專利名稱：^99mTc標(biāo)記RGD多肽腫瘤診斷藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于腫瘤診斷的放射性藥物，特別涉及用于intergrinavi33受體陽性腫瘤診斷的三種RGD多肽放射性藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全世界惡性腫瘤每年發(fā)病1100多萬人，病死800多萬人。惡性腫瘤發(fā)病率在我國也呈明顯上升趨勢，據(jù)國家衛(wèi)生資料統(tǒng)計，近兩年來我國城市居民惡性腫瘤占死亡原因的第1位，每年新增患者約220萬人。近年來惡性腫瘤的治療手段在不斷發(fā)展，不僅傳統(tǒng)的化療和放療技術(shù)更加規(guī)范化和科學(xué)化，新的治療方法，如分子靶向治療、免疫治療和基因治療等，正在逐步應(yīng)用于臨床。與之相適應(yīng)，要求惡性腫瘤診斷技術(shù)不僅要能夠進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷，更迫切需要進(jìn)一步反映惡性腫瘤的生物學(xué)行為和病理特點，為治療方案的科學(xué)化決策提供的確切的依據(jù)。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力直接關(guān)系到患者的預(yù)后，同時對于臨床醫(yī)師選擇治療方案具有至關(guān)重要的意義。但目前臨床上還缺乏準(zhǔn)確判定惡性腫瘤轉(zhuǎn)移能力的檢測方法，而主要依靠經(jīng)驗判斷。新生血管和淋巴管形成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，腫瘤新生血管形成促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，淋巴道形成與腫瘤轉(zhuǎn)移直接相關(guān)。整合素(integrin)是一組跨膜糖蛋白，由一個α亞單位和β亞單位通過非共價鍵組成的異二聚體，也是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的受體，與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如纖維結(jié)合蛋白、玻璃結(jié)合蛋白、層粘蛋白和膠原等) 的受體識別序列RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)特異結(jié)合。整合素調(diào)控新生血管和淋巴道的形成。諸多研究表明，整合素調(diào)控金屬基質(zhì)蛋白酶等蛋白水解酶，直接參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促使腫瘤轉(zhuǎn)移；整合素的豐富表達(dá)是促使腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲的重要分子，它直接介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)蛋白的粘附和結(jié)合；參與調(diào)控胞內(nèi)細(xì)胞骨架構(gòu)成， 細(xì)胞增殖。α νβ3是目前研究最多的整合素分子，在骨肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、肺癌、乳腺癌、 前列腺癌、膀胱癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及浸潤性黑色素瘤等多種實體腫瘤細(xì)胞表面和腫瘤新生血管均有豐富的表達(dá)，在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和絕大多數(shù)正常組織表達(dá)缺乏或幾乎不表達(dá)。 ανβ3受體介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞粘附和移行，在腫瘤新生血管生成和淋巴道轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。 