治營養(yǎng)不良表型的能力對包括MSC在內(nèi)的成體干細(xì)胞群體以及胚胎干細(xì)胞進(jìn)行了評估。迄今為止，所述方法未顯現(xiàn)多大希望。解釋失敗的理由例證了當(dāng)使用經(jīng)遺傳修飾的干細(xì)胞時(shí)研究者遭遇的困難負(fù)責(zé)干細(xì)胞的生肌潛能的背后機(jī)制仍然未完全闡明，供體群體至肌肉的歸巢通常不足，以及受者中未被充分理解的免疫應(yīng)答可導(dǎo)致有限的治療成功(Stemcellbasedtherapiestotreatmusculardystrophies.Price，Kuroda，Rudnicki)。用于治療杜興肌營養(yǎng)不良(DMD)的一個(gè)方法利用已用治療性表達(dá)盒轉(zhuǎn)導(dǎo)的生肌干細(xì)胞(myogenicstemcell)的自體細(xì)胞移植。該方法的發(fā)展受到一系列問題的阻礙，包括低頻率的細(xì)胞植入、跟蹤移植的細(xì)胞的困難、攜帶標(biāo)記基因的自體細(xì)胞的快速丟失以及將肌養(yǎng)蛋白基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)移入生肌干細(xì)胞中的困難。通過用eGFP編碼序列替代肌養(yǎng)蛋白C末端結(jié)構(gòu)域(DeltaCT)和除去大部分肌養(yǎng)蛋白中心柱結(jié)構(gòu)域(DeltaH2-R19)來對miniDys-GFP融合基因進(jìn)行工程改造。在表達(dá)處于骨骼肌特異性啟動子控制之下的miniDys-GFP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因mdx(4Cv)小鼠中，綠色融合蛋白定位在肌纖維膜上，其在該處裝配肌養(yǎng)蛋白-糖蛋白復(fù)合物并且阻止?fàn)I養(yǎng)不良在轉(zhuǎn)基因mdx(4Cv)小鼠肌肉中發(fā)生。(HumMolGenet.，2006Mayl5;15(10):1610-22.Epub2006Apr4.Ahighlyfunctionalmini_dystrophin/GFPfusiongeneforcellandgenetherapystudiesofDuche皿emusculardystrophy丄iS，KimuraE，NgR，F(xiàn)allBM，MeuseL，ReyesM，F(xiàn)aulknerJA，ChamberlainJS.)維-奧二氏綜合征(Wiskott-Aldrich-Syndrome)特征在于血小板減少、失調(diào)和在生命更晚期朝向淋巴瘤發(fā)展的傾向，其代表了經(jīng)工程改造的干細(xì)胞治療的潛在靶(Dupre等人，2006)。范可尼貧血被認(rèn)為是"干細(xì)胞疾病"并且已成為有關(guān)使用基因療法的治療的深入研究的主題。該疾病代表了詳盡表征的造血干細(xì)胞的先天性缺陷。其是以骨髓衰竭和發(fā)育異常、高發(fā)病率的脊髓發(fā)育不良(myelodysplasia)、急性非淋巴細(xì)胞性白血病和實(shí)體瘤為特征的罕見遺傳性疾病。范可尼貧血的遺傳學(xué)基礎(chǔ)在于任何一個(gè)已知的范可尼貧血基因中的選擇性突變，這使該疾病成為基因療法的候選物。但該疾病非常復(fù)雜，因?yàn)橐衙枋隽酥辽?2個(gè)遺傳亞型(FA-A，-B，-C，-Dl，-D2，_E，_F，_G，-1，-J，_L，_M)，并且除了FA-I以外所有亞型都與獨(dú)特的基因相關(guān)聯(lián)。大多數(shù)FA蛋白形成通過單泛素化激活FANCD2蛋白的復(fù)合物，而FANCJ和FANCD1/BRCA2在該步驟下游起作用。除了FANCJ/BRIP1和FANCM(其為DNA解旋酶)以及FANCL(其可能為E3泛素綴合酶)夕卜，F(xiàn)A蛋白通常缺乏功能性結(jié)構(gòu)域。基于對交聯(lián)劑的超敏感性，F(xiàn)A蛋白據(jù)認(rèn)為在阻止DNA復(fù)制叉前進(jìn)的DNA鏈內(nèi)交聯(lián)的修復(fù)中起作用。(CellOncol.2006:28(1-2):3-29.TheFanconianemiapathwayofgenomicmaintenance.LevitusM，.ToenieH，deWinterJP.)作為基因治療的潛在候選對象的另外的遺傳性干細(xì)胞缺陷包括無巨核細(xì)胞性血小板減少癥(amegakaryocyticthrombocytopenia)、先天性角化不良(dyskeratosiscongenity)和舒-戴二氏綜合征(Shwachman-Diamondsyndrome)。地中海貧血和鐮狀細(xì)胞病(SickleCelldisease)屬于遺傳性溶血性貧血群體，其代表了世界上最常見的遺傳性疾病，從而是干細(xì)胞基因治療的重要候選對象(PersonsandTisdale，2004)。在臨床情況下使用經(jīng)遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的良好實(shí)例是對系帶骨病(bridledbonedisease)成骨不全中的遺傳突變的矯治。成骨不全因編碼I型膠原的基因C0LIA1或C0LIA2中的突變而引起骨質(zhì)脆弱。Chamberlain等人從成骨不全患者的骨中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)并且鑒定了C0LIA1基因中的點(diǎn)突變(Chamberlain等人，2004)。