本發(fā)明涉及新穎的包含細(xì)菌RNA和細(xì)菌細(xì)胞壁的組合物以及用于制備和使用這些組合物的方法。這些組合物具有免疫刺激和抗癌活性。

背景技術(shù)：
癌癥的治療繼續(xù)是臨床和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)的一個(gè)問題。目前可利用的治療方案包括外科手術(shù)、輻射、化學(xué)療法、免疫療法(包括自體和異源細(xì)胞療法)或它們的組合。外科手術(shù)經(jīng)常由于腫瘤組織未被識(shí)別和未被切除而失敗。輻射和化學(xué)療法也經(jīng)常失敗，并且所述治療的副作用經(jīng)常降低患者的生活質(zhì)量。外科手術(shù)和化學(xué)療法與免疫系統(tǒng)的顯著的且經(jīng)常非特異性的抑制有關(guān)(Hammer等人，Eur.Surg.Res.，199224：133-137；Joos和Tam，Proc.Am.Thorac.Soc.，20052：445-448)。這種免疫抑制經(jīng)常與機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生有關(guān)，正如接受高劑量全身輻照的個(gè)體中已知的高傳染性并發(fā)癥比率所證實(shí)的(Gil等人，Infection，200735：421-427)。輻射、外科手術(shù)和化學(xué)療法另外與多譜系造血的和骨髓的抑制(骨髓抑制)有關(guān)，例如，但不限于，白細(xì)胞減少癥、嗜中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥和/或貧血(Montoya.J.Infus.Nurs.200730：168-172)。這些病癥對(duì)于患者而言可能是危及生命的。化學(xué)療法經(jīng)常由于抗性的存在或隨后形成而失效，所述抗性經(jīng)?？梢钥绮煌N類的藥物(多藥抗藥性)。癌癥的免疫療法已經(jīng)使用了許多年。首選的免疫治療之一是混合的細(xì)菌疫苗(Coley氏疫苗)，其活性成分是細(xì)菌脂多糖。應(yīng)當(dāng)指出，由于脂多糖的不希望的且經(jīng)常有毒的效應(yīng)，管理機(jī)構(gòu)努力限制或消除脂多糖在藥劑中的存在。近年來，被輻照過的惡性黑素瘤細(xì)胞的混合物已經(jīng)用于在具有惡性黑素瘤的患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，這增加了幾位患者的存活期(Morton，等人.Ann.Surg.1992，216：463-482)。由免疫治療(免疫療法)提供的一個(gè)重大益處是，它通常不伴有外科手術(shù)、輻射或化學(xué)療法的副作用。在3項(xiàng)在癌癥患者中使用樹突細(xì)胞免疫療法的研究中，報(bào)告了極微小的副作用至沒有副作用(Hsu，等人.NatureMedicine，19962：52-58；Murphy，等人。TheProstate，199629：371-380；Nestle，等人.NatureMedicine，1998，4(3)：328-332)。已知分枝桿菌細(xì)胞壁會(huì)刺激宿主免疫防御機(jī)制(先天性防御機(jī)制，通過與病原體相關(guān)分子模式受體(PAMP)的相互作用；和獲得性防御機(jī)制，通過免疫原性的分子物質(zhì)的存在)。使用完整的、存活的分枝桿菌的免疫療法在臨床上被用于治療膀胱癌。將分枝桿菌卡介苗(BCG)(即一種減毒的牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)菌株)重復(fù)滴注進(jìn)具有膀胱癌的個(gè)體的膀胱中，在可能且優(yōu)選的情況下，在通過外科手術(shù)切除腫瘤以后在佐劑環(huán)境中(如例如歐洲泌尿科學(xué)會(huì)指南(EuropeanAssociationofUrologyGuidelines)2007版第8-9頁所述)。但是，它的應(yīng)用伴有用它的存活性質(zhì)有關(guān)的許多不利副作用(Koya，等人.J.Urology2006，175：2004-2010)，以及經(jīng)常較低的臨床效力和應(yīng)答持續(xù)時(shí)間比率，特別是在經(jīng)歷治療復(fù)發(fā)的患者中(Witjes和Hendricksen.Eur.Urol.2008，53：24-26)。它的用于治療其它癌癥的用途被禁止，因?yàn)樗谢罘种U菌，且可以引起致命的全身性感染(Orifice，等人.Tumori1978，64：437-443)。已經(jīng)使用分枝桿菌牝牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)嘗試了使用完整的、但是滅活的分枝桿菌的癌癥免疫療法，但是迄今為止尚未在臨床研究中鑒別出在使用它以后確定的長期存活(參見Stanford等人，Eur.J.Cancer2008，44：224-227)。顯然，完整分枝桿菌(不論存活的還是滅活的)不代表用于癌癥治療的最有效形式的免疫療法。已經(jīng)在動(dòng)物腫瘤模型中、在癌癥患者中(美國專利號(hào)4,503,048，5,759,554和6,326,357)，并且作為諸如細(xì)菌和病毒感染等感染性疾病的治療(美國專利號(hào)3,172,815和4,744,984)，充分評(píng)價(jià)了利用細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)菌提取物的免疫療法。具有免疫刺激和抗癌活性的分枝桿菌細(xì)胞壁組合物(例如如在美國專利號(hào).4,503,048，5,759,554，6,329,347和/或在Ribi等人，J.Bacteriol.中所述1965，91：975-983)具有下述缺點(diǎn)：它們的制備需要生物試劑和材料、化學(xué)試劑、溶劑或稀釋劑和酶處理，具有有害的化學(xué)試劑和外來蛋白污染的潛力。此外，已經(jīng)報(bào)道，為了得到最佳的抗癌活性，需要作為油乳狀液的高純度的分枝桿菌細(xì)胞壁(主要由充分的化學(xué)和酶處理以后剩下的細(xì)胞壁骨架組成)制劑(Yarkoni和Rapp，CancerRes.，197939：535-7)。含有分枝桿菌細(xì)胞壁的油乳狀液經(jīng)常是物理上不穩(wěn)定的，且難以再現(xiàn)地制備，并且可以對(duì)受體是有毒的(因?yàn)楸娝苤恼T發(fā)超敏反應(yīng)的潛力)。還已經(jīng)描述了含有生物活性的復(fù)合DNA的分枝桿菌細(xì)胞壁，其具有免疫治療和抗癌活性，并且其不依賴于油的存在(美國專利號(hào)6,326,357)，但是這些仍然具有下述缺點(diǎn)：它們的制備需要化學(xué)和酶處理，具有有害的化學(xué)試劑和外來蛋白污染的潛力。另外，使用這樣的組合物，尚未證實(shí)可能優(yōu)先地優(yōu)化免疫治療活性或抗癌活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，使用小樣品體積和在40,000-45,000磅/平方英寸(PSI，等于276-317mpa)(參見Ribi等人，J.Bacterial.，1966，91：975-983)高壓的冷卻的壓力盒(諸如Sorvall壓力盒)，可以實(shí)現(xiàn)微生物的裂解。這樣的方法耗時(shí)、低效且具有小體積，并且另外受到這類設(shè)備的當(dāng)前不能利用性的阻礙。已經(jīng)描述了使用高壓均質(zhì)化的更有效的方法用于從遺傳工程改造的微生物中分離蛋白(作為包涵體)(參見Peternel和Komel：Isolationofbiologicallyactivenanomaterial[inclusionbodies]frombacterialcells.MicrobialCellFactories20109：66)。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，革蘭氏陽性生物由于它們的肽聚糖含量和結(jié)構(gòu)而對(duì)這樣的方法具有抗性(參見Diels和Michaels：Highpressurehomogenizationasanon-thermaltechniquefortheinactivationofmicroorganisms.Crit.Rev.Microbiol.，2006；32：201-216)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也教導(dǎo)了使均質(zhì)化循環(huán)數(shù)目最小化的技術(shù)的應(yīng)用(參見Bailey等人，ImprovedhomogenizationofrecombinantEscherichiacolifollowingpretreatmentwithguanidiniumchloride：Biotech.Prog.，1995；11：533-539)。這樣的操作的應(yīng)用實(shí)際上明顯地是用于除去細(xì)胞壁碎片，而不是保留它們。使用高壓破碎技術(shù)時(shí)，諸如DNA等核酸的存在被另外教導(dǎo)為要除去(而不是保留)的污染物(參見Rathore等人，AnalysisforresidualhostcellproteinsandDNAinprocessstreamsofarecombinantproteinproductexpressedinEscherichiacolicells：J.Pharm.Biomed.Anal.，2003；32：1199-1211)。需要這樣的用于制備新細(xì)菌核酸組合物的新操作：其使用在幾mL至幾升體積范圍內(nèi)的可縮放的工作體積，并導(dǎo)致新的細(xì)菌核酸和細(xì)胞壁組合物的有效生產(chǎn)。已知的是，分枝桿菌細(xì)胞壁及其組分可以刺激和活化巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞以產(chǎn)生生物活性分子，所述生物活性分子可以引起、加速、放大和刺激免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)免疫刺激效應(yīng)。這些生物活性分子包括，但不限于：造血和骨髓生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子。生長因子是結(jié)合細(xì)胞表面上的受體的蛋白，主要結(jié)果是活化細(xì)胞的增殖和/或分化。細(xì)胞因子是一個(gè)獨(dú)特的調(diào)節(jié)蛋白家族。主要從免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(諸如但不限于白細(xì)胞)分泌、并充當(dāng)細(xì)胞間介質(zhì)的細(xì)胞因子會(huì)刺激體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答以及吞噬細(xì)胞的活化。從淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子被稱作淋巴因子，而由單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子被稱作單核因子。許多淋巴因子也被稱作白介素(IL)，因?yàn)樗鼈儾粌H由白細(xì)胞分泌，而且能夠影響白細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答。趨化因子是這樣的一類細(xì)胞因子：其具有吸引和活化白細(xì)胞的能力，特別是響應(yīng)于感染(一個(gè)被稱作趨化性的過程)。根據(jù)共有半胱氨酸基序中的變異，可以將它們分成至少3個(gè)結(jié)構(gòu)分支：c(趨化因子、c)、cc(趨化因子、cc)和cxc(趨化因子，cxc)(Johrer等人.Exp.Opin.Biol.Ther.20088：269-290.)?；瘜W(xué)治療劑或輻射療法對(duì)負(fù)責(zé)產(chǎn)生這些造血和骨髓生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的生產(chǎn)的有害影響，會(huì)導(dǎo)致增加的機(jī)會(huì)性感染的易感性。癌癥(其中存在超過100種疾病)是非典型細(xì)胞的異常凈積累，其源自失控的細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡的缺乏或缺陷、或前述二者的組合。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(例如，但不限于，F(xiàn)as、TNFR1和p53/p21)中的突變已經(jīng)各自涉入癌癥的發(fā)病機(jī)制(Levine，A.Cell88：323-331，1997；Fisher，D.Cell78：529-542，1994)。異常的細(xì)胞凋亡不僅對(duì)于癌癥的發(fā)病機(jī)制而言是重要的，而且對(duì)于癌癥對(duì)許多抗癌療法的抗性的可能性而言也是重要的。對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的抗性已經(jīng)作為重要的多藥抗藥性(MDR)種類而出現(xiàn)，其可能解釋高比例的治療失敗。MDR(同時(shí)對(duì)結(jié)構(gòu)上和功能上無關(guān)的化學(xué)治療劑類別的抗性)可以是先天性的和獲得性的。也就是說，有些癌癥從不對(duì)治療做出應(yīng)答，而其它癌癥(最初對(duì)治療敏感的)隨后通過抗性克隆的選擇而形成抗藥性。由于化學(xué)治療劑的治療效果主要依賴于在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抗藥性(其會(huì)降低化學(xué)治療劑的有效性)會(huì)直接地或間接地導(dǎo)致減少的細(xì)胞凋亡，且通常與多種癌癥的臨床預(yù)后不良有關(guān)。已經(jīng)證實(shí)，現(xiàn)有技術(shù)的抗癌劑對(duì)于臨床應(yīng)用而言是不充分的。這些藥劑中的許多是無效的(Bischoff等人.Science274：373-376，1996)或有毒的，具有顯著的副作用(Lamm等人.JournalofUrology153：1444-1450，1995)，導(dǎo)致抗藥性或免疫致敏和超敏反應(yīng)的形成，并弱化受體。因此，需要這樣的新穎的治療性組合物：其刺激免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和造血和骨髓生長因子，抑制癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。這些治療性組合物應(yīng)當(dāng)自身可用作抗癌劑，以及就其它抗癌劑而言具有佐劑活性。該治療性組合物應(yīng)當(dāng)可用于預(yù)防或治療與癌癥、外科手術(shù)、輻射或化學(xué)療法有關(guān)的骨髓抑制。此外，這樣的治療性組合物應(yīng)當(dāng)可簡(jiǎn)單地且相對(duì)廉價(jià)地制備，它的活性應(yīng)當(dāng)在制品之間是可再現(xiàn)的，它的活性應(yīng)當(dāng)隨時(shí)間保持穩(wěn)定，并且它對(duì)癌細(xì)胞的作用應(yīng)當(dāng)可用具有最小不利反應(yīng)性和毒性的給藥方案來實(shí)現(xiàn)。另外，需要制備新穎的治療性組合物的方法，所述組合物是有效的，且不會(huì)導(dǎo)致在它們的制備中使用的酶或化學(xué)試劑的存在。還需要新穎的治療性組合物，其治療、預(yù)防、減輕或改善自身免疫障礙、炎癥性或傳染性疾病、骨髓抑制或造血和骨髓異常。所述治療性組合物應(yīng)當(dāng)可與其它治療劑一起用作佐劑。此外，這樣的治療性組合物應(yīng)當(dāng)可簡(jiǎn)單地且相對(duì)廉價(jià)地制備，它的活性應(yīng)當(dāng)在制品之間是可再現(xiàn)的，它的活性應(yīng)當(dāng)隨時(shí)間保持穩(wěn)定，并且它的作用應(yīng)當(dāng)可用具有最小毒性的給藥方案來實(shí)現(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明通過提供新穎組合物滿足了上述要求，所述組合物包含源自細(xì)菌或分枝桿菌的核糖核酸(RNA)和細(xì)胞壁(在本文中定義為RNC)。本發(fā)明通過提供包含細(xì)菌核糖核酸(RNA)和細(xì)菌細(xì)胞壁(定義為BRNC)的新穎組合物和制備和使用這些組合物的方法滿足了上述要求。本發(fā)明還通過提供包含分枝桿菌RNA和分枝桿菌細(xì)胞壁(定義為MRNC)的新穎組合物和制備和使用這些組合物的方法滿足了上述要求。這些新穎組合物包含：分離自細(xì)菌或分枝桿菌的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的細(xì)菌或分枝桿菌RNA和細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞壁，其中所述RNA可以作為單鏈(ss)、雙鏈(ds)或單鏈-雙鏈雜合鏈(hs)存在，其中所述RNA配制在藥學(xué)上可接受的媒介物中或與藥學(xué)上可接受的載體系統(tǒng)復(fù)合(其中術(shù)語復(fù)合用于描述2種或更多種分子物質(zhì)的化學(xué)結(jié)合)。盡管可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的藥用載體系統(tǒng)，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體系統(tǒng)是基于細(xì)菌細(xì)胞壁或分枝桿菌細(xì)胞壁。本發(fā)明的組合物還可以含有完整的細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞，其含量針對(duì)期望的治療目的進(jìn)行選擇。本發(fā)明的組合物具有抗癌活性。本發(fā)明的組合物也含有免疫系統(tǒng)刺激活性。本發(fā)明的組合物也可作為其它治療方式的佐劑。在本申請(qǐng)中使用3種不同的名稱來描述這些新穎組合物。首先，術(shù)語細(xì)菌RNA組合物(BRNC)通常用于描述由不同的細(xì)菌物種制成的組合物。BRNC可以用本文公開的方法從不同的革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌制備。其次，術(shù)語分枝桿菌RNA組合物(MRNC)用于描述由不同的分枝桿菌制成的組合物。在不同的實(shí)施方案中，MRNC可以從任何分枝桿菌制備。第三，在其它實(shí)施方案中，使用具體的分枝桿菌種、分枝桿菌復(fù)合物或分枝桿菌菌株來制備MRNC。這些的例子是，但不限于：鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)(包括副結(jié)核亞種，通常稱作MAP)、牛分枝桿菌BCG(MycobacteriumbovisBCG)、草分枝桿菌(Mycobacteriumphlei)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)或牝牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)，利用本文公開的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，制備本文所述的組合物的方法可用于從除了在詳細(xì)描述和實(shí)施例中描述的那些以外的分枝桿菌制備MRNC。術(shù)語分枝桿菌RNA組合物(MpRNC)用于描述包含從草分枝桿菌制備的RNA和細(xì)胞壁的組合物。