α νβ 3的表達(dá)水平與惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移能刀等惡性表型有關(guān)，也可以作為評價某些惡性腫瘤預(yù)后的的指標(biāo)。放射性核素標(biāo)記的RGD序列配體已經(jīng)被用于腫瘤的放射性核素顯像研究，用于檢測轉(zhuǎn)移潛力較高的integrin α νβ 3表達(dá)陽性的腫瘤。已有的研究結(jié)果認(rèn)為R⑶多肽二聚體顯像劑與惡性腫瘤表面integrinavi33的親和力更好，要優(yōu)于RGD多肽四聚體。但目前已有的RGD多肽二聚體顯像劑在非靶器官代謝方面還有一定的不足，有必要發(fā)明新型的RGD 多肽二聚體顯像劑，通過改變配體的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步加快顯像劑在肺、肝和腎等非靶器官的代謝速度，從而降低放射性本底，提高腫瘤顯像的圖像質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
為克服已有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供三種生物代謝動力學(xué)更為理想的放射性核素標(biāo)記RGD多肽腫瘤診斷藥物。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的主要技術(shù)方案如下通過合成中間體化合物 Boc-K (NIC) -Osu,將 K(NIC)結(jié)構(gòu)與三種多肽 RGD2 (RGD2，X-RGD2 和 3P-RGD2)相連接，再進(jìn)一步連接螯合劑HYNIC，實現(xiàn)99mTc標(biāo)記，制成RGD多肽二聚體顯像藥物 99mTc-HYNIC-K (NIC) -RGD2、、99mTc-HYNIC-K (NIC) _3G_RGD2 和 99mTc-HYNIC-K (NIC) _3P_RGD2。 K(NIC)配體結(jié)構(gòu)使上述三種顯像藥物在肺、肝和腎等非靶器有更為理想的代謝速度，放射性本底較低，提高了腫瘤顯像的圖像質(zhì)量。


圖1制備中間體化合物Boc-K(NIC) -OSu的化學(xué)反應(yīng)示意圖；圖2制備中間體化合物K(NIC)-RGD2的化學(xué)反應(yīng)示意圖；圖3制備標(biāo)記前體化合物HYNIC-K (NIC)-RGD2的化學(xué)反應(yīng)示意圖；圖4制備中間體化合物K(NIC)-3G_RGD2的化學(xué)反應(yīng)示意圖；圖5制備標(biāo)記前體化合物HYNIC-K (NIC)-3G_RGD2的化學(xué)反應(yīng)示意圖；圖6制備中間體化合物K(NIC) -3P-RGD2的化學(xué)反應(yīng)示意圖；圖7制備標(biāo)記前體化合物HYNIC-K (NIC)-3P_RGD2的化學(xué)反應(yīng)示意圖；圖 899mTc 標(biāo)記制備顯像劑 99mTc-HYNIC-K (NIC) -RGD2、、99mTc-HYNIC-K (NIC) -3G-RGD2 和 99miTc-HYNIC-K (NIC)-3P-RGD2 的示意圖；圖 9"mTc-HYNIC-K (NIC) _3P_RGD2 用于 U87MG 膠質(zhì)瘤、MDA-MB_4;35 乳腺癌、A549 肺癌、PC3前列腺癌等四種荷瘤鼠動物模型的γ顯像圖。