已用腺伴隨病毒成功地感染了MSC以靶向并且使突變的C0LIA1基因失活。然后將經(jīng)矯治的MSC移植入免疫缺陷型小鼠，受損細(xì)胞顯示提高的穩(wěn)定性和膠原加工。實(shí)施例實(shí)施例1從患者或供體的骨髓和其他來源分離多能成體干細(xì)胞，利用體外貼壁生長來測定細(xì)胞活性和生物學(xué)功能。在該體外階段，貼壁生長的細(xì)胞不表達(dá)"干細(xì)胞標(biāo)記"CD34，從而在體外培養(yǎng)期間被認(rèn)為是0034_陰性的。在該階段，利用病毒或非病毒技術(shù)瞬時(shí)或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染0034_陰性、貼壁生長的干細(xì)胞，并在體內(nèi)應(yīng)用之前進(jìn)行體外選擇性擴(kuò)增。為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因CD34-陰性祖細(xì)胞，將2個(gè)啟動子用于治療性基因的選擇和器官/靶特異性可誘導(dǎo)性?；谄滢D(zhuǎn)染和整合(如果期望的話)(與粘附選擇性組合)來選擇基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。如本實(shí)施例，tie2-啟動子增強(qiáng)子驅(qū)動只在內(nèi)皮分化(其在腫瘤新血管生成期間發(fā)生)的背景中表達(dá)的HSV-TK基因。當(dāng)循環(huán)內(nèi)源性干細(xì)胞以及全身性施用的干細(xì)胞被生理性募集至腫瘤生長部位參與腫瘤新血管生成(無論其是原發(fā)性腫瘤部位還是轉(zhuǎn)移灶部位)時(shí)，干細(xì)胞分化成腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞。在該器官特異性分化過程中，干細(xì)胞表達(dá)通過血管生成相關(guān)tie2激活來驅(qū)動的HSV-TK基因?，F(xiàn)在可對患者施用前體藥物更昔洛韋@,該前體藥物在腫瘤血管生成部位被HSV-TK轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性物質(zhì)。該方法在乳腺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌、胰腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床前模型中顯示是成功的。預(yù)期該方法可應(yīng)用于依賴于腫瘤新血管生成的任何(惡性)瘤。該方法的目的是破壞腫瘤血管生成。實(shí)施例2如實(shí)施例1中一樣，但本實(shí)施例不表達(dá)HSV-TK，而是表達(dá)凝血物質(zhì)(clottingsubstance)作為細(xì)胞毒性蛋白。實(shí)施例3血管生成也是組織改建和傷口愈合的關(guān)鍵生物學(xué)過程。其不僅用于皮膚或粘膜的的損傷而且還用于其他組織，如胰腺中產(chǎn)生胰島素的P細(xì)胞的缺乏(其導(dǎo)致胰島素依賴型糖尿病(IDDM))。轉(zhuǎn)基因CD34-陰性祖細(xì)胞的全身性施用還可在胰腺中誘導(dǎo)靜息的胰島祖細(xì)胞的活化，從而補(bǔ)充內(nèi)分泌胰腺，矯治ID匿患者的高血糖狀態(tài)。tie-2增強(qiáng)子啟動子激活血管活性物質(zhì)如VEGF的基因，從而促進(jìn)組織改建和傷口愈合。實(shí)施例4如實(shí)施例3中一樣，但如果內(nèi)源性再生不再充足，則與同種異體胰島細(xì)胞的移植妙A(yù)￡口口。實(shí)施例5如實(shí)施例1中一樣，但轉(zhuǎn)基因細(xì)胞具有增強(qiáng)的至腫瘤生長、組織改建或傷口愈合的部位的歸巢能力(利用趨化因子生物學(xué))。使用GPI-粘蛋白-趨化因子對CD34-陰性、貼壁生長的干細(xì)胞進(jìn)行工程改造。此類試劑將使得能夠選擇性表達(dá)與獲自CX3CL1或CXC16的融合至GPI錨的粘蛋白-結(jié)構(gòu)域連接的特定趨化因子。此類趨化因子-粘蛋白試劑的表達(dá)將募集表達(dá)趨化因子受體的互補(bǔ)白細(xì)胞。例如，在腫瘤治療背景中處于tie2啟動子增強(qiáng)子控制之下的CXCL10-粘蛋白-GPI的表達(dá)將促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞募集至腫瘤環(huán)境。該試劑將用作腫瘤免疫療法的佐劑。相同的方法還可用于組織改建以促進(jìn)選擇的白細(xì)胞群體的平行募集。實(shí)施例6如實(shí)施例1中一樣，但經(jīng)遺傳工程改造的CD34-陰性干細(xì)胞在同種異體骨髓/干細(xì)胞移植后可在例如自身免疫性障礙如慢性炎性腸病或移植物抗宿主病中調(diào)節(jié)炎性環(huán)境。這可通過抗炎物質(zhì)如白細(xì)胞介素(IL-10)的位點(diǎn)特異性表達(dá)來促進(jìn)。實(shí)施例7如實(shí)施例1中一樣，但使用普通病毒抗原(例如其在腫瘤生長的部位誘導(dǎo)內(nèi)部加強(qiáng)免疫，例如麻疹或禽痘)的位點(diǎn)特異性表達(dá)。實(shí)施例8如在實(shí)施例1中一樣，但治療性基因的激活被早期發(fā)育階段的基因(例如Noggin)抑制，其最終在腫瘤或組織改建/再生部位的成熟組織中在轉(zhuǎn)基因祖細(xì)胞的分化過程中被下調(diào)。第II部分雄柳嫌鍵腫瘤血管發(fā)生代表了癌癥治療劑的選擇性遞送的很有前景的耙。