術(shù)語牛分枝桿菌菌株BCGRNA組合物(MbRNC)、恥垢分枝桿菌RNA組合物(MsRNC)、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)RNA組合物(MapRNC)和牝牛分枝桿菌RNA組合物(MvRNC)分別用于描述包含從牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種和牝牛分枝桿菌制備的RNA和細(xì)胞壁的組合物。在每種組合物MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中，使用導(dǎo)致寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的有效產(chǎn)生的操作，從分枝桿菌分離出RNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每種MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC還可以含有不同量的完整分枝桿菌細(xì)胞。完整細(xì)胞可以以下述量存在于MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC中：按重量計(jì)大約0-99％，0.05-95％，0.07-50％，0.1-20％或0.19-19％的量，或在這些范圍中的任一個(gè)內(nèi)的量，或按重量計(jì)小于或0.75％小于0.2％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些新穎組合物具有一定含量(其可以在總核酸含量的大約30％至100％范圍內(nèi))的2-4000個(gè)堿基長度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的RNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些新穎組合物具有一定含量(總核酸含量的大約30-100％)的2-150個(gè)堿基長度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些新穎組合物具有一定含量(總核酸含量的大約30-100％)的大于150或151-4000個(gè)堿基長度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些新穎組合物具有一定含量(總核酸含量的大約30-100％)的主要是20-40個(gè)堿基長度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。當(dāng)存在最小含量的完整分枝桿菌細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明的組合物的抗癌活性最大化。當(dāng)存在5-50％w/w范圍內(nèi)的完整分枝桿菌細(xì)胞含量時(shí)，免疫刺激活性最大化。通過控制在實(shí)施例中詳述的制備方法，或通過向MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC中添加完整的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)期望的完整的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞的含量。MRNC可以作為從一種分枝桿菌種、菌株、亞株或復(fù)合物制備的組合物單獨(dú)使用，或者與得自其它分枝桿菌種、菌株、亞株或復(fù)合物的MRNC聯(lián)合使用。例如，MpRNC和MvRNC的組合將產(chǎn)生免疫刺激和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的最佳NOD2和TLR2活化。類似地，MpRNC和MvRNC的組合將產(chǎn)生最佳抗癌活性和免疫刺激。這些新組合物具有免疫刺激活性、抗癌活性和造血的和骨髓的干細(xì)胞生長因子刺激活性。與現(xiàn)有技術(shù)制品不同，這些新組合物含有寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸(諸如但不限于單鏈(ss)、雙鏈(ds)或它們的混合物)，且含有適用于預(yù)期用途的水平的完整分枝桿菌。并且，與現(xiàn)有技術(shù)不同，在需要合成試劑的組合(參見Uehara等人，Muramyldipeptideanddiaminopimelicacid-containingdesmuramylpeptidesincombinationwithchemicallysynthesizedToll-likereceptoragonistssynergisticallyinducedproductionofinterleukin-8inaNOD2-andNOD-dependentmanner，respectively，inhumanmonocyticcellsinculture：Cell.Microbiol.，2005；7：53-61)的情況下，這些新組合物具有活化核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(NOD2)和Toll-樣受體2(TLR2)受體的能力，從而證實(shí)了對(duì)免疫系統(tǒng)受體的意外的雙功能激動(dòng)劑活性，其可用于在預(yù)防性或治療性處理方案中刺激免疫系統(tǒng)、刺激造血干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞增殖以及治療癌癥。在不同的實(shí)施方案中，這些組合物可有效地誘導(dǎo)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞的應(yīng)答、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或細(xì)胞凋亡以及抑制細(xì)胞增殖。這些組合物會(huì)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子以及造血干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞生長因子。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可相對(duì)廉價(jià)地制備，并且它們的活性可在制品中再現(xiàn)。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC隨時(shí)間保持穩(wěn)定且有效，且在具有最小毒性的給藥方案。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC分別如下從分枝桿菌或草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌制備：培養(yǎng)并收獲所述分枝桿菌。通過利用高壓均質(zhì)化，破碎分枝桿菌以根據(jù)需要除去完整分枝桿菌，隨后進(jìn)行離心過程以根據(jù)需要消除任何殘余的完整分枝桿菌細(xì)胞。重要的是，使用無RNA酶的和/或非特異性的無核酸酶的試劑來優(yōu)化RNC的回收。根據(jù)需要使用低相對(duì)離心力來除去完整分枝桿菌。然后可以使用常規(guī)萃取技術(shù)(例如硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取)分離出寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸，或者在除去完整分枝桿菌以后對(duì)上清液施加高相對(duì)離心力，以分離出在細(xì)胞破碎以后仍然與分枝桿菌細(xì)胞壁混合在一起的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。重要的是，使用不含核酸酶污染(非特異性的內(nèi)切和外切核酸酶或核糖核酸酶)的試劑來消除或最小化RNA降解，并由此優(yōu)化制備步驟中的產(chǎn)量。在預(yù)防、治療和消除多種疾病和減輕疾病的影響中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC是有效的治療劑，所述疾病包括、但不限于，惡性的、自身免疫性和免疫缺陷性疾病、骨髓抑制和造血和骨髓異常。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC特別適用于治療由不希望的和失控的細(xì)胞增殖介導(dǎo)的疾病和過程，諸如癌癥。這些組合物還可作為佐劑有效地增強(qiáng)其它抗癌劑的有效性。這樣的抗癌劑包括，但不限于：藥物、免疫刺激物、抗原、抗體、疫苗、輻射、化學(xué)治療劑、基因試劑、生物學(xué)上工程改造的試劑和化學(xué)合成的試劑、以及靶向細(xì)胞死亡分子進(jìn)行活化或滅活的試劑、抑制癌細(xì)胞增殖的試劑和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的試劑。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC還可有效地用于預(yù)防或治療與癌癥治療有關(guān)的骨髓抑制(單核細(xì)胞減少癥和/或嗜中性粒細(xì)胞減少癥)或癌癥本身，以及用于預(yù)防或治療與藥物治療或疾病有關(guān)的不同的造血和骨髓異常，所述疾病例如、但不限于獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、骨髓增生異常綜合征、自身免疫疾病、終末期腎疾病或病毒感染。在藥學(xué)上可接受的載體中的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC可以以有效地刺激免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞的應(yīng)答、和抑制應(yīng)答細(xì)胞的增殖、和誘導(dǎo)應(yīng)答細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的劑量施用給動(dòng)物或人。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC可以通過下述方法施用：包括、但不限于，懸浮在水性制劑中、在乳膏劑和凝膠中，通過在油或其它疏水的液體制劑中乳化，包封在脂質(zhì)體中，和與天然的或人工的載體、與組織-或細(xì)胞-特異性的配體、或與組織-或細(xì)胞-特異性的抗體形成復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC的新穎組合物和制備這些組合物的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC組合物的新穎制備方法，所述方法優(yōu)化用于制備分枝桿菌細(xì)胞群的培養(yǎng)基中的碳源、氮源和鐵源的含量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可用于培養(yǎng)分枝桿菌細(xì)胞群的新穎合成培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC組合物的新穎制備方法，所述方法優(yōu)化培養(yǎng)基中的碳、氮和鐵的含量，并消除對(duì)用于制備分枝桿菌細(xì)胞群的外源性生物材料的需求，并消除外源性生物試劑或化學(xué)試劑在下游制備方法中的應(yīng)用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在藥學(xué)上可接受的載體中的新穎的治療性的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC的治療性組合物以及使用這些治療性組合物誘導(dǎo)動(dòng)物或人的應(yīng)答細(xì)胞的治療應(yīng)答的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過給動(dòng)物或人施用這些治療性組合物來刺激免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過給動(dòng)物或人施用這些治療性組合物來刺激免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞產(chǎn)生生物活性分子(諸如細(xì)胞因子、趨化因子、白介素和/或造血和骨髓生長因子)的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過給動(dòng)物或人施用這些治療性組合物來有效地治療動(dòng)物或人的疾病的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過給動(dòng)物或人施用這些治療性組合物來有效地治療動(dòng)物或人的癌癥的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物和方法，其抑制動(dòng)物的應(yīng)答細(xì)胞的增殖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物和方法，其誘導(dǎo)動(dòng)物的應(yīng)答細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物和方法，其可有效地用作其它抗癌療法的佐劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物和方法，其可有效地用作其它免疫刺激療法的佐劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物和方法，其可有效地用于治療免疫缺陷疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物和方法，其可有效地用于預(yù)防或治療骨髓抑制(白細(xì)胞減少癥、嗜中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥或貧血)或造血和骨髓異常。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物和方法，其可有效地用作用于預(yù)防或治療骨髓抑制或造血和骨髓異常的其它療法的佐劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過給動(dòng)物或人施用這些治療性組合物來有效地治療動(dòng)物或人的自身免疫病的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備方法，其不會(huì)導(dǎo)致化學(xué)試劑或酶在組合物中的存在。在閱讀公開的實(shí)施方案的下述詳細(xì)描述和所附權(quán)利要求書以后，將會(huì)明白本發(fā)明的這些和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1。草分枝桿菌(1a)、MCWE(1b)、MCC(1c)、MpRNC低(1d)、MpRNC中間(1e)和MpRNC高(1f)的透射電子顯微照片(TEM)。條是1μm(對(duì)于1a、1b和1c)和2μm(對(duì)于1d、1e和1f)。圖2。核酸寡核苷酸長度的電泳分析。2a.使用RNA納米6000試劑盒，在高壓滅菌之前的RNA梯標(biāo)準(zhǔn)品和MpRNC中間。2b.使用小RNA試劑盒在高壓滅菌以后含有不同比例的高壓滅菌的草分枝桿菌細(xì)胞的MpRNC(MpRNC高-、MpRNC低-或/和MpRNC中間-)(在4個(gè)核苷酸處的峰是內(nèi)部寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品，且與MpRNC中的核酸無關(guān)。FU＝熒光單位，nt＝核苷酸長度圖3。在RNA酶-A處理之前和之后測(cè)得的含有不同比例的高壓滅菌的完整草分枝桿菌細(xì)胞(3a高-、3b低-或3c中間)和高壓滅菌的草分枝桿菌(3d)的MpRNC的RNA和DNA含量。圖4。在MpRNC、MbRNC、MsRNC和MvRNC中的RNA酶敏感的核酸(NA)。4a：提取的對(duì)照處理的和RNA酶處理的核酸的脲-PAGE凝膠電泳；4b：通過掃描密度測(cè)定法測(cè)得的提取的核酸中的RNA的比例。圖5。MpRNC中間的分枝菌酸譜。5a：使用用于定量可提取脂類的山崳酸標(biāo)準(zhǔn)品得到的分枝菌酸譜；5b：使用用于定量可皂化脂類的低和高分枝菌酸碳數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品(估測(cè)為～C40和～C110)得到的分枝菌酸譜。圖6。分枝桿菌RNC的NOD2活化。使用表達(dá)NOD2的HEK293細(xì)胞確定從4種分枝桿菌種(草分枝桿菌、牛分枝桿菌菌株BCG、恥垢分枝桿菌和牝牛分枝桿菌)制備的RNC的NOD2激動(dòng)劑活性。NOD2活化導(dǎo)致NF-κB-驅(qū)動(dòng)的分泌型胚性堿性磷酸酶(SEAP)誘導(dǎo)。在用細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的SEAP水解底物以后，將酶活性表達(dá)為在630nm的O.D.，且與NOD2活化成比例。一式三份測(cè)定的平均值±。圖7。分枝桿菌RNC的TLR2活化。使用表達(dá)TLR2受體的HEK293細(xì)胞確定從4種分枝桿菌種(草分枝桿菌、牛分枝桿菌菌株BCG、恥垢分枝桿菌和牝牛分枝桿菌)制備的MRNC的TLR2激動(dòng)劑活性。TLR2活化導(dǎo)致NF-κB-驅(qū)動(dòng)的SEAP誘導(dǎo)。在用細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的SEAP水解底物以后，將酶活性表達(dá)為在630nm的O.D.，且與NOD2活化成比例。一式三份測(cè)定的平均值±。圖8。含有不同比例的高壓滅菌的完整草分枝桿菌的MpRNC中間對(duì)人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的IL-10和IL-12產(chǎn)生的刺激。通過ELISA測(cè)定在用MpRNC和高壓滅菌的草分枝桿菌處理以后由人PBMC產(chǎn)生的IL-10和IL-12p40亞基。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了新穎組合物，其包含源自細(xì)菌或分枝桿菌的核糖核酸(RNA)和細(xì)胞壁(在本文中定義為RNC)。本發(fā)明提供了包含細(xì)菌RNA和細(xì)菌細(xì)胞壁的新穎組合物(定義為BRNC)以及制備和使用這些組合物的方法。本發(fā)明也提供了包含分枝桿菌RNA和分枝桿菌細(xì)胞壁的新穎組合物(定義為MRNC)以及制備和使用這些組合物的方法。這些組合物可以與載體和/或細(xì)胞一起配制。這些新穎組合物包含得自細(xì)菌或分枝桿菌的細(xì)胞壁以及得自細(xì)菌或分枝桿菌RNA的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的RNA，其中所述寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸可以作為單鏈(ss)、雙鏈(ds)或單鏈-雙鏈雜合鏈(hs)存在。這些組合物可以在藥學(xué)上可接受的媒介物中配制或與藥學(xué)上可接受的載體系統(tǒng)復(fù)合(其中術(shù)語復(fù)合用于描述2種或更多種分子物質(zhì)的化學(xué)結(jié)合)。