具體實施例方式一 . RGD多肽放射性藥物的制備方法1.材料和設(shè)備所需化學(xué)物品由美國Sigma/Aldrich公司購入，不需進(jìn)一步純化即可使 用° Boc-Lys (nicotinoyl) -OH 禾口 Lys(Boc)2-OSu 由美國 Bachem Biosciences 公司購入。RGD 環(huán)肽，E [c (RGDfK)]2 (RO)2)，G3-E K3-C (RGDfK) ]2(3G-RGD2)和 PEG4-E [PEG4-C (RGDfK) ]2 (3P-RGD2)由美國 P印tides hternational 公司(Louisville，KY) 按照常規(guī)工藝制造。NMR (核磁共振)頻譜數(shù)據(jù)由300MHz的Bruzker ARX FT核磁共振光譜儀記錄所得，顯示的頻譜數(shù)據(jù)是以TMS(三甲基硅烷基)為參照的化學(xué)位移值(ppm)。ESI (電噴射離子化)質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Firmigan LCQ傳統(tǒng)質(zhì)譜儀上采集獲得。99mTcCV從原子高科股份有限公司購得。2. HPLC (高效液相色譜)方法HPLC方法1 使用的是LabAillance色譜系統(tǒng)，該色譜系統(tǒng)包括紫外_可見光檢測儀(波長為254nm)和以hrbax C18為固定相的半制備柱(柱寬X柱長為9. 4nmX250mm, 固定相的孔徑大小為IOOA，美國Agilent Technologies公司提供)，流動速度為2.5ml/min,首先用含70 % A (用溶解在水中的0. 1 %的三氯乙酸配置)和30 % B (用溶解在乙醇中的0. 的三氯乙酸配置)的流動相平衡色譜柱0 5分鐘，然后依次用含有30% B的流動相和含70% B的流動相分別沖洗5分鐘和20分鐘。HPLC方法2 使用的是LabAillance色譜系統(tǒng)，該色譜系統(tǒng)包括β -ram IN-超聲檢測儀(Tampa，F(xiàn)L)和以hrbax C18為固定相的色譜柱(柱寬X柱長4. 6mmX 250mm，固定相的孔徑大小為300A，美國Agilent Technologies公司提供)，流動速度為lml/min。流動相的組成以及沖洗的時間依次為90% A(25mM NH4Oac, pH = 6. 8)、10% B(乙腈)到85% AU5% B沖洗5分鐘，15% B沖洗5分鐘，20% B沖洗20分鐘，60% B沖洗25分鐘。HPLC方法流動相的組成以及沖洗時間依次為第一次用90% A(25mM NH4Oac,pH =6. 8)、10 % B (乙腈)到85 % A、15 % B的流動相沖洗5分鐘，然后依次為15 % B沖洗5m 分鐘，15% B沖洗5分鐘，20% B沖洗20分鐘，60% B沖洗25分鐘。3.中間體化合物Boc-K(NIC)-Osu的制備方法將300μπιο1Ν、Ν' -二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC，質(zhì)量61. 9mg)添加到3ml含有 290 μ mol BOC-Lys (煙酰氯鹽酸鹽，質(zhì)量IOlmg)和300 μ mol羥基琥珀酼亞胺(NHS，34. 5mg) 的DMF(二甲基亞酰胺)溶液中。反應(yīng)混合物需要在室溫下攪動5小時。反應(yīng)混合物中的白色沉淀需通過過濾除去。剩下的過濾液在低壓下使其蒸發(fā)干。然后將蒸發(fā)干的殘留物溶解在3ml 二氯甲烷中。再過濾此溶解液并將濾過液濃縮至Iml。接著向濃縮液中逐滴添加20ml 二乙醚，反應(yīng)會生成白色沉淀。過濾得沉淀，并用二乙醚洗滌(洗三次，每次5ml)。真空下干燥即可得B0c-K(NIC)-OSu粗產(chǎn)品。所得產(chǎn)品質(zhì)量為75. 8mg (產(chǎn)率約為60%)。粗合成的B0c-K(NlC)-OSu不經(jīng)過進(jìn)一步純化即可用于多肽的連接。Hl標(biāo)記的核磁共振(⑶Cl3) 1. 60 (s，9H，(CH3) 3C0)，1. 75 (m, 2H, CH2)，1. 88 (m, 2H, CH2)，2. 12 (m, 2H, CH2)，3. 01 (s,4H, COCH2CH2CO)，3. 66 (t, 2H, CH2CH2NH)，5. 10 (dd, H, NHCHC0)，7. 54 (t, H, aromatic)，8. 36 (d, H, aromatic), 8. 88 (d, H, aromatic)禾口 9. 15 (s, H, aromatic)。(圖 1)4.中間體化合物K(NIC)-RGD2的制備方法將20 μ mol Boc-K (NIC) -OSu (質(zhì)量 8. 