專利名稱：制備具有生理活性的il－18多肽的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及制備具有生理活性的IL-18多肽的方法，更具體的是涉及制備活性人IL-18的方法。
IL-18，也被認(rèn)為是干擾素-γ-誘導(dǎo)因子，是最近發(fā)現(xiàn)的新的細(xì)胞因子。活性IL-18包含有157個氨基酸殘基。其具有潛在的生物學(xué)活性，包括通過T細(xì)胞和脾細(xì)胞誘導(dǎo)干擾素-γ-產(chǎn)物，增強(qiáng)NK細(xì)胞殺死活性，促進(jìn)原初(naive)CD4+T細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞。此外，人IL-18增大GM-CSF的產(chǎn)生和降低IL-10的產(chǎn)生。IL-18已經(jīng)顯示出比IL-12有更高的干擾素-γ-誘導(dǎo)能力，通過不同的受體發(fā)出信號和利用不同的信號傳導(dǎo)途徑。
IL-18，編碼的核苷酸序列，和純化蛋白質(zhì)的某些物理化學(xué)的化學(xué)性質(zhì)是已知的(Ushio，S.，et al.，1996，J.Immunology，156，4274-4279；Dinarello，C.A.，et al.1998，J.Leukocyte Biology，1998.63，658-664)。
Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kayaku Kenkyujo′s(″Hayashibara″)，U.S.5,192,324，相應(yīng)于EP 0692536，于1996年1月17日出版，公開了一種小鼠蛋白，該蛋白通過免疫活性細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，該蛋白被進(jìn)一步的鑒定具有某些物理化學(xué)性質(zhì)和已經(jīng)定義的部分氨基酸序列特征。還公開了具有157個氨基酸序列的蛋白，及其兩個片斷，編碼該蛋白的DNA(471bp)，雜交瘤，蛋白純化的方法，以及檢測該蛋白的方法。
Hayashibara′s U.S.6,214,584，相應(yīng)于EP 0712931，于1996年5月22日出版，公開了157個氨基酸的人蛋白及其同系物，編碼該蛋白的DNA，轉(zhuǎn)化體，制備該蛋白的方法，針對該蛋白的單克隆抗體，雜交瘤，蛋白純化的方法，檢測該蛋白的方法，處理和/或抑制惡性腫瘤的方法，病毒病，細(xì)菌感染疾病，和免疫疾病。
Incyte Pharmaceuticals，Inc.′s，WO 97/24441，出版于1997年7月10日，公開了193個氨基酸的蛋白質(zhì)，相應(yīng)于IL-18前體和編碼DNA。
人類細(xì)胞中，由基因表達(dá)形成的多肽可能由胞內(nèi)酶部分消化并接受糖鏈。能滿意地地與藥物結(jié)合的多肽可能是有與在人類細(xì)胞中相同加工的那些。已知大多數(shù)細(xì)胞因子通常以不具有生物學(xué)活性的細(xì)胞前體的形式產(chǎn)生，然后由胞內(nèi)酶進(jìn)行加工將其轉(zhuǎn)化成活性多肽。
IL-18多肽通常以193個氨基酸的前體的形式存在于人類細(xì)胞中，并且沒有生物學(xué)活性。前體IL-18也就是ProIL-18。一種由IL-18前體制備活性IL-18的方法由Hayashibara′s U.S.5,879,942所傳授，相應(yīng)于EP0819757，出版于1998年1月21日。所述專利公開了可將IL-18前體轉(zhuǎn)化成活性IL18的酶或蛋白。
由IL-18前體制備活性IL18的另一種方法是由Hayashibara′s U.S.5,891,663所傳授的，相應(yīng)于EP0821005，出版于1998年1月28日。該專利公開了將IL-18前體與白介素-1β-轉(zhuǎn)化酶(″ICE″)接觸。該專利與參考文獻(xiàn)在此引入作為參考。
作為細(xì)胞程序死亡和炎癥介質(zhì)的ICE在文中已得以廣泛研究。還知道ICE可將白介素-1和白介素-18的前體加工成活性形式(Thornberry，NA，etal.，1992，Nature 356，768-774；Ghayur，T et al.，1997，Nature386，619-623)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用活化酶體外激活人IL-18前體(也稱Pro-IL-18)的方法，包括將人前體IL-18與活化酶例如caspase 4或caspase 5接觸。更特別的是，本發(fā)明提供通過caspase 4和caspase 5作用IL-18前體以切割特定位點(diǎn)產(chǎn)生活性多肽的方法，所述活性多肽可在免疫活性細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生。
本發(fā)明進(jìn)一步提供體內(nèi)激活人IL-18前體的方法，包括蛋白與活化酶的共表達(dá)。更特別的是，本發(fā)明提供利用蛋白酶體內(nèi)激活I(lǐng)L-18的方法，所述蛋白酶諸如caspase 4，也稱為ICERELII，caspase 5，也稱ICERELIII，和遍在蛋白(ubiquitin)-特異性蛋白酶，其可作用于IL-18多肽前體以將其轉(zhuǎn)化成可誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的活性多肽。
附圖簡述

圖1顯示人前體IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
圖2顯示編碼全長人IL-18的核酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3顯示活性人IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。
圖4顯示6-his標(biāo)記的N-末端截短的caspase 4的氨基酸序列(SEQ IDNO4)。
圖5顯示編碼氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列為6-his標(biāo)記的N-末端截短的caspase 4的氨基酸序列(SEQ ID NO5)。
圖6顯示6-his標(biāo)記的N-末端截短的caspase 5的氨基酸序列(SEQ IDNO6)。
圖7顯示編碼氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列為6-his標(biāo)記的N-末端截短的caspase 5的氨基酸序列(SEQ ID NO7)。
圖8顯示雙順反子表達(dá)盒(bicistronic expression cassette)的概圖，用于大腸桿菌中Pro-IL-18和截短的caspase 4共表達(dá)的pET28-ProIL-18/Casp 4內(nèi)包含所述雙順反子表達(dá)盒。
圖9顯示pET28內(nèi)Pro-IL-18/Caspase 4表達(dá)盒的序列(SEQ ID NO8)。
圖10顯示Pro-IL-18/Caspase 4表達(dá)盒的annotated序列，編號方式與pET28a載體內(nèi)的位點(diǎn)相應(yīng)。
圖11顯示Pro-IL-18/Caspase4的誘導(dǎo)。
圖12顯示雙順反子表達(dá)盒的概圖，用于大腸桿菌中ProIL-18和Caspase 5共表達(dá)的pET28-ProIL-18/截短的Caspase-5內(nèi)包含所述雙順反子表達(dá)盒。
圖13顯示pET28內(nèi)Pro-IL-18/Caspase 5表達(dá)盒的序列(SEQ ID NO9)。
圖14顯示Pro-IL-18/截短的Caspase 5表達(dá)盒的annotated序列表，詳述調(diào)控序列的特征和Pro-IL-18與截短的Caspase 5的翻譯，編號方式與pET28a載體內(nèi)的位點(diǎn)相對應(yīng)。
圖15顯示Pro-IL-18/Caspase 5的誘導(dǎo)。
圖16顯示Ub-IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO10)。
圖17顯示編碼Ub-IL-18氨基酸序列的核酸序列(SEQ ID NO11)。
圖18顯示pET28載體內(nèi)Ub-IL-18/Ubp-1表達(dá)盒的核酸序列(SEQ ID NO12)。
圖19顯示pET28載體內(nèi)Ub-IL-18/Ubp-1的annotated序列，編號方式與pET28載體內(nèi)的位點(diǎn)相對應(yīng)。
圖20顯示通過Ubp-1的Ub-IL-18表達(dá)和加工。
圖21顯示利用KG-1(人骨髓單核細(xì)胞系)細(xì)胞的IL-18活性鑒定并且監(jiān)測IFN-γ的產(chǎn)生(如所示的IL-18以各種方式表達(dá))。
圖22顯示利用純化的人PBMCs進(jìn)行的IL-18活性鑒定并且監(jiān)測IFN-γ的產(chǎn)生(如所示IL-18以各種方式表達(dá))。
發(fā)明詳述Caspase 4和5是胱氨酸蛋白酶家族的成員，包括白介素-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)，其優(yōu)先切割包含蛋白酶激活基元的底物，所述基元包括氨基酸序列XEYD，其中X選自由W，L，F(xiàn)，Y，I，V，D，或E組成的氨基酸組，E是谷氨酸，Y選自由H，I，A，T，S，P或E組成的氨基酸組；D是天冬氨酸(Munday，N.A.，et al.，1995，J.Biol.Chemistry，270，15870-15876；Talanian，R.V.et al，1997，J.Biol.Chemistry 272，96 77-82；Thonzberry，N.A.et al.1997 J.Biol.Chemistry 272，17907-11)。caspase-5的底物識別被認(rèn)為基本上是與ICE和caspase-4相同的而與caspase的其它成員不同。(Talanian，R.V.et al，1997，J.Biol.Chemistry 272，9677-82；Thomberry，N.A.et al.1997 J.Biol.Chemistry 272，17907-11)。Caspase4在EP-B-0 754 234中公開。Caspase 5在U.S.5,552,536和U.S.5,760,180中公開。
遍在蛋白-特異性蛋白酶屬于不依賴ATP型酶家族，可精確地從與其融合的蛋白質(zhì)N末端切割進(jìn)化上保守的76氨基酸遍在蛋白多肽。這些蛋白酶特異地切割肽鍵，該肽鍵在遍在蛋白蛋白質(zhì)羧基-末端氨基酸殘基和結(jié)合遍在蛋白的任何非-遍在蛋白蛋白質(zhì)的氨基基團(tuán)間。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的遍在蛋白-特異性蛋白酶，Ubp1，Ubp-2，和Ubp-3，例如，是已知的并且可被重組表達(dá)以催化去除遍在蛋白的反應(yīng)，該反應(yīng)在體內(nèi)和體外靶向遍在蛋白融合蛋白(Baker，RT et al.，1992，J.Biol.Chem.26723364-23375；Baker，RT et al.，1994 J.Biol.Chem.26925381-25386)。除了以脯氨酸起點(diǎn)的外，釀酒酵母遍在蛋白-特異性蛋白酶的特異性容許精確地自任何肽去除遍在蛋白。其它種類的遍在蛋白-特異性蛋白酶諸如小鼠Unp和其人同系物的Unph，甚至能在脯氨酸前進(jìn)行有效的切割(GilchristCA et al.1997，J.Biol.Chem.27232280-32285。因此，在體外結(jié)合或與遍在蛋白特異性蛋白酶共表達(dá)時，通過去除精確融合的遍在蛋白肽事實(shí)上可生成任何所需的N-末端。遍在蛋白特異性蛋白酶在U.S.5,212,058；U.S.5,683,904；U.S.5,391,490；和U.S.5,494,818中公開。
任何天然的或人工制備的caspase 4，caspase 5，或遍在蛋白蛋白酶只要其產(chǎn)生活性多肽就可用于本發(fā)明中，所述活性多肽可獨(dú)立于其結(jié)構(gòu)，來源和起源在免疫活性細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生。