本發(fā)明的組合物還可以含有完整的細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞，其含量針對(duì)期望的治療目的進(jìn)行優(yōu)化。這些新組合物具有免疫刺激活性、抗癌活性和造血的和骨髓的干細(xì)胞生長因子刺激活性。與現(xiàn)有技術(shù)制品不同，這些新組合物含有寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸(諸如但不限于單鏈(ss)、雙鏈(ds)或它們的混合物)，并且任選地含有適用于預(yù)期用途的選定水平的完整分枝桿菌。并且，與現(xiàn)有技術(shù)不同，在需要合成試劑的組合(參見Uehara等人，Muramyldipeptideanddiaminopimelicacid-containingdesmuramylpeptidesincombinationwithchemicallysynthesizedToll-likereceptoragonistssynergisticallyinducedproductionofinterleukin-8inaNOD2-andNOD-dependentmanner，respectively，inhumanmonocyticcellsinculture：Cell.Microbiol.，2005；7：53-61)的情況下，這些新組合物具有活化核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(NOD2)和Toll-樣受體2(TLR2)受體的能力，從而證實(shí)了對(duì)免疫系統(tǒng)受體的意外的雙功能激動(dòng)劑活性，其可用于在預(yù)防性或治療性處理方案中刺激免疫系統(tǒng)、刺激造血干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞增殖以及治療癌癥。在不同的實(shí)施方案中，這些組合物可有效地誘導(dǎo)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞的應(yīng)答、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或細(xì)胞凋亡以及抑制細(xì)胞增殖。這些組合物會(huì)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子以及造血干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞生長因子。在預(yù)防、治療和消除多種疾病和減輕疾病的影響中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC是有效的治療劑，所述疾病包括、但不限于，惡性的、自身免疫性和免疫缺陷性疾病、骨髓抑制和造血和骨髓異常。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC特別適用于治療由不希望的和失控的細(xì)胞增殖介導(dǎo)的疾病和過程，諸如癌癥。這些組合物還可作為佐劑有效地增強(qiáng)其它抗癌劑的有效性。這樣的抗癌劑包括，但不限于：藥物、免疫刺激物、抗原、抗體、疫苗、輻射、化學(xué)治療劑、基因試劑、生物學(xué)上工程改造的試劑和化學(xué)合成的試劑、以及靶向細(xì)胞死亡分子進(jìn)行活化或滅活的試劑、抑制癌細(xì)胞增殖的試劑和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的試劑。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC還可有效地用于預(yù)防或治療與癌癥治療有關(guān)的骨髓抑制(單核細(xì)胞減少癥和/或嗜中性粒細(xì)胞減少癥)或癌癥本身，以及用于預(yù)防或治療與藥物治療或疾病有關(guān)的不同的造血和骨髓異常，所述疾病例如、但不限于獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、骨髓增生異常綜合征、自身免疫疾病、終末期腎疾病或病毒感染。在藥學(xué)上可接受的載體中的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC可以以有效地刺激免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞的應(yīng)答、和抑制應(yīng)答細(xì)胞的增殖、和誘導(dǎo)應(yīng)答細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的劑量施用給動(dòng)物或人。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC可以通過下述方法施用：包括、但不限于，懸浮在水性制劑中、在乳膏劑和凝膠中，通過在油或其它疏水的液體制劑中乳化，包封在脂質(zhì)體中，和與天然的或人工的載體、與組織-或細(xì)胞-特異性的配體、或與組織-或細(xì)胞-特異性的抗體形成復(fù)合物。定義術(shù)語制備方法的優(yōu)化用于描述這樣的過程：其中獲得分枝桿菌細(xì)胞群的發(fā)酵利用培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中存在適當(dāng)?shù)奶肌⒌丸F含量，從而導(dǎo)致提高的分枝桿菌細(xì)胞群產(chǎn)量。術(shù)語制備方法的優(yōu)化也表示，在分枝桿菌細(xì)胞壁組合物的制備中，消除對(duì)化學(xué)試劑或酶的應(yīng)用的需求。在本申請(qǐng)中使用3種不同的名稱來描述這些新穎組合物。首先，術(shù)語細(xì)菌RNA組合物(BRNC)通常用于描述由不同的細(xì)菌物種制成的組合物。BRNC可以用本文公開的方法從不同的革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌制備。其次，術(shù)語分枝桿菌RNA組合物(MRNC)用于描述由不同的分枝桿菌制成的組合物。在不同的實(shí)施方案中，MRNC可以從任何分枝桿菌制備。第三，在其它實(shí)施方案中，使用具體的分枝桿菌種、分枝桿菌復(fù)合物或分枝桿菌菌株來制備MRNC。這些的例子是，但不限于：鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)(包括副結(jié)核亞種，通常稱作MAP)、牛分枝桿菌BCG(MycobacteriumbovisBCG)、草分枝桿菌(Mycobacteriumphlei)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)或牝牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)，利用本文公開的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，制備本文所述的組合物的方法可用于從除了在詳細(xì)描述和實(shí)施例中描述的那些以外的分枝桿菌制備MRNC。術(shù)語分枝桿菌RNA組合物(MpRNC)用于描述包含從草分枝桿菌制備的RNA和細(xì)胞壁的組合物。術(shù)語牛分枝桿菌菌株BCGRNA組合物(MbRNC)、恥垢分枝桿菌RNA組合物(MsRNC)、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)RNA組合物(MapRNC)和牝牛分枝桿菌RNA組合物(MvRNC)分別用于描述包含從牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種和牝牛分枝桿菌制備的RNA和細(xì)胞壁的組合物。在每種組合物MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中，使用導(dǎo)致寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的有效產(chǎn)生的操作，從分枝桿菌分離出RNA。術(shù)語分枝桿菌RNA組合物(MRNC)用于描述由不同的分枝桿菌制成的組合物。在不同的實(shí)施方案中，MRNC可以從任何分枝桿菌制備。在其它實(shí)施方案中，使用具體的分枝桿菌種、分枝桿菌復(fù)合物或分枝桿菌菌株來制備MRNC。這些的例子是，但不限于：鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)(包括副結(jié)核亞種，通常稱作MAP)、牛分枝桿菌BCG(MycobacteriumbovisBCG)、草分枝桿菌(Mycobacteriumphlei)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)或牝牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)，利用本文公開的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，制備本文所述的組合物的方法可用于從除了在詳細(xì)描述和實(shí)施例中描述的那些以外的分枝桿菌制備細(xì)胞壁組合物。術(shù)語草分枝桿菌RNA組合物(MpRNC)用于描述從草分枝桿菌制成的組合物。術(shù)語牛分枝桿菌菌株BCGRNA組合物(MbRNC)、恥垢分枝桿菌RNA組合物(MsRNC)、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)RNA組合物(MapRNC)和牝牛分枝桿菌RNA組合物(MvRNC)分別用于描述從牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種和牝牛分枝桿菌制成的組合物。在每種組合物MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中，使用導(dǎo)致寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的有效產(chǎn)生的操作，從分枝桿菌分離出RNA。如本文所定義的，分枝桿菌培養(yǎng)基組合物(MCMC)表示含有優(yōu)化的碳源、氮源和鐵源的新穎的合成培養(yǎng)基，其用于制備分枝桿菌細(xì)胞群，且其中所述培養(yǎng)基的碳、氮和鐵含量使得存在最佳的碳利用和最佳的分枝桿菌濕細(xì)胞群產(chǎn)量。如本文所定義的，培養(yǎng)表示產(chǎn)生分枝桿菌細(xì)胞群的過程，其中在培養(yǎng)基中培養(yǎng)分枝桿菌，所述培養(yǎng)基優(yōu)化過碳、氮和鐵含量但不限于此，以確保細(xì)菌或分枝桿菌的最佳分裂?？梢允褂玫脑O(shè)備和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如本文所定義的，下游處理或制備表示這樣的過程：收獲通過培養(yǎng)制備的分枝桿菌細(xì)胞群，通過使用高壓均質(zhì)化、差速離心和熱處理的適當(dāng)組合，制備含有RNA的組合物或含有RNA的細(xì)胞壁組合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的能夠?qū)崿F(xiàn)高壓均質(zhì)化的技術(shù)，而不脫離本發(fā)明的范圍或教導(dǎo)。如本文所定義的，細(xì)菌細(xì)胞壁表示得自含有細(xì)胞壁分子組分的細(xì)菌界成員的細(xì)胞壁，且其中這些分子至少包含多糖和含有丙氨酸(ALA)的肽鏈，二者共同稱作肽聚糖。如本文所定義的，分枝桿菌細(xì)胞壁表示從至少含有肽聚糖和分枝菌酸的分枝桿菌科和分枝桿菌屬的成員制備的任意細(xì)胞壁組合物，且其中所述肽聚糖由聚合物組成，所述聚合物由[N-乙酰基葡糖胺-N-?；谒醈n的重復(fù)單位組成，其中N-?；荖-乙酰基或N-羥乙?；移渲兴鼍酆湘溚ㄟ^肽橋相連，且其中所述分枝菌酸是α-取代的β-羥基化的極長鏈脂肪酸。這些肽橋的確切氨基酸組成在不同的分枝桿菌種和它們的菌株之間是高度保守的，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，但是經(jīng)常包括二氨基庚二酸(DAP)，并且在已知的范圍內(nèi)，總是包括通過乳酸部分與N-?；谒嵯噙B的丙氨酸(ALA)。分枝菌酸的類型是對(duì)各個(gè)分枝桿菌種特異性的，并根據(jù)分子的長度(范圍為～60-90個(gè)碳原子)細(xì)分成簇。如本文所定義的，外源性污染表示任何外源物的存在，所述外源物包括、但不限于蛋白、生化制品或化學(xué)試劑，其常規(guī)地用于制備細(xì)菌-或分枝桿菌-衍生的組合物(包括制備細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞生物質(zhì)和細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞壁組合物)。與以前的制備細(xì)菌和分枝桿菌細(xì)胞壁組合物的方法不同，用本發(fā)明的方法制備的與RNC組合物有關(guān)的細(xì)菌和分枝桿菌蛋白被保留，因?yàn)闆]有外源性蛋白水解酶處理。與以前的制備細(xì)菌和分枝桿菌細(xì)胞壁組合物的方法不同，所述細(xì)菌和分枝桿菌細(xì)胞壁脂類被保留，因?yàn)闆]有外源性去脂質(zhì)化溶劑處理。如本文所定義的，術(shù)語制備表示用于分離RNC的過程，其中破碎完整的細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞以形成細(xì)胞壁碎片，且其中然后將這樣的碎片與RNA組合地分離，以得到細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞壁RNC。如本文所定義的，術(shù)語寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分別是指，從細(xì)菌、分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌菌株BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌得到的2至大約20個(gè)堿基或20至大約4000個(gè)堿基長度的RNA分子。RNA與細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞壁一起被定義為RNC。所述RNA可以由單鏈(ss)、雙鏈(ds)、單鏈-雙鏈雜合鏈(hs)組成，且所述RNA得自細(xì)菌，更優(yōu)選地得自分枝桿菌，最優(yōu)選地得自草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌。所述RNC可以包含一種或多種得自不同的細(xì)菌或分枝桿菌的RNC，且可以另外包含得自不同的細(xì)菌或分枝桿菌的完整細(xì)胞。還可以使用得自一種或多種細(xì)菌或分枝桿菌的細(xì)胞壁配制RNC。如本文所定義的，細(xì)菌或分枝桿菌的高壓均質(zhì)化表示這樣的過程：其中使完整的細(xì)菌或分枝桿菌在水性賦形劑中的懸浮液在壓力下穿過閥門中的建立高湍流和剪切力條件的微小縫隙，這會(huì)造成細(xì)菌或分枝桿菌裂解成細(xì)胞壁碎片并釋放出細(xì)胞質(zhì)組分，包括蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。如本文所定義的，低速離心表示足以沉淀未破碎的細(xì)菌或分枝桿菌的相對(duì)離心力(RCF)。如本文所定義的，高速離心表示足以沉淀細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞壁RNC的相對(duì)離心力。如本文所定義的，免疫刺激表示刺激先天性和/或獲得性免疫系統(tǒng)，從而引起免疫應(yīng)答。該免疫應(yīng)答可以包括、但不限于下述的一種或多種：免疫細(xì)胞分化和分裂、Toll-樣受體的活化、NOD受體的活化、除了Toll-樣或NOD以外的受體的活化、趨化因子和細(xì)胞因子合成的誘導(dǎo)、生長因子合成的誘導(dǎo)、增加的細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)、減少的細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)、殺細(xì)胞活性或細(xì)胞毒性活性的活化、抗體產(chǎn)生的刺激或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的刺激。如本文所定義的，抗癌活性表示，導(dǎo)致癌細(xì)胞的抑制和/或死亡的任何過程。這樣的抗癌活性可以是對(duì)癌細(xì)胞靶標(biāo)的直接作用的結(jié)果，或者是由免疫系統(tǒng)的刺激引起的間接作用的結(jié)果。在本申請(qǐng)中，術(shù)語動(dòng)物包括人。在本申請(qǐng)中，術(shù)語產(chǎn)生是指合成和/或釋放。用于培養(yǎng)分枝桿菌的新穎組合物本發(fā)明提供了用于培養(yǎng)分枝桿菌的新穎培養(yǎng)基，其含有優(yōu)化水平和比例的碳、氮和鐵，用于以適時(shí)的方式產(chǎn)生分枝桿菌細(xì)胞群。這些新穎培養(yǎng)基利用有機(jī)氮源或無機(jī)氮源，并提供這樣的操作：其中額外的碳、氮和鐵可以在一個(gè)分子內(nèi)提供。這些新穎培養(yǎng)基不需要添加外源性蛋白諸如牛白蛋白或過氧化氫酶就可有效地生產(chǎn)分枝桿菌細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述優(yōu)化的氮通過添加無機(jī)銨鹽(包括、但不限于硫酸銨)來提供。所述優(yōu)化的碳通過添加有機(jī)分子來提供，所述有機(jī)分子包括、但不限于糖類諸如葡萄糖(右旋糖)、二醇類諸如甘油或酸類諸如檸檬酸，且其含有可被分枝桿菌代謝的碳。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述優(yōu)化的氮和碳由含有兩種原子的分子提供，所述分子包括、但不限于檸檬酸(二)銨或氨基酸諸如但不限于天冬酰胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述優(yōu)化的碳、氮和鐵由含有所有三種原子的分子提供，所述分子包括、但不限于檸檬酸鐵銨。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用這樣的培養(yǎng)基：其提供優(yōu)化的碳、氮和鐵以及額外的二價(jià)陽離子(包括、但不限于鈣和鎂)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在沒有額外外源性生物試劑存在下配制所述培養(yǎng)基，所述外源性生物試劑包括、但不限于白蛋白、酶或生長促進(jìn)劑(包括、但不限于分枝桿菌素)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用混合和通氣操作來優(yōu)化氧的供給，以確保細(xì)菌或分枝桿菌的快速的好氧性生長。新穎的細(xì)菌和分枝桿菌組合物本發(fā)明提供了新穎的細(xì)菌和分枝桿菌組合物，其包含分離自細(xì)菌或分枝桿菌的RNA、細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞壁。這些組合物包括如前面定義的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC。這些組合物任選地含有不同量的完整的細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每種組合物MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC還可以含有不同量的完整的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞。完整細(xì)胞可以以下述量存在于MRNC、MpRNC、MbRNCMsRNC、MapRNC或MvRNC中：按重量計(jì)，0-99％、0.05-95％、0.07-50％、0.1-20％或0.19-19％，或在這些范圍中的任一個(gè)內(nèi)的量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些新穎組合物具有一定含量(其可以在總核酸含量的大約30％至100％范圍內(nèi))的2-4000個(gè)堿基長度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的RNA組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些新穎組合物具有一定含量(總核酸含量的30-100％)的大于150個(gè)堿基或151-4000個(gè)堿基長度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的RNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些新穎組合物具有一定含量(總核酸含量的30-100％)的主要為20-40個(gè)堿基長度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用例如硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取從分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)或牝牛分枝桿菌中提取RNA，制備含有約90％或更多的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的RNA的新穎RNC組合物?？梢詫?duì)這樣的RNA制品進(jìn)行熱處理(通過例如但不限于在121℃保持5-30min)，以便得到這樣的RNC組合物：其中寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸鏈長度是在2-4000個(gè)堿基之間。該RNC組合物可以與藥學(xué)上可接受的載體相組合。當(dāng)存在最小含量的完整分枝桿菌細(xì)胞時(shí)，會(huì)優(yōu)化抗癌活性。當(dāng)存在5-50％w/w范圍內(nèi)的完整分枝桿菌細(xì)胞含量時(shí)，會(huì)優(yōu)化免疫刺激活性。通過控制在實(shí)施例中詳述的制備方法，或通過向MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC中添加完整的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)或牝牛分枝桿菌細(xì)胞，可以調(diào)控完整的細(xì)菌、分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)或牝牛分枝桿菌細(xì)胞的數(shù)目。這些新穎組合物MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC具有免疫刺激活性、抗癌活性和造血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞生長因子刺激活性。與現(xiàn)有技術(shù)制品不同，這些新組合物含有單獨(dú)的單鏈(ss)、雙鏈(ds)和單鏈-雙鏈雜合鏈(hs)，為免疫刺激活性和抗癌活性進(jìn)行了優(yōu)化，并與分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)或牝牛分枝桿菌細(xì)胞壁一起配制。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些組合物另外包含適用于預(yù)期用途的一定水平的完整分枝桿菌細(xì)胞。本發(fā)明的組合物可有效地刺激免疫系統(tǒng)、刺激造血和骨髓生長因子合成和治療癌癥。在不同的實(shí)施方案中，這些組合物可有效地誘導(dǎo)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞的應(yīng)答、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或細(xì)胞凋亡、和抑制細(xì)胞增殖。這些組合物誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和造血和骨髓生長因子。當(dāng)與藥學(xué)上可接受的載體相組合以形成治療性組合物并施用給動(dòng)物時(shí)，本發(fā)明的組合物可有效地刺激免疫系統(tǒng)和治療癌癥。在不同的實(shí)施方案中，這些治療性組合物誘導(dǎo)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞的應(yīng)答、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或細(xì)胞凋亡、和抑制癌細(xì)胞增殖。這些組合物誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和造血和骨髓細(xì)胞生長因子。在預(yù)防、治療、減輕和消除多種疾病疾病中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC是有效的治療劑，所述疾病包括、但不限于，惡性的、自身免疫性和免疫缺陷性疾病、骨髓抑制和造血和骨髓異常。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC特別適用于治療由不希望的和失控的細(xì)胞增殖介導(dǎo)的疾病和過程，諸如但不限于癌癥。這些組合物還可作為佐劑有效地增強(qiáng)其它抗癌劑的有效性。這樣的抗癌劑包括，但不限于：藥物、免疫功能刺激物、免疫功能抑制劑、抗原、抗體、疫苗、輻射、化學(xué)治療劑(單獨(dú)的，或在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)組合中)、基因試劑、生物學(xué)上工程改造的試劑和化學(xué)合成的試劑、以及靶向細(xì)胞死亡分子進(jìn)行活化或滅活的試劑、抑制癌細(xì)胞增殖的試劑和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的試劑。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC還可有效地用于預(yù)防或治療與癌癥治療有關(guān)的或癌癥本身誘發(fā)的骨髓抑制(白細(xì)胞減少癥、嗜中性粒細(xì)胞減少癥)，以及用于預(yù)防或治療與藥物治療或疾病有關(guān)的不同的造血和骨髓異常，所述疾病例如、但不限于獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、骨髓增生異常綜合征、自身免疫疾病、終末期腎疾病或病毒感染。本發(fā)明的2種或更多種組合物的組合可以用于優(yōu)化免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和治療癌癥。例如，MpRNC和MvRNC的組合將產(chǎn)生最佳的NOD2和TLR2活化用于免疫刺激和細(xì)胞因子誘導(dǎo)。類似地，MpRNC和MvRNC的組合將產(chǎn)生最佳的抗癌活性和免疫刺激。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用細(xì)菌來提供BRNC組合物，其包含寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的細(xì)菌RNA、細(xì)菌細(xì)胞壁和藥用載體、賦形劑或媒介物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用分枝桿菌來提供MRNC組合物，其包含寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的分枝桿菌RNA、分枝桿菌細(xì)胞壁和藥用載體或媒介物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC組合物分別包含寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的草分枝桿菌RNA、牛分枝桿菌BCGRNA、恥垢分枝桿菌RNA、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種RNA或牝牛分枝桿菌RNA，所述RNA與得自這些物種的細(xì)胞壁和藥用載體、賦形劑或媒介物相組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，用藥物遞送系統(tǒng)(諸如但不限于聚氨基葡糖納米顆?；蜿栯x子脂質(zhì)體)配制BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC或MvRNC組合物。這些組合物BRNC、MRNAC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中的每一種可以與可接受的載體(諸如藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、媒介物或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的的其它遞送系統(tǒng))相組合，以形成可以施用給動(dòng)物或人的組合物。這些組合物BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中的每一種可以分別與選定量的完整的細(xì)菌細(xì)胞、分枝桿菌細(xì)胞、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞相組合，以形成可以施用給動(dòng)物或人的組合物。BRNC、MRNAC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可在動(dòng)物中有效地誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和造血和骨髓生長因子，并抑制應(yīng)答細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)應(yīng)答細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，所述應(yīng)答細(xì)胞包括、但不限于癌細(xì)胞。真細(xì)菌種可以用于實(shí)踐本發(fā)明來制備BRNC或MRNC，包括、但不限于，棒狀桿菌種、棒桿菌屬各種、紅球菌屬各種、博德特菌屬各種、埃希氏菌屬各種、利斯特菌屬各種、諾卡爾菌屬各種和分枝桿菌種。分枝桿菌種，包括、但不限于，恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)、偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacteriumfortuitum)、堪薩斯分枝桿菌(Mycobacteriumkansaii)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、牝牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)、鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)和有關(guān)的亞種和草分枝桿菌(Mycobacteriumphlei)，可以用于制備MRNC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分枝桿菌種草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌用于制備MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，古細(xì)菌物種可以用于制備BRNC。用于制備含有分枝桿菌細(xì)胞壁RNA的組合物(MRNC)的方法本發(fā)明另外提供了一種從任意分枝桿菌種制備分枝桿菌細(xì)胞壁RNA組合物的方法。使用本發(fā)明的方法可以用于制備分枝桿菌細(xì)胞壁-RNA的許多分枝桿菌種、分枝桿菌復(fù)合物、分枝桿菌亞種和分枝桿菌菌株，由例如美國的NCBI(參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov)維持且可從它容易地得到。盡管本發(fā)明提供了從所有分枝桿菌種和菌株制備MRNC的方法，優(yōu)選的分枝桿菌種和菌株是這樣的：已知其在培養(yǎng)中快速地生長，且因而能夠在短時(shí)間段內(nèi)提供分枝桿菌細(xì)胞生物質(zhì)。也優(yōu)選的是，已知快速地生長且另外對(duì)免疫感受態(tài)個(gè)體非致病性的那些分枝桿菌種和菌株。BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可相對(duì)廉價(jià)地制備，它們的活性在制品之間是可再現(xiàn)的，并且它們的活性隨時(shí)間保持穩(wěn)定，并且它們未被外源物污染，所述外源物包括、但不限于本領(lǐng)域技術(shù)人員用于制備分枝桿菌細(xì)胞壁組合物的蛋白、酶、生化制品或化學(xué)試劑。此外，BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品對(duì)受體具有最小的毒性(如果有的話)。為了制備BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC，分別在適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌物種、分枝桿菌種、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌，并收獲，所述培養(yǎng)基具有優(yōu)化的碳、氮和鐵含量，以確保碳源的完全利用。氨基酸提供氮源。二堿基氨基酸(包括、但不限于天冬酰胺)是優(yōu)選的氮源。其它氮源包括銨鹽或它們的等效物。額外的鐵源是無機(jī)鹽或有機(jī)鹽，包括、但不限于檸檬酸鹽，其提供額外的碳源。鐵復(fù)合物，包括、但不限于檸檬酸鐵銨(檸檬酸銨鐵)，會(huì)提供額外的鐵、氮和碳源。優(yōu)選的碳(作為葡萄糖或其它可代謝利用的碳源)濃度是500-2500mMol/升。在不同的實(shí)施方案中，C與N之比是約1∶0.0095至1∶0.06、約1∶0.02至1∶0.06、或在1∶0.06或約1∶0.06。在不同的實(shí)施方案中，C與Fe之比是在或約1∶1.8x10-4至1∶3.2x10-3、在或約1∶1.8x10-3至2.7x10-4、或在或約1∶2.7x10-4?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何可接受的碳源、氮源或鐵源。這樣的培養(yǎng)基還可以含有額外的鹽以及維生素，并預(yù)見到，根據(jù)特定需要調(diào)節(jié)這些的存在和濃度。破碎細(xì)菌或分枝桿菌，以釋放出RNA，并確保完整的細(xì)菌、分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞的受控除去。通過使用高壓均質(zhì)化方法進(jìn)行破碎，隨后進(jìn)行離心過程。低相對(duì)離心力會(huì)除去完整的細(xì)菌或分枝桿菌。使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類似操作，可以在該階段從BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中提取RNA。可替換地，可以使用高相對(duì)離心力分離與在細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞的破碎以后與細(xì)菌、分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞壁混合在一起的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC。重要的是，使用無核酸酶、和無DNA酶/RNA酶(內(nèi)切和外切核酸酶活性)的試劑，并且所述方法在或約4℃進(jìn)行，以使制備步驟中的RNA降解最小化。細(xì)菌RNA的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸序列、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸長度、和寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸結(jié)構(gòu)(諸如但不限于單鏈分子、雙鏈分子、含有單鏈和雙鏈的雜合體、或者寡核糖核苷酸內(nèi)和多核糖核苷酸內(nèi)堿基配對(duì)的結(jié)構(gòu))是BRNC的生物活性所必需的。更具體地，分枝桿菌RNA的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸序列、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸長度、和寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸結(jié)構(gòu)(諸如但不限于單鏈分子、雙鏈分子、含有單鏈和雙鏈的雜合體、或者寡核糖核苷酸內(nèi)和多核糖核苷酸內(nèi)堿基配對(duì)的結(jié)構(gòu))是MRNC的生物活性所必需的。將細(xì)菌、分枝桿菌或草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌用于配制BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC細(xì)胞壁的用途，會(huì)產(chǎn)生對(duì)于使BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的生物活性(免疫刺激和抗癌活性)最大化而言重要的生物載體和遞送系統(tǒng)。制備含有不同數(shù)目的完整的細(xì)菌或分枝桿菌細(xì)胞的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的方法本發(fā)明另外提供了一種從任意細(xì)菌物種和菌株制備BRNC的方法。另外，本發(fā)明另外提供了一種從任意分枝桿菌種制備MRNC的方法。使用本發(fā)明的方法可以用于制備分枝桿菌細(xì)胞壁-RNC的許多分枝桿菌種、分枝桿菌復(fù)合物、分枝桿菌亞種和分枝桿菌菌株，由例如美國的NCBI(參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov)維持且可從它容易地得到。優(yōu)選的分枝桿菌種是這樣的：已知其在培養(yǎng)中快速地生長，且因而能夠在短時(shí)間段內(nèi)提供分枝桿菌細(xì)胞生物質(zhì)。也優(yōu)選的是，已知快速地生長且被認(rèn)為對(duì)免疫感受態(tài)個(gè)體非致病性的物種。