開發(fā)骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞以將外源基因選擇性靶向腫瘤血管生成環(huán)境。此類實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，外源加入的MSC歸巢至它們在其中經(jīng)歷分化的腫瘤?；蚶鏡FP報(bào)告基因以及自殺基因HSV-tk在Tie2啟動子/增強(qiáng)子的控制之下在分化期間選擇性表達(dá)。前體藥物更昔洛韋⑧與tk表達(dá)的協(xié)同施用有效地靶向腫瘤并且導(dǎo)致對腫瘤生長的抑制。麵國扁,Dr.ChristophKlein使用之前建立的鼠乳腺癌模型研究經(jīng)工程改造的MSC在腫瘤血管生成中的用途。該模型可廣泛用于人乳腺癌。在該模型中，將攜帶處于匪TV啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下的激活的大鼠c-neu癌基因的轉(zhuǎn)基因小鼠與BALB/c小鼠回交，目的是產(chǎn)生用于癌癥治療的可廣泛應(yīng)用的模型。表達(dá)非轉(zhuǎn)化大鼠原癌基因的雌性HER-2/neu(neu-N)轉(zhuǎn)基因小鼠在5至6月齡時(shí)開始產(chǎn)生自發(fā)性局灶性乳腺癌(spontaneousfocalmammaryadeno-carcinomas)。此類腫瘤的發(fā)生和組織學(xué)與在乳腺癌患者中觀察到的相似。在腫瘤血管生成的背景中處于內(nèi)皮特異性啟動子控制之下的RFP和GFP基因在imMSC中的表達(dá)為了評估在腫瘤血管生成的背景中對組織特異性表達(dá)的基因在imMSC中的表達(dá)的控制，以及通過顯微鏡追蹤imMSC在更長時(shí)期內(nèi)的分布，已將紅色和綠色熒光蛋白(RFP，GFP)基因克隆入經(jīng)修飾的表達(dá)載體以進(jìn)行體內(nèi)檢測。小鼠已知表達(dá)非轉(zhuǎn)化大鼠原癌基因的雌性HER-2/neu(neu-N)轉(zhuǎn)基因小鼠在5至6月齡時(shí)發(fā)生自發(fā)性局灶性乳腺癌。按照AgreementtotheEuropeanUnionGuidelines維持BALB-neuT轉(zhuǎn)基因小鼠。篩選半合子(neuT+/neuT-)小鼠。每周檢查Balb-neuT雌性小鼠的乳腺2次，并且測量出現(xiàn)的腫瘤。在手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤后，將經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞注射入乳腺癌模型小鼠。當(dāng)殘余的腫瘤長大時(shí)，外源加入的imMSC提供用于新血管形成的前體細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)Tie-2-RFP(內(nèi)皮特異性啟動子驅(qū)動紅色熒光蛋白)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的imMSC易于歸巢至腫瘤，分化成內(nèi)皮細(xì)胞，并且表達(dá)RFP報(bào)告基因(圖5)。在此類實(shí)驗(yàn)中，評估間充質(zhì)細(xì)胞至Balb-neuT小鼠的原發(fā)性乳房腫瘤內(nèi)的整合。在應(yīng)用3次RFP轉(zhuǎn)染后，可在所有切片的血管樣區(qū)域中檢測到表達(dá)RFP的細(xì)胞。該結(jié)果顯示，細(xì)胞歸巢至新血管形成的部位并且通過活化的Tie2啟動子/增強(qiáng)子表達(dá)標(biāo)記基因。通過靶向內(nèi)皮中的自殺基因來抑制腫瘤生長然后改變實(shí)驗(yàn)方案以評估自殺基因HSV-tk的作用。與前體藥物更昔洛韋@(GCV)組合的tk基因產(chǎn)物產(chǎn)生了影響復(fù)制性細(xì)胞的有效毒素。用攜帶由血管內(nèi)皮Tie2啟動子/增強(qiáng)子驅(qū)動的單純皰疹病毒-胸苷激酶(tk)基因的質(zhì)粒穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染ImMSC。為此目的，再次使用乳腺癌血管生成的鼠模型來在抗血管生成治療中評估經(jīng)工程改造的MSC。方法I.在18或22周齡時(shí)在腫瘤生長指數(shù)期進(jìn)行的經(jīng)工程改造的MSC的注射和更昔洛韋簡治療Balb-neuTtrsg的治療在第0天(第22周)開始用0.2ml細(xì)胞(500，000個(gè)細(xì)胞)和0.2mlPBS(作為對照)注射小鼠。在第5至8天，以30g/gBW的日劑量(例如對于21gBW的小鼠使用100iU)施用更昔洛韋③。在第9天后，重復(fù)小鼠的治療循環(huán)直至解剖。在治療期間，記錄腫瘤進(jìn)展、體重(在各治療循環(huán)的第0和6天進(jìn)行測量)和行為。為了獲得關(guān)于用Tie2-Tk-as-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和GCV進(jìn)行治療的效果的總體印象(分別與兩個(gè)對照組相比較)，在治療過程中記錄宏觀(macroscopic)體重值直至解剖。測量時(shí)間點(diǎn)是各治療循環(huán)的第0天和第5天以及解剖當(dāng)天。