人類細(xì)胞中，基因表達(dá)形成的多肽可通過胞內(nèi)酶加工。胞內(nèi)酶將前體蛋白，諸如ProIL-18切割成它們的活性形式。能令人滿意地結(jié)合藥物的多肽應(yīng)該受到與人類細(xì)胞中所進(jìn)行的多肽的加工相似的加工。多肽通常以前體的形式存在于人類細(xì)胞中并且沒有生物學(xué)活性。已知大多數(shù)細(xì)胞因子包括IL-18多肽通常生成的是沒有生物學(xué)活性的前體，接著通過胞內(nèi)酶加工轉(zhuǎn)化成活性多肽。
本發(fā)明所指的IL-18前體存在于，例如，可固有地產(chǎn)生該多肽的細(xì)胞，哺乳動物宿主細(xì)胞，和細(xì)菌系統(tǒng)中，諸如大腸桿菌，通過導(dǎo)入DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如具有SEQ ID NO2核苷酸序列的DNA，所述序列包含編碼所述多肽的區(qū)。使用所述哺乳動物的和細(xì)菌宿主細(xì)胞，前體IL-18可與蛋白酶共表達(dá)產(chǎn)生活性IL-18。
體外切割本發(fā)明提供前體多肽諸如IL-18前體的體外活化的方法，包括將前體多肽與活化酶接觸。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供人IL-18前體的體外活化的方法，包括將前體人IL-18與caspase 4或caspase 5接觸。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過活化酶切割而體外激活I(lǐng)L-18前體，所述活化酶可識別包括氨基酸序列XEYD的特異性蛋白酶激活基元，其中X選自由W，L，F(xiàn)，Y，I，V，D，或E組成的氨基酸組，Y選自由H，I，A，T，S，P或E組成的氨基酸組。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過caspase 4或caspase 5切割SEQ IDNO1中天冬氨酸36和酪氨酸37間的肽鍵而體外激活I(lǐng)L-18前體，以產(chǎn)生在免疫活性細(xì)胞中可誘導(dǎo)IFN-γ生成的活性多肽。
一般，caspase 4或caspase 5可從能固有地產(chǎn)生它的細(xì)胞和應(yīng)用重組DNA技術(shù)得到的轉(zhuǎn)化體中得到。所述細(xì)胞的實(shí)施例是自哺乳動物和人類細(xì)胞確定的那些，例如上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞及它們所確立的細(xì)胞系。轉(zhuǎn)化體的實(shí)施例包括通過將編碼caspase 5的DNA導(dǎo)入微生物和動物細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化微生物和動物細(xì)胞。通過在本領(lǐng)域所用的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化體來制備Caspase 4或caspase 5，或者在完整培養(yǎng)基(intact cultures)形式中或者是在從培養(yǎng)基分離后用超聲處理它們，或者是將轉(zhuǎn)化體浸在低滲溶劑中，將所得到的細(xì)胞碎片或包含細(xì)胞上清和細(xì)胞碎片的混合物應(yīng)用到下面本領(lǐng)域純化酶所用的常規(guī)技術(shù)中，鹽析，透析，過濾，濃縮，分離沉降(separatorysedimentation)，離子交換層析，凝膠過濾層析，吸附層析，等電層析，疏水層析(hydrophobic chroma tography)，親合層析，反相層析(reverse-phase chromatography)，親和層析凝膠電泳和電聚焦(affinitychromatography gel electrophoresis and electrofocusing)。兩種或更多種的這些純化方法可結(jié)合使用。編碼caspase 4(圖5)(SEQ ID NO5)和caspase 5(圖7)(SEQ ID NO7)的DNA和產(chǎn)生caspase 4與caspase5的轉(zhuǎn)化體在本領(lǐng)域是已知的。例如，如(Munday NA et al.，1996，J.Biol.Chem 2615870-76.)所述，通過表達(dá)沒有pro區(qū)的N-末端截短的肽在大腸桿菌中產(chǎn)生活性形式的所述酶。
固有地產(chǎn)生前體多肽的細(xì)胞，例如，Pro-IL-18，或能被轉(zhuǎn)化產(chǎn)生該前體的那些，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。優(yōu)選的培養(yǎng)基包括本領(lǐng)域所熟知的培養(yǎng)基，例如Luria Bertani培養(yǎng)基或用于培養(yǎng)大腸桿菌的豐富培養(yǎng)基，包括胰蛋白胨和酵母提取物。
利用上述方法得到的Caspase 4或caspase 5，在破碎自培養(yǎng)基分離的或未分離的增生細(xì)胞后，允許在所得的培養(yǎng)基中共存，或?qū)⑵浼尤氲剿没旌衔镏谢蚣?xì)胞碎片。所需caspase 4或caspase 5的數(shù)量低于該前體的等摩爾數(shù)。caspase 4或caspase 5在允許caspase 4或caspase 5作用于該前體的溫度與pH值下與前體接觸。通常，在溫度約為4-40℃和pH值約為6-9下caspase 4或caspase 5允許與前體反應(yīng)至所需量的活性多肽從物質(zhì)(material)前體形成。優(yōu)選的溫度約為25℃，優(yōu)選的pH值約為7.2，因此，可得到含活性多肽的反應(yīng)混合物。
根據(jù)作用每分鐘每微克caspase 4或caspase-5產(chǎn)生加工多肽的微克數(shù)，caspase 4或caspase 5的活性通過活性單位得以鑒定和表達(dá)。
體內(nèi)共表達(dá)本發(fā)明進(jìn)一步提供了體內(nèi)活化前體多肽的方法，例如IL-18前體，包括與活化的蛋白酶共表達(dá)該蛋白質(zhì)。更具體的是，本發(fā)明提供了體內(nèi)活化IL-18的方法，包括多肽例如IL-18與蛋白酶諸如caspase 4，caspase 5，和遍在蛋白的雙順反子共表達(dá)，caspase 4，也稱ICERELII，caspase 5，也稱ICERELIII。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，人caspase 4，也稱ICERELII，與人Pro-IL-18雙順反子共表達(dá)以允許體內(nèi)進(jìn)行ProIL-18加工成活性IL-18。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，截短的人caspase 4(SEQ ID NO.4)，與人Pro-IL-18雙順反子共表達(dá)以允許體內(nèi)進(jìn)行ProIL-18(SEQ ID NO1)加工成活性IL-18(SEQ ID NO3)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，人caspase 5，也稱ICERELIII，與人Pro-IL-18雙順反子共表達(dá)以允許體內(nèi)進(jìn)行ProIL-18加工成活性IL-18(SEQ ID NO3)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，遍在蛋白蛋白酶1(Ubp-1)與遍在蛋白-IL-18(Ubp-IL-18)雙順反子共表達(dá)以允許體內(nèi)進(jìn)行UB-IL-18加工成活性IL-18。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，遍在蛋白蛋白酶1(Ubp-1)與遍在蛋白-IL-18(Ubp-IL-18)雙順反子共表達(dá)以允許體內(nèi)進(jìn)行UB-IL-18(SEQ ID NO9)加工成活性IL-18(SEQ ID NO3)。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，截短的人caspase 5(SEQ ID NO5)，與人Pro-IL-18雙順反子共表達(dá)以允許體內(nèi)進(jìn)行ProIL-18(SEQ ID NO1)加工成活性IL-18(SEQ ID NO3)。
將編碼caspase 4或caspase 5的DNA和編碼所述多肽前體的DNA均導(dǎo)入合適的微生物和動物細(xì)胞以進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在這種情況下，DNA表達(dá)所形成的caspase 4或caspase 5，作用于相同轉(zhuǎn)化體中DNA表達(dá)形成的多肽前體，以形成活性多肽(圖11和15)。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是表皮-，間質(zhì)-，成神經(jīng)細(xì)胞-，造血-細(xì)胞系，衍生于人，猴，小鼠和倉鼠以及常用作宿主的例如3T3細(xì)胞，包括3T3-Swiss albino細(xì)胞(ATCC CCL 92)，C1271細(xì)胞(ATCC CRL1616)，CHO細(xì)胞包括CHOK1細(xì)胞(ATCC CCL 61)，CV-1細(xì)胞(ATCC CCL 70)，COS細(xì)胞包括COS-1細(xì)胞(ATCC CCL 1650)，HeLa細(xì)胞(ATCC CCL 2)，MOP細(xì)胞包括MOP-8細(xì)胞(ATCCCRL 1709)和它們的突變體。最優(yōu)選的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。最優(yōu)選的方法是用氯化銣(rubidium chloride)的化學(xué)轉(zhuǎn)化，將編碼caspase 4或5的DNA與編碼所述多肽前體的DNA導(dǎo)入大腸桿菌，這是本領(lǐng)域所熟知的。將編碼caspase 4或5的DNA與編碼所述多肽前體的DNA導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞包括常規(guī)的DEAE-葡聚糖方法，磷酸鈣方法，電穿孔，脂轉(zhuǎn)染，微注射，病毒感染方法，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，皰疹病毒，牛痘病毒。這種情況下，按照下面標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使用載體例如pCD，pcIL-SRα，pKY4，pCDM8，pCEV4，pME18S和pSV2-gpt，所述載體包括合適的啟動子，增強(qiáng)子，復(fù)制起點(diǎn)，終止點(diǎn)，剪接序列，聚腺苷酸化序列和/或選擇標(biāo)記，描述于Ausubel FM et al.，1994 Current Protocols inMolecular Biology，New YorkGreene Publishing Assoc.和WileyInterscience中。通過免疫學(xué)檢測觀察到產(chǎn)生活性多肽的克隆，由在營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)后從轉(zhuǎn)化體選擇所需克隆進(jìn)行篩選。用本領(lǐng)域常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)克隆轉(zhuǎn)化體得到含活性多肽的培養(yǎng)物。對于固有產(chǎn)生所述多肽前體的細(xì)胞和其它轉(zhuǎn)化產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞，它們在活化酶下可產(chǎn)生所述前體，活化所述多肽，所述活化酶例如caspase 4，caspase 5，和遍在蛋白。應(yīng)用哺乳動物宿主細(xì)胞的重組DNA技術(shù)在Glutzman，Cell，23175(1981)Mullingan，PNAS782072(1981)中詳細(xì)公開。應(yīng)用細(xì)菌宿主細(xì)胞的重組DNA技術(shù)在蛋白質(zhì)表達(dá)A Practical Approach，S.J.Higgins和B.D.Hames eds.1999，New York，Oxford University Press中公開。
