專利名稱：物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物材料，特別涉及具有捕獲干細(xì)胞并誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖及定向分化功能、對(duì)組織具有誘導(dǎo)再生作用的生物支架材料及其制備方法和醫(yī)學(xué)用途。
背景技術(shù)：
組織工程最主要的思路是設(shè)計(jì)制備出三維仿生組織，構(gòu)建具有類似天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的生物材料支架，為細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)、發(fā)育和細(xì)胞間通訊提供理想的微環(huán)
^Mi ο靜電紡絲技術(shù)能夠連續(xù)制備納米級(jí)或亞微米級(jí)納米纖維，其構(gòu)建的支架具有較高的孔隙率、較好的孔道連通以及高比表面積，是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。通過調(diào)節(jié)溶液濃度、紡絲設(shè)備參數(shù)可以很好地控制支架材料的結(jié)構(gòu)、化學(xué)和幾何形貌、纖維取向、拓?fù)湫螒B(tài)及表面圖案等，從而可調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、粘附、增殖與分化等行為。如研究表明，通過靜電紡絲制備的聚己內(nèi)脂(PCL)納米纖維支架能夠支持體外培養(yǎng)的干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，維持細(xì)胞表型并促進(jìn)細(xì)胞增殖。Yang通過選擇合適工藝形成由納米、微米級(jí)纖維并以有序、無序排列形成的四種支架，首次培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)，探索其在神經(jīng)修復(fù)中的應(yīng)用。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞和軸突沿纖維取向伸展和生長(zhǎng)，與微米級(jí)纖維支架相比，細(xì)胞在PLLA納米級(jí)纖維上的分化率更高，在平行纖維上有助于軸突生長(zhǎng)，表明靜電紡納米纖維支架在神經(jīng)修復(fù)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。Xu等也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)在定向排列的P (LLA-CL)納米纖維上的血管平滑肌細(xì)胞沿納米纖維方向定向生長(zhǎng)，并呈現(xiàn)梭樣收縮表型。Basle等的研究表明，體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞能沿著膠原纖維的排列方向進(jìn)行遷移。Han等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)的拓?fù)湫螒B(tài)會(huì)在細(xì)胞分化中占據(jù)重要的角色，通過電紡絲技術(shù)調(diào)整支架結(jié)構(gòu)，初步現(xiàn)實(shí)了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的控制。此外，近年來不斷有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞能夠感應(yīng)材料表面圖案結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化并對(duì)此作出應(yīng)答。如^ng等研究了取向靜電紡絲支架的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)這種由納米纖維構(gòu)成的非織造基體能促進(jìn)心肌細(xì)胞進(jìn)行各向同性或各向異性的生長(zhǎng)，心肌細(xì)胞在一定程度上能夠進(jìn)入到纖維，研究結(jié)果表明，工程構(gòu)建的心臟組織的結(jié)構(gòu)和功能都可以通過支架的化學(xué)和幾何形貌(納米和微米表面結(jié)構(gòu))得到調(diào)整。Biggs認(rèn)為細(xì)胞在基質(zhì)表面粘附能力下降與表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)影響相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)，而某些信號(hào)蛋白的過表達(dá)也會(huì)影響細(xì)胞與基質(zhì)表面納米溝槽的結(jié)合和粘附。微納米圖案化能夠影響細(xì)胞的生長(zhǎng)行為，其對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞的刺激的結(jié)果與使用化學(xué)刺激的作用是相似的，不同種類的細(xì)胞對(duì)相同微納米圖案做出的反應(yīng)也可能不同。