9mg)和 4 μ mol E [c (RGDfK) ] 2 (質(zhì)量 4. 8mg) 溶解在2ml無水DMF中。然后加入3滴DIEA，并在室溫攪拌過夜。加入2ml水，反應(yīng)混合物的Wi值為6. 0到7. 0。參照高效液相色譜(方法1)分離反應(yīng)產(chǎn)物。收集20. 7分鐘時的樣品并真空冷凍干燥即可獲得BOC-K(NIC)-RGD2產(chǎn)物質(zhì)量為3. Img(產(chǎn)率47% )。ESI-MS質(zhì)譜分析的數(shù)據(jù)為:m/z (質(zhì)荷比)=1651. 5 (計算的分子量為1650. 8d，分子式[C76H110N22O20]+)。 將Boc-K(NIC)-RGD2溶解在2. Oml干凈的TFA中，室溫攪拌15min可以使TFA除去。剩余的反應(yīng)物溶解在2ml的0. IM的醋酸銨緩沖液中。然后按照高效液相色譜(方法2)分離反應(yīng)產(chǎn)物，收集16. 5min時的樣品并真空冷凍干燥即可獲得反應(yīng)產(chǎn)物K(NIC)-RGD2，產(chǎn)物的質(zhì)量為2. 5mg，產(chǎn)率86%。ESI-MS質(zhì)譜分析的質(zhì)荷比m/z為1552，計算的分子量為1550. 8d， 分子式[C71Hlt^22O18]+。(圖 2)5.標(biāo)記前體化合物HYNIC-K (NIC) -RGD2的制備方法將8 μ mol HYNIC-Osu (質(zhì)量為 3. 5mg)和 1. 6 μ mol K (NIC) -RGD2 (質(zhì)量為 2. 5mg) 溶解在aiilDMF中。向混合物中添加3滴DIEA。室溫攪拌反應(yīng)混合物M小時。然后加入 2ml醋酸銨緩沖液(100mM，pH = 7. 0)再利用高效液相色譜(方法1)分離反應(yīng)產(chǎn)物。收集 18. 7min時的樣品，并真空冷卻干燥即可得HYNIC-K(NIC)-RGD2。產(chǎn)物的質(zhì)量為1. Img(產(chǎn)率為38%。ESI-MS質(zhì)譜分析的m/z (質(zhì)荷比)為1邪4. 3 (計算的分子量為1553. 8d，分子式+)。(圖 3)6.中間體化合物K(NIC)-3G_RGD2的制備方法14 μ mol Boc-K (NIC) -Osu (質(zhì)量為 6. 3mg)禾口 2·8μπιο1 Gly3-E[Gly3-C (RGDfK) ]2(質(zhì)量為5. Img)溶解在2mlDMF中。向混合物中添加3滴DIEA0 室溫攪拌反應(yīng)混合物過夜。然后加入2ml水，調(diào)整反應(yīng)體系的PH值約為6. O 7. O。再利用高效液相色譜(方法1)分離反應(yīng)產(chǎn)物。收集19. 3min時的樣品，并真空冷卻干燥即可得 Boc-K(NIC)-3G3-RGD2。產(chǎn)物的質(zhì)量為3. Omg，產(chǎn)率為50%。ESI-MS質(zhì)譜分析的m/z (質(zhì)荷比)為 2163. 9 (計算的分子量為 2164d，分子式[C76H110N22O20]+)。將 Boc-K(NIC) -RGD2 溶解在2. Oml無水TFA中，室溫攪拌15分鐘可以使多余的TFA除去。剩余的反應(yīng)物溶解在2ml 的0. IM的醋酸銨緩沖液中(100mM，pH = 7. 0)。然后按照高效液相色譜(方法1)分離反應(yīng)產(chǎn)物，收集16.5分鐘時的樣品并真空冷凍干燥即可獲得反應(yīng)產(chǎn)物1((肌0-36-1 02，產(chǎn)物的質(zhì)量為2. 9mg(產(chǎn)率約90% )。ESI-MS質(zhì)譜分析的質(zhì)荷比m/z為2064. 4，計算的分子量為 2063. 9，分子式[C89H129N31O27]+。(圖 4)7.標(biāo)記前體化合物HYNIC-K (NIC)-3G_RGD2的制備方法將7 μ mol HYNIC-Osu (質(zhì)量為 3. Img)和 1. 4 μ mol K (NIC) _3G_RGD2 (質(zhì)量為
