專利名稱：一種采用生物提取法制備縮宮素溶液的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用生物提取法制備縮宮素溶液的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
縮宮素(Oxytocin)，又稱催產(chǎn)素，是一種由9個氨基酸殘基組成的、具有一個二硫鍵的、具有生物活性的多肽類產(chǎn)品，分子式C43H66N12O12S2 ，分子量1007. 2，等電點7. 7，易溶于水，溶于丙酮、丁醇和稀醋酸，不溶于乙醚和石油醚，干品穩(wěn)定，PH3. 5 4. 4的酸性溶液中
穩(wěn)定，堿性溶液中不穩(wěn)定。結(jié)構(gòu)式如下
OH
/
J\
NHS
^ LR
NHNH ΛQ
% H
NH-.sO縮宮素多肽的N末端和C末端分別為半胱氨酸和甘氨酸，其間的七個氨基酸以肽鍵相連形成一級結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上，由于氫鍵的形成，作用九肽間產(chǎn)生二級螺旋結(jié)構(gòu)；而N末端的半胱氨酸和第6位的半胱氨酸的S結(jié)合形成雙S鍵而形成一個內(nèi)環(huán)，加之疏水基團，如9肽中的酪氨酸，亮氨酸和異亮氨酸等形成疏水鍵，使九肽中的極性基團在內(nèi)部，而離子基團在外部，使產(chǎn)品內(nèi)部排斥水相而形成緊密結(jié)構(gòu)的趨勢-β折疊，形成生物活性特定的空間結(jié)構(gòu)活性中心。而縮宮素具有天然的雙S鍵和β-回折的結(jié)構(gòu)決定了縮宮素的生物活性?？s宮素是一種哺乳動物激素，于1895年被發(fā)現(xiàn)，主要由下丘腦視上核和室旁核的神經(jīng)分泌大細胞系統(tǒng)分泌產(chǎn)生，從垂體后葉釋放入血液，沿血液循環(huán)到達遠端的器官發(fā)揮作用，在臨床上被廣泛用于引產(chǎn)、催產(chǎn)及預(yù)防因分娩后子宮乏力引起的大出血，是目前美國FDA唯一認可用于臨床引產(chǎn)的藥物?？s宮素還能刺激乳腺的平滑肌收縮，有助于乳汁自乳房排出，但并不增加乳腺的乳汁分泌量?？s宮素不僅可作為育齡婦女生育時催產(chǎn)使用，同時該產(chǎn)品在國際上也被廣泛應(yīng)用于動、植物養(yǎng)殖方面，如用于動物，不僅可提高動物的受胎率及繁殖率，還可提高單位產(chǎn)奶量；用于果樹，則不僅可加強果物的優(yōu)異外觀，還能起到催熟的作用。目前主要采用化學(xué)合成法制備縮宮素。我國自1969年第一次合成縮宮素以來，國內(nèi)30余家縮宮素制劑生產(chǎn)廠家均采用九肽酰胺經(jīng)鈉-液氨法消除、縮合的辦法合成縮宮素。然而合成的縮宮素粗品含有一些與縮宮素結(jié)構(gòu)類似的雜肽，例如氨基酸消旋化產(chǎn)生的非對映異構(gòu)體、部分氨基酸未連接上產(chǎn)生的缺失肽、肽鍵斷裂產(chǎn)生的斷裂肽以及氧化不徹底產(chǎn)生的還原態(tài)開環(huán)肽等，造成縮宮素產(chǎn)品收率較低，純化困難。而且采用化學(xué)合成法制備的縮宮素無法形成其天然的雙S鍵和β -回折的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)品存在生物活性低的問題。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有制備方法的缺陷提供一種采用生物提取法制備縮宮素溶液的生產(chǎn)工藝。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種采用生物提取法制備縮宮素溶液的生產(chǎn)工藝，包括 步驟I :垂體后葉干粉加水提取，離心收集提取液；步驟2 :提取液經(jīng)含有O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)的層析柱分離收集層析液，其中所述層析柱的填料為人造沸石；步驟3 :層析液用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3. 5，加熱至100°C保溫3分鐘，立即冷卻后過濾收集濾液，濾液用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至3. 5，加入皂土吸附，過濾收集濾液即得。本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝運用獨特的生物制備工藝技術(shù)，采用水提取垂體后葉干粉中的縮宮素，然后利用人造沸石吸附除去垂體后葉干粉提取液中加壓素最后利用皂土除去小分子物質(zhì)、有機有色物和熱原，從而使制得縮宮素具有天然的雙S鍵和β -回折的結(jié)構(gòu)，提高了制得的縮宮素的溶液的生物活性。其中，本發(fā)明所述垂體后葉干粉可以通過商業(yè)渠道從市場上購買得到，也可由哺乳動物小腦垂體后葉自行制備得到。在一個實施例中，所述垂體后葉干粉的制備方法為取哺乳動物小腦置于丙酮中脫水后，分離垂體后葉，干燥后粉碎過40-60目篩得到。其中，所述哺乳動物為豬、狗、牛、羊、馬中的一種。優(yōu)選為豬、羊。本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝首先采用水提取垂體后葉干粉以將其中的縮宮素分離。其中，步驟I所述加水提取優(yōu)選為加水提取四次，每次30分鐘，合并提取液。進一步的，作為優(yōu)選，步驟I所述加水提取的步驟中垂體后葉干粉與水的重量比為 1:10-1:20。更優(yōu)選為 1:12-1:16。在本發(fā)明中，所述提取縮宮素的水可以為蒸餾水、去離子水、注射用水中的一種。優(yōu)選為注射用水。在一個具體實施例中所述加水提取為稱后葉干粉，加入16倍注射用水，攪拌提取30分鐘，離心，收集液體，殘渣再分別加入14倍、12倍、12倍注射用水按同法提取三次，合并四次離心液。本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝步驟2利用人造沸石吸附除去垂體后葉干粉提取液中加壓素，從而得到較純的縮宮素。由于縮宮素在ΡΗ3. 5 4. 4的酸性環(huán)境中最穩(wěn)定，因此本發(fā)明所述層析柱加入了 O. 25%的冰醋酸以使溶液呈酸性。