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過在均質(zhì)化過程中適當(dāng)?shù)厥褂么_定的高壓，并與在含有細(xì)菌、分枝桿菌或草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞壁的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制劑的制備中使用的確定的均質(zhì)化循環(huán)的數(shù)目相結(jié)合，可以控制在BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中存在的完整細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)目。發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，改變?cè)贐RNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中存在的完整細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)目，可以影響這些組合物的免疫刺激活性和抗癌活性，從而可以實(shí)現(xiàn)期望的和最佳的免疫調(diào)節(jié)、或期望的和最佳的抗癌活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，與沒有經(jīng)歷高壓均質(zhì)化和低速離心處理的相當(dāng)分枝桿菌樣品相比，在MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞壁制劑中的完整分枝桿菌細(xì)胞的數(shù)目可以減少至少20倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與沒有經(jīng)歷高壓均質(zhì)化、低速離心和隨后對(duì)細(xì)菌細(xì)胞制品進(jìn)行額外高壓均質(zhì)化處理的相當(dāng)分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌樣品相比，在MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中的完整分枝桿菌細(xì)胞的數(shù)目可以減少至少30倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與沒有經(jīng)歷高壓均質(zhì)化、低速離心和隨后對(duì)分枝桿菌或草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞制品進(jìn)行額外高壓均質(zhì)化處理的相當(dāng)分枝桿菌樣品相比，在MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中的完整的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞的數(shù)目可以減少至少35倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以制備這樣的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC組合物：其分別含有高水平的完整分枝桿菌細(xì)胞含量或草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞含量(例如超過大約1-50％w/w)。這樣的技術(shù)包括例如4個(gè)高壓均質(zhì)化循環(huán)，其中所述4個(gè)高壓均質(zhì)化循環(huán)中的2個(gè)在高速離心步驟之前進(jìn)行，并且所述高壓均質(zhì)化循環(huán)中的2個(gè)在高速離心步驟之后進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以制備這樣的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品：其分別含有中間水平的完整分枝桿菌細(xì)胞含量、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞含量(例如在約0.2至約0.9％w/w之間)。這樣的技術(shù)包括例如7個(gè)高壓均質(zhì)化循環(huán)，其中所述7個(gè)高壓均質(zhì)化循環(huán)中的5個(gè)在高速離心步驟之前進(jìn)行，并且2個(gè)高壓均質(zhì)化步驟在高速離心步驟之后進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以制備這樣的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品：其含有超低水平的完整分枝桿菌細(xì)胞含量、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞含量(例如小于約0.2％w/w)。這樣的技術(shù)包括例如10個(gè)高壓均質(zhì)化循環(huán)，其中所述10個(gè)高壓均質(zhì)化循環(huán)中的5個(gè)在低速離心步驟之前進(jìn)行，3個(gè)高壓均質(zhì)化循環(huán)在低速離心之后進(jìn)行，并且2個(gè)高壓均質(zhì)化步驟在高速離心步驟之后進(jìn)行。在上述技術(shù)中，‘高壓均質(zhì)化’是指這樣的高壓均質(zhì)化循環(huán)：其足以造成分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌的有效破裂，從而得到含有RNA的細(xì)胞壁碎片組合物。還可以使用與高壓均質(zhì)化相當(dāng)?shù)钠渌僮?，例如，但不限于，微流化。?yīng)當(dāng)理解，細(xì)菌和分枝桿菌細(xì)胞破碎領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明以后可以容易地確定對(duì)于要破碎的具體分枝桿菌種、菌株、次代株或復(fù)合物而言最佳的壓力。如本文所定義的，低速離心表示足以沉淀未破碎的細(xì)菌、分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌的相對(duì)離心力(RCF)。應(yīng)當(dāng)理解，離心領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明以后可以容易地確定對(duì)于沉降在如上所述的細(xì)胞破碎以后剩余的任何完整的細(xì)菌或分枝桿菌而言最佳的RCF。本文定義的高速離心表示足以沉淀細(xì)菌、分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞壁的相對(duì)離心力。預(yù)見到，離心領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明以后可以容易地確定，在破碎并通過如上所述的低速離心除去期望的量的完整的細(xì)菌和分枝桿菌以后，對(duì)于沉降得自細(xì)菌或分枝桿菌的細(xì)胞壁而言最佳的相對(duì)離心力。上述高壓均質(zhì)化技術(shù)的應(yīng)用可以用于制備含有不同水平(例如，高、中間或低)的完整分枝桿菌的MRNC，其中適當(dāng)?shù)厥褂酶邏壕|(zhì)化壓力、低速離心和高速離心或它們的組合。另外，所述的高壓均質(zhì)化技術(shù)已經(jīng)用于制備這樣的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC：其分別含有高、低或中間水平的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，與沒有經(jīng)歷差速離心以從制品中除去完整分枝桿菌細(xì)胞、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞(即，沒有高壓均質(zhì)化處理)的分枝桿菌制品相比，通過上述的高壓均質(zhì)化方法制備的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品分別含有減少數(shù)目的完整分枝桿菌細(xì)胞、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，每種MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品(w/w)的完整分枝桿菌細(xì)胞、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞的百分比分別小于約50％w/w、小于約40％w/w、小于約30％w/w、小于約20％w/w、小于約10％w/w、小于約5％w/w、小于約1％w/w、或小于約0.5％w/w。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品進(jìn)行熱處理過程，諸如但不限于，例如，在95℃加熱5-30min，或例如在121℃加熱5-30min，其足以滅活在所述組合物中剩余的任何完整的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品的熱處理(例如在121℃保持5-30min或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它條件)來制備在約2-150個(gè)、約10-100個(gè)或約20-40個(gè)堿基長度范圍內(nèi)的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，制備MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的方法包括：破碎分枝桿菌細(xì)胞生物質(zhì)、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌，以從其制備細(xì)胞壁和有關(guān)的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸，分離完整的未破碎的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞；和將破碎的細(xì)菌分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞部分的可溶性的細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)容物與細(xì)胞壁和寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分離，以得到細(xì)菌、分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞壁RNC(BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制備MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品的方法包括：破碎分枝桿菌細(xì)胞生物質(zhì)以釋放寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸；將寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸與未破碎的完整的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞分離；重復(fù)所述步驟以控制完整的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞的數(shù)目；然后，加熱寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸至足以得到約20-40個(gè)核苷酸堿基的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸長度的溫度。組合物的核酸含量這些組合物MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的核酸含量是約500-50000ng/mg、約500-5000ng/mg或約500-3000ng/mg。在不同的實(shí)施方案中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的提取的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的長度是約2至約4000個(gè)堿基長度、約2至約150個(gè)堿基長度、或大于150個(gè)堿基長度。在不同的實(shí)施方案中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的提取的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的長度是約150個(gè)堿基至約4000個(gè)堿基長度、或約10至約50個(gè)堿基長度、或約20至約40個(gè)堿基長度。在不同的實(shí)施方案中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的提取的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的長度小于150個(gè)堿基或小于100個(gè)堿基。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，可以修改上述操作，使得包括其它步驟，只要它們不會(huì)不利地影響MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的質(zhì)量和總回收率。在高壓均質(zhì)化和低速離心以后，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的治療有效性會(huì)增加，因?yàn)樗龈邏壕|(zhì)化操作會(huì)通過產(chǎn)生寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸而減小提取的RNA分子的長度，并從各種制品中除去完整的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞。通過使用但不限于熱處理(例如，在121℃熱處理30min)，或通過適當(dāng)?shù)厥褂脡A基序列限制的內(nèi)切核酸酶，可以容易地實(shí)現(xiàn)寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸長度的進(jìn)一步減小。發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，在消化RNA的RNA酶處理以后，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品的充當(dāng)免疫刺激物或抗癌劑的能力顯著減小。因此，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品在RNA酶處理或無意暴露于核糖核酸酶以后具有有限的治療有效性，除非通過使用制劑和載體系統(tǒng)來保護(hù)RNA，所述制劑和載體系統(tǒng)限制RNA對(duì)RNA酶(內(nèi)切或外切)或核酸酶的降解作用的接近。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的免疫刺激活性和抗癌活性已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品中存在的完整的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞的總數(shù)的減少，對(duì)通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)測(cè)定測(cè)得的免疫刺激活性具有顯著影響。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中存在的完整分枝桿菌細(xì)胞的總數(shù)的減少，對(duì)免疫刺激活性具有顯著的積極影響，諸如外周血單核細(xì)胞中增加的IL-10和IL-12p40誘導(dǎo)。此外，發(fā)現(xiàn)在上述制品中存在的完整的分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種或牝牛分枝桿菌細(xì)胞的總數(shù)的減少，對(duì)通過癌細(xì)胞增殖的抑制測(cè)得的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的抗癌活性具有積極的增強(qiáng)作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用細(xì)胞因子誘導(dǎo)測(cè)定，可以測(cè)量MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC對(duì)動(dòng)物或人的造血和骨髓生長因子的免疫刺激活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞因子(包括、但不限于，IL-10和IL-12)的免疫刺激活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的治療性組合物具有抗癌活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的癌細(xì)胞增殖測(cè)定，可以測(cè)定MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的抗癌活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這樣的測(cè)定用于鑒別抗癌活性的用途，其預(yù)測(cè)體內(nèi)抗癌活性。在預(yù)防性或治療性場(chǎng)合中施用包含MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的組合物本身不是免疫接種過程。它是刺激免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞的應(yīng)答以及抑制應(yīng)答細(xì)胞(諸如但不限于癌細(xì)胞)的增殖和誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡的預(yù)防性或治療性處理。該預(yù)防性或治療性處理可用于預(yù)防、治療、減輕或消除疾病，包括、但不限于癌癥。但是認(rèn)識(shí)到，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品的施用會(huì)引起針對(duì)在制劑中使用的分枝桿菌細(xì)胞壁組分的免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答被MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的免疫刺激活性額外地增強(qiáng)(免疫佐劑效應(yīng))。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，當(dāng)從其制備MRNC時(shí)，這樣的應(yīng)答可有效地治療機(jī)會(huì)性或致病性分枝桿菌感染。