在所得反應(yīng)混合物和培養(yǎng)物包含活性IL-18多肽，可完整地用作IFN-γ誘導(dǎo)物時，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用超聲，細(xì)胞裂解酶和/或表面活性劑破碎培養(yǎng)物中的細(xì)胞，接著通過過濾，離心等，從所得的細(xì)胞和細(xì)胞碎片中分離所述多肽，下面標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)方法描述于(Protein PurificationPrinciples and Practice，Cantor，C.R.ed.1993，New York，Spinger-Verlag)。通過本領(lǐng)域用于純化生物學(xué)活性物質(zhì)的常規(guī)純化方法，所述分離于細(xì)胞和細(xì)胞碎片的多肽得以提純，例如，鹽析，透析，過濾，濃縮，分離沉降，離子交換層析，凝膠過濾層析，吸附層析，等電層析，疏水層析，反相層析，親合層析，凝膠電泳和電聚焦親和層析。如果必要，兩種或更多種的這些純化方法可結(jié)合使用。所得純化的多肽可被濃縮并冷凍干燥成液體或固體產(chǎn)物以滿足最終的用途。
本發(fā)明雙順反子表達(dá)盒是多用途載體，事實(shí)上可用于體內(nèi)的加工任何多肽，所述多肽包含合適的caspase 4/caspase 5或遍在蛋白酶(ubiquitinase)的切割識別位點(diǎn)，如先前描述(Tobias，J.W.et al.，Journal of Biological Chemistry，1991.266(18)p.12021.12028；Talanian，R.V.et al.，Journal of biological Chemistry，1997.272(15)p.9677-9682)。雙順反子表達(dá)提供有利于其它共表達(dá)策略的優(yōu)點(diǎn)，由于兩基因結(jié)合在相同的轉(zhuǎn)錄單元，確保兩基因隨時間(over time)的一致表達(dá)(consistent expression)。這可與雙質(zhì)粒系統(tǒng)相比較，長時間時雙質(zhì)粒其中之一可能丟失，或單質(zhì)粒雙啟動子系統(tǒng)，其中表達(dá)可由于一個實(shí)驗到另一個實(shí)驗的每個啟動子而變化。尤其是，本文所述的雙順反子表達(dá)系統(tǒng)理想地適合于體內(nèi)活化酶，細(xì)胞因子，生長因子以及其它蛋白水解的可激活的蛋白，由此能自在單步(single step)中由細(xì)胞大規(guī)模地生產(chǎn)所述蛋白，不需要單獨(dú)的體外激活步驟。
活化蛋白酶，caspase 4(Ala105到Asn377)或caspase 5(Ile146到Asn418)，緊接Pro-IL-18序列之后被亞克隆為N-末端6-His融合，以產(chǎn)生兩基因的轉(zhuǎn)錄融合。T7終止子位于caspase-4序列的下游用于雙順反子轉(zhuǎn)錄單元的翻譯終止。包括缺陷型Shine Dalgarno序列的小基因間隔區(qū)被加入以僅允許自caspase-4序列起始的最低的翻譯(圖10和14)。其它調(diào)控區(qū)包括25堿基對lac操縱子序列，所述操縱子序列緊接17堿基對啟動子的下游，其通過lac阻遏物結(jié)合，所述lac阻遏物由位于該質(zhì)粒的lac-I基因的拷貝編碼，由此在沒有T7 RNA聚合酶時抑制基本轉(zhuǎn)錄。然后將指定為ProIL18/Casp4和ProIL18/Casp5的所得質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21(DE3)菌株，該菌株包含T7聚合酶基因的誘導(dǎo)染色體拷貝。
雙順反子盒的翻譯受T7啟動子的指導(dǎo)，其受噬菌體T7 RNA聚合酶蛋白的控制，被自T7 RNA聚合酶基因的溶源性拷貝所編碼。該T7 RNA聚合酶染色體拷貝自身是在lacUV5啟動子的控制之下，通過添加異丙基-1-thio-b-D-galactopyranoside誘導(dǎo)。誘導(dǎo)導(dǎo)致Pro-IL18和組氨酸-caspase-4或組氨酸-caspase-5協(xié)同轉(zhuǎn)錄和翻譯。初期(Nascently)翻譯的caspase-4或caspase-5自動加工成活性種類，其啟動蛋白水解活化pro-IL-18。翻譯的前體IL-18以及翻譯后活化的IL-18主要是大腸桿菌內(nèi)可溶性的。通過常規(guī)層析方法誘導(dǎo)后，包含N-末端酪氨酸的成熟活性IL-18從細(xì)胞溶解產(chǎn)物直接純化。在37℃4小時或29℃18小時用caspase-4切割成熟IL-18得以完成(圖11)，29℃18小時用caspase-5切割成熟IL-18得以完成(圖15)。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明使用截短的(truncated)caspase 4，如圖4(SEQ ID NO4和SEQ ID NO5)所示，或截短的caspase 5，如圖5(SEQ ID NO6和SEQ ID NO7)所示。caspase 4和caspase 5的截短公開于Munday，N.A.，et al.，1995，J.Biol；Chemistry，270，15870-15876中。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生活性多肽的方法，是通過遍在蛋白-特異性蛋白酶與N-末端遍在蛋白IL-18融合體(前體)共表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，所述融合體是通過遍在蛋白c-末端水解酶的活性而轉(zhuǎn)化成活性IL-18。包含真正的(authentic)N-末端酪氨酸的76個氨基酸遍在蛋白蛋白質(zhì)，與人IL-18成熟N-末端融合并且和遍在蛋白-特異性蛋白酶在大腸桿菌中共表達(dá)，例如如SEQ ID NO10和SEQ ID NO11所示。在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)遍在蛋白高度保守的7 6-殘基蛋白，其功能是標(biāo)記蛋白質(zhì)的降解(Baker，R.T.，CurrentOpinion in Biotechnology，1996.7(5)p.541-6)。通過遍在蛋白-特異性蛋白酶的作用，遍在蛋白被特異地自蛋白質(zhì)上切割，所述遍在蛋白-特異性蛋白酶在真核細(xì)胞中內(nèi)源性的表達(dá)，而在細(xì)菌中沒有。大腸桿菌中遍在蛋白融合蛋白質(zhì)與遍在蛋白-特異性蛋白酶的共表達(dá)還導(dǎo)致有效地去除遍在蛋白(Baker，R.T.et al.，Journal of Biological Chemistry，1992.267(32)p.23364-75)(圖20)。此外，大多數(shù)去除遍在蛋白的酶能在除了脯氨酸外的任何氨基酸前切割。因此，盡管在PI′位點(diǎn)存在大量的芳香族酪氨酸殘基，自成熟IL-18的遍在蛋白的切割是可能的。
遍在蛋白-IL-18(Ub-IL-18)和遍在蛋白蛋白酶-1(Ubp-1)(Tobias，J.W.et al.，Jour77al of Biological Chemistry，1991.266(18)p.12021.12028)的共表達(dá)通過在誘導(dǎo)型T7啟動子控制下兩基因的雙順反子表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)。成熟IL-18表達(dá)為N-末端與進(jìn)化上保守的76氨基酸遍在蛋白肽的融合體。pET28a載體內(nèi)T7 RNA聚合酶啟動子控制下將Ub-IL-18cDNA亞克隆。隨后，編碼全長遍在蛋白-特異性蛋白酶的cDNA被亞克隆T7終止子序列前的下游(圖19)。由于Ub-IL-18和遍在蛋白特異性蛋白酶cDNA被翻譯成單mRNA轉(zhuǎn)錄物，從中Ub-IL-18和遍在蛋白-特異性蛋白酶cDNA′s被分別轉(zhuǎn)錄。
如上所述，本發(fā)明方法獲得的活性人IL-18多肽，具有誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)物作為有用的生物學(xué)活性物質(zhì)生成的活性，刺激自KG-1(人骨髓單核細(xì)胞系)細(xì)胞產(chǎn)生IFNg并純化人PBMCs(圖22)。
所有的出版物和專利在此引入作為參考，下面的實(shí)施例進(jìn)一步解釋但并不限制本發(fā)明實(shí)施例實(shí)施例1-前體IL-18(pro-IL-18)的制備在大腸桿菌中人前體IL-18被表達(dá)為N-末端6-組氨酸標(biāo)記的融合體。表達(dá)質(zhì)粒ProEx-hIL18，衍生于包含Trc啟動子和IacIq的載體pPROEX-1(生命技術(shù))用于異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。為了構(gòu)建重組表達(dá)載體，含完整caspase 5前體基因的DNA片斷自cDNA克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，5′以Nde I和3′以Bam HI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)加尾。pPROEX-中在兩限制位點(diǎn)間擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆，由此產(chǎn)生與載體中6-組氨酸編碼序列的框內(nèi)N-末端融合(in frame N-terminal fusion)。
在37℃用IPTG誘導(dǎo)5小時后，所得質(zhì)粒在DH10B宿主細(xì)胞中表達(dá)。自誘導(dǎo)培養(yǎng)物離心后得到的細(xì)胞沉淀中收獲重組蛋白。
實(shí)施例2-pro-IL-18的純化將如實(shí)施例1中所述表達(dá)pro-IL-18的1.5kg大腸桿菌細(xì)胞懸浮于3.6L裂解緩沖液C(50mM Tris HCl，10mM BME，0.5M NaCI，5％甘油，1ug/ml胃蛋白酶抑制劑A，1ug/ml leupepsin，0.4mM AEBSF)中，通過Microfluidics在12,000psi，28,000xg離心，兩步法(two passes)裂解，并收集到3.7L上清，將用含5mM咪唑(BufferD)緩沖液C預(yù)平衡過的600ml NiNTA瓊脂糖加入到上清中并溫育漿液一小時以捕獲pro-IL-18。漿液在低速度(3,000rpm)下離心，傾析上清，將漿液上柱，用緩沖液D沖洗該柱，并且用300mM咪唑緩沖液C洗脫出pro-IL-18。在緩沖液E(25mM HEPES，10mM BME，pH8.0)中透析匯集液(pool)，并應(yīng)用到用相同緩沖液平衡過的DEAE ToyoPearl 650M柱上，用0-0.5M NaCl線性梯度緩沖液E洗脫柱，匯集液包含650mg＞90％純pro-IL-18。
實(shí)施例3-Caspase 4的制備在大腸桿菌中人前體caspase-4也被表達(dá)為N-末端6-組氨酸標(biāo)記的融合體。表達(dá)質(zhì)粒，pET16b-caspase 4，衍生于包含噬菌體T7啟動子的載體pET16b(Novagen)。重組載體通過PCR擴(kuò)增caspase-4活性域(氨基酸Ile146至Asn418)而構(gòu)建，所述域在N-末端結(jié)合有6-組氨酸編碼序列，并且以NcoI和Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)加尾。所得PCR產(chǎn)物接著在此兩限制位點(diǎn)間進(jìn)行亞克隆產(chǎn)生N-末端6-組氨酸Caspase 4融合載體。
