專利名稱：一種酸激活csp靶向抗菌肽及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽，具體地，涉及一種酸激活CSP靶向抗菌肽及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
齲病是在以細(xì)菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生的慢性進(jìn)行性破壞性感染性疾病
(樊明文2008; Kidd 2011).o who將其列為僅次于心血管病、腫瘤之后的第三大非傳 染性重點(diǎn)防治疾病(Fontana . 2011).。變形鏈球菌{Streptococcus mutans是頻病的主要致病菌 (Kiinbayashi — 2011>,為革蘭氏陽(yáng)性菌，厭氧或兼性厭氧，抑制其生長(zhǎng)可
有效治療齲(Giacaman . 2010, Marsh 2010)·°變形鏈球菌以生物膜(SM biofilm)的形式存在并致齲。以生物膜形式存在的細(xì)菌與以浮游態(tài)存在的細(xì)菌相比，在代謝特點(diǎn)和生理現(xiàn)象方面存在著眾多明顯的不同點(diǎn)，如對(duì)抗菌劑的敏感性、基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)、耐酸性等。細(xì)菌生物膜對(duì)多數(shù)抗菌劑有較強(qiáng)的抵
抗力，其抗性水平約為浮游態(tài)細(xì)菌的IO1-IO3倍(唐子圣.2006;張耀超2009;. 2011)。SM生物膜在紅霉素和青霉素濃度為5000倍MIC作用I h時(shí)及濃度為1000倍MIC作用3 h時(shí)，未能被完全殺死；在洗必泰濃度為500倍MIC作用I h及濃度為100倍MIC作用3 h，也未
能被完全殺死_子圣.2006) ο類(lèi)似地，Noiri等發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉菌單胞生物膜在160倍MIC
濃度的甲硝唑中仍能生長(zhǎng)，其耐藥機(jī)制與單個(gè)細(xì)菌迥然不同 moirt 2003)°細(xì)菌生物
膜耐藥性的增強(qiáng)與其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)密切相關(guān)以生物膜形式存在的細(xì)菌，其生長(zhǎng)速度顯著低于浮游態(tài)細(xì)菌，常處于靜止期，不易被常規(guī)的抗菌劑殺滅(Stewart. 2001)。而且，臨床常用的抗菌劑如洗必泰、氟制劑等，還具有副作用并易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥、耐氟?？咕?Antimicrobial Peptides, AMP)是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，具有獨(dú)特的抗菌機(jī)制、抗菌譜廣、種類(lèi)多、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。Batoni等報(bào)道，AMP主要通過(guò)膜攻擊途徑作用于生物膜內(nèi)生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng)的細(xì)菌，從而抑制細(xì)菌及其生物膜的生長(zhǎng)。此外，與傳統(tǒng)抗生素相比，AMP還具有快速殺滅細(xì)菌的動(dòng)力學(xué)
特征，將更適用于動(dòng)態(tài)且快速變化的微生物群落(如生物膜) 咖勝^cn D。但
AMP的廣譜抗菌性也容易造成菌群失調(diào)等不良后果(Eckert. 2006a)。同時(shí)，天然AMP具有生
物效能低、篩選難度高、蛋白水解不穩(wěn)定等缺點(diǎn).(Hale and Hancock 2007) (Taguchi. 2009)。特異性祀向抗菌妝(SpecificallyTargeted AntiMicrobial Peptides, STAMPs)是一種可設(shè)計(jì)并具有特異性的AMP，由靶向定位區(qū)域、AMP區(qū)域和(或)連接體區(qū)域組成。靶向定位區(qū)通過(guò)增高靶細(xì)菌表面AMP濃度(He . 2007),使AMP的特異性、殺傷效力和