具體地，需要能夠減少與結(jié)核病、約內(nèi)氏病或克羅恩氏病(但不限于此)有關(guān)的炎癥和發(fā)病的治療。更具體地，可以使用包含具有優(yōu)化的免疫刺激活性和疫苗抗原活性和疫苗佐劑活性的MapRNC的組合物，其具有預(yù)防或治療牛和人類的MAP感染的優(yōu)點(diǎn)?？梢允褂冒米猿^一種分枝桿菌種(其含有與MAP的那些交叉反應(yīng)的抗原)的RNC的組合物來產(chǎn)生保護(hù)性應(yīng)答，后者導(dǎo)致MAP感染的控制。包含MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的組合物的治療效果包括，但不限于：刺激免疫系統(tǒng)的應(yīng)答細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子可以導(dǎo)致免疫系統(tǒng)細(xì)胞的活化和隨后的細(xì)胞裂解，或者活化應(yīng)答細(xì)胞中的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶和細(xì)胞凋亡。細(xì)胞裂解和細(xì)胞凋亡單獨(dú)地或組合地具有抗癌活性和佐劑活性。也就是說，包含MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC和MvRNC的治療性組合物可以作為抗癌劑單獨(dú)施用，并且包含MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的組合物可以在其它抗癌劑之前、同時(shí)或之后施用以增加治療有效性。在預(yù)防、治療、減輕和消除多種疾病疾病中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC是有效的預(yù)防劑和治療劑，所述疾病包括、但不限于，惡性的、自身免疫性和免疫缺陷性疾病、骨髓抑制和造血和骨髓異常。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC還可作為佐劑有效地增強(qiáng)其它試劑的有效性。這樣的試劑包括，但不限于：藥物、抗生素、其它免疫刺激物、抗原、抗體、疫苗、輻射和化療、基因試劑、生物學(xué)上工程改造的試劑和化學(xué)合成的試劑、以及靶向細(xì)胞死亡分子進(jìn)行活化或滅活的試劑、抑制癌細(xì)胞增殖的試劑和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的試劑。在本發(fā)明的每個(gè)前述方面和實(shí)施方案中，也在本文中具體地預(yù)見到除了上述的那些以外的組合佐劑或療法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以與一種或多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的目前可得到的化學(xué)治療劑一起施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以與一種或多種抗生素、抗-殺真菌劑、抗病毒劑、抗寄生蟲劑、抗炎藥或免疫刺激藥或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的試劑一起施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以與一種或多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于預(yù)防或治療骨髓抑制或造血和骨髓異常的藥物或試劑一起施用。本發(fā)明的組合物可以用于治療動(dòng)物受試者或患者，且更優(yōu)選哺乳動(dòng)物，包括人類，以及哺乳動(dòng)物諸如非人靈長類動(dòng)物、狗、貓、馬、牛、豬、嚙齒類動(dòng)物和魚。藥學(xué)上可接受的載體和施用組合物的方法可以用藥學(xué)上可接受的載體容易地配制、制備或施用MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的組合物。這樣的制品可以通過各種技術(shù)來制備。這樣的技術(shù)包括：使MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的組合物和它的載體相混合。在一個(gè)實(shí)施方案中，如下制備MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC組合物：使MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC組合物與液體載體、固體載體或兩種載體均勻地且親密地混合。液體載體包括，但不限于：水性制劑、非水性制劑或二者。固體載體包括，但不限于：生物載體、化學(xué)載體或二者。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC組合物可以在水性懸浮液、油乳狀液、油包水乳狀液和水包油包水乳狀液中和在載體中施用，所述載體包括、但不限于，乳膏劑、凝膠、脂質(zhì)體(中性的、陰離子的或陽離子的)、脂質(zhì)納米球或微球、中性的、陰離子的或陽離子的聚合納米顆?；蛭⒘！⑽稽c(diǎn)特異性的乳狀液、長期保留的乳狀液、粘性的乳狀液、微型乳狀液、納米乳狀液、微球、納米球、納米顆粒和微型泵，且具有允許持續(xù)釋放組合物的不同的天然的或合成的聚合物，包括陰離子的、中性的或陽離子的多糖和陰離子的、中性的、陽離子的聚合物或共聚物，所述微型泵或聚合物植入在需要遞送組合物的位置附近。聚合物和它們的應(yīng)用描述在，例如，Brem等人(JournalofNeurosurgery1991，74：441-446)。此外，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可以與任意一種載體或載體的任意組合一起使用。這些包括，但不限于：抗氧化劑、緩沖劑和抑制細(xì)菌劑，且可以包括助懸劑和增稠劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC組合物或基于載體的制品作為無RNA酶的水性懸浮液施用。就作為水性懸浮液施用而言，將MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC懸浮于無RNA酶的且無核酸酶的藥學(xué)上可接受的賦形劑、緩沖液或載體中，包括、但不限于，注射用水、生理鹽水或葡萄糖溶液，或通過下述技術(shù)：包括、但不限于，高壓均質(zhì)化、超聲處理和微流化，且可以無菌處理或最終滅菌。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以在密封的安瓿或管形瓶中保存冷凍干燥的(低壓凍干的)MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC，只需要在即將使用之前加入藥學(xué)上可接受的賦形劑、緩沖液或載體，例如無RNA酶的和無核酸酶的無菌水。就在非水性的載體中施用而言，可以用礦物油或用中性油乳化MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC，所述中性油例如，但不限于，甘油二酯、甘油三酯、磷脂、脂質(zhì)、油及其混合物，其中所述油含有多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的適當(dāng)混合物。例子包括，但不限于：大豆油、芥花油、棕櫚油、橄欖油和myglyol，其中脂肪酸碳的數(shù)目是在12-22之間，且其中所述脂肪酸可以是飽和的或不飽和的。任選地，帶電荷的脂質(zhì)或磷脂可以懸浮于中性油中。更具體地，可以使用磷脂酰絲氨酸，其靶向在巨噬細(xì)胞上的受體。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，可以在制備乳狀液時(shí)使用在水性介質(zhì)中配制的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC，或低壓凍干的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC粉末。本發(fā)明因而提供了MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC組合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和任選的其它治療成分和/或預(yù)防成分。所述載體和其它治療成分必須是可接受的，其含義是，與組合物的其它成分相容，且對(duì)其受體無害。以在動(dòng)物(包括人)中有效地誘導(dǎo)治療應(yīng)答的量，施用MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC組合物。施用的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC組合物的劑量將取決于要治療的病癥、具體的制劑和其它臨床因素，諸如受體的體重和狀況以及給藥途徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的量是每劑約0.00001mg/kg至約100mg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的量是每劑約0.0001mg/kg至約50mg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的量是每劑約0.001mg/kg至約10mg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的量是每劑約0.01mg/kg至約5mg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的量是每劑約0.1mg/kg至約1mg/kg。通過對(duì)比它們的體外活性和在動(dòng)物模型中的體內(nèi)活性，可以確定本發(fā)明的化合物的有用劑量。將在小鼠和其它動(dòng)物中的有效劑量外推至人類的方法是本領(lǐng)域已知的；例如，參見美國專利號(hào)4,938,949。在下面舉例說明在本發(fā)明中使用的組合物的施用模式。但是，所述組合物可以通過多種途徑中的任一種來遞送，所述途徑包括：通過注射(例如，皮下注射、肌肉內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、動(dòng)脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射)，通過連續(xù)靜脈內(nèi)輸注，皮膚途徑，真皮途徑，透皮途徑，口服途徑(例如，片劑、丸劑、液體藥物、可食用的膜條)，通過植入的滲透泵，通過栓劑或氣溶膠噴霧。施用途徑包括，但不限于：局部途徑、真皮內(nèi)途徑、鞘內(nèi)途徑、病灶內(nèi)途徑、瘤內(nèi)途徑、膀胱內(nèi)途徑、陰道內(nèi)途徑、眼內(nèi)途徑、直腸內(nèi)途徑、肺內(nèi)途徑、椎管內(nèi)途徑、真皮途徑、真皮下途徑、關(guān)節(jié)內(nèi)途徑、放置在體腔內(nèi)、鼻吸入、肺吸入、印在皮膚中和電穿孔。根據(jù)給藥途徑，每劑包含在可接受的載體中的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的組合物的體積是約0.001ml至約100ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，每劑包含在可接受的載體中的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的組合物的體積是約0.01ml至約50ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每劑包含在可接受的載體中的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的組合物的體積是約0.1ml至約30ml。包含在可接受的載體中的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的組合物可以在單次劑量治療中或在多次劑量治療中按照計(jì)劃表施用，或者在適合要治療的疾病、受體的狀況和給藥途徑的時(shí)間段內(nèi)施用。期望的劑量可以方便地呈現(xiàn)在單次劑量中，或者作為以適當(dāng)?shù)拈g隔施用的分份劑量，例如，作為每個(gè)的2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)亞劑量。所述亞劑量本身可以進(jìn)一步分成例如許多離散的松散間隔的施用。用于活化免疫系統(tǒng)受體的方法本發(fā)明提供了用于活化免疫系統(tǒng)受體的方法，所述方法包括：給有此需要的受試者施用治療有效量的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC和藥學(xué)上可接受的載體。通過本發(fā)明可以活化的免疫系統(tǒng)受體是(但不限于)：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(NOD2)，即負(fù)責(zé)感知病原體相關(guān)分子模式(PAMP)分子胞壁酰二肽(即具有免疫刺激活性的細(xì)菌肽聚糖的最小結(jié)構(gòu)組分)的模式識(shí)別受體(PRR)，和Toll-樣受體2(TLR2)，即負(fù)責(zé)感知多種病原體相關(guān)分子模式(PAMP)分子(諸如肽聚糖、脂甘露聚糖(LM)、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)和含有(棕櫚酸)n-衍生的一個(gè)或多個(gè)N-端半胱氨酸的脂蛋白和脂肽)的模式識(shí)別受體(PRR)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，這2種免疫系統(tǒng)受體的活化會(huì)導(dǎo)致抗癌活性和抗感染活性(包括、但不限于細(xì)菌、真菌和病毒感染)的產(chǎn)生以及疫苗佐劑活性的刺激和人骨髓CD14+細(xì)胞的分化。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的起這2種受體的激動(dòng)劑作用的能力，會(huì)提供未滿足的需求，并進(jìn)一步提供勝過在腫瘤學(xué)、感染性疾病或疫苗領(lǐng)域中用作治療劑的單功能NOD2或TLR2激動(dòng)劑的顯著優(yōu)點(diǎn)。用于治療包括癌癥和免疫系統(tǒng)障礙在內(nèi)的疾病的方法本發(fā)明提供了用于治療癌癥的方法，所述方法包括：給有此需要的受試者施用治療有效量的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC和藥學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的方法和組合物可用于癌癥和免疫系統(tǒng)疾病或障礙的治療性處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在征狀或征象發(fā)作之前，或在癌癥疾病的嚴(yán)重征狀或征象發(fā)作之前，通過適時(shí)施用組合物作為預(yù)防劑，可以預(yù)防某些癌癥。因而，可以用一種或多種本發(fā)明的組合物治療處于特定癌癥疾病風(fēng)險(xiǎn)中的患者作為預(yù)防措施。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種在罹患上面指出的癌癥疾病或癌癥適應(yīng)癥中的任意一種或多種的受試者中減輕或改善癌癥或腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移、癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖和/或抑制與上面指出的癌癥疾病和/或癌癥適應(yīng)癥中的任意一種或多種有關(guān)的征狀的方法。該方法包括：給有此需要的受試者施用在藥學(xué)上可接受的載體中的治療有效量的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可以與藥學(xué)上可接受的載體一起單獨(dú)施用，或者與一種或多種抗炎化合物、免疫刺激劑或抗癌劑聯(lián)合施用，其中所述MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC足以抑制癌癥或腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移和/或癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可作為治療劑有效地治療、減輕或消除疾病，所述疾病包括、但不限于癌癥。癌癥包括，但不限于：原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥、鱗狀細(xì)胞癌、纖維肉瘤、肉狀瘤癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、腎癌、骨肉瘤、皮膚黑素瘤、基底細(xì)胞癌、胰腺癌、膀胱癌、尿道癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤和源自它們的轉(zhuǎn)移。在一個(gè)方面，使用本發(fā)明的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC組合物可以治療的癌癥疾病和癌癥障礙包括，例如，但不限于，AIDS相關(guān)的癌癥、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉(zhuǎn)移性腦腫瘤、兒科腦腫瘤、乳腺癌、男性乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌和其它子宮癌、食管癌、膽囊和膽管癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、肝轉(zhuǎn)移、肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、兒科癌、垂體腫瘤、前列腺癌、血液學(xué)病癥、肉瘤、實(shí)體瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、威爾曼瘤、支氣管癌、結(jié)腸和直腸癌、尿道癌、非霍奇金淋巴瘤、皮膚黑素瘤、腎和腎癌、骨盆癌、胰腺癌、口腔癌和咽癌、胃食管癌、肝內(nèi)膽管癌、喉癌、急性髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、軟組織癌包括心臟、GIST(胃腸間質(zhì)瘤)、小腸癌、慢性髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、肛門和肛管癌、肛門直腸癌、外陰癌、胸膜癌、惡性間皮瘤、骨和關(guān)節(jié)癌、下咽癌、眼和眼眶癌、鼻和鼻腔癌、中耳癌、鼻咽癌、輸尿管癌、腹膜癌、網(wǎng)膜和腸系膜癌和胃腸類癌瘤或它們的任意組合。