本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝步驟2所述分離收集層析液的步驟為在人造沸石加入O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)，攪拌后倒入層析柱內(nèi)，使人造沸石自然沉降，等人造沸石沉降約2-3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使人造沸石繼續(xù)沉積，同時逐漸加入O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)平衡層析柱，待層析柱中人造沸石加至柱高2/3時，加入O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)至冰醋酸水溶液液面高于人造沸石沉積面2-3厘米，立即加入提取液，收集層析柱出口流出的白色渾濁的層析液。其中所述逐漸加入O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)平衡層析柱的目的是使層析柱內(nèi)的人造沸石之間無縫隙，保證提取液的層析效率。進一步地，在具體實施例方式中，當提取液面下降到人造沸石表面時，立即繼續(xù)加注射用水，但渾濁液流盡后停止收集。作為優(yōu)選，按g/mL計，人造沸石與O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)的質(zhì)量體積比為1:10。進一步地，本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝步驟2所述提取液的流速優(yōu)選為45 50mL/min。 本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝步驟3層析后的層析液用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3. 5，加熱然后加入皂土吸附以除去小分子物質(zhì)、有機有色物和熱原，從而能進一步純化縮宮素。作為優(yōu)選，所述加入皂土吸附的步驟為按每IOOmL濾液加入3mL10%皂土漿的量加入皂土衆(zhòng)，攪拌吸附40分鐘。從上述的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明制備縮宮素的方法取垂體后葉干粉加水提取，離心收集提取液；提取液經(jīng)含有O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)的人造沸石層析柱分離收集層析液；層析液用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至3. 5，加熱至100°C保溫3分鐘，立即冷卻后過濾收集濾液，濾液用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至3. 5，加入皂土吸附，過濾收集濾液即得。本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝運用獨特的生物制備工藝技術(shù)，采用水提取垂體后葉干粉中的縮宮素，然后利用人造沸石吸附除去垂體后葉干粉提取液中加壓素最后利用皂土除去小分子物質(zhì)、有機有色物和熱原，從而制得縮宮素。本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝具有操作簡單、污染小、收率高等特點，適用于縮宮素的大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝制得的縮宮素純度高、生物活性高，治療的療效顯著、藥物副作用小、安全性高，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及動、植物養(yǎng)殖領(lǐng)域。
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了一種采用生物提取法制備縮宮素溶液的生產(chǎn)工藝。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例I :稱羊垂體后葉干粉100g，加入注射用水I. 6升，攪拌提取30分鐘，離心，收集液體，殘渣再分別加水I. 4升、I. 2升、I. 2升按同法提取三次，合并四次離心液。取人造沸石1600g,加入O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)16升,攪拌后倒入層析柱內(nèi)，使人造沸石自然沉降，等人造沸石沉降約2-3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使人造沸石繼續(xù)沉積，同時逐漸加入O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)平衡層析柱，待O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)液面高于人造沸石沉積面2-3厘米時，立即加入提取液，適當調(diào)節(jié)流速45飛OmL/min，收集吸附柱開始流出的白色渾濁液。當提取液面下降到沸石表面時，立即繼續(xù)加注射用水，但渾濁液流盡后停止收集。流出沸石柱的層析液用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至3. 5，水浴迅速加熱攪拌至100°C保溫3分鐘，立即冷卻后紙漿過濾后收集濾液。濾液用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3. 5，并按每IOOmL溶液加入3mL10%皂土漿的用量加入皂土，攪拌吸附40分鐘后，經(jīng)過濾后收集無色澄清溶液即得縮宮素溶液。每克后葉干粉制得縮宮素980單位以上。放入潔凈的塑料桶中，按45kg/桶加蓋后貼簽，桶用潔凈的塑料膜包扎密封后，存放于_5°C以下冷庫中，有效期12個月。取樣，用磺基水楊酸試液檢查，不發(fā)生沉淀。實施例2:稱后豬垂體后葉干粉50g，加入注射用水O. 8升，攪拌提取30分鐘，離心，收集液體，殘渣再分別加水O. 