2.9mg)溶解在aiilDMF中。向混合物中添加3滴DIEA。室溫攪拌反應(yīng)混合物2天。然后加入2ml醋酸銨緩沖液(100mM，pH = 7. 0)，再利用高效液相色譜(方法1)分離反應(yīng)產(chǎn)物。 收集15. 5分鐘時的樣品，并真空冷卻干燥即可得HYNIC-K(NIC)-3G-RGD2。產(chǎn)物的質(zhì)量為 0. 5mg，產(chǎn)率為15%。ESI-MS質(zhì)譜分析的m/z (質(zhì)荷比)為2366. 9 (計算的分子量為2367d， 分子式[Cltl2H138R34O31S]+)。(圖 5)8.中間體化合物K(NIC)-3P_RGD2的制備方法1 2 μ mo 1 Boc-K (NIC) -Osu (質(zhì)量為 5. 4mg)禾口 2·4μπιο1 PEG4-E[PEG4-C (RGDfK) ]2(質(zhì)量為5. Omg)溶解在aiilDMF中。向混合物中添加3滴DIEA。 于室溫過夜攪拌反應(yīng)混合物。然后加入2ml水，調(diào)整反應(yīng)體系的PH值約為6. O 7. O。再利用高效液相色譜(方法1)分離反應(yīng)產(chǎn)物。收集21. 5分鐘時的樣品，并真空冷卻干燥即可得反應(yīng)中間物Boc-K(NIC)-3P-RGD2。產(chǎn)物的質(zhì)量為3. %ig，產(chǎn)率為60%。ESI-MS質(zhì)譜分析的m/z (質(zhì)荷比)為2392.4(計算的分子量為2392. 2，分子式[Cltl9H173N25O35]+)。將所得 BOC-K (NIC) -3P-RGD2溶解在aiilDMF中，于室溫攪拌15分鐘，使得TFA除去。剩余物質(zhì)溶解在aiil 0. IM的醋酸銨緩沖液(100mM，PH = 7. 0)中。再利用高效液相色譜(方法1)分離反應(yīng)產(chǎn)物。收集14.2分鐘時的樣品，并真空冷卻干燥即可得反應(yīng)產(chǎn)物K(NIC)-3P-RGD2。產(chǎn)物的質(zhì)量為3. Omg，產(chǎn)率為90%。ESI-MS質(zhì)譜分析的m/z (質(zhì)荷比)為2294(計算的分子量為 2292. 2，分子式[C104H165N25O33]+)。(圖 6)。9.標(biāo)記前體化合物HYNIC-K (NIC)-3P_RGD2的制備方法將6·5μπιο1 HYNIC-OSu (質(zhì)量為 2. 9mg)和 1. 3 μ mol K (NIC) _3P_RGD2 (質(zhì)量為
3.Omg)溶解在aiilDMF中。向混合物中添加3滴DIEA。于室溫攪拌反應(yīng)混合物3天。再利用高效液相色譜(方法1)分離反應(yīng)混合物。收集18分鐘時的樣品，并真空冷卻干燥即可得反應(yīng)產(chǎn)物HYNIC-K(NIC)-3P-RGD2。產(chǎn)物的質(zhì)量為1. Omg，產(chǎn)率為30%。ESI-MS質(zhì)譜分析的m/z (質(zhì)荷比)為2595. 3 (計算的分子量為2595. 2，分子式[C117H174N28O37S]+)。(圖7)。
10. 99mTc-HYNIC-K (NIC) -RGD2、,"mTc-HYNIC-K (NIC) -3G-RGD2 禾口 99mTc-HYNIC-K (NIC) _3P_RGD2 的標(biāo)記方法向一個5cc的玻璃瓶中加入25 μ g HYNIC連接劑，0. 4mL 0. 25M琥珀酸緩沖液(pH =4. 8)以及0. 4mL tricine溶液Q5mg/mL，溶解在0. 25M琥珀酸緩沖液中)。再向玻璃瓶中加入 0. 5mL99mTc(V(約含 10 20mCi)和 25L SnCl2 (1. Omg/mL 溶解在 0. IN HCl 中)。然后將玻璃瓶至于100°C熱水浴中加熱20分鐘。加熱完成后，將玻璃瓶置于室溫放置5分鐘。 接著采用放射性-高效液相色譜(方法幻對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析。確定LogP值。對于生物組織分布的研究，先利用高效液相色譜對放射性99mTc標(biāo)記藥物進(jìn)行純化。流動相中的揮發(fā)性物質(zhì)可以在真空中除去。