實(shí)驗(yàn)包括1個(gè)治療組和2個(gè)對照組小鼠，并且始于2個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，18周齡和22周齡。表2.解剖后治療組的數(shù)據(jù)，包括體重、絕對和相對腫瘤負(fù)荷。方法II.在手術(shù)切除后在腫瘤再牛的背景中對治療的評估在手術(shù)切除腫瘤后的患者中，在手術(shù)中遺漏的殘余腫瘤通常會生長，從而導(dǎo)致癌癥的復(fù)發(fā)。為了檢測經(jīng)工程改造的MSC/tk療法在該背景中的功效，在18周齡時(shí)切除Balb/cneu-N轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺組織，從而導(dǎo)致原發(fā)性腫瘤的延遲發(fā)作。在手術(shù)后，用如上所述的MSC-tk和GCV方案治療小鼠。治療導(dǎo)致腫瘤生長在被治療的小鼠中的顯著減小(圖8)。胰腺腫瘤模型然后在C57B1/6小鼠中建立原位胰腺癌模型以評估基于MSC的療法在不同腫瘤系統(tǒng)中的功效。所述系統(tǒng)之前由ChristianeB進(jìn)s禾口ClaudiusCo腦d建立(SurgeryD印artment，LMU)。在該模型中，將與C57B1/6小鼠同基因型的Panc02胰腺癌細(xì)胞被膜下(subc即sularly)注射入正好位于脾臟下方的胰腺區(qū)域以建立原發(fā)性胰腺腫瘤。將具有處于CMV啟動子控制之下的GFP以及處于Tie2啟動子/增強(qiáng)子的控制之下的RFP和tk的構(gòu)建體導(dǎo)入從C57B1/6小鼠分離的MSC。通過i.v.注射全身性施用轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，將經(jīng)工程改造以組成型表達(dá)GFP(處于CMV啟動子的控制之下)的MSC注射入具有正在生長的腫瘤的小鼠中。發(fā)現(xiàn)所述細(xì)胞有效地歸巢至腫瘤(圖9)。在平行實(shí)驗(yàn)中，用經(jīng)Tie2-RFP工程改造的MSC注射具有正在生長的腫瘤的小鼠。5天后，殺死動物，就RFP的表達(dá)檢查腫瘤。結(jié)果顯示，RFP在腫瘤背景中強(qiáng)烈上調(diào)(圖9)。在其他器官(脾、淋巴結(jié)和胸腺)中未檢測到RFP。參考文獻(xiàn)Aiuti，A，Slavin，S，Aker，M，F(xiàn)icara，F(xiàn)，Deola，S，Mortellaro，A，Morecki，S，Andolfi，G，Tabucchi，A，Carlucci，F(xiàn)，Marinello，E，Cattaneo，F(xiàn)，Vai，S，Servida，P，Miniero，R，Roncarolo，MG，Bordignon，C(2002)CorrectionofADA-SCIDbystemcellgenetherapycombinedwithnonmyeloablativeconditioning.Science296:2410—2413.Aluigi，MG，Angelini，C，F(xiàn)alugi，C，F(xiàn)ossa，R，Genever，P，Gallus，L，Layer,PG，Prestipino，G，Rakonczay，Z，Sgro，M，Thielecke，H，Trombino，S(2005)Interactionbetweenorganophosphatecompoundsandcholinergicf皿ctionsduringdevelopment.ChemBiolInteract157—158:305—316.Armentano，D，Sookdeo，CC，Hehir，KM，Gregory,RJ，StGeorge，JA，Prince,GA，Wadsworth，SC，Smith,AE(1995)CharacterizationofanadenovirusgenetransfervectorcontaininganE4deletion.HumGeneTher6:1343-1353.31Atchison,RW，Casto，BC，Hammon，麗(1965)Adenovirus-AssociatedDefectiveVirusParticles.Science149:754_756.Atchison,RW，Casto，BC，Hammon，WM(1966)Electronmicroscopyofadenovirus-associatedvirus(AAV)incellcultures.Virology29:353-357.Baekelandt,V，DeStrooper，B，Nuttin，B，Debyser，Z(2000)Genetherapeuticstrategiesforneurodegenerativediseases.CurrOpinMolTher2:540_554.Barese，CN，Goebel，WS，Dinauer，MC(2004)Genetherapyforchronicgra皿lcmatousdisease.ExpertOpinBiolTher4:1423_1434.Becerra，SP，Koczot，F(xiàn)，F(xiàn)abisch，P，Rose,JA(1988)Synthesisofadeno—associatedvirusstructuralproteinsrequiresbothalternativemRNAsplicingandalternativeinitiationsfromasingletranscript.JVirol62:2745-2754.Eondas，G(2001)Immunoliposomes:apromisingapproachtotargetingcancertherapy.BioDrugs15:215_224.Benihoud，K，Yeh，P，Perrlcaudet，M(1999)Adenovirusvectorsforgonedelivery.Curr0pinBiotechnol10:440_447.Bett，AJ，Haddara，W，Prevec，L，Graham,FL(1994)Anefficientandflexihlesystemforconstructionofadenovlrusvectorswithinsertionsordeletionsinearlyregions1and3.ProcNatlAcadSciUSA91:8802-8806.Beyer，WR，Westphal，M，0stertag，W，vonLaer，D(2002)Oncoretrovirusandlentivirusvectorspsoudotypedwithlymphocyticchoriomeningitisvirusglycoprotein-generation,concentration,andbroadhostranga.JViro176:1488-1495.Bradfute，SB，Goodell，MA(2003)Adenoviraltransductionofmousehematopoieticstemcells.MolTher7:334—340.Buning，H，Nicklin，SA，Perabo，L，Hallek，M，Baker，AH(2003)AAV_basedgenetrahsfer.CurrOpinMolTher5:367_375.Cao，H，Koehler，DR，Hu，J(2004)Adenoviralvectorsforgenereplacementtherapy.ViralImmunol17:327—333.Cavazzana—Calvo，M，Hacein—Bey，S，deSaintBasile，G，Gross,F，Yvon，E，Nusbaum，P，Selz，F(xiàn)，Hue,C，Certain,S，Casanova,幾，Bousso，P，Deist，F(xiàn)L，F(xiàn)ischer,A(2000)Genetherapyofhumanseverecombinedimmunodeficiency(SCID)_X1disease.Science288:669-672.Chamberlain,JR，Schwarze，U，Wang，PR，Hirata，RK，Hankenson，KD，Pace,JM，Underwood,RA，Song，KM，Sussman，M，Byers，PH，Russell，DW(2004)Genetargetinginstemcellsfromindividualswithosteogenesisimperfecta.Science303:1198—1201.Cochrane,AW，Chen，CH，Rosen，CA(1990)SpecificinteractionofthehumanimmunodeficiencyvirusRevproteinwithastructuredregionintheenvmRNA.ProcNatlAcadSciUSA87:1198-1202.Dancer,A，Julien，S，Bouillot，S，Pointu，H，Ve潔t，M，Huber，P(2003)Expressionofthymidinekinasedrivenbyanendothelial—specificpromoterinhibitstumorgrowthofLewislungcarcinomacellsintransgenicmice.GeneTherlO:1170-1178.Danthi皿e，X，Imperiale，MJ(2000)Productionoffirstgenerationadenovirusvectors:areview.GeneTher7:1707—1714.Danthinne，X，Werth，E(2000)Newtoolsf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未被遺傳修飾，和(b)在導(dǎo)入所述CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述受試者是人。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述受試者患有杜興肌營養(yǎng)不良或貝克肌營養(yǎng)不良。21.權(quán)利要求19的方法，其中所述CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是同種異體的。22.權(quán)利要求19的方法，其中所述治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞是大約lx103至大約lx107個(gè)細(xì)胞/kg體重。23.用于改善將要經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷手術(shù)的受試者的微循環(huán)和/或急性傷口愈合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞，其中(a)在即將經(jīng)歷手術(shù)之前、手術(shù)期間和/或手術(shù)后立即向所述受試者的血流中導(dǎo)入所述CD34—干細(xì)胞，(b)所述CD34—干細(xì)胞未被遺傳修飾，和(c)在導(dǎo)入所述CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述受試者是人。