在lacUV5啟動子控制下，將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到溶源性BL21 DE3大腸桿菌菌株，該大腸桿菌菌株包含T7 RNA聚合酶的染色體拷貝，用1mM IPTG誘導(dǎo)后能誘導(dǎo)表達(dá)caspase 4。從細(xì)胞沉淀中純化活性蛋白，所述沉淀在37℃誘導(dǎo)3小時后分離。
實(shí)施例4-Caspase 4的純化在裂解大腸桿菌細(xì)胞時，如實(shí)施例2所述該大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)N-末端6-組氨酸標(biāo)記的人caspase 4，在裂解物上清中可檢測caspase 4活性。在自上清的NiNTA瓊脂糖珠粒(bead)捕獲蛋白質(zhì)時，均可回收p10和p20。這表明在細(xì)胞培養(yǎng)期間通過p10和p20結(jié)合點(diǎn)自動切割活化caspase 4蛋白酶域，其維持非共價異二聚體。利用該信息，6-組氨酸標(biāo)記p20/p10異二聚體可被純化。整個方法在4℃實(shí)施以避免任何進(jìn)一步的分子斷裂。
約400g濕大腸桿菌細(xì)胞沉淀懸浮于含25mM HEPES，0.1％CHAPS，500mM NaCl，10mM β巰基乙醇(BME)，pH7.4，和10％甘油(Buffer A)的1.6L裂解緩沖液中，并用兩步法經(jīng)Microfluidics 12,000psi裂解，裂解物與30,000xg離心一小時，回收得到1.7L裂解物上清。將用含5mM咪唑裂解緩沖液預(yù)先平衡的150ml NiNTA瓊脂糖加入到該裂解物上清中，用2NNaOH將懸浮液調(diào)節(jié)到pH8.0，caspase 4分批吸附(batch-absorbed)一小時。將NiNTA瓊脂糖填充到柱中，用5mM和25mM咪唑的緩沖液A依次沖洗以去除雜質(zhì)，并用300mM咪唑緩沖液A洗脫caspase 5。蛋白質(zhì)對BufferB(25mM HEPES，0.1％CHAPS，10％甘油，10mM BME，pH8.0)透析，并應(yīng)用到用相同緩沖液預(yù)先平衡過的DEAE ToyoPearl 650M上。用100mM NaCl的相同緩沖液洗脫出Caspase 4。使用熒光肽底物，LEED-AMC，顯示高度特異性的caspase 4成分被匯集。
實(shí)施例5-體外活化和制備多肽如實(shí)施例2所述純化的Pro-IL-18使用Caspase 4以1∶500w/w的比例在室溫溫育3小時。根據(jù)SDS-PAGE分析Prodomain的切割反應(yīng)完成＞90％。反應(yīng)混合物中加入140ml NiNTA瓊脂糖的Buffer D，溫育1小時，倒到燒結(jié)玻璃板漏斗(sintered glass funnel)以回收未結(jié)合的主要包含成熟IL-18的物質(zhì)。少量剩余的pro-IL-18，prodomain，caspase 4和其它雜質(zhì)結(jié)合到NINTA瓊脂糖上。未結(jié)合溶液被調(diào)整到25mM DTT，溫育1小時以完成還原反應(yīng)，通過加入2M磷酸調(diào)整溶液pH值至6.0，用YM10膜濃縮至86ml。將濃縮的樣品應(yīng)用到預(yù)先用含0.1M NaCl的10mM NaPhosphate pH6.0平衡過的Superdex 75柱上，匯集的級分包含560毫克成熟IL-18。
實(shí)施例6-體內(nèi)活化和制備多肽通過同時表達(dá)人前體IL-18和caspase-4也可完成體內(nèi)活化IL-18。Pro-IL-18與人caspase-4在表達(dá)質(zhì)粒pET28-Pro-IL-18/Casp4內(nèi)雙順反子地自單轉(zhuǎn)錄物大腸桿菌共表達(dá)(圖5和6)。為了自Pro-IL-18序列最佳翻譯啟動，在T7啟動子控制下將人pro-IL-18基因亞克隆入pET28a(Novagen)，所述啟動子包括有效的Shine-Dalgarno序列(圖8)。緊接在包括缺陷型Shine-Dalgarno序列的Pro-IL-18序列之后，將caspase 4基因(Ile146至Asn418)亞克隆，以允許自caspase 4序列的最低翻譯啟動。包括T7終止子序列用于雙順反子轉(zhuǎn)錄單元之后翻譯終止。然后將所得的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至BL21(DE3)宿主，該宿主包含T7聚合酶基因的可誘導(dǎo)染色體拷貝。所述宿主中該構(gòu)建體用1mM IPTG的誘導(dǎo)導(dǎo)致pro-IL-18和pro-caspase 4的協(xié)同(coordinate)轉(zhuǎn)錄和翻譯。初期翻譯的pro-caspase 4被自動加工成活性種類，其啟動蛋白水解活化pro-IL-18。圖8顯示在1mM IPTG誘導(dǎo)(0-18小時)后，于29℃活化18小時的IL-18的時程(time course)。
實(shí)施例7-體內(nèi)活化caspase 4caspase 4的體內(nèi)活化在(Munday，N.A.，et al.，1995，J.Biol.Chemistry，270，15870-15876)中描述。大腸桿菌中缺少proregion通過切割成能裝配成活性酶異二聚體的P10和P20亞基，始于Ala 59截短形式的caspase-4的表達(dá)導(dǎo)致自活化(self-activation)。caspase-4活化的延遲被翻譯成Pro-IL-18切割和活化為成熟IL-18的延遲(圖9)。在其切割成成熟IL-18之前能積累更高穩(wěn)定的Pro-IL-18，成熟IL-18在細(xì)胞中穩(wěn)定性較低。
實(shí)施例8-與Caspase 4共表達(dá)的人IL-18的純化如實(shí)施例6所述，將表達(dá)IL-18的66g大腸桿菌細(xì)胞懸浮于含1mM EDTA和10mM DTT的130ml 0.1M HEPES pH7.5中(除了最后步驟沒有SH，整個方法在4℃進(jìn)行，并且存在10mM DTT)，使用Microfluidics通過兩步法于15,000psi裂解。裂解物(230ml)于34,000xg離心30分鐘。用25mMHEPES pH7.0將上清(200ml)稀釋至1L，并流經(jīng)串聯(lián)的兩柱ToyoPearl SP650M和ToyoPearl DEAE 650M，源于大腸桿菌細(xì)胞的許多雜質(zhì)結(jié)合到柱上。流通(flow-through)物質(zhì)用25mM bistris propane調(diào)整到pH9.5，稀釋至2L，應(yīng)用到用25mM bistris propane HCl pH9.5平衡過的Source 15Q柱上。用線性梯度0-0.5M NaCl的相同緩沖液洗脫該柱。使用Vydac C4RP-HPLC鑒定包含IL-18的級分并匯集(250ml)。使用YM10膜將匯集液濃縮成50ml并應(yīng)用到Superdex 75柱上，該柱用包含1mM EDTA和0.15M NaCI的10mM NaPO4 pH 6.0預(yù)先平衡(體內(nèi)使用沒有DTT)。
實(shí)施例9-截短型caspase 5的制備人截短型caspase 5也在大腸桿菌中被表達(dá)為N-末端6-組氨酸標(biāo)記的融合體。表達(dá)質(zhì)粒，pET16b-截短型caspase 5，衍生于包含噬菌體T7啟動子的載體pET16b(Novagen)。重組載體通過PCR擴(kuò)增截短型caspase 5活性域(氨基酸11e 146至Asn418)來構(gòu)建，所述域在N-末端結(jié)合有6-組氨酸編碼序列并且以Nco I和Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)加尾。所得PCR產(chǎn)物接著在兩限制位點(diǎn)間進(jìn)行亞克隆產(chǎn)生N-末端結(jié)合有6-組氨酸截短型Caspase 5的融合載體。
將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到溶源性BL21 DE3大腸桿菌菌株，該大腸桿菌菌株包含T7 RNA聚合酶的染色體拷貝，在lacUV5啟動子控制下，用1mM IPTG誘導(dǎo)后能誘導(dǎo)表達(dá)截短型caspase 5。從細(xì)胞沉淀中純化活性蛋白，所述沉淀在37℃誘導(dǎo)3小時后分離。
實(shí)施例10-截短型caspase 5的純化在裂解大腸桿菌細(xì)胞時，如實(shí)施例9所述該大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)N-末端6-組氨酸標(biāo)記的人截短型caspase 5，在裂解物上清中可檢測到截短型caspase 5活性。在自上清的NiNTA瓊脂糖珠粒捕獲蛋白質(zhì)時，均可回收p10和p20。這表明在細(xì)胞培養(yǎng)期間通過p10和p20結(jié)合點(diǎn)自動切割活化截短型caspase 5，截短型caspase 5維持可溶非共價異二聚體。利用該信息，6-組氨酸標(biāo)記的p20/p10異二聚體可被純化。整個方法在4℃實(shí)施以避免任何進(jìn)一步的分子斷裂。
約400g濕大腸桿菌細(xì)胞沉淀懸浮于含25mM HEPES，0.1％CHAPS，500mM NaCl，10mM β巰基乙醇(BME)pH7.4，和10％甘油(Buffer A)的1.6L裂解緩沖液中，并用兩步法經(jīng)Microfluidics 12,000psi裂解，裂解物30,000xg離心一小時，回收得到1.7L裂解物上清。將用含5mM咪唑裂解緩沖液預(yù)先平衡的150ml NiNTA瓊脂糖加入到該裂解物上清中，用2NNaOH將懸浮液調(diào)節(jié)到pH8.0，caspase 5分批吸收一小時。將NiNTA瓊脂糖填充到柱中，用5mM和25mM咪唑緩沖液A依次沖洗以去除雜質(zhì)，并用300mM咪唑緩沖液A洗脫caspase 5。蛋白質(zhì)對Buffer B(25mM HEPES，0.1％CHAPS，10％ glycerol，10mM BME，pH8.0)透析，再應(yīng)用到用相同緩沖液預(yù)先平衡過的DEAE ToyoPear l650M上。用100mM NaCl的相同緩沖液洗脫出截短型caspase 5。使用熒光肽底物，顯示高度特異性的截短型caspase5級分，LEED-AMC，被匯集。
實(shí)施例11-體外活化和制備多肽如實(shí)施例1和2所述純化制備的Pro-IL-18使用截短型caspase 5以1∶500w/w的比例在室溫溫育3小時。根據(jù)SDS-PAGE分析，prodomain的切割反應(yīng)完成＞90％。反應(yīng)混合物中加入140ml NiNTA瓊脂糖的Buffer D，溫育1小時，倒到燒結(jié)玻璃漏斗(sintered glass funnel)以回收主要包含成熟IL-18的未結(jié)合物質(zhì)。少量剩余的pro-IL-18，prodomain，截短的caspase 5和其它雜質(zhì)結(jié)合到NINTA瓊脂糖上。未結(jié)合溶液被調(diào)整到25mMDTT，溫育1小時以完成還原反應(yīng)，通過加入2M磷酸調(diào)整溶液pH值至6.0，用YM10膜濃縮至86ml。將濃縮的樣品應(yīng)用到預(yù)先用含0.1M NaCl的10mMNaPhosphate pH6.0平衡過的Superdex 75柱上，匯集級分包含560毫克成熟IL-18。
實(shí)施例12-體內(nèi)活化和制備多肽通過同時表達(dá)人前體IL-18和截短型caspase 5也可完成體內(nèi)活化IL-18。Pro-IL-18與人截短型caspase 5在表達(dá)質(zhì)粒pET28-Pro-IL-18/Casp5內(nèi)雙順反子地自單轉(zhuǎn)錄物大腸桿菌共表達(dá)(圖9)。自Pro-IL-18序列的最佳翻譯啟動，在T7啟動子控制下將人pro-IL-18基因亞克隆入pET28a(Novagen)，所述啟動子包括有效的Shine-Dalgarno序列(圖10)。在包括缺陷型Shine-Dalgarno序列的Pro-IL-18序列之后，將截短型caspase 5基因(Ile146至Asn418)直接亞克隆，以允許自截短型caspase 5序列的最低翻譯啟動。包括T7終止子序列在雙順反子轉(zhuǎn)錄單元之后用于翻譯終止。然后將所得的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至BL21(DE3)宿主，該宿主包含T7聚合酶基因的可誘導(dǎo)染色體拷貝。所述宿主中該構(gòu)建體用1mM IPTG的誘導(dǎo)導(dǎo)致pro-IL-18和pro-caspase 5的協(xié)同轉(zhuǎn)錄和翻譯。初期翻譯pro-caspase 5被自動加工成活性種類，啟動蛋白水解活化pro-IL-18。