在某些尺寸范圍內(nèi)，支架材料的表面圖案化能夠抑制或誘導(dǎo)細(xì)胞行為。盡管經(jīng)過二十多年的努力，組織工程已完成了大量基礎(chǔ)研究工作。目前國(guó)際上已有組織工程皮膚、組織工程軟骨產(chǎn)品面世，并得到美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)。在我國(guó)，西安組織工程技術(shù)研究中心成功開發(fā)了我國(guó)第一個(gè)組織工程產(chǎn)品-組織工程皮膚。然而，組織工程因?yàn)樯婕暗?周以上的自體細(xì)胞分離培養(yǎng)、組織體外構(gòu)建與培養(yǎng)，因此，傳統(tǒng)的組織工程研究手段不具備普適性，對(duì)產(chǎn)業(yè)化和臨床應(yīng)用存在制約性。另外，長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)和體外組織構(gòu)建，可能導(dǎo)致細(xì)胞表現(xiàn)型、基因以及功能的變化，并且細(xì)胞被細(xì)菌污染的幾率大大增加，這些問題對(duì)其產(chǎn)業(yè)化和臨床應(yīng)用也極為不利。因此，組織工程的研究需要跳出原來的思維模式，尋求一種生產(chǎn)更為簡(jiǎn)單、操作性更強(qiáng)，適合臨床應(yīng)用的研究方法。近年，組織誘導(dǎo)性生物材料的概念逐漸在生物材料科學(xué)領(lǐng)域形成。其概念是基于對(duì)材料的微觀微孔結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、化學(xué)修飾和復(fù)合生物活性物質(zhì)，賦予材料誘導(dǎo)組織再生的活性，使組織再生和修復(fù)在體內(nèi)完成。將這種支架材料植入體內(nèi)后，利用體內(nèi)的組織環(huán)境，通過干細(xì)胞遷移、黏附、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，迅速完成組織的修復(fù)和再生。本發(fā)明從干細(xì)胞增殖及定向分化的微環(huán)境出發(fā)，根據(jù)特定組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及生物環(huán)境要求，以生物可降解高分子材料為基礎(chǔ)材料，采用靜電紡絲技術(shù)，通過混紡或后期物理吸附的方法，引入與干細(xì)胞遷移、粘附、增殖分化相關(guān)的天然生物活性材料及活性因子等，設(shè)計(jì)構(gòu)建出具有良好生物相容性、足夠的力學(xué)強(qiáng)度、可生物降解、適合干細(xì)胞增殖及定向分化、具有促進(jìn)細(xì)胞遷移粘附及捕獲干細(xì)胞從而誘導(dǎo)骨、軟骨、神經(jīng)及皮膚等組織再生功能的物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種負(fù)載有活性物質(zhì)、具有良好生物相容性、足夠的力學(xué)強(qiáng)度、可生物降解、具有促進(jìn)細(xì)胞遷移粘附及捕獲干細(xì)胞從而誘導(dǎo)組織再生等功能的物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料。本發(fā)明的目的之二是提供上述物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料，由可生物降解的高分子物質(zhì)和活性物質(zhì)制備而成，以高分子物質(zhì)為100重量份計(jì)，活性物質(zhì)為0-20重量份但不為零；所述100重量份高分子物質(zhì)由50-100重量份的合成高分子物質(zhì)和0-50重量份的天然高分子物質(zhì)組成；所述可生物降解的高分子物質(zhì)和活性物質(zhì)通過靜電紡絲形成高分子納米纖維膜或復(fù)合高分子納米纖維膜，所述的活性物質(zhì)均勻分布包埋在纖維膜內(nèi)。所述的合成高分子物質(zhì)的分子量為5 20萬，選自乳酸-羥基乙酸的共聚物PLGA、聚乳酸、聚己內(nèi)酯或聚乙交酯中的一種或幾種的混合物；所述的天然高分子物質(zhì)的分子量為5 100萬，選自透明質(zhì)酸、絲蛋白、硫酸軟骨素、肝素、膠原蛋白、明膠、殼聚糖、核酸、血清纖維結(jié)合蛋白或多肽中的一種或幾種的混合物；所述的活性物質(zhì)選自表皮生長(zhǎng)因子EGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β、胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF、⑶31抗體、⑶對(duì)抗體、層粘連蛋白、趨化因子SDF-1、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子NGF、骨形成蛋白ΒΜΡ-2、成骨生長(zhǎng)肽0PG、血小板衍生生長(zhǎng)因子PDGF、含多種生長(zhǎng)因子的富血小板血漿中的一種或幾種的混合物。