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述手術(shù)是腹部手術(shù)、胸部手術(shù)、神經(jīng)外科手術(shù)或整形手術(shù)。26.權(quán)利要求24的方法，其中所述手術(shù)是腹腔鏡手術(shù)。27.權(quán)利要求24的方法，其中所述手術(shù)是開放手術(shù)。28.權(quán)利要求24的方法，其中所述CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是同種異體的。29.權(quán)利要求24的方法，其中所述CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是自體的。30.權(quán)利要求24的方法，其中所述治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞是大約lx103至大約lx107個(gè)細(xì)胞/kg體重。31.用于改善將要經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷身體創(chuàng)傷的受試者的微循環(huán)和/或急性傷口愈合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞，其中(a)在即將經(jīng)歷身體創(chuàng)傷之前、身體創(chuàng)傷期間和/或身體創(chuàng)傷后立即向所述受試者的血流中導(dǎo)入所述CD34—干細(xì)胞，(b)所述CD34—干細(xì)胞未被遺傳修飾，和(c)在導(dǎo)入所述CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述受試者是人。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述身體創(chuàng)傷是分娩。34.權(quán)利要求32的方法，其中所述身體創(chuàng)傷是由劇烈動作引起的皮肉傷，并且在身體創(chuàng)傷后立即向所述受試者的血流中導(dǎo)入所述CD34—干細(xì)胞。35.權(quán)利要求32的方法，其中所述身體創(chuàng)傷是燒傷，并且在身體創(chuàng)傷后立即向所述受試者的血流中導(dǎo)入所述CD34—干細(xì)胞。36.權(quán)利要求32的方法，其中所述CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是同種異體的。37.權(quán)利要求32的方法，其中所述CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是自體的。38.權(quán)利要求32的方法，其中所述治療有效數(shù)量的CD34—干細(xì)胞是大約lx103至大約lx107個(gè)細(xì)胞/kg體重。39.用于治療患有腫瘤的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼細(xì)胞毒性蛋白的區(qū)域，所述區(qū)域與(ii)啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，由此當(dāng)所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞鄰近正在經(jīng)歷血管生成的腫瘤組織和在其鄰近分化時(shí)，選擇性表達(dá)所述細(xì)胞毒性蛋白，和(b)在導(dǎo)入所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述受試者是人。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述腫瘤選自前列腺腫瘤、胰腺腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、乳腺腫瘤、黑色素瘤、基底細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、睪丸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或惡性星形細(xì)胞腫瘤例如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸直腸腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、卵巢腫瘤、宮頸腫瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤/平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、尤文氏肉瘤/PNET和惡性淋巴瘤。42.權(quán)利要求40的方法，其中所述啟動子/增強(qiáng)子組合是Tie2啟動子/增強(qiáng)子，所述細(xì)胞毒性蛋白是單純皰疹病毒胸苷激酶，并且以允許所述單純皰疹病毒胸苷激酶產(chǎn)生更昔洛韋@細(xì)胞毒性的方式用更昔洛韋@治療所述受試者。43.權(quán)利要求40的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是同種異體的。44.權(quán)利要求40的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是自體的。