將剩下的放射性示蹤物溶解在鹽溶液中至放射性比活濃度約為 30Ci/mL即可得到用于組織分布研究的顯像藥物。對于顯像的研究，藥物可以按照以下方法準(zhǔn)備將放射性示蹤物溶解在鹽溶液中至放射性比活濃度約為lmCi/mL。在封閉實驗中， 將RGD2多肽溶解在藥劑中至終濃度3. 5mg/mL。在將配置成的顯像劑溶液注射到動物體內(nèi)之前，需要使用0. 20 μ m的Millex-LG過濾器過濾。每只實驗動物注射0. Iml的顯像藥物溶液。(圖8)三種99mTc標(biāo)記RGD多肽藥物均有高的放射性化學(xué)純度(RCP >90%)以及高的特異性( 5Ci/ymol)。在等體積的辛醇和25mM磷酸緩沖液的混合液中可以確定這三種復(fù)合物的分離系數(shù)。表1總結(jié)了這三種99mTc標(biāo)記RGD多肽藥物的理論計算的LogP值以及它們在高效液相色譜中的阻滯時間。表1.99mTc標(biāo)記RGD多肽藥物的理論計算的LogP值以及它們在高效液相色譜中的阻滯時間
權(quán)利要求
1.三種99mTc標(biāo)記的RGD多肽放射性藥物，這三種RGD多肽放射性藥物在結(jié)構(gòu)上均為RGD環(huán)狀二聚體，通過雙功能螯合劑進(jìn)行放射性核素99mTc標(biāo)記，其主要特征是利用尼克酸[K(NIC)]結(jié)構(gòu)與R⑶相連接，以替代以往99mTc標(biāo)記使用的協(xié)同配體三苯基膦三磺酸鈉(TPPTS)，從而降低了藥物結(jié)構(gòu)的分子量，改善了放射性藥物在非靶器官的代謝動力學(xué)，所述三種放射性藥物為"mTc-HYNIC-K(NIC)-RGD2,99mTc-HYNIC-K(NIC)-X-RGD2 和 99mTc-HYNIC-K (NIC) _3P_RGD2，均為無色透明液體針劑。
2.權(quán)利要求1中所述的99mTc標(biāo)記RGD多肽放射性藥物的制備方法，其特征在于所述方法包括以下步驟a.中間體化合物Boc-K(NIC) -Osu的制備方法將300μπιο1 N, N' -二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC，61.9mg)添加到3ml含有290ymol BOC-Lys (煙酰氯鹽酸鹽，IOlmg)和300 μ mol羥基琥珀酼亞胺(NHS，；34. 5mg)的DMF(二甲基亞酰胺)溶液中，反應(yīng)混合物需要在室溫下攪動5小時，反應(yīng)混合物中的白色沉淀需通過過濾除去，剩下的過濾液在低壓下使其蒸發(fā)干；將蒸發(fā)干的殘留物溶解在3ml 二氯甲烷中，再過濾此溶解液并將濾過液濃縮至Iml ；向濃縮液中逐滴添加20ml 二乙醚，反應(yīng)會生成白色沉淀，過濾得沉淀，并用二乙醚洗滌(洗三次，每次5ml)；真空下干燥即可得 Boc-K (NIC) -OSu粗產(chǎn)品，所得產(chǎn)量為75. 8mg (產(chǎn)率約為60 % )，粗合成的Boc-K (NIC) -OSu 不經(jīng)過進(jìn)一步純化即可用于多肽的連接；Hl標(biāo)記的核磁共振(⑶Cl3) :1.60(s,9H, (CH3)3CO)，1. 75 (m，2H，CH2)，1. 88 (m，2H，CH2)，2. 12(m，2H，CH2)，3. 01 (s，4H，COCH2CH2CO), 3. 66 (t, 2H, CH2CH2NH)，5. 10 (dd, H, NHCHC0)，7. 54 (t, H, aromatic)，8. 36 (d, H, aromatic)， 8. 88 (d, H, aromatic)禾口 9. 15 (s, H, aromatic)；b.中間體化合物K(NIC) -RGD2的制備方法將 20 μ mol Boc-K (NIC) -OSu (8. 9mg)和 4 μ mol E [c (RGDfK) ] 2 (4. 8mg)溶解在 2ml 無水DMF中，加入3滴DIEA，并在室溫攪拌過夜；反應(yīng)后，加入2ml水，反應(yīng)混合物的pH值為 6. O到7. O ；參照高效液相色譜分離反應(yīng)產(chǎn)物，收集20. 