在另一個(gè)方面，使用本發(fā)明可以治療的癌癥疾病和癌癥障礙包括，但不限于：結(jié)直腸癌、胃癌、卵巢癌、骨肉瘤、肝細(xì)胞癌、伯基特淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞淋巴結(jié)病、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)相關(guān)的淋巴瘤、T-細(xì)胞淋巴瘤、口腔毛狀白斑、淋巴組織增生病、淋巴上皮癌、基于體腔的淋巴瘤或B-細(xì)胞淋巴瘤、非角質(zhì)化癌、鱗狀細(xì)胞鼻咽癌、腎移植相關(guān)的上皮腫瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、血管淋巴樣增生、前列腺腫瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、李弗勞明綜合征、加德納氏綜合征、維爾納氏綜合征、類神經(jīng)(nervoid)基底細(xì)胞癌綜合征、1型神經(jīng)纖維瘤病、宮頸發(fā)育不良、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥、胰島素瘤、蕈樣肉芽腫病、成骨性肉瘤、惡化前的皮膚病變(局部的)、橫紋肌肉瘤、骨源性、真性紅細(xì)胞增多癥、特發(fā)性血小板增多癥或它們的任意組合。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可以用作抗感染劑。本發(fā)明也可用于保護(hù)暴露于致病性物質(zhì)(諸如病毒和細(xì)菌)以后的動(dòng)物。本發(fā)明可用于調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物血細(xì)胞生成，或在從輻照、外科手術(shù)或化學(xué)療法治療恢復(fù)的患有癌癥的動(dòng)物中誘導(dǎo)造血和骨髓恢復(fù)(白細(xì)胞減少癥、嗜中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥或貧血)。本發(fā)明可用于預(yù)防或治療與藥物治療或疾病有關(guān)的多種造血和骨髓異常，所述疾病例如、但不限于獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、骨髓增生異常綜合征、自身免疫疾病、終末期腎疾病或病毒感染。本發(fā)明還可用于治療或減輕自身免疫障礙、炎癥性疾病和感染性疾病。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可以用于治療由病毒、細(xì)菌、分枝桿菌(諸如但不限于結(jié)核分枝桿菌或鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種)或細(xì)胞內(nèi)生物造成的多種感染，包括、但不限于，皰疹病毒的感染，諸如馬鼻肺炎、傳染性牛鼻氣管炎、子宮內(nèi)膜炎、單純皰疹、帶狀皰疹、眼部皰疹、貓病毒性鼻氣管炎，和感染貓呼吸道的皰疹病毒。本發(fā)明也可有效地治療狗仔的細(xì)小病毒感染。本發(fā)明的組合物可有效地作為人類的生殖器皰疹感染和獲得性免疫缺陷綜合征以及動(dòng)物和人類的其它病毒感染的治療劑。例如，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可以用于治療病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌感染，例如，但不限于，馬皰疹病毒、馬流感病毒、單純皰疹、鏈球菌物種諸如但不限于獸瘟鏈球菌、大腸桿菌和駱馬巴貝蟲(LlamaBabesia)。下述實(shí)施例將用于進(jìn)一步例證本發(fā)明，但是，與此同時(shí)，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。相反，顯而易見的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本文的描述以后，可以明白不同的其它實(shí)施方案、修改及其等同方案，而不脫離本發(fā)明的精神和/或所附權(quán)利要求的范圍。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明的詳細(xì)描述和實(shí)施例以后將會(huì)將其中的發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于從革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌制備免疫刺激的和抗癌的RNC，而不脫離本發(fā)明的精神和意圖或所附權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例1在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)分枝桿菌在美國專利號(hào)4,744,984和美國專利號(hào)6,326,357中教導(dǎo)的分枝桿菌細(xì)胞壁組合物的制備詳細(xì)說明了BACTOTMAC培養(yǎng)液(DifcoLabs，現(xiàn)在的BectonDickenson)用于制備分枝桿菌細(xì)胞群的用途。該培養(yǎng)液含有眎蛋白胨No.3、牛肉膏、酵母浸出物和麥芽浸出物(DifcoTM&BBLTMManualofMicrobiologicalCultureMedia，第2版，2009，第35-36頁)。另外，在制備生物質(zhì)之前，在牛奶中保存在這些專利中用作實(shí)施例的草分枝桿菌的種子儲(chǔ)備物。前述專利還教導(dǎo)，培養(yǎng)是靜止的，并且分枝桿菌培養(yǎng)物作為在培養(yǎng)基上的表面菌膜生長。為了消除前述物質(zhì)污染分枝桿菌生物質(zhì)的可能性，開發(fā)了新穎的合成培養(yǎng)基用于培養(yǎng)分枝桿菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知Middlebrook7H9培養(yǎng)液適用于培養(yǎng)純的分枝桿菌培養(yǎng)物，但是需要添加含有動(dòng)物源材料的補(bǔ)充物(含有牛血清白蛋白和過氧化氫酶的MiddlebrookADC富集物)，并且另外受益于聚山梨酯80或甘油的使用(DifcoTM&BBLTMManualofMicrobiologicalCultureMedia，第2版，2009，第355-356頁)。但是，意外地發(fā)現(xiàn)，在不使用存在于MiddlebrookADC富集培養(yǎng)基中的外源性蛋白牛白蛋白或過氧化氫酶時(shí)，或不使用非離子去污劑聚山梨酯80時(shí)，分枝桿菌在Middlebrook7H9中有效地生長。還意外地發(fā)現(xiàn)，與用單獨(dú)的Middlebrook7H9培養(yǎng)液培養(yǎng)相比，額外的鐵(作為檸檬酸鐵銨)和額外的碳和氮源(諸如但不限于天冬酰胺或檸檬酸銨)的應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致優(yōu)良的分枝桿菌群產(chǎn)量。使用適當(dāng)比例的額外的碳、氮和鐵來促進(jìn)代謝活性和細(xì)胞分裂(通過優(yōu)化用于合成蛋白、核酸和其它細(xì)胞組分的碳與氮之比)，以及增強(qiáng)代謝(通過增加的鐵可用性)，從而增加分枝桿菌分裂速率和分枝桿菌細(xì)胞群。下述結(jié)果用于證實(shí)改變培養(yǎng)基中的C∶N∶Fe比例對(duì)草分枝桿菌的生長的影響，所述草分枝桿菌在本文中用作代表性的分枝桿菌種的一個(gè)例子。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，使用替代性的C、N和Fe源可以重復(fù)下述的發(fā)現(xiàn)，且可以應(yīng)用于其它分枝桿菌，而不脫離本發(fā)明的范圍和意圖。在例如Difco和BBLManualofMicrobiologicalCultureMedia，第2版，2009，第355-356頁中，可以得到Middlebrook7H9培養(yǎng)液和ADC的組成。在下述新開發(fā)的培養(yǎng)基中測(cè)定草分枝桿菌的生長，所述培養(yǎng)基在下文中被定義為分枝桿菌培養(yǎng)基組合物(MCMC)：A.含有Middlebrook7H9(BDCanada，Mississauga，Ontario)、葡萄糖和甘油的MCMC組合物。B.含有Middlebrook7H9、葡萄糖、甘油且含有額外的Fe(作為檸檬酸鐵銨)和天冬酰胺作為鐵源、碳源和氮源的MCMC組合物。C.含有葡萄糖、甘油且含有Fe(作為檸檬酸鐵銨)、天冬酰胺和檸檬酸(二)銨作為鐵源、碳源和氮源的MCMC組合物。D.含有葡萄糖、甘油且含有Fe(作為檸檬酸鐵銨)和檸檬酸(二)銨作為鐵源、碳源和氮源的MCMC組合物。在一項(xiàng)單獨(dú)的研究中，還使用上述的組合物C，確定了含有鐵和天冬酰胺(作為L、DL或D立體異構(gòu)體)的MCMC組合物的影響。為了制備MCMCA和MCMCBMiddlebrook7H9培養(yǎng)液，將9.4gMiddlebrook7H9粉末培養(yǎng)基與除了葡萄糖以外的添加劑相混合，與甘油和添加劑相混合，溶解在水(900mL)中，并通過蒸汽高壓滅菌進(jìn)行滅菌。將葡萄糖溶解在水中，并總是分別過濾除菌，然后加入，以得到1000mL的終體積。MCMCC和MCMCD不含Middlebrook7H9粉末培養(yǎng)基。表1顯示了對(duì)于含有甘油、葡萄糖和上述的添加劑的Middlebrook7H9培養(yǎng)液以及2種不含Middlebrook7H9培養(yǎng)液粉末的培養(yǎng)基而言，每升培養(yǎng)基的C、N和Fe的摩爾含量。表1.用于制備分枝桿菌細(xì)胞群的合成培養(yǎng)基的C、N和Fe含量*所有(代謝地)可利用的碳已經(jīng)用于計(jì)算中。**所有(代謝地)可利用的氮已經(jīng)用于計(jì)算中。***所有可利用的鐵已經(jīng)用于計(jì)算中。將檸檬酸鐵銨定義為C6H10FeNO8。Middlebrook7H9粉末從BDCanada，Mississauga，Ontario得到，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。用于制備約900mLDifcoTMMiddlebrook7H9培養(yǎng)液的近似配方如下：硫酸銨(0.5g)、L-谷氨酸(0.5g)、檸檬酸鈉(0.1g)、吡哆醇(1.0mg)、生物素(0.5mg)、磷酸氫二鈉(2.5g)、磷酸二氫鉀(1.0g)、檸檬酸鐵銨(0.04g)、硫酸鎂(0.05g)、氯化鈣(0.5mg)、硫酸鋅(1.0mg)、硫酸銅(1.0mg)。所有其它試劑得自Sigma，Oakville，Ontario。在下面顯示了用于制備MCMC-A、MCMC-B、MCMC-C和MCMC-D的培養(yǎng)基的組成(按g/L計(jì))。但是，應(yīng)當(dāng)理解，盡管列出的每個(gè)具體數(shù)字是針對(duì)MCMC-A、MCMC-B、MCMC-C和MCMC-D的一個(gè)配方，這些數(shù)字各自可以增加或減小約10％至約20％，以產(chǎn)生MCMC-A、MCMC-B、MCMC-C和MCMC-D培養(yǎng)基的變體，并且相應(yīng)地改變C∶N和C∶Fe比率。MCMC-AMCMC-BMCMC-CMCMC-C(D-天冬酰胺)MCMC-C(L天冬酰胺)MCMC-D下述操作描述了從草分枝桿菌制備分枝桿菌細(xì)胞群，并因此充當(dāng)從一般的分枝桿菌制備分枝桿菌細(xì)胞群的一般實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀該實(shí)施例以后，將會(huì)適當(dāng)?shù)匦薷乃霾僮饕詽M足各種分枝桿菌種、復(fù)合物和菌株的具體需要。將草分枝桿菌(菌株110)作為在Petriagani斜面上的菌落在4℃保存，或者作為在含有20％甘油的Middlebrook7H9中的懸浮液在-80℃保存。使用從Petriagani斜面制備的種子培養(yǎng)物，確定最佳的培養(yǎng)碳、氮和鐵比率。將得自Petriagani斜面的菌落放在1.2LM培養(yǎng)基中，并在分散以后培養(yǎng)7天(250rpm，37℃，在定軌搖床中，Lab-LineInstruments，MelrosePark，IL，美國)。在調(diào)節(jié)至標(biāo)準(zhǔn)化的OD以后，將200mL加入一系列含有1L各種MCMC的培養(yǎng)瓶中。繼續(xù)培養(yǎng)(250rpm，37℃，在LAB-Line定軌搖床中)，并在10天的時(shí)段內(nèi)定期取出副本燒瓶。通過低速離心洗滌，分離出分枝桿菌群，低壓凍干，并測(cè)定干重。在低壓凍干法不能實(shí)行的情況下，使用下述換算因子從濕細(xì)胞質(zhì)量計(jì)算干重：濕細(xì)胞質(zhì)量/6.81＝干細(xì)胞質(zhì)量(預(yù)先通過實(shí)驗(yàn)確定該因子的平均值±SD是6.81±1.16，n＝7)。表2中的結(jié)果顯示了MCMC中的不同的碳、氮和鐵比率對(duì)草分枝桿菌的產(chǎn)量以及最佳產(chǎn)量的時(shí)間(按天計(jì))的影響，表3中的結(jié)果顯示了使用外消旋的DL-、D-或L-天冬酰胺對(duì)分枝桿菌細(xì)胞群的產(chǎn)量的影響。應(yīng)當(dāng)理解，這些研究在不同的時(shí)間進(jìn)行，并且分枝桿菌細(xì)胞群的絕對(duì)產(chǎn)量在研究與研究之間變化。表2.C、N和Fe含量對(duì)草分枝桿菌細(xì)胞群產(chǎn)量的影響*將產(chǎn)量表示為g草分枝桿菌干重/升培養(yǎng)液。表3.天冬酰胺立體異構(gòu)體D、L或DL外消旋混合物對(duì)草分枝桿菌的產(chǎn)量的影響在表2中顯示的結(jié)果證實(shí)，增加可利用的碳、氮和鐵的量會(huì)引起細(xì)胞群產(chǎn)量的增加，以及減少獲得最大產(chǎn)量所需的時(shí)間。所述結(jié)果也表明，例如、但不限于天冬酰胺或檸檬酸銨(即，可利用的氮源，無論它是有機(jī)分子還是無機(jī)分子形式)的應(yīng)用會(huì)增加產(chǎn)量。與檸檬酸銨(而不是硫酸銨)的應(yīng)用有關(guān)的2個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，檸檬酸鹽(弱酸的鹽，其會(huì)為培養(yǎng)基提供大量緩沖能力)的碳的相對(duì)緩慢的代謝，和在培養(yǎng)過程中觀察到的培養(yǎng)液pH的減少的波動(dòng)，這與從不可代謝的硫酸鹽(強(qiáng)酸的鹽)產(chǎn)生硫酸相一致。在表3中顯示的結(jié)果證實(shí)，與使用L-立體異構(gòu)體相比，D-天冬酰胺或外消旋混合物(如果是DL天冬酰胺)的應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生更低的分枝桿菌細(xì)胞群產(chǎn)量。這些數(shù)據(jù)與天冬酰胺的L-立體異構(gòu)體(而不是D-立體異構(gòu)體或外消旋混合物)的更有效利用相一致。檸檬酸銨作為氮源似乎具有其它優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)殇@離子不是外消旋的。使用優(yōu)化的MCMC-C進(jìn)行了第三項(xiàng)研究，其中對(duì)比了草分枝桿菌和恥垢分枝桿菌產(chǎn)量。如關(guān)于草分枝桿菌所述，制備恥垢分枝桿菌(ATCC，馬納薩斯，VA，菌株ATCC14468)，并如上所述進(jìn)行直接比較(head-to-head)培養(yǎng)。表4.MCMC-C用于制備草分枝桿菌和恥垢分枝桿菌細(xì)胞群的用途分枝桿菌產(chǎn)量，g干重/L最佳產(chǎn)量，天草分枝桿菌7.66恥垢分枝桿菌9.66在表4中顯示的結(jié)果證實(shí)，MCMC組合物C的應(yīng)用在相對(duì)較短的時(shí)間段內(nèi)產(chǎn)生大量分枝桿菌細(xì)胞群，并且這樣的產(chǎn)量不限于草分枝桿菌。進(jìn)行了一項(xiàng)單獨(dú)的研究，以便確定在培養(yǎng)過程中對(duì)培養(yǎng)基額外通氣的影響。如上所述培養(yǎng)草分枝桿菌，但是使用帶有3組擋板的Fermbach燒瓶，以便增加培養(yǎng)基的混合和對(duì)大氣氧的利用。將草分枝桿菌在MCMC-C培養(yǎng)基中的生長與它在BactoTMAC培養(yǎng)液和MCMC-A中的生長進(jìn)行對(duì)比。將在120小時(shí)時(shí)的草分枝桿菌細(xì)胞群產(chǎn)量確定為g干重分枝桿菌細(xì)胞群/升培養(yǎng)基。結(jié)果表明，使用BactoTMAC培養(yǎng)液，產(chǎn)量為5.0g/L，使用MCMC-A，產(chǎn)量為3.15g/L，使用MCMC-C，產(chǎn)量為9.2g/L(相對(duì)于MCMC-A增加2.9倍，相對(duì)于BactoTMAC培養(yǎng)液增加1.84倍)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，在增加混合和通氣(諸如但不限于Fermbach燒瓶)的培養(yǎng)條件下，草分枝桿菌的產(chǎn)量進(jìn)一步增加，并且在新培養(yǎng)基組合物中的產(chǎn)量大于用BactoTMAC培養(yǎng)液或MCMC-A得到的產(chǎn)量。使用從冷凍儲(chǔ)備物制備的分枝桿菌的種子培養(yǎng)物，制備本發(fā)明的分枝桿菌細(xì)胞壁RNC。如下從冷凍儲(chǔ)備物制備種子培養(yǎng)物：將1瓶冷凍儲(chǔ)備物加入600mL改良培養(yǎng)基中，并在160-250rpm在定軌搖床(Lab-Line，MelrosePark，IL，美國)中在振蕩下在37℃培養(yǎng)7天。然后將種子培養(yǎng)物以1∶10稀釋度接種至更大的培養(yǎng)體積，并使用相同的條件培養(yǎng)7天。通過低速離心洗滌，收獲分枝桿菌生物質(zhì)，此后將沉淀的分枝桿菌再懸浮于注射用水(無核酸酶)中，得到10％w/v懸浮液。如在下面的實(shí)施例中所述，從該懸浮液制備本發(fā)明的組合物。通常，如在美國專利號(hào)6,326,357中所述，培養(yǎng)草分枝桿菌7-10天(對(duì)于制備種子培養(yǎng)物而言)和額外的10-20天(對(duì)于制備分枝桿菌細(xì)胞生物質(zhì)而言，培養(yǎng)總時(shí)間為17-30天)。該制備方法的產(chǎn)量是大約20g草分枝桿菌濕重/升培養(yǎng)基，相當(dāng)于大約2-3g草分枝桿菌干重/升。上述的使用MCMC組合物和培養(yǎng)條件的新制備方法共需要14天，產(chǎn)量為大約6.5-7.6g草分枝桿菌干重/升，由此使制備生物質(zhì)所需的時(shí)間顯著減少，并使分枝桿菌細(xì)胞群的產(chǎn)量顯著增加。與以前的教導(dǎo)相比，這樣的改善意外地使生物質(zhì)生產(chǎn)效率增加。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在本實(shí)施例中描述的重要原理是，使用的用于制備分枝桿菌細(xì)胞群的培養(yǎng)基不含外源性動(dòng)物、植物或真菌材料，并且培養(yǎng)過程通過使用優(yōu)化的培養(yǎng)基以及維持分枝桿菌懸浮(而不是作為靜止生長培養(yǎng)條件特有的菌膜)的振蕩來優(yōu)化分枝桿菌的生長。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本實(shí)施例以后可以修改這些原理，以導(dǎo)致特定分枝桿菌種、復(fù)合物或菌株的最佳生長，而不背離本發(fā)明的精神和/或所附權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例2在制備免疫刺激和抗癌組合物過程中控制完整分枝桿菌的數(shù)目下述實(shí)施例鑒定了用于制備本發(fā)明的組合物的新操作，其使用在幾mL至幾升體積范圍內(nèi)的可縮放的工作體積，并且導(dǎo)致包含核酸和細(xì)胞壁的新細(xì)菌組合物的有效生產(chǎn)。