上述物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的一種制備方法，包括以下步驟a、高分子紡絲液的配制將合成高分子物質(zhì)溶解在溶劑中，然后加入活性物質(zhì)，得到高分子紡絲液；b、支架材料的制備選用多噴頭或單噴頭紡絲裝置，將步驟a所得高分子紡絲液裝入靜電紡絲設(shè)備的儲(chǔ)液裝置中進(jìn)行靜電紡絲，得到可作為物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的高分子納米纖維膜材料，纖維直徑為50nm 5000nm。上述物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的一種制備方法，包括以下步驟a、高分子紡絲液的配制將合成高分子物質(zhì)和天然高分子物質(zhì)混合溶解在溶劑中，然后加入活性物質(zhì)，得到高分子紡絲液；b、支架材料的制備選用多噴頭或單噴頭紡絲裝置，將步驟a所得高分子紡絲液裝入靜電紡絲設(shè)備的儲(chǔ)液裝置中進(jìn)行靜電紡絲，得到高分子納米纖維膜，纖維直徑為50nm 5000nm ；C、將步驟b所獲得的高分子納米纖維膜材料浸泡到交聯(lián)劑溶液中，對(duì)其中的天然高分子物質(zhì)組分進(jìn)行交聯(lián)，于室溫反應(yīng)6 12小時(shí)后，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到可作為物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的高分子納米纖維膜材料。上述物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的一種制備方法，包括以下步驟a、高分子紡絲液的配制將合成高分子物質(zhì)溶解在第一溶劑中，配制成第一溶液；將活性物質(zhì)和天然高分子物質(zhì)溶解在第二溶劑中，配制成第二溶液；b、支架材料的制備選用多噴頭紡絲裝置或核殼電紡裝置，將步驟a所得第一溶液和第二溶液分別裝入不同輸液通路中進(jìn)行靜電紡絲，得到復(fù)合高分子納米纖維膜，其中合成高分子纖維的直徑為lOO-lOOOnm，天然高分子纖維的直徑為50-500nm，纖維膜的厚度為 0. 1-0. 5mm ；C、將步驟b所獲得的復(fù)合高分子納米纖維膜浸泡到交聯(lián)劑溶液中，對(duì)其中的天然高分子物質(zhì)組分進(jìn)行交聯(lián)，于室溫反應(yīng)6 12小時(shí)后，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到可作為物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的復(fù)合高分子納米纖維膜材料。所述的溶劑選自水、氟代試劑、氯仿、DMF、THF中的一種或幾種的混合物。所述的靜電紡絲的工藝條件為溶液的供料速率為5 50ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為8 20cm ；環(huán)境溫度為20 50°C ；靜電壓為10 30kV。所述的交聯(lián)劑溶液是由碳二亞胺與丙酮和水的混合溶劑新配制的溶液，溫度為4°C，其中碳二亞胺的濃度為50mM 200mM，丙酮和水的混合溶劑中，丙酮與水的重量比為80 20。所述的第一溶劑選自氯仿、DMF、THF中的一種或幾種的混合物；所述的第二溶劑選自水、或水與乙醇的混合物、或水與甲醇的混合物。本發(fā)明突破了組織工程以往的研究理念，突破無生命的材料不可能誘導(dǎo)組織形成的傳統(tǒng)觀點(diǎn)，從干細(xì)胞增殖及定向分化的微環(huán)境出發(fā)，根據(jù)特定組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及生物環(huán)境要求，以生物可降解高分子材料為基礎(chǔ)材料，通過納米電紡技術(shù)及材料表面改性等技術(shù)，對(duì)材料的微觀微孔結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和化學(xué)修飾等技術(shù)進(jìn)行深入研究，引入與干細(xì)胞遷移、粘附、增殖分化相關(guān)的天然生物活性材料及活性因子等，設(shè)計(jì)構(gòu)建出了具有良好生物相容性、足夠的力學(xué)強(qiáng)度、可生物降解、適合干細(xì)胞增殖及定向分化、具有促進(jìn)細(xì)胞遷移粘附及捕獲干細(xì)胞從而誘導(dǎo)骨、軟骨、神經(jīng)及皮膚等組織再生功能的仿生三維立體組織工程支架。實(shí)現(xiàn)僅通過支架材料自身即可實(shí)現(xiàn)受損組織的再生與重建，為再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供新思路和新途徑。