7分鐘時的樣品并真空冷凍干燥即可獲得BOC-K(NIC)-RGd2產(chǎn)量為3. Img (產(chǎn)率47% )，ESI-MS質(zhì)譜分析的數(shù)據(jù)為m/z (質(zhì)荷比)=1651.5(計算的分子量為 1650. 8，分子式[C76H110N22O20]+)；將 Boc-K (NIC)-RGD2 溶解在2. Oml干凈的TFA中，室溫攪拌15min ；去除TFA，剩余的反應(yīng)物溶解在^iil的0. IM的醋酸銨緩沖液中；按照高效液相色譜分離反應(yīng)產(chǎn)物，收集16. 5min時的樣品并真空冷凍干燥即可獲得反應(yīng)產(chǎn)物K (NIC) -RGD2,產(chǎn)量為2. 5mg,產(chǎn)率86% ；ESI-MS質(zhì)譜分析的質(zhì)荷比m/z為 1552，計算的分子量為1550. 8，分子式[C71H102N22O18]+ ；c.標(biāo)記前體化合物HYNIC-K(NIC)-RGD2的制備方法將 8 μ mol HYNIC-Osu (3. 5mg)和 1. 6 μ mol K (NIC) -RGD2 (2. 5mg)溶解在 2mlDMF 中， 向混合物中添加3滴DIEA，室溫攪拌反應(yīng)混合物M小時；反應(yīng)后，加入2ml醋酸銨緩沖液 (IOOmM, pH = 7. 0)再利用高效液相色譜分離反應(yīng)產(chǎn)物；收集18. 7min時的樣品，并真空冷卻干燥即可得HYNIC-K (NIC)-RGD2,產(chǎn)量為1. lmg，產(chǎn)率為38% ;ESI_MS質(zhì)譜分析的m/z (質(zhì)荷比)為1854. 3 (計算的分子量為1553. 8，分子式[C84H111N25O22S]+)；d.中間體化合物K(NIC) -3G-RGD2的制備方法將 1 4 μ mo 1 Boc-K (NIC) -Osu (質(zhì)量 為 6. 3mg)禾口 2·8μπιο1 Gly3-E[Gly3-c (RGDfK)J2 (5. lmg)溶解在2ml DMF中，向混合物中添加3滴DIEA,室溫攪拌反應(yīng)混合物過夜；反應(yīng)完成后，加入2ml水，調(diào)整反應(yīng)體系的PH值約為6. 0 7. 0， 再利用高效液相色譜分離反應(yīng)產(chǎn)物；收集19. 3分鐘時的樣品，并真空冷卻干燥即可得 Boc-K(NIC)-3G3-RGD2。產(chǎn)物的質(zhì)量為3. Omg，產(chǎn)率為50% ；ESI-MS質(zhì)譜分析的m/z (質(zhì)荷比)為2163. 9 (計算的分子量為2164，分子式[C76H110N22O20]+)；將Boc-K(NIC)-RGD2溶解在2.Oml無水TFA中，室溫攪拌15分鐘；去除TFA，剩余的反應(yīng)物溶解在2ml的0. IM的醋酸銨緩沖液中(100mM，pH = 7. 0)，按照高效液相色譜分離反應(yīng)產(chǎn)物，收集16. 5分鐘時的樣品并真空冷凍干燥即可獲得反應(yīng)產(chǎn)物K(NIC)-3G-RGD2，產(chǎn)量為2. 9mg(產(chǎn)率約90% ) ；ESI-MS質(zhì)譜分析的質(zhì)荷比m/z為2064. 4，計算的分子量為2063. 9，分子式[C89H129N31O27]+ ；e.標(biāo)記前體化合物HYNIC-K(NIC)-3G-RGD2的制備方法將 7 μ mol HYNIC-Osu (3. Img)和 1. 4 μ mol K (NIC) -3G-RGD2 (2. 9mg)溶解在 2ml DMF 中，在向混合物中添加3滴DIEA。室溫攪拌反應(yīng)混合物2天；反應(yīng)完成后，加入2ml醋酸銨緩沖液(100mM，pH = 7. 0)，再利用高效液相色譜分離反應(yīng)產(chǎn)物；收集15. 5分鐘時的樣品， 并真空冷卻干燥即可得HYNIC-K (NIC)-3G-RGD2 ；產(chǎn)量為0. 5mg，產(chǎn)率為15%;ESI_MS質(zhì)譜分析的m/z (質(zhì)荷比)為2366. 9 (計算的分子量為2367，分子式[Cltl2H13J34O31S]+)；f.