動(dòng)態(tài)性能全面提升 (Edceit 2006a, EckeH 2006b) ° SM感受刺激多肽(csp)是
、----------H.-- -------- ----- --*
SM密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorum- sensing, QS)中的菌種間特異性信號(hào)分子 ^(Qj 2005)
，具有介導(dǎo)SM進(jìn)入基因感受態(tài)，影響SM的轉(zhuǎn)化突變、遺傳性狀、粘附聚集等重要作用。Eckert等利用固相合成法將CSP與來(lái)自于羊髓的AMP novispirin GlO雜合成C16G2，可特異性破壞SM生物膜而將其殺滅，但不影響人口腔中正常菌群的生長(zhǎng)，與單獨(dú)使用novispirin GlO相比,其殺傷能力提高了 20倍以上,但是表現(xiàn)出了一定的細(xì)胞毒性及溶血
性 (Eckert. 2006a, Kaplan ^ 2011)°Meiittin是從蜂毒中提取發(fā)現(xiàn)的一 類(lèi)聞破膜
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活性的抗菌肽，其對(duì)SM細(xì)菌的殺傷能力明顯強(qiáng)于C16G2 (Kafkft 2011)°但是缺乏選擇性以及高毒性限制了 melittin的臨床應(yīng)用。由于變形鏈球菌是厭氧細(xì)菌，因而代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量的乳酸，從而導(dǎo)致其生存的微環(huán)境呈酸性。此外，因而我們利用這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一類(lèi)酸激活的CSP靶向抗菌肽用2，3-二甲基馬來(lái)酸酐(DMMAn)對(duì)抗菌肽melittin中賴氨酸的側(cè)鏈氨基進(jìn)行保護(hù),從而使抗菌肽失去陽(yáng)離子特征而降低活性。當(dāng)pH低于6. 8時(shí)，DMMAn就可以從氨基上脫掉，使抗菌肽melittin恢復(fù)活性；將DMMAn保護(hù)的melittin通過(guò)二硫鍵與CSP祀向分子相連，以提高變形鏈球菌表面melittin的數(shù)量。這種新型的CSP祀向抗菌肽即可以通過(guò)CSP祀向分子提高抗菌肽的選擇性和抗菌肽在SM細(xì)菌表面的聚集度，同時(shí)又通過(guò)DMMAn對(duì)氨基的保護(hù)而降低了 melittin的毒性。當(dāng)這種CSP靶向抗菌肽進(jìn)入到齲齒內(nèi)之后，可被微環(huán)境的酸性條件而激活，從而具有殺菌活性。細(xì)菌生物膜對(duì)多數(shù)抗菌劑有較強(qiáng)的抵抗力，其抗性水平約為浮游態(tài)細(xì)菌的101-103倍(唐子圣.2006;張耀超2009; . 2011)。SM生物膜在紅霉素和青霉素濃度為5000倍MIC作用I h時(shí)及濃度為1000倍MIC作用3 h時(shí)，未能被完全殺死；在洗必泰濃度為500倍MIC作用I h及濃度為100倍MIC作用3 h，也未能被完全殺死(唐子圣.2006)。類(lèi)似地，Noiri等發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉菌單胞生物膜在160倍MIC濃度的甲硝唑中仍能生長(zhǎng)，其耐藥機(jī)制與單個(gè)細(xì)菌迥然不同(Noiri. 2003)。細(xì)菌生物膜耐藥性的增強(qiáng)與其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)密切相關(guān)以生物膜形式存在的細(xì)菌，其生長(zhǎng)速度顯著低于浮游態(tài)細(xì)菌，常處于靜止期，不易被常規(guī)的抗菌劑殺滅(Stewart . 2001)。而且,臨床常用的抗菌劑如洗必泰、氟制劑等,還具有副作用并易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥、耐氟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供了一種酸激活CSP靶向抗菌肽，它可以通過(guò)CSP靶向分子提高抗菌肽的選擇性和抗菌肽在SM細(xì)菌表面的聚集度，同時(shí)又通過(guò)2，3-二甲基馬來(lái)酸酐(DMMAn)對(duì)氨基的保護(hù)而降低了抗菌肽melittin的毒性，當(dāng)這種CSP靶向抗菌肽進(jìn)入到齲齒內(nèi)之后，可被微環(huán)境的酸性條件而激活，從而具有殺菌活性。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案