實(shí)施例13-與截短型caspase 5共表達(dá)的人IL-18純化如實(shí)施例12所述，將表達(dá)IL-18的66g大腸桿菌細(xì)胞懸浮于含1mMEDTA和10mM DTT的130ml 0.1M HEPES pH7.5中(除了最后步驟沒有SH，整個方法在4℃進(jìn)行，并且存在10mM DTT)，使用Microfluidics通過兩步法于15,000psi裂解。裂解物(230ml)于34,000xg離心30分鐘。用25mM HEPES pH7.0將上清(200ml)稀釋至1L，并流經(jīng)串聯(lián)的兩柱ToyoPearlSP 650M和ToyoPearl DEAE 650M，源于大腸桿菌細(xì)胞的許多雜質(zhì)結(jié)合到柱上。流通物質(zhì)用25mM bistris propane調(diào)整到pH9.5，稀釋至2L，應(yīng)用到用25mM bistris propane HCl pH9.5平衡過的Source 15Q柱上。用線性梯度0-0.5M NaCl的相同緩沖液洗脫該柱。使用Vydac C4 RP-HPLC鑒定包含IL-18的成分并將其匯集(250ml)。使用YM10膜將沉積物濃縮成50ml并應(yīng)用到Superdex 75上，該柱用包含1mM EDTA和0.15M NaCI的10mM NaPO4 pH6.0預(yù)先平衡(體內(nèi)使用沒有DTT)。
實(shí)施例14-遍在蛋白/Pro-IL-18/Ubpl的制備76個氨基酸遍在蛋白編碼序列與成熟人IL-18的起點(diǎn)經(jīng)平端連接框內(nèi)融合，成熟IL-18的第一個酪氨酸密碼子直接在遍在蛋白的甘氨酸76密碼子后。接著在T7啟動子控制下將基因融合體亞克隆至pET載體，用于自遍在蛋白-IL-18基因序列最佳轉(zhuǎn)錄啟動，所述啟動子包括有效的Shine-Dalgarno序列。接著在包括缺陷型Shine-Dalgarno序列的IL-18后，全長Ubp-1基因直接被亞克隆以用于最低Ubp-1翻譯。圖11描述了pET28內(nèi)UbIL-18/Ubp-1表達(dá)盒序列。圖13描述了pET28內(nèi)UbIL-18/Ubp-1的annotated序列。編號與pET28內(nèi)位點(diǎn)對應(yīng)。
實(shí)施例15-IL-18的體內(nèi)活化和制備接著將實(shí)施例14的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至BL21(DE3)宿主。用1mM IPTG的誘導(dǎo)導(dǎo)致pro-IL-18和pro-caspase 4的協(xié)同轉(zhuǎn)錄和翻譯。Ubp-1的酶反應(yīng)導(dǎo)致有效地將Ub-IL-18加工成成熟活性IL-18，接著用常規(guī)方法IL-18可被直接從大腸桿菌裂解物中純化。圖16解釋了用1mM IPTG的誘導(dǎo)后IL-18表達(dá)和于30℃和37℃加工的時程。上部的箭頭表示泳道1中未加工UB-IL-18的部分，底部的箭頭表示泳道3中加工過的UB-IL-18的部分(采用抗-IL-18抗血清進(jìn)行Western blot檢測)。
實(shí)施例16-與遍在蛋白共表達(dá)的人IL-18的純化如實(shí)施例15所述，將表達(dá)IL-18的66g大腸桿菌細(xì)胞懸浮于含1mMEDTA和10mM DTT的130ml 0.1M HEPES pH7.5中(除了最后步驟沒有SH，整個方法在4℃進(jìn)行，并且存在10mM DTT)，使用Microfluidics通過兩步法于15,000psi裂解。裂解物(230ml)于34,000xg離心30分鐘。用25mM HEPES pH7.0將上清(200ml)稀釋至1L，并流經(jīng)串聯(lián)的兩柱ToyoPearlSP 650M和ToyoPearl DEAE 650M，源于大腸桿菌細(xì)胞的許多雜質(zhì)結(jié)合到柱上。流通物質(zhì)用25mM bistris propane調(diào)整到pH9.5，稀釋至2L，應(yīng)用到用25mM bistris propane HCl pH9.5平衡過的Source 15Q柱上。用線性梯度0-0.5M NaCl的相同緩沖液洗脫該柱。使用Vydac C4 RP-HPLC鑒定包含IL-18的級分并匯集(250ml)。使用YM10膜將沉積物濃縮成50ml并應(yīng)用到Superdex 75上，該柱用包含1mM EDTA和0.15M NaCI的10mMNaPO4 pH6.0預(yù)先平衡(體內(nèi)使用沒有DTT)。
雖然本文描述了目前認(rèn)為是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，它應(yīng)被理解為其中可以進(jìn)行各種改變，所附權(quán)利要求中意欲覆蓋的所有如此改變落在本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍之內(nèi)。
序列表<110>史密絲克萊恩比徹姆公司(SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION)<120>制備具有生理活性的IL-18多肽的方法<130>P51137<140>待指定<141>Herewith<150>60/211,832<151>2000-06-15<150>60/224,128<151>2000-08-10<150>60/264,923<151>2001-01-30<160>12<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>193<212>PRT<213>人(Homo sapien)<400>1Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met1 5 10 15Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn20 25 30Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile35 40 45Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro50 55 60Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg65 70 75 80Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met85 90 95Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys100 105 110Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile115 120 125Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly130 135 140His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe145 150 155 160Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys165 170 175Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu180 185 190Asp
<210>2<211>582<212>DNA<213>人(Homo sapien)<400>2atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aatcagatta ctttggcaag 120cttgagagca aactatcggt cattcgtaat ttaaatgacc aggtcctatt tatcgaccaa 180gggaatcgtc cactattcga ggacatgaca gacagtgact gccgagacaa tgcgccgcga 240accattttca ttatatctat gtacaaggat tctcagccgc gcggaatggc cgtaactatt 300tctgtcaaat gtgaaaagat atccacgctg tcgtgtgaga acaagattat tagtttcaaa 360gagatgaatc cgccggataa tatcaaggac acgaagtctg atatcatatt tttccagcgc 420agcgtgccgg ggcacgataa caagatgcaa tttgaatcat ccagctatga agggtacttt 480cttgcatgcg agaaggaacg cgatctcttt aaacttattt taaagaaaga ggacgagcta 540ggcgatcgca gcattatgtt cactgtccaa aatgaagact ag582<210>3<211>157<212>PRT<213>人(Homo sapien)<400>3Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp20 25 30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile35 40 45Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile50 55 60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys85 90 95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys100 105 110Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu115 120 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu130 135 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145 150 155<210>4<211>282<212>PRT<213>人(Homo sapien)<400>4Met Gly His His His His His His Gly Ala Leu Lys Leu Cys Pro His1 5 10 15Glu Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro20 25 30Ile Lys Glu Arg Asn Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn35 40 45Thr Glu Phe Asp His Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile50 55 60Thr Gly Met Lys Glu Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val65 70 75 80Glu Glu Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe85 90 95Ala Thr Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu100 105 110Met Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu115 120 125Lys Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn130 135 140Asn