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1新生組織的生長(zhǎng)狀態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1高分子紡絲液的配制將聚己內(nèi)酯(PCL，分子量10萬)、明膠(GE，分子量10萬)與活性物質(zhì)(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF或一定比例的富血小板血漿PRP)溶解在三氟代乙醇中，配制成總濃度為12W/v%的混合溶液作為高分子紡絲液，其中PCL、GE、活性物質(zhì)的質(zhì)量比為70 25 5。支架材料的制備選用單噴頭紡絲裝置，將所得高分子紡絲液裝入靜電紡絲設(shè)備的儲(chǔ)液裝置中，調(diào)整溶液的供料速率為20ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為12cm ；環(huán)境溫度為25°C ；靜電壓為20kV，在收集器上得到高分子納米纖維，纖維平均直徑為400nmo將所獲得的高分子納米纖維浸泡到新配制的、在4°C冰箱中儲(chǔ)存池以上的、含50mM 200mM的碳二亞胺的80/20的丙酮和水的混合溶液中，于4°C冰箱中交聯(lián)反應(yīng)1 后，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到本發(fā)明的一種可作為物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的高分子納米纖維膜材料。復(fù)制新西蘭大白兔全層皮膚缺損動(dòng)物模型，將制備的高分子納米纖維膜材料消毒滅菌后移植于皮膚缺損處，分別于不同時(shí)間觀察缺損皮膚的修復(fù)狀況。結(jié)果隨著時(shí)間增加，白色纖維移植物逐漸降解，創(chuàng)面及移植物新鮮濕潤(rùn)，4周左右移植物完全形成新生皮膚；冰凍切片HE染色結(jié)果顯示形成的新生皮膚結(jié)構(gòu)和正常皮膚基本相同，形成了正常的表皮層、皮下組織層及真皮層，并可見有皮膚附屬器——毛發(fā)、皮脂腺、汗腺等形成。(參見圖1)。實(shí)施例2高分子紡絲液的配制將聚己內(nèi)酯(PCL，分子量10萬)溶解在80 20的氯仿與甲醇的混合溶劑中，配制成8w/V%的PCL溶液；將明膠(GE，分子量30萬)與活性物質(zhì)(骨形成蛋白BMP-2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β或一定比例的富血小板血漿PRP)溶解在水中，配制成總濃度為15W/v%的混合溶液，其中GE與活性物質(zhì)的質(zhì)量比為90 10。支架材料的制備選用雙噴頭紡絲裝置，將上述配制的PCL溶液與含有活性物質(zhì)的GE混合溶液分別裝入兩個(gè)不同的輸液通路中，調(diào)整溶液的供料速率為15ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為12cm ；環(huán)境溫度為25°C;PCL電紡靜電壓為18kV，GE電紡靜電壓為22kV，在收集器上得到含活性物質(zhì)的厚度為0.2-0. 4mm的纖維膜材料，且PCL GE 活性物質(zhì)的質(zhì)量比為35 48 7。其中PCL平均纖維直徑在150-600nm，GE平均纖維直徑約 100-400nm。將所獲得的纖維膜浸泡到新配置的、在4°C冰箱中儲(chǔ)存池以上的、含50mM 200mM的碳二亞胺的80/20的丙酮和水的混合溶液中，于4°C冰箱中交聯(lián)反應(yīng)1 后，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到可作為物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的復(fù)合高分子納米纖維膜材料。實(shí)施例3
高分子紡絲液的配制將聚己內(nèi)酯(PCL，分子量10萬)與活性物質(zhì)(內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF、富血小板血漿PRP)溶解在80 20的氯仿與甲醇的混合溶劑中，配制成8w/
的紡絲液，其中PCL和活性物質(zhì)的質(zhì)量比為85 15。支架材料的制備選用單噴頭紡絲裝置，將所得高分子紡絲液裝入靜電紡絲設(shè)備的儲(chǔ)液裝置中，調(diào)整溶液的供料速率為20ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為12cm ；環(huán)境溫度為25°C ；靜電壓為20kV，在收集器上得到0. 4mm厚的高分子納米纖維，纖維平均直徑為500nm。實(shí)施例4(1)高分子紡絲液的配置將PLGA (分子量10萬)溶解在80/20的DMF與丙酮的混合溶劑中，獲得濃度為10w/V%的PLGA溶液；將透明質(zhì)酸(分子量為200萬)與活性分子(內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF、CD31抗體)溶解在3/2的DMF與水的混合溶劑中，配制得濃度為3W/v%的混合溶液，其中透明質(zhì)酸與活性分子質(zhì)量比為50/50。(2)納米纖維膜材料的制備選用多噴頭紡絲裝置，將PLGA溶液與透明質(zhì)酸的混合溶液分別填裝到不同的輸液通路中進(jìn)行靜電紡絲，電紡工藝參數(shù)為靜電壓為25kV ；供料速率為20ul/min，接受距離為8cm ；環(huán)境溫度為50°C，在收集器上得到0. 3mm厚的高分子纖維膜材料，且PLGA 透明質(zhì)酸活性物質(zhì)的質(zhì)量比為77 11.5 11. 5，PLGA纖維直徑為200-1000nm，透明質(zhì)酸纖維直徑為50_200nm。(3)將步驟( 所獲得的纖維膜浸泡到含200mM碳二亞胺的80/20的乙醇和水的混合溶液中，對(duì)透明質(zhì)酸組分進(jìn)行交聯(lián)，于4°c冰箱中交聯(lián)反應(yīng)1 后，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到可作為物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的復(fù)合高分子納米纖維膜材料。實(shí)施例5(1)高分子紡絲液的配置將PLA(分子量12萬)溶解在70/30的DMF與氯仿的混合溶劑中，獲得濃度為10w/V%的PLA溶液；將膠原蛋白(分子量為100萬)與活性分子(內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF、CD31抗體)溶解在9/1的水與乙醇的混合溶劑中，配制得濃度為3w/V%的混合溶液，其中透明質(zhì)酸與活性分子質(zhì)量比為80/20。(2)納米纖維膜材料的制備選用多噴頭紡絲裝置，將PLA溶液與膠原蛋白的混合溶液分別填裝到不同的輸液通路中進(jìn)行靜電紡絲，電紡工藝參數(shù)為靜電壓為22kV ；供料速率為20ul/min，接受距離為8cm ；環(huán)境溫度為50°C，在收集器上得到0. 2mm厚的高分子纖維膜材料，且PLA 膠原蛋白活性物質(zhì)的質(zhì)量比為77 18 5，PLA纖維直徑為200-800nm，膠原蛋白纖維直徑為100_400nm。(3)將步驟( 所獲得的纖維膜浸泡到含IOOmM碳二亞胺的80/20的乙醇和水的混合溶液中，對(duì)膠原蛋白組分進(jìn)行交聯(lián)，于4°c冰箱中交聯(lián)反應(yīng)1 后，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到可作為物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的復(fù)合高分子納米纖維膜材料。(4)復(fù)制兔全層皮膚缺損模型(在制備皮膚缺損模型前抽取骨髓提取培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并進(jìn)行GFP轉(zhuǎn)基因標(biāo)記)，將步驟C3)制備的纖維膜覆蓋于兔背皮膚傷口處，同時(shí)靜脈注射100萬個(gè)經(jīng)GFP標(biāo)記的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，于不同時(shí)間分批取出移植物，熒光顯微鏡下觀察干細(xì)胞遷移粘附情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植的纖維膜上有綠色熒光細(xì)胞，說明所構(gòu)建材料可吸引干細(xì)胞遷移粘附，即具有募集干細(xì)胞的作用。實(shí)施例6(1)高分子紡絲液的配置將PLGA (分子量10萬)溶解在80/20的DMF與丙酮的混合溶劑中，獲得濃度為12w/V%的PLGA溶液；將殼聚糖(分子量為20萬)與活性分子(層粘連蛋白、bFGF、EGF^DM抗體)溶解在80/20的水與乙酸的混合溶劑中，配制得濃度為5W/v%的混合溶液，其中殼聚糖與活性分子質(zhì)量比為50 50。(2)納米纖維膜材料的制備選用多噴頭紡絲裝置，將PLGA溶液與殼聚糖的混合溶液分別填裝到不同的輸液通路中進(jìn)行靜電紡絲，電紡工藝參數(shù)為靜電壓為22kV ；供料速率為20ul/min，接受距離為8cm ；環(huán)境溫度為50°C，在收集器上得到0. 15mm厚的高分子纖維膜材料，且PLGA 殼聚糖活性物質(zhì)的質(zhì)量比為70 15 15，PLGA纖維直徑為200-1000nm,殼聚糖纖維直徑在50_100nm。(3)將步驟( 所獲得的纖維膜至于戊二醛蒸汽中對(duì)纖維膜進(jìn)行交聯(lián)，在反應(yīng)1 后，至于真空干燥室進(jìn)行干燥，得到可作為物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的復(fù)合高分子納米纖維膜材料。(4)將步驟( 制備的纖維膜置于含神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的生物反應(yīng)器中進(jìn)行立體動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，不同時(shí)間取出纖維膜觀察干細(xì)胞粘附增殖情況。結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維膜上的NSC逐漸增多，且細(xì)胞伸出觸角軸突呈神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)并表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志NSE和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志GFAP，表明所構(gòu)建的纖維膜可粘附干細(xì)胞并促進(jìn)其增殖分化。