一種酸激活CSP靶向抗菌肽，由2，3- 二甲基馬來(lái)酸酐、抗菌肽meIittin、CSP靶向分子反應(yīng)制成。具體地，所述2，3_ 二甲基馬來(lái)酸酐的三個(gè)分子分別與抗菌肽melittin的三個(gè)賴氨酸側(cè)鏈氨基反應(yīng)后連接；所述CSP祀向分子通過(guò)二硫鍵連接于抗菌肽melittin的N末端半胱氨酸的巰基上。本發(fā)明提出的酸激活CSP靶向抗菌肽，通過(guò)以下步驟制備完成
(1)Psy-CSPci6 的合成
a.祀向肽CSPa6的固相合成采用Rink-AmideMBHA樹(shù)脂上,通過(guò)經(jīng)典的Fmoc固相化學(xué)合成方法合成N末端含有半胱氨酸的靶向肽CSPa6;利用反向高效液相色譜柱進(jìn)行分離純化，收集主峰，冷凍干燥后得到白色的純肽固體粉末；
b.靶向肽CSPa6中半胱氨酸側(cè)鏈巰基的活化將O.4 mmol 二硫二吡啶溶于2ml甲醇溶液中，然后將O. 04 mmol Cys-MitP溶于Iml甲醇/水，其V/V為I: f 1:10，并滴加入上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反應(yīng)10-16 h，利用C18反向高效液相柱層析純化，得到巰基活化的 Pys- CSPci6 ；
其反應(yīng)式為
權(quán)利要求
1.一種酸激活CSP靶向抗菌肽，由2，3-二甲基馬來(lái)酸酐、抗菌肽melittin、CSP靶向分子反應(yīng)制成。
2.根據(jù)權(quán)I所述的酸激活CSP靶向抗菌肽，其特征在于，所述2，3-二甲基馬來(lái)酸酐的三個(gè)分子分別與抗菌肽melittin的三個(gè)賴氨酸側(cè)鏈氨基反應(yīng)后連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的酸激活CSP靶向抗菌肽，其特征在于，所述CSP靶向分子通過(guò)二硫鍵連接于抗菌肽melittin的N末端半胱氨酸的巰基上。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的酸激活CSP靶向抗菌肽，其特征在于，通過(guò)以下步驟制備完成 (1)Psy-CSPci6 的合成 a.祀向肽CSPa6的固相合成采用Rink-AmideMBHA樹(shù)脂上,通過(guò)經(jīng)典的Fmoc固相化學(xué)合成方法合成N末端含有半胱氨酸的靶向肽CSPa6;利用反向高效液相色譜柱進(jìn)行分離純化，收集主峰，冷凍干燥后得到白色的純肽固體粉末； b.靶向肽CSPa6中半胱氨酸側(cè)鏈巰基的活化將O.4 mmol 二硫二吡啶溶于2ml甲醇溶液中，然后將O. 04 mmol Cys-MitP溶于Iml甲醇/水，其V/V為I: f 1:10，并滴加入上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反應(yīng)10-16 h，利用C18反向高效液相柱層析純化，得到巰基活化的 Pys- CSPci6 ； (2)DMMAn-melittin 的合成 a.抗菌肽melittin的固相合成采用Rink-AmideMBHA樹(shù)脂上,通過(guò)經(jīng)典的Fmoc固相化學(xué)合成方法合成N末端含有半胱氨酸的melittin祀向肽；利用反向高效液相色譜柱進(jìn)行分離純化，收集主峰，冷凍干燥后得到白色的純肽固體粉末； b.DMMAn-melittin 的合成將與 O. 04 mmol melittin 溶于 4ml 含有 IOOmM HEPES 和125mM NaOH的水溶液中，然后IOml含有O. 