Arg Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val145 150 155 160Gln Ala Cys Arg Gly Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser165 170 175Pro Thr Ser Leu Glu Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu180 185 190Glu Asp Ala Val Tyr Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe195 200 205Cys Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly210 215 220Ser Ile Phe Ile Thr Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp225 230 235 240Cys Cys His Leu Glu Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu245 250 255Thr Pro Arg Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met260 265 270Thr Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn275 280<210>5<211>849<212>DNA<213>人(Homo sapien)<400>5atgggccatc atcatcatca tcatggcgcc ctcaagcttt gtcctcatga agaattcctg 60agactatgta aagaaagagc tgaagagatc tatccaataa aggagagaaa caaccgcaca 120cgcctggctc tcatcatatg caatacagag tttgaccatc tgcctccgag gaatggagct 180gactttgaca tcacagggat gaaggagcta cttgagggtc tggactatag tgtagatgta 240gaagagaatc tgacagccag ggatatggag tcagcgctga gggcatttgc taccagacca 300gagcacaagt cctctgacag cacattcttg gtactcatgt ctcatggcat cctggaggga 360atctgcggaa ctgtgcatga tgagaaaaaa ccagatgtgc tgctttatga caccatcttc 420cagatattca acaaccgcaa ctgcctcagt ctgaaggaca aacccaaggt catcattgtc 480caggcctgca gaggtgcaaa ccgtggggaa ctgtgggtca gagactctcc agcatccttg 540gaagtggcct cttcacagtc atctgagaac ctggaggaag atgctgttta caagacccac 600gtggagaagg acttcattgc tttctgctct tcaacgccac acaacgtgtc ctggagagac 660agcacaatgg gctctatctt catcacacaa ctcatcacat gcttccagaa atattcttgg 720tgctgccacc tagaggaagt atttcggaag gtacagcaat catttgaaac tccaagggcc 780aaagctcaaa tgcccaccat agaacgactg tccatgacaa gatatttcta cctctttcct 840ggcaattga 849<210>6<211>282<212>PRT<213>人(Homo sapien)<400>6Met Gly His His His His His His Gly Ile Leu Lys Leu Cys Pro Arg1 5 10 15Glu Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Lys Asn His Asp Glu Ile Tyr Pro20 25 30Ile Lys Lys Arg Glu Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn35 40 45Thr Lys Phe Asp His Leu Pro Ala Arg Asn Gly Ala His Tyr Asp Ile50 55 60Val Gly Met Lys Arg Leu Leu Gln Gly Leu Gly Tyr Thr Val Val Asp65 70 75 80Glu Lys Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Val Leu Arg Ala Phe85 90 95Ala Ala Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu100 105 110Met Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Ala His Lys Lys115 120 125Lys Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn130 135 140Asn Arg Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val145 150 155 160Gln Ala Cys Arg Gly Glu Lys His Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser165 170 175Pro Ala Ser Leu Ala Val Ile Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu180 185 190Ala Asp Ser Val Cys Lys Ile His Glu Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe195 200 205Cys Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Arg Thr Arg Gly210 215 220Ser Ile Phe Ile Thr Glu Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Cys225 230 235 240Cys Cys His Leu Met Glu Ile Phe Arg Lys Val Gln Lys Ser Phe Glu245 250 255Val Pro Gln Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Ala Thr Leu260 265 270Thr Arg Asp Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn275 280<210>7<211>849<212>DNA<213>人(Homo sapien)<400>7atgggccatc atcatcatca tcatggcata ctcaaacttt gtcctcgtga agaattcctg 60agactgtgta aaaaaaatca tgatgagatc tatccaataa aaaagagaga ggaccgcaga 120cgcctggctc tcatcatatg caatacaaag tttgatcacc tgcctgcaag gaatggggct 180cactatgaca tcgtggggat gaaaaggctg cttcaaggcc tgggctacac tgtggttgac 240gaaaagaatc tcacagccag ggatatggag tcagtgctga gggcatttgc tgccagacca 300gagcacaagt cctctgacag cacgttcttg gtactcatgt ctcatggcat cctagaggga 360atctgcggaa ctgcgcataa aaagaaaaaa ccggatgtgc tgctttatga caccatcttc 420cagatattca acaaccgcaa ctgcctcagt ctaaaggaca aacccaaggt catcattgtc 480caggcctgca gaggtgaaaa acatggggaa ctctgggtca gagactctcc agcatccttg 540gcagtcatct cttcacagtc atctgagaac ctggaggcag attctgtttg caagatccac 600gaggagaagg acttcattgc tttctgttct tcaacaccac ataacgtgtc ctggagagac 660cgcacaaggg gctccatctt cattacggaa ctcatcacat gcttccagaa atattcttgc 720tgctgccacc taatggaaat atttcggaag gtacagaaat catttgaagt tccacaggct 780aaagcccaga tgcccaccat agaacgagca accttgacaa gagatttcta cctctttcct 840ggcaattga 849<210>8<211>1743<212>DNA<213>人(Homo sapien)<400>8agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60ttcccctcta gaccacacct taaggaggat ataacatatg gctgctgaac cagtagaaga 120caattgcatc aactttgtgg caatgaaatt tattgacaat acgctttact ttatagctga 180agatgatgaa aacctggaat cagattactt tggcaagctt gagagcaaac tatcggtcat 240tcgtaattta aatgaccagg tcctatttat cgaccaaggg aatcgtccac tattcgagga 300catgacagac agtgactgcc gagacaatgc gccgcgaacc attttcatta tatctatgta 360caaggattct cagccgcgcg gaatggccgt aactatttct gtcaaatgtg aaaagatatc 420cacgctgtcg tgtgagaaca agattattag tttcaaagag atgaatccgc cggataatat 480caaggacacg aagtctgata tcatattttt ccagcgcagc gtgccggggc acgataacaa 540gatgcaattt gaatcatcca gctatgaagg gtactttctt gcatgcgaga aggaacgcga 600tctctttaaa cttattttaa agaaagagga cgagctaggc gatcgcagca ttatgttcac 660tgtccaaaat gaagactagt ggaggatata ataccaggaa taaataaaat ccatgggcca 720tcatcatcat catcatggcg ccctcaagct ttgtcctcat gaagaattcc tgagactatg 780taaagaaaga gctgaagaga tctatccaat aaaggagaga aacaaccgca cacgcctggc 840tctcatcata tgcaatacag agtttgacca tctgcctccg aggaatggag ctgactttga 900catcacaggg atgaaggagc tacttgaggg tctggactat agtgtagatg tagaagagaa 960tctgacagcc agggatatgg agtcagcgct gagggcattt gctaccagac cagagcacaa1020gtcctctgac