中間體化合物K(NIC) -3P-RGD2的制備方法將 12 μ mol Boc-K(NIC) -Osu (5. 4mg)禾口 2. 4 μ mol PEG4-E [PEG4-c (RGDfK) ] 2 (5. Omg) 溶解在aiilDMF中，向混合物中添加3滴DIEA，于室溫過夜攪拌反應(yīng)混合物；反應(yīng)完成后， 加入2ml水，調(diào)整反應(yīng)體系的PH值約為6. O 7. O ；利用高效液相色譜分離反應(yīng)產(chǎn)物，收集21. 5分鐘時的樣品，并真空冷卻干燥即可得反應(yīng)中間物Boc-K(OTC)-3P-RGD2，產(chǎn)量為3.4mg，產(chǎn)率為60%;ESI-MS質(zhì)譜分析的m/z (質(zhì)荷比)為2392. 4 (計算的分子量為2392. 2， 分子式[Cltl9H173N25O35]+)；將所得BOC-K (NIC)-3P-RGD2溶解在anlDMF中，于室溫攪拌15分鐘，使得TFA除去，剩余物質(zhì)溶解在aiil 0. IM的醋酸銨緩沖液(lOOmM，pH = 7. 0)中；再利用高效液相色譜分離反應(yīng)產(chǎn)物，收集14. 2分鐘時的樣品，并真空冷卻干燥即可得反應(yīng)產(chǎn)物 K (NIC) -3P-RGD2，產(chǎn)量為3. Omg,產(chǎn)率為90 % ；ESI-MS質(zhì)譜分析的m/z (質(zhì)荷比)為2294 (計算的分子量為2四2· 2，分子式[C104H165N25O33]+)；g.標(biāo)記前體化合物HYNIC-K(NIC)-3P-RGD2的制備方法將 6. 5 μ mol HYNIC-OSu (2. 9mg)和 1· 3 μ mol K (NIC) _3P_RGD2 (3. Omg)溶解在 2ml DMF 中，向混合物中添加3滴DIEA，于室溫攪拌反應(yīng)混合物3天；再利用高效液相色譜分離反應(yīng)混合物，收集18分鐘時的樣品，并真空冷卻干燥即可得反應(yīng)產(chǎn)物HYNIC-K(NIC)-3P-RGD2， 產(chǎn)量為1. Omg,產(chǎn)率為30% ；ESI-MS質(zhì)譜分析的m/z (質(zhì)荷比)為2595. 3 (計算的分子量為 2595. 2，分子式[C117H174N28O37S]+)；f . 99mTc-HYNIC-K (NIC)- RGD2、、99mTc-HYNIC-K (NIC) -3G-RGD2 禾口 99mTc-HYNIC-K (NIC) _3P_RGD2 的標(biāo)記方法加入 25 μ g HYNIC 連接劑，0. 4mL 0. 25M琥珀酸緩沖液(pH = 4. 8)以及 0.4mL tricine 溶液(25mg/mL，溶解在0. 25M琥珀酸緩沖液中)；再加入0. 5mL 99mTcO4^ (約含10 20mCi) 和25 μ L SnC^ (1. Omg/mL溶解在0. IN HCl中)，然后置于100°C熱水浴中加熱20分鐘，加熱完成后，于室溫放置5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及三種用于intergrinαvβ3受體陽性腫瘤診斷的RGD多肽放射性藥物及其制備方法。這三種RGD多肽放射性藥物在結(jié)構(gòu)上均為RGD環(huán)狀二聚體，通過雙功能螯合劑進(jìn)行放射性核素99mTc標(biāo)記。其主要特征是以與RGD相連接的尼克酸[K(NIC)]結(jié)構(gòu)替代以往使用的99mTc標(biāo)記協(xié)同配體三苯基膦三磺酸鈉(TPPTS)，從而降低了藥物結(jié)構(gòu)的分子量，加快了放射性藥物在非靶器官的代謝速度。所述三種放射性藥物為99mTc-HYNIC-K(NIC)-RGD2、99mTc-HYNIC-K(NIC)-3G-RGD2和99mTc-HYNIC-K(NIC)-3P-RGD2，均為無色透明液體針劑。
文檔編號A61K103/10GK102552949SQ201210038368
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者高偉 申請人:安徽筑夢生物科技有限公司