6 mmol 2，3-二甲基馬來(lái)酸酐的甲醇溶液滴加入上述含有melittin的水溶液中，反應(yīng)O. 5 h，利用C18反向高效液相柱層析純化，得到DMMAn-melittin ； (3)CSP靶向抗菌肽的合成將 O. 02 mmol Pys- CSPci6 與 0. 02 mmolDMMAn-melittin 溶于 2 ml 甲醇/ 水中，其 V/V為I: f 1:10，反應(yīng)10-16 h，通過(guò)HPLC進(jìn)行純化，得到目標(biāo)產(chǎn)物一具有酸激活特性的CSP革巴向抗菌肽化合物。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述酸激活CSP靶向抗菌肽的制備方法，包括以下步驟 (1)Psy-CSPci6 的合成 a.祀向肽CSPa6的固相合成采用Rink-AmideMBHA樹(shù)脂上,通過(guò)經(jīng)典的Fmoc固相化學(xué)合成方法合成N末端含有半胱氨酸的靶向肽CSPa6;利用反向高效液相色譜柱進(jìn)行分離純化，收集主峰，冷凍干燥后得到白色的純肽固體粉末； b.靶向肽CSPa6中半胱氨酸側(cè)鏈巰基的活化將0.4 mmol 二硫二吡啶溶于2ml甲醇溶液中，然后將0.04 mmol Cys-MitP溶于Iml甲醇/水，其V/V為I: f 1:10，并滴加入上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反應(yīng)10-16 h，利用C18反向高效液相柱層析純化，得到巰基活化的 Pys- CSPci6 ； (2)DMMAn-melittin 的合成 a.抗菌肽melittin的固相合成采用Rink-Amide MBHA樹(shù)脂上,通過(guò)經(jīng)典的Fmoc固相化學(xué)合成方法合成N末端含有半胱氨酸的melittin祀向肽；利用反向高效液相色譜柱進(jìn)行分離純化，收集主峰，冷凍干燥后得到白色的純肽固體粉末； b. DMMAn-melittin 的合成將與 O. 04 mmol melittin 溶于 4ml 含有 IOOmM HEPES 和125mM NaOH的水溶液中，然后IOml含有O. 6 mmol 2，3-二甲基馬來(lái)酸酐的甲醇溶液滴加入上述含有melittin的水溶液中，反應(yīng)O. 5 h，利用C18反向高效液相柱層析純化，得到DMMAn-melittin ； (3)CSP靶向抗菌肽的合成將 O. 02 mmol Pys- CSPci6 與 O. 02 mmolDMMAn-melittin 溶于 2 ml 甲醇/ 水中，其 V/V為I: f 1:10，反應(yīng)10-16 h，通過(guò)HPLC進(jìn)行純化，得到目標(biāo)產(chǎn)物一具有酸激活特性的CSP革巴向抗菌肽化合物。
6.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的酸激活CSP靶向抗菌肽在制備變形鏈球菌抗菌劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的酸激活CSP靶向抗菌肽在制備治療齲病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種酸激活CSP靶向抗菌肽，由2，3-二甲基馬來(lái)酸酐、抗菌肽melittin、CSP靶向分子反應(yīng)制成。另外，本發(fā)明提出了酸激活CSP靶向抗菌肽的制備方法及兩種應(yīng)用。本發(fā)明提出的酸激活CSP靶向抗菌肽可以通過(guò)CSP靶向分子提高抗菌肽的選擇性和抗菌肽在SM細(xì)菌表面的聚集度，同時(shí)又通過(guò)2，3-二甲基馬來(lái)酸酐(DMMAn)對(duì)氨基的保護(hù)而降低了抗菌肽melittin的毒性，當(dāng)這種CSP靶向抗菌肽進(jìn)入到齲齒內(nèi)之后，可被微環(huán)境的酸性條件而激活，從而具有殺菌活性。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102827288SQ20121031481
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者周建業(yè), 張偉, 王記增, 林志偉, 陳熙明, 李志杰 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)