45.權(quán)利要求40的方法，其中所述治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞是大約lx103至大約lx107個(gè)細(xì)胞/kg體重。46.用于治療患胃腸障礙的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，(b)在導(dǎo)入所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除，和(c)所述胃腸障礙以胃腸內(nèi)皮中需要細(xì)胞增殖為特征。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述受試者是人。48.權(quán)利要求47的方法，其中所述胃腸障礙是結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸障礙或克羅恩病。49.權(quán)利要求47的方法，其中所述啟動子/增強(qiáng)子組合是Tie2啟動子/增強(qiáng)子，并且增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。50.權(quán)利要求47的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是同種異體的。51.權(quán)利要求47的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是自體的。52.權(quán)利要求47的方法，其中所述治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞是大約lx103至大約lx107個(gè)細(xì)胞/kg體重。53.用于治療糖尿病受試者或前驅(qū)糖尿病受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，和(b)在導(dǎo)入所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述受試者是人。55.權(quán)利要求54的方法，其中所述受試者是前驅(qū)糖尿病受試者。56.權(quán)利要求55的方法，其中所述前驅(qū)糖尿病受試者是I型糖尿病的前驅(qū)糖尿病受試者。57.權(quán)利要求55的方法，其中所述前驅(qū)糖尿病受試者是II型糖尿病的前驅(qū)糖尿病受試者。58.權(quán)利要求54的方法，其中所述受試者是糖尿病受試者。59.權(quán)利要求58的方法，其中所述糖尿病受試者患有I型糖尿病。60.權(quán)利要求58的方法，其中所述糖尿病受試者患有II型糖尿病。61.權(quán)利要求54的方法，其中所述啟動子/增強(qiáng)子組合是Tie2啟動子/增強(qiáng)子，并且增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)是與血管生成相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。62.權(quán)利要求54的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是同種異體的。63.權(quán)利要求54的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是自體的。64.權(quán)利要求54的方法，其中所述治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞是大約lx103至大約lx107個(gè)細(xì)胞/kg體重。65.用于治療患有肌營養(yǎng)不良的受試者的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼在受試者的肌肉細(xì)胞中不存在的或表達(dá)不足的或其在受試者的肌肉細(xì)胞中過表達(dá)是期望的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)肌肉特異性啟動子或肌肉特異性啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，和(b)在導(dǎo)入所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。66.權(quán)利要求65的方法，其中所述受試者是人。67.權(quán)利要求66的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是同種異體的。68.權(quán)利要求66的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是自體的。69.權(quán)利要求66的方法，其中所述受試者患有杜興肌營養(yǎng)不良或貝克肌營養(yǎng)不良。70.權(quán)利要求69的方法，其中所述肌肉特異性啟動子/增強(qiáng)子組合是MyoD啟動子/增強(qiáng)子，并且在所述受試者的肌肉細(xì)胞中不存在的蛋白質(zhì)是肌養(yǎng)蛋白。71.權(quán)利要求70的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是同種異體的。72.權(quán)利要求70的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是自體的。73.