如在實(shí)施例1中所述，制備分枝桿菌細(xì)胞群(草分枝桿菌用作分枝桿菌細(xì)胞群的示例性的和代表性的例子)。在通過低速離心進(jìn)行沉淀以除去培養(yǎng)基組分以后，使用AvestinEmulsiFlex-C5高壓勻漿器(Avestin，Ottawa，Ontario，加拿大)，通過高壓均質(zhì)化(18,000磅/平方英寸[PSI]，5個(gè)循環(huán)，在4℃的溫度)，破碎草分枝桿菌細(xì)胞(制備為在無DNA酶的且無RNA酶的注射用水中的10％w/v懸浮液)?？梢允褂妙愃频幕虻刃У南到y(tǒng)，而不脫離本發(fā)明。然后在認(rèn)為對(duì)于完整分枝桿菌的除去而言最佳的相對(duì)離心力(在4℃在3,160xg離心30min)，離心勻漿物。在本實(shí)施例中，將10％w/v草分枝桿菌懸浮液的樣品、高壓均質(zhì)化以后的勻漿物、得自低速離心的上清液(含有完整的和污染的草分枝桿菌)和已經(jīng)進(jìn)行額外高壓均質(zhì)化循環(huán)的得自低速離心的上清液連續(xù)稀釋(在注射用水中10-2至10-7的稀釋度)，并如下確定菌落形成單位(CFU)的數(shù)目：在胰蛋白酶大豆瓊脂生長培養(yǎng)基上鋪板，在37℃溫育72-96h，并計(jì)數(shù)菌落，將它們表達(dá)為CFU/mL。已經(jīng)報(bào)道，Avestin高壓均質(zhì)化系統(tǒng)會(huì)在1-3個(gè)循環(huán)以后實(shí)現(xiàn)酵母和大腸桿菌細(xì)胞的～100％破碎(http://www.avestin.com/English/efapplications.html#Rupture)。5個(gè)均質(zhì)化步驟沒有實(shí)現(xiàn)草分枝桿菌的100％破碎將提示本領(lǐng)域技術(shù)人員，這是該微生物的效率限度。但是意外地發(fā)現(xiàn)，對(duì)含有明顯耐受5個(gè)高壓均質(zhì)化循環(huán)的完整草分枝桿菌細(xì)胞的低速離心上清液進(jìn)行在4℃溫度在18,000PSI的額外高壓均質(zhì)化步驟(2-3)，會(huì)導(dǎo)致完整草分枝桿菌細(xì)胞的進(jìn)一步減少(表5)。額外高壓均質(zhì)化步驟的意外益處是，完整草分枝桿菌細(xì)胞的數(shù)目的進(jìn)一步受控減少和分枝桿菌細(xì)胞壁-RNC的產(chǎn)量的增加。由于草分枝桿菌在懸浮培養(yǎng)中以細(xì)胞聚集體的形式生長，不可能直接確定分枝桿菌懸浮液中的CFU的數(shù)目(經(jīng)確定低估大約100倍)。使用如下確定的計(jì)算估測(cè)：圖1所示的微生物的大小與大腸桿菌的大小(0.5x2μm：ImagingwholeEscherichiacolibacteriabyusingsingle-particlex-raydiffraction.MiaoJ，等人.PNAS2003，100：110-112)類似，因而允許基于單個(gè)大腸桿菌的重量(其為665飛克(fg)(Singlecelldetectionwithmicromechanicaloscillators.Illic，B，等人，J.Vac.Sci.Technol.B.2001，19(6)：2825-2828))計(jì)算出10％w/v草分枝桿菌懸浮液的估測(cè)CFU。表5.高壓均質(zhì)化對(duì)完整分枝桿菌的數(shù)目的影響在表5中顯示的結(jié)果證實(shí)，5個(gè)高壓均質(zhì)化循環(huán)的應(yīng)用與懸浮液中的分枝桿菌的有效破碎(99.42％-基于上述計(jì)算)相一致。在5個(gè)高壓均質(zhì)化循環(huán)以后的低速離心導(dǎo)致完整的活分枝桿菌細(xì)胞的數(shù)目比沒有經(jīng)歷高壓均質(zhì)化的等同草分枝桿菌樣品減少了5,000倍。使用得自低速離心的上清液的進(jìn)一步高壓均質(zhì)化步驟的應(yīng)用，產(chǎn)生額外的0.007％含量，其代表完整的活分枝桿菌細(xì)胞的數(shù)目比沒有經(jīng)歷高壓均質(zhì)化的等同草分枝桿菌樣品減少了2,895倍。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在本實(shí)施例中證實(shí)的重要原理是，由使用額外的均質(zhì)化步驟產(chǎn)生的意外益處是完整分枝桿菌(其是被認(rèn)為耐受高壓均質(zhì)化的革蘭氏陽性微生物)的進(jìn)一步破碎，以及通過使用不同的均質(zhì)化步驟控制在低速離心上清液中含有的分枝桿菌細(xì)胞壁RNC級(jí)分的完整分枝桿菌水平的能力。實(shí)施例3包含分枝桿菌細(xì)胞壁和RNA的組合物(MpRNC)的制備為了進(jìn)一步證實(shí)上述的新方案用于制備分枝桿菌細(xì)胞壁組合物的實(shí)用性，開發(fā)了需要使用不同的均質(zhì)化壓力和均質(zhì)化循環(huán)次數(shù)的新方法，其能夠制備含有分枝桿菌細(xì)胞壁的新分枝桿菌細(xì)胞壁-RNA組合物(MRNC)，并且包括：a)完整分枝桿菌細(xì)胞含量的受控減小；b)確定長度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的產(chǎn)生；和c)意外的免疫刺激活性的產(chǎn)生。在本實(shí)施例中，如在實(shí)施例1中所述制備分枝桿菌細(xì)胞群(使用草分枝桿菌作為分枝桿菌細(xì)胞群的示例性的和代表性的例子，并且應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在本實(shí)施例中描述的制備方法適用于細(xì)菌和分枝桿菌)。首先通過低速離心洗滌完整草分枝桿菌細(xì)胞以除去培養(yǎng)基組分，然后使用AvestinEmulsiFlex-C5高壓勻漿器(Avestin，Ottawa，Ontario，加拿大)使用高壓均質(zhì)化破碎。在高壓均質(zhì)化以后，使用相對(duì)離心力通過差速離心除去剩余的完整分枝桿菌細(xì)胞，所述相對(duì)離心力針對(duì)任何殘余的、完整的且未破碎的分枝桿菌的受控除去以及可溶物(細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物，包括蛋白)的消除進(jìn)行了優(yōu)化。通過在更高的相對(duì)離心力離心洗滌，進(jìn)一步純化不含完整分枝桿菌細(xì)胞的制品，所述制品包含與分枝桿菌細(xì)胞壁碎片相混合的呈寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的分枝桿菌RNA，以便除去可溶性的污染物。在高相對(duì)離心力離心洗滌以后，MpRNC級(jí)分分離為沉淀物。如下確定MpRNC級(jí)分中的活分枝桿菌的數(shù)目：將不含分枝桿菌完整細(xì)胞的級(jí)分的系列稀釋物鋪板在胰蛋白酶大豆瓊脂生長培養(yǎng)基上，在37℃溫育72-96h，并確定菌落形成單位(CFU)的數(shù)目。然后將MpRNC懸浮液在121℃熱處理5-30min。表6顯示了用于制備具有高、中間或低完整分枝桿菌細(xì)胞含量的MpRNC(以后分別稱作MpRNC高、MpRNC中間和MpRNC低)的步驟。表6.含有高、中間和低水平的完整草分枝桿菌的MpRNC的制備在表7中顯示的結(jié)果顯示了使用表6所述的操作制備的MpRNC中的CFU的數(shù)目。表7.具有不同的完整分枝桿菌細(xì)胞含量水平的MpRNC的制備*基于665fg/細(xì)菌的完整細(xì)菌重量(Singlecelldetectionwithmicromechanicaloscillators.Illic，B，等人，J.Vac.Sci.Technol.2001，B.19(6)：2825-2828)數(shù)據(jù)表明，通過增加均質(zhì)化壓力和MpRNC經(jīng)歷的均質(zhì)化循環(huán)的數(shù)目，在MpRNC中存在的活完整草分枝桿菌細(xì)胞的數(shù)目發(fā)生顯著的且更重要的是受控的減少。完整分枝桿菌的重量百分比的計(jì)算(基于665fg的細(xì)菌重量)表明＜0.2％(MpRNC低)至19.6％(MpRNC高)的受控范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，通過適當(dāng)?shù)厥褂么_定的方法，諸如均質(zhì)化壓力的受控應(yīng)用、均質(zhì)化循環(huán)的數(shù)目和在本發(fā)明中描述的差速離心的應(yīng)用，因此可以將MpRNC中的活分枝桿菌細(xì)胞的數(shù)目容易地控制在100倍范圍內(nèi)。實(shí)施例4從牛分枝桿菌菌株BCG、恥垢分枝桿菌和牝牛分枝桿菌制備MRNC在本實(shí)施例中，使用3種不同的分枝桿菌(1種已知在培養(yǎng)時(shí)緩慢生長，2種已知在培養(yǎng)時(shí)快速生長)，來制備不同的MRNC組合物。這樣，本實(shí)施例連同本發(fā)明的實(shí)施例1、2和3教導(dǎo)了本領(lǐng)域技術(shù)人員如何從任意分枝桿菌種或菌株制備MRNC。為了保留核酸成分，在到處使用無核酸酶的(無RNA酶的且無DNA酶的)試劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明以后還會(huì)認(rèn)識(shí)到，如在用于從草分枝桿菌制備MpRNC的實(shí)施例1、2和3中詳細(xì)描述的不同的均質(zhì)化循環(huán)和壓力的應(yīng)用和差速離心的選擇性應(yīng)用，使得能夠從用于期望用途的其它物種制備含有最佳完整分枝桿菌細(xì)胞水平的RNC組合物。得自分枝桿菌生物質(zhì)或得自商購可得的來源的牛分枝桿菌BCG可以用于制備MbRNC組合物。在本實(shí)施例中，使用BCG的Connaught菌株。BCG可作為含有2-10x108CFU/mg的低壓凍干的粉末(Immucyst，Aventis，Toronto，ON，加拿大)商業(yè)得到。首先將所述低壓凍干的粉末再懸浮于注射用水(Wisent)中在20℃保持30min，間隙地渦旋。通過低速離心，沉淀懸浮的細(xì)胞，然后使用AvestinEmulsiFlex-C5高壓勻漿器使用高壓均質(zhì)化破碎，隨后如關(guān)于MpRNC中間縮合上，經(jīng)過少許修改，進(jìn)行差速離心以分離MbRNC。具體地，對(duì)在注射用水中的0.243％w/v牛分枝桿菌BCG懸浮液在4℃進(jìn)行5個(gè)18,000psi高壓均質(zhì)化循環(huán)，并用熱交換器循環(huán)水。然后將勻漿物在3,160xg離心30min，以沉淀任何殘余的、完整的且未破碎的牛分枝桿菌BCG。然后將上清液(其含有與分枝桿菌細(xì)胞壁碎片混合的分枝桿菌RNC)在38,400xg離心1小時(shí)，以除去可溶性的污染物，并沉淀RNC和牛分枝桿菌BCG細(xì)胞壁(MbRNC)。然后將沉淀物再懸浮于注射用水中，并如上所述均質(zhì)化2個(gè)額外的循環(huán)。將含有牛分枝桿菌MbRNC的懸浮液在121℃熱處理5-30min。使用得自培養(yǎng)的分枝桿菌生物質(zhì)的恥垢分枝桿菌(得自ATCC，馬納薩斯，VA，菌株14468)來制備MsRNC。如在實(shí)施例1中所述，制備恥垢分枝桿菌細(xì)胞。首先通過低速離心洗滌完整分枝桿菌(恥垢分枝桿菌)以除去培養(yǎng)基組分，然后使用AvestinEmulsiFlex-C5高壓勻漿器使用高壓均質(zhì)化破碎，隨后如關(guān)于MpRNC所述差速離心。詳細(xì)而言，對(duì)在注射用水中的10％w/v恥垢分枝桿菌細(xì)胞懸浮液進(jìn)行5個(gè)18,000psi高壓均質(zhì)化循環(huán)。然后將勻漿物在4℃在3,160xg離心30min，以沉淀完整的且未破碎的分枝桿菌。然后將上清液(其含有與分枝桿菌細(xì)胞壁碎片混合的分枝桿菌RNA)在4℃在38,400xg離心1小時(shí)以除去可溶性的污染物，并沉淀MsRNC。然后將MsRNC沉淀物再懸浮于注射用水中，并如上所述均質(zhì)化2個(gè)額外循環(huán)。將含有恥垢分枝桿菌RNC(MsRNC)的懸浮液在121℃熱處理5-30min。在補(bǔ)充了OADC富集物(BDDiagnosticSystem，Sparks，馬里蘭州，美國)的Middlebrook7H9培養(yǎng)液中培養(yǎng)牝牛分枝桿菌(菌株ATCC15483，美國弗吉尼亞州馬納薩斯美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypingCultureCollections))。將沉淀的細(xì)菌在-20℃保存?zhèn)溆?。由于迄今未知的生長因子在OADC富集物中的存在，補(bǔ)充了OADC富集物(BD)的Middlebrook7H9培養(yǎng)液的應(yīng)用，允許與在合成培養(yǎng)基中的生長相比牝牛分枝桿菌的最佳生長。在本實(shí)施例中，使用本文所述的新制備方法來確保沒有向外源物的額外暴露。首先通過低速離心洗滌所述細(xì)胞以除去培養(yǎng)基組分，然后使用AvestinEmulsiFlex-C5高壓勻漿器使用高壓均質(zhì)化破碎，隨后如關(guān)于MpRNC所述進(jìn)行差速離心。詳細(xì)而言，對(duì)在注射用水中的10％w/v牝牛分枝桿菌懸浮液進(jìn)行5次18,000psi高壓均質(zhì)化循環(huán)。然后將上清液(其含有與分枝桿菌細(xì)胞壁碎片混合的分枝桿菌RNA)在4℃在38,400xg離心1小時(shí)以除去可溶性的污染物，并沉淀MvRNC。然后將所述沉淀物再懸浮于注射用水中，并如上所述均質(zhì)化2個(gè)額外循環(huán)。將含有牝牛分枝桿菌RNC(MvRNC)的懸浮液在121℃熱處理5-30min。實(shí)施例5從革蘭氏陰性細(xì)菌制備BRNC可以如下從一種或幾種革蘭氏陰性細(xì)菌制備本發(fā)明的BRNC組合物：例如，破碎細(xì)菌，隨后進(jìn)行苯酚/氯仿/異戊醇萃取和乙醇沉淀(參見：ShortProtocolsinMolecularBiology，第3版，Ausubel等人.編，JohnWiley&SonsInc.，NewYork，美國)?？梢允褂妹阜椒?，所述酶方法用于在提取含有核酸的組合物之前消化不希望的化學(xué)物質(zhì)，并由此優(yōu)化產(chǎn)量。例如，將革蘭氏陰性細(xì)菌懸浮于5mL無RNA酶的50mMTris-HCl、5mMEDTA、pH8.0中，加入無RNA酶的溶菌酶(Sigma-Aldrich)至1mg/mL的濃度，并在37℃溫育90min。然后加入無RNA酶的蛋白水解酶K(Invitrogen，Burlington，Ontario，加拿大)至得到0.1mg/mL的終濃度，加入無RNA酶的十二烷基硫酸鈉(BioRad，Richmond，California)至得到1％w/v的終濃度，并繼續(xù)在65℃溫育10min。然后通過苯酚/氯仿/異戊醇萃取，分離核酸?？梢匀芜x地處理含有RNA的組合物(例如，通過使用高壓均質(zhì)化、機(jī)械剪切、超聲處理或高壓滅菌)，以得到本發(fā)明的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。通過使用如在本發(fā)明的實(shí)施例1、2、3和4中描述的高壓均質(zhì)化和差速離心和熱處理，可以任選地使用細(xì)菌RNA來制備細(xì)菌細(xì)胞壁RNC制劑(BRNC)，使得它們具有抗癌和免疫刺激活性。所述BRNC可以另外與藥用載體相組合，所述藥用載體例如但不限于如在實(shí)施例36和37中描述的陽離子脂質(zhì)體或納米顆粒。實(shí)施例6從革蘭氏陽性細(xì)菌制備BRNC或MRNC可以如下從一種或幾種革蘭氏陽性細(xì)菌(包括分枝桿菌)制備本發(fā)明的BRNC組合物和MRNC組合物：例如，破碎細(xì)菌或分枝桿菌，隨后進(jìn)行苯酚/氯仿/異戊醇萃取和乙醇沉淀(參見：ShortProtocolsinMolecularBiology，第3版，Ausubel等人.編，JohnWiley&SonsInc.，NewYork，美國)。可以使用酶方法，所述酶方法用于在提取RNA之前消化不希望的化學(xué)物質(zhì)，并由此優(yōu)化產(chǎn)量。作為上述的新穎方法的適用性的一個(gè)例子。將革蘭氏陽性細(xì)菌懸浮于5mL無RNA酶的50mMTris-HCl、5mMEDTA、pH8.0中，加入無RNA酶的溶菌酶(Sigma-Aldrich)至1mg/mL的濃度，并在37℃溫育90min。然后加入無RNA酶的蛋白水解酶K(制備自Tritirachiumalbum.Invitrogen，Burlington，Ontario，加拿大)至得到0.1mg/mL的終濃度，加入無RNA酶的十二烷基硫酸鈉(BioRad，Richmond，California)至得到1％w/v的終濃度，并繼續(xù)在65℃溫育10min。然后通過苯酚/氯仿/異戊醇萃取和乙醇沉淀，分離RNA?？梢匀芜x地處理BRNC和MRNC(例如，通過使用高壓均質(zhì)化、機(jī)械剪切、超聲處理或熱處理)，以得到本發(fā)明的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。通過使用如在本發(fā)明的實(shí)施例1、2、3和4中描述的高壓均質(zhì)化和差速離心和熱處理，可以任選地使用細(xì)菌RNA來制備BRNC制劑，使得它們具有抗癌和免疫刺激活性。所述細(xì)菌RNC可以另外與藥用載體相組合，所述藥用載體例如但不限于如在實(shí)施例36和37中描述的陽離子脂質(zhì)體或納米顆粒。通過使用如在本發(fā)明的實(shí)施例1、2、3和4中描述的高壓均質(zhì)化和差速離心和熱處理，可以任選地使用分枝桿菌RNA來制備MRNC制劑，使得它們具有抗癌和免疫刺激活性。所述MRNC可以另外與藥用載體相組合，所述藥用載體例如但不限于如在實(shí)施例36和37中描述的陽離子脂質(zhì)體或納米顆粒。實(shí)施例7分枝桿菌細(xì)胞壁組合物中的完整分枝桿菌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢查使用透射電子顯微術(shù)(TEM)，進(jìn)行分枝桿菌細(xì)胞壁組合物的形態(tài)學(xué)對(duì)比。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在本實(shí)施例中，使用MpRNC作為BRNC和MRNC的完整細(xì)胞含量的一個(gè)示例性的和代表性的例子。如在實(shí)施例1中所述制備草分枝桿菌生物質(zhì)的樣品，如在實(shí)施例3中所述制備MpRNC高、中間和低的樣品，如在美國專利號(hào)6,326,357中所述制備MCC的樣品，如在美國專利號(hào)5,759,554中所述制備MCWE的樣品。后兩種制備方法都使用利用鏈霉蛋白酶/胰蛋白酶消化和苯酚/脲處理的操作。使用TEM檢查所有樣品的形態(tài)。將制備為在注射用水中的懸浮液的樣品(1mg/mLw/v)用5％w/v戊二醛預(yù)綴合(體積比：1∶1)1小時(shí)。離心(8,000xg離心10min)以后，將沉淀物懸浮于新鮮的2.5％v/v戊二醛中，并在4℃溫育過夜。溫育以后，用洗滌緩沖液洗滌樣品，并在進(jìn)一步處理之前在4℃保存在洗滌緩沖液中。在洗滌緩沖液中洗滌3次以后，用四氧化鋨和亞鐵氰化鉀將樣品預(yù)染色2小時(shí)，洗滌，并在丙酮中脫水。然后用在丙酮中的遞增濃度的EponTM滲透樣品，并在58℃聚合48小時(shí)。將厚切片(90-100nm)放在200-目銅網(wǎng)格上，并用乙酸雙氧鈾、隨后用Reynolds鉛染色。在JEOLJEM-2011200kVw/FasTEMw/QuartzXOneMicroanalyticalSystem和GatanDualView300W1.3kx1kCCD照相機(jī)或配有AMT2kx2kCCD照相機(jī)