agcacattct tggtactcat gtctcatggc atcctggagg gaatctgcgg1080aactgtgcat gatgagaaaa aaccagatgt gctgctttat gacaccatct tccagatatt1140caacaaccgc aactgcctca gtctgaagga caaacccaag gtcatcattg tccaggcctg1200cagaggtgca aaccgtgggg aactgtgggt cagagactct ccagcatcct tggaagtggc1260ctcttcacag tcatctgaga acctggagga agatgctgtt tacaagaccc acgtggagaa1320ggacttcatt gctttctgct cttcaacgcc acacaacgtg tcctggagag acagcacaat1380gggctctatc ttcatcacac aactcatcac atgcttccag aaatattctt ggtgctgcca1440cctagaggaa gtatttcgga aggtacagca atcatttgaa actccaaggg ccaaagctca1500aatgcccacc atagaacgac tgtccatgac aagatatttc tacctctttc ctggcaattg1560aaaatggatc cgaattcgag ctccgtcgac aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac1620caccaccact gagatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc1680accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt1740ttg 1743<210>9<211>1464<2l2>DNA<213>人(Homo sapien)<400>9atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aatcagatta ctttggcaag 120cttgagagca aactatcggt cattcgtaat ttaaatgacc aggtcctatt tatcgaccaa 180gggaatcgtc cactattcga ggacatgaca gacagtgact gccgagacaa tgcgccgcga 240accattttca ttatatctat gtacaaggat tctcagccgc gcggaatggc cgtaactatt 300tctgtcaaat gtgaaaagat atccacgctg tcgtgtgaga acaagattat tagtttcaaa 360gagatgaatc cgccggataa tatcaaggac acgaagtctg atatcatatt tttccagcgc 420agcgtgccgg ggcacgataa caagatgcaa tttgaatcat ccagctatga agggtacttt 480cttgcatgcg agaaggaacg cgatctcttt aaacttattt taaagaaaga ggacgagcta 540ggcgatcgca gcattatgtt cactgtccaa aatgaagact agtggaggat ataataccag 600gaataaataa aatccatggg ccatcatcat catcatcatg gcatactcaa actttgtcct 660cgtgaagaat tcctgagact gtgtaaaaaa aatcatgatg agatctatcc aataaaaaag 720agagaggacc gcagacgcct ggctctcatc atatgcaata caaagtttga tcacctgcct 780gcaaggaatg gggctcacta tgacatcgtg gggatgaaaa ggctgcttca aggcctgggc 840tacactgtgg ttgacgaaaa gaatctcaca gccagggata tggagtcagt gctgagggca 900tttgctgcca gaccagagca caagtcctct gacagcacgt tcttggtact catgtctcat 960ggcatcctag agggaatctg cggaactgcg cataaaaaga aaaaaccgga tgtgctgctt1020tatgacacca tcttccagat attcaacaac cgcaactgcc tcagtctaaa ggacaaaccc1080aaggtcatca ttgtccaggc ctgcagaggt gaaaaacatg gggaactctg ggtcagagac1140tctccagcat ccttggcagt catctcttca cagtcatctg agaacctgga ggcagattct1200gtttgcaaga tccacgagga gaaggacttc attgctttct gttcttcaac accacataac1260gtgtcctgga gagaccgcac aaggggctcc atcttcatta cggaactcat cacatgcttc1320cagaaatatt cttgctgctg ccacctaatg gaaatatttc ggaaggtaca gaaatcattt1380gaagttccac aggctaaagc ccagatgccc accatagaac gagcaacctt gacaagagat1440ttctacctct ttcctggcaa ttga 1464<210>10<211>233<212>PRT<213>人(Homo sapien)<400>10Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu1 5 10 15Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln Asp20 25 30Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys35 40 45Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu50 55 60Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Tyr Phe Gly Lys65 70 75 80Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu85 90 95Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser100 105 110Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr115 120 125Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys130 135 140Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys145 150 155 160Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile165 170 175Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu180 185 190Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp195 200 205Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser210 215 220Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp225 230<210>11<211>702<212>DNA<213>人(Homo sapien)<400>11atgcagatct tcgtcaagac gttaaccggt aaaaccataa ctctagaagt tgaatcttcc 60gataccatcg acaacgttaa gtcgaaaatt caagacaagg aaggcattcc acctgatcaa 120caaagattga tctttgccgg taagcagctc gaagacggta gaacgctgtc tgattacaac 180attcagaagg agtcgacctt acatcttgtc ttaagactaa gaggagggta ctttggcaag 240cttgagagca aactatcggt cattcgtaat ttaaatgacc aggtcctatt tatcgaccaa 300gggaatcgtc cactattcga ggacatgaca gacagtgact gccgagacaa tgcgccgcga 360accattttca ttatatctat gtacaaggat tctcagccgc gcggaatggc cgtaactatt 420tctgtcaaat gtgaaaagat atccacgctg tcgtgtgaga acaagattat tagtttcaaa 480gagatgaatc cgccggataa tatcaaggac acgaagtctg atatcatatt tttccagcgc 540agcgtgccgg ggcacgataa caagatgcaa tttgaatcat ccagctatga agggtacttt 600cttgcatgcg agaaggaacg cgatctcttt aaacttattt taaagaaaga ggacgagcta 660ggcgatcgca gcattatgtt cactgtccaa aatgaagact ag702<210>12<211>3419<212>DNA<213>人(Homo sapien)<400>12agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60ttcccctcta gaccacacct taaggaggat ataacatatg cagatcttcg tcaagacgtt 120aaccggtaaa accataactc tagaagttga atcttccgat accatcgaca acgttaagtc 180gaaaattcaa gacaaggaag gcattccacc tgatcaacaa agattgatct ttgccggtaa 240gcagctcgag gacggtagaa cgctgtctga ttacaacatt cagaaggagt cgaccttaca 300tcttgtctta agactaagag gagggtactt tggcaagctt gagagcaaac tatcggtcat 360tcgtaattta aatgaccagg tcctatttat cgaccaaggg aatcgtccac tattcgagga 420catgacagac agtgactgcc gagacaatgc gccgcgaacc attttcatta tatctatgta 480caaggattct cagccgcgcg gaatggccgt aactatttct gtcaaatgtg aaaagatatc 540cacgctgtcg tgtgagaaca agattattag tttcaaagag atgaatccgc cggataatat 600caaggacacg aagtctgata tcatattttt ccagcgcagc gtgccggggc acgataacaa 660gatgcaattt gaatcatcca gctatgaagg gtactttctt gcatgcgaga aggaacgcga 720tctctttaaa cttattttaa agaaagagga cgagctaggc gatcgcagca ttatgttcac 780tgtccaaaat gaagactagt ggaggatata ataccaggaa taaataaaat ccatgggcca 840tcatcatcat catcatggca tggatgaaag caagataaac agtttattac aatttttatt 900tggttcccga