實(shí)施例7(1)高分子紡絲液的配置將PLGA (分子量10萬)溶解在80/20的DMF與丙酮的混合溶劑中，獲得濃度為10w/V%的PLGA溶液；將透明質(zhì)酸(分子量為200萬)、明膠(膠凍強(qiáng)度=Approx. 220Bloom)與活性分子(CDM抗體、趨化因子SDF-1、表皮生長(zhǎng)因子EGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF)溶解在90/10的水與乙醇的混合溶劑中，配制得濃度為5W/v%的混合溶液，其中透明質(zhì)酸、明膠與活性分子質(zhì)量比為25 25 50。(2)納米纖維膜材料的制備選用多噴頭紡絲裝置，將PLGA溶液與透明質(zhì)酸的混合溶液分別填裝到不同的輸液通路中進(jìn)行靜電紡絲，電紡工藝參數(shù)為靜電壓為22kV ；供料速率為20ul/min，接受距離為8cm環(huán)境溫度為50°C，在收集器上得到厚為0. 12mm厚的高分子纖維膜材料，且PLGA 天然高分子活性物質(zhì)的質(zhì)量比為67 16.5 16.5，PLGA纖維直徑為200-1000nm，天然高分子混合纖維直徑在50_300歷。(3)將步驟( 所獲得的纖維膜浸泡到含200mM碳二亞胺的80/20的乙醇和水的混合溶液中，對(duì)透明質(zhì)酸與明膠組分進(jìn)行交聯(lián)，于4°c冰箱中交聯(lián)反應(yīng)1 后，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到可作為物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的復(fù)合高分子納米纖維膜材料。(4)復(fù)制兔全層皮膚缺損模型(在制備皮膚缺損模型前抽取骨髓提取培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并進(jìn)行GFP轉(zhuǎn)基因標(biāo)記)，將步驟C3)制備的纖維膜覆蓋于兔背皮膚傷口處，同時(shí)靜脈注射100萬個(gè)經(jīng)GFP標(biāo)記的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，于不同時(shí)間分批取出移植物，熒光顯微鏡下觀察干細(xì)胞遷移粘附情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植的纖維膜上有綠色熒光細(xì)胞，說明所構(gòu)建材料可吸引干細(xì)胞遷移粘附，即具有募集干細(xì)胞的作用。
權(quán)利要求
1.一種物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料，其特征在于由可生物降解的高分子物質(zhì)和活性物質(zhì)制備而成，以高分子物質(zhì)為100重量份計(jì)，活性物質(zhì)為0-20重量份但不為零；所述100重量份高分子物質(zhì)由50-100重量份的合成高分子物質(zhì)和0-50重量份的天然高分子物質(zhì)組成；所述可生物降解的高分子物質(zhì)和活性物質(zhì)通過靜電紡絲形成高分子納米纖維膜或復(fù)合高分子納米纖維膜，所述的活性物質(zhì)均勻分布包埋在纖維膜內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料，其特征在于所述的合成高分子物質(zhì)的分子量為5 20萬，選自乳酸-羥基乙酸的共聚物PLGA、聚乳酸、聚己內(nèi)酯或聚乙交酯中的一種或幾種的混合物；所述的天然高分子物質(zhì)的分子量為5 100萬，選自透明質(zhì)酸、絲蛋白、硫酸軟骨素、肝素、膠原蛋白、明膠、殼聚糖、核酸、血清纖維結(jié)合蛋白或多肽中的一種或幾種的混合物；所述的活性物質(zhì)選自表皮生長(zhǎng)因子EGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β、胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF、⑶31抗體、⑶M抗體、層粘連蛋白、 趨化因子SDF-1、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子NGF、骨形成蛋白ΒΜΡ-2、成骨生長(zhǎng)肽0PG、血小板衍生生長(zhǎng)因子PDGF、含多種生長(zhǎng)因子的富血小板血漿中的一種或幾種的混合物。
3.如權(quán)利要求1所述的物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a、高分子紡絲液的配制將合成高分子物質(zhì)溶解在溶劑中，然后加入活性物質(zhì)，得到高分子紡絲液；b、支架材料的制備選用多噴頭或單噴頭紡絲裝置，將步驟a所得高分子紡絲液裝入靜電紡絲設(shè)備的儲(chǔ)液裝置中進(jìn)行靜電紡絲，得到可作為物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的高分子納米纖維膜材料，纖維直徑為50nm 5000nm。