權(quán)利要求66的方法，其中所述治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞是大約lx103至大約lx107個(gè)細(xì)胞/kg體重。74.用于改善將要經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷手術(shù)的受試者的微循環(huán)和/或急性傷口愈合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，和(b)在導(dǎo)入所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。75.權(quán)利要求74的方法，其中所述受試者是人。76.權(quán)利要求75的方法，其中所述手術(shù)是腹部手術(shù)、胸部手術(shù)、神經(jīng)外科手術(shù)或整形手術(shù)。77.權(quán)利要求75的方法，其中所述手術(shù)是腹腔鏡手術(shù)。78.權(quán)利要求75的方法，其中所述手術(shù)是開放手術(shù)。79.權(quán)利要求75的方法，其中所述啟動子/增強(qiáng)子組合是Tie2啟動子/增強(qiáng)子，并且增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)是與血管生成相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。80.權(quán)利要求75的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是同種異體的。81.權(quán)利要求75的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是自體的。82.權(quán)利要求75的方法，其中所述治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞是大約lx103至大約lx107個(gè)細(xì)胞/kg體重。83.用于改善將要經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷身體創(chuàng)傷的受試者的微循環(huán)和/或急性傷口愈合的方法，該方法包括向所述受試者的血流中導(dǎo)入治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞，其中(a)每一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)編碼增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的區(qū)域，該區(qū)域與(ii)內(nèi)皮特異性啟動子或啟動子/增強(qiáng)子組合有效連接，和(b)在導(dǎo)入所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞之前、同時(shí)或之后未進(jìn)行骨髓清除。84.權(quán)利要求83的方法，其中所述受試者是人。85.權(quán)利要求84的方法，其中所述身體創(chuàng)傷是分娩。86.權(quán)利要求84的方法，其中所述身體創(chuàng)傷是由劇烈動作引起的皮肉傷，并且在身體創(chuàng)傷后立即向所述受試者的血流中導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞。87.權(quán)利要求84的方法，其中所述身體創(chuàng)傷是燒傷，并且在身體創(chuàng)傷后立即向所述受試者的血流中導(dǎo)入經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞。88.權(quán)利要求83的方法，其中所述啟動子/增強(qiáng)子組合是Tie2啟動子/增強(qiáng)子，并且所述增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)是與血管生成相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。89.權(quán)利要求84的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是同種異體的。90.權(quán)利要求84的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞對于所述受試者來說是自體的。91.權(quán)利要求84的方法，其中所述治療有效數(shù)量的經(jīng)遺傳修飾的CD34—干細(xì)胞是大約lx103至大約lx107個(gè)細(xì)胞/kg體重。全文摘要本發(fā)明提供了用于治療許多狀況的新的基于干細(xì)胞的方法。此類方法利用CD34干細(xì)胞，并且具有許多有利方面，因?yàn)樗鼈儾恍枰诖委煹氖茉囌咧羞M(jìn)行骨髓清除。取決于待治療的障礙，可對本方法中所使用的CD34干細(xì)胞進(jìn)行或不進(jìn)行遺傳修飾。文檔編號A61K45/00GK101778934SQ200880100100公開日2010年7月14日申請日期2008年5月20日優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日發(fā)明者M(jìn)·拉吉,M·斯坦格,P·尼爾森,R·胡斯申請人:埃普塞斯有限責(zé)任兩合公司