caggattttt tgagaaattt taaaacttgg agtaacaaca ataacaatct 960atcgatttat ttattaattt ttggcatagt agtatttttt tataaaaaac cagaccatct1020aaactacatt gttgagagcg ttagtgaaat gacaacaaac ttcagaaata ataatagcct1080tagccgttgg ttgcccagaa gtaagtttac ccacttagac gaagagatct tgaaaagagg1140tggtttcatt gctggtttag ttaatgatgg taacacttgt tttatgaact ctgttttgca1200atcattggca tcatccagag aattaatgga gttcttggac aataatgtca taaggaccta1260tgaggagata gaacaaaatg aacacaatga agaaggaaac gggcaagaat ctgctcaaga1320tgaagccact cataagaaaa acactcgtaa gggtggcaaa gtttatggta agcataagaa1380gaaattgaat aggaagtcaa gttcgaaaga agacgaagaa aagagccagg agccagatat1440cactttcagt gtcgccttaa gggatctact ttctgcctta aatgcgaagt attatcggga1500taaaccctat ttcaaaacca atagtttatt gaaagcaatg tccaaatctc caagaaaaaa1560tattcttctt ggctacgacc aagaggacgc gcaagaattc ttccagaaca tactagccga1620gttggaaagt aacgttaaat cattgaatac tgaaaaacta gataccactc cagttgcgaa1680atcagaatta cccgatgatg ctttagtagg tcaacttaac cttggtgaag ttggcactgt1740ttacattcca actgaacaga ttgatcctaa ctctatacta catgacaagt ccattcaaaa1800tttcacacct ttcaaactaa tgactccttt agatggtatc acggcagaaa gaattggttg1860tttacagtgt ggtgagaacg gtggcataag atattccgta ttttcgggat taagcttaaa1920tttaccgaac gagaatattg gttccacttt aaaattatct cagttattga gcgactggag1980taaacctgaa atcatcgaag tcgtagaatg taaccgttgt gccctcacag cagcgcactc2040tcatttattt ggtcagttga aagaatttga aaaaaaacct gagggttcga tcccagaaaa2100gccaattaac gctgtaaaag atagggtcca tcaaatcgaa gaagttcttg ccaaaccagt2160tattgacgat gaagattata agaagttgca tacagcaaat atggtacgta aatgctctaa2220atctaagcag attttaatat caagacctcc accattatta tccattcata tcaacagatc2280cgtatttgat ccaagaacgt acatgattag aaaaaataac tcgaaagtat tgtttaagtc2340aacgttgaat cttgcccctt ggtgttgtga tattaatgaa atcaatttgg atgctcgttt2400gccaatgtca aaaaaggaaa aagctgcgca acaagattca agtgaagatg aaaacattgg2460cggtgaatac tatacgaaat tacatgaacg cttcgagcag gaatttgaag acagcgagga 2520agaaaaagaa tacgatgacg cagaggggaa ctatgcgtct cattacaatc ataccaagga 2580tatcagtaac tatgatcccc taaacggtga agtcgatggc gtgacatccg atgatgaaga 2640tgagtacatt gaagaaaccg atgctttagg gaatacaatc aaaaaaagga tcatagaaca 2700ttctgatgtt gaaaacgaga atgtaaaaga taatgaagaa ctgcaagaaa tcgacaatgt 2760gagccttgac gaaccaaaga tcaatgttga agatcaacta gaaacatcat ctgatgagga 2820agatgttata ccagctccac ctatcaatta tgctaggtca ttttccacag ttccagccac 2880tccattgaca tattcattgc gctctgtcat tgttcactac ggtacccata attatggtca 2940ttacattgca tttagaaaat acaggggttg ttggtggaga atatctgatg agactgtgta 3000cgttgtggac gaagctgaag tcctttcaac acccggtgta tttatgttat tttacgaata 3060tgactttgat gaagaaactg ggaagatgaa ggatgatttg gaagctattc agagtaataa 3120tgaagaagat gatgaaaaag agcaggagca aaaaggagtc caggagccaa aggaaagcca 3180agagcaagga gaaggtgaag agcaagagga aggtcaagag cagatgaagt tcgagagaac 3240agaagaccat agagatattt ctggtaaaga tgtaaactaa gctcgagcac caccaccacc 3300accactgaga tccggctgct aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg 3360ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttg3419
權(quán)利要求
1.一種自具有蛋白酶激活基元的前體多肽制備活性多肽的方法，所述基元包括氨基酸序列XEYD，其中X選自由W，L，F(xiàn)，Y，I，V，D，或E組成的氨基酸組，Y選自由H，I，A，T，S，P或E組成的氨基酸組，所述方法包括(i)將caspase 4與前體多肽接觸，和(ii)純化該活性多肽。
2.一種自具有蛋白酶激活基元的前體多肽制備活性多肽的方法，所述基元包括氨基酸序列XEYD，其中X選自由W，L，F(xiàn)，Y，I，V，D，或E組成的氨基酸組，Y選自由H，I，A，T，S，P或E組成的氨基酸組，所述方法包括(i)將caspase 5與前體多肽接觸，和(ii)純化該活性多肽。
3.一種自前體IL-18多肽制備活性IL-18多肽的方法，包括(i)將caspase 4與前體IL-18多肽接觸；和(ii)純化該活性IL-18多肽。
4.一種自前體IL-18多肽制備活性IL-18多肽的方法，包括(i)將caspase 5與前體IL-18多肽接觸；和(ii)純化該活性IL-18多肽。
5.權(quán)利要求3的方法，其中前體IL-18多肽是人IL-18多肽。
6.權(quán)利要求4的方法，其中前體IL-18多肽是人IL-18多肽。
7.一種制備活性人IL-18多肽的方法，包括(i)將caspase 4與人前體IL-18多肽接觸以將所述前體多肽轉(zhuǎn)化成活性人IL-18多肽，所述前體IL-18多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列或其部分，所述部分保留了SEQ ID NO1的氨基酸序列中第36位天冬氨酸殘基和第37位酪氨酸殘基作為N-末端序列；和(ii)純化該活性人IL-18多肽。
8.一種制備活性人IL-18多肽的方法，包括(i)將caspase 5與人前體IL-18多肽接觸以將所述前體多肽轉(zhuǎn)化成活性人IL-18多肽，所述前體IL-18多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列或其部分，所述部分保留了SEQ ID NO1的氨基酸序列中第36位天冬氨酸殘基和第37位酪氨酸殘基作為N-末端序列；和(ii)純化該活性人IL-18多肽。
9.制備權(quán)利要求7所述的活性人IL-18多肽的方法，其中活性人IL-18多肽是具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。
10.制備權(quán)利要求8所述的活性人IL-18多肽的方法，其中活性人IL-18多肽是具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。
11.一種自前體多肽制備活性多肽的方法，包括(i)通過雙順反子使caspase 4與前體多肽共表達(dá)，和(ii)純化該活性多肽。
12.一種自前體多肽制備活性多肽的方法，包括(i)通過雙順反子使caspase 5與前體多肽共表達(dá)；和(ii)純化該活性多肽。
13.一種自前體IL-18多肽制備活性IL-18多肽的方法，包括(i)通過雙順反子使遍在蛋白酶與遍在蛋白/IL-18融合體共表達(dá)，和(ii)純化該活性IL-18多肽。
14.一種自前體多肽制備活性IL-18多肽的方法，包括(i)通過雙順反子使caspase 4與前體IL-18多肽共表達(dá)，和(ii)純化該活性IL-18多肽。
15.一種自前體IL-18多肽制備活性IL-18多肽的方法，包括(i)通過雙順反子使caspase 5與前體IL-18多肽共表達(dá)，和(ii)純化該活性IL-18多肽。
16.權(quán)利要求13的方法，其中前體IL-18多肽是人前體IL-18多肽。
17.權(quán)利要求14的方法，其中前體IL-18多肽是人前體IL-18多肽。
18.權(quán)利要求15的方法，其中前體IL-18多肽是人前體IL-18多肽。
19.權(quán)利要求16的方法，其中活性人IL-18多肽是具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。
20.權(quán)利要求17的方法，其中活性人IL-18多肽是具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。
21.權(quán)利要求18的方法，其中活性人IL-18多肽是具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。
22.一種自前體人IL-18多肽制備活性人IL-18多肽的方法，包括(i)通過雙順反子使遍在蛋白酶與具有SEQ ID NO10的氨基酸序列的遍在蛋白/IL-18共表達(dá)；和(ii)純化該活性人IL-18多肽。
23.一種自人前體IL-18多肽制備活性人IL-18多肽的方法，包括(i)通過雙順反子使caspase 4與人前體IL-18多肽共表達(dá)，所述caspase 4具有SEQ ID NO4的氨基酸序列；和(ii)純化該活性IL-18多肽。
24.一種自人前體IL-18多肽制備活性人IL-18多肽的方法，包括(i)通過雙順反子使caspase 5與人前體IL-18多肽共表達(dá)，所述caspase 5具有SEQ ID NO6的氨基酸序列；和(ii)純化該活性IL-18多肽。
全文摘要
一種制備具有生理活性多肽的方法，包括將前體多肽與活化酶接觸，或共表達(dá)該多肽與活化蛋白酶。
文檔編號C07K14/54GK1436246SQ01811278
公開日2003年8月13日 申請日期2001年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月15日
發(fā)明者基揚(yáng)·O·約翰森, 羅伯特·B·柯克帕特里克, 阿倫·R·沙茨曼, 霍銀森, 帕特里克·麥克德維特 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司