4.如權(quán)利要求1所述的物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a、高分子紡絲液的配制將合成高分子物質(zhì)和天然高分子物質(zhì)混合溶解在溶劑中，然后加入活性物質(zhì)，得到高分子紡絲液；b、支架材料的制備選用多噴頭或單噴頭紡絲裝置，將步驟a所得高分子紡絲液裝入靜電紡絲設(shè)備的儲(chǔ)液裝置中進(jìn)行靜電紡絲，得到高分子納米纖維膜，纖維直徑為50nm 5000nm ；C、將步驟b所獲得的高分子納米纖維膜材料浸泡到交聯(lián)劑溶液中，對(duì)其中的天然高分子物質(zhì)組分進(jìn)行交聯(lián)，于室溫反應(yīng)6 12小時(shí)后，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到可作為物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的高分子納米纖維膜材料。
5.如權(quán)利要求1所述的物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a、高分子紡絲液的配制將合成高分子物質(zhì)溶解在第一溶劑中，配制成第一溶液；將活性物質(zhì)和天然高分子物質(zhì)溶解在第二溶劑中，配制成第二溶液；b、支架材料的制備選用多噴頭紡絲裝置或核殼電紡裝置，將步驟a所得第一溶液和第二溶液分別裝入不同輸液通路中進(jìn)行靜電紡絲，得到復(fù)合高分子納米纖維膜，其中合成高分子纖維的直徑為lOO-lOOOnm，天然高分子纖維的直徑為50-500nm，纖維膜的厚度為C、將步驟b所獲得的復(fù)合高分子納米纖維膜浸泡到交聯(lián)劑溶液中，對(duì)其中的天然高分子物質(zhì)組分進(jìn)行交聯(lián)，于室溫反應(yīng)6 12小時(shí)后，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到可作為物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料的復(fù)合高分子納米纖維膜材料。
6.如權(quán)利要求3或4所述的物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料，其特征在于所述的溶劑選自水、氟代試劑、氯仿、DMF、THF中的一種或幾種的混合物。
7.如權(quán)利要求3或4或5所述的物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料，其特征在于 所述的靜電紡絲的工藝條件為溶液的供料速率為5 50ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為8 20cm ；環(huán)境溫度為20 50°C ；靜電壓為10 30kV。
8.如權(quán)利要求4或5所述的物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料，其特征在于所述的交聯(lián)劑溶液是由碳二亞胺與丙酮和水的混合溶劑新配制的溶液，溫度為4°C，其中碳二亞胺的濃度為50mM 200mM，丙酮和水的混合溶劑中，丙酮與水的重量比為80 20。
9.如權(quán)利要求5所述的物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料，其特征在于所述的第一溶劑選自氯仿、DMF、THF中的一種或幾種的混合物；所述的第二溶劑選自水、或水與乙醇的混合物、或水與甲醇的混合物。
全文摘要
物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料及其制備方法。一種物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料，由可生物降解的高分子物質(zhì)和活性物質(zhì)制備而成，以高分子物質(zhì)為100重量份計(jì)，活性物質(zhì)為0-20重量份但不為零；100重量份高分子物質(zhì)由50-100重量份的合成高分子物質(zhì)和0-50重量份的天然高分子物質(zhì)組成；高分子物質(zhì)和活性物質(zhì)通過靜電紡絲形成高分子納米纖維膜或復(fù)合高分子納米纖維膜，活性物質(zhì)均勻鍵合在纖維膜表面。本發(fā)明的物理包埋活性物質(zhì)的組織工程支架材料，具有良好的生物相容性、足夠的力學(xué)強(qiáng)度、可生物降解、適合干細(xì)胞增殖及定向分化、具有促進(jìn)細(xì)胞遷移粘附及捕獲干細(xì)胞從而誘導(dǎo)骨、軟骨、神經(jīng)及皮膚等組織再生功能。
文檔編號(hào)A61L27/54GK102552976SQ20121003829
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者易應(yīng)萍, 汪泱, 聶華榮, 鄧志鋒, 郭菲 申請(qǐng)人:汪泱