7升、O. 6升、O. 5升按同法提取三次，合并四次離心液。取人造沸石IOOOg,加入O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)10升，攪拌后倒入層析柱內(nèi)，使人 造沸石自然沉降，等人造沸石沉降約2-3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使人造沸石繼續(xù)沉積，同時逐漸加入O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)平衡層析柱，待O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)液面高于人造沸石沉積面2-3厘米時，立即加入提取液，適當調(diào)節(jié)流速45飛OmL/min，收集吸附柱開始流出的白色渾濁液。當提取液面下降到沸石表面時，立即繼續(xù)加注射用水，但渾濁液流盡后停止收集。流出沸石柱的層析液用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至3. 5，水浴迅速加熱攪拌至100°C保溫3分鐘，立即冷卻后紙漿過濾后收集濾液。濾液用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3. 5，并按每IOOmL溶液加入3mL10%皂土漿的用量加入皂土，攪拌吸附40分鐘后，再經(jīng)過濾后收集無色澄清溶液即得縮宮素溶液。每克后葉干粉制得縮宮素980單位以上。放入潔凈的塑料桶中，按45kg/桶加蓋后貼簽，桶用潔凈的塑料膜包扎密封后，存放于_5°C以下冷庫中，有效期12個月。取樣，用磺基水楊酸試液檢查，不發(fā)生沉淀。以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種采用生物提取法制備縮宮素溶液的生產(chǎn)工藝，包括 步驟I:垂體后葉干粉加水提取，離心收集提取液； 步驟2 :提取液經(jīng)含有O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)的層析柱分離收集層析液，其中所述層析柱的填料為人造沸石； 步驟3 :層析液用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3. 5，加熱至100°C保溫3分鐘，立即冷卻后過濾收集濾液，濾液用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至3. 5，加入皂土吸附，過濾收集濾液即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟I所述垂體后 葉干粉的制備方法為取哺乳動物小腦置于丙酮中脫水后，分離垂體后葉，干燥后粉碎過40-60目篩即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述哺乳動物為豬、狗、牛、羊、馬中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟I所述加水提取為加水提取四次，每次30分鐘，合并提取液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟I所述加水提取的步驟中垂體后葉干粉與水的重量比為1:10-1:20。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟2所述分離收集層析液的步驟為在人造沸石加入O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)，攪拌后倒入層析柱內(nèi)，使人造沸石自然沉降，等人造沸石沉降約2-3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使人造沸石繼續(xù)沉積，同時逐漸加入O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)平衡層析柱，待層析柱中人造沸石加至柱高2/3時，加入O. 25%冰醋酸水溶液(體積/體積)至冰醋酸水溶液液面高于人造沸石沉積面2-3厘米，立即加入提取液，收集層析柱出口流出的白色渾濁的層析液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述生產(chǎn)工藝，其特征在于，按g/mL計，人造沸石與O.25%冰醋酸水溶液(體積/體積)的質(zhì)量體積比為1:10。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟2所述提取液的流速為45飛OmL/min0
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟3所述加入皂土吸附的步驟為按每IOOmL濾液加入3mL10%皂土漿的量加入皂土漿，攪拌吸附40分鐘。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種采用生物提取法制備縮宮素溶液的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝運用獨特的生物制備工藝技術(shù)，采用水提取垂體后葉干粉中的縮宮素，然后利用人造沸石吸附除去垂體后葉干粉提取液中加壓素最后利用皂土除去小分子物質(zhì)、有機有色物和熱原，從而制得縮宮素。本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝具有操作簡單、污染小、收率高等特點，適用于縮宮素的大規(guī)模生產(chǎn)。制得的縮宮素純度高、生物活性高，治療的療效顯著、藥物副作用小、安全性高，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及動、植物養(yǎng)殖領(lǐng)域。
文檔編號C07K1/22GK102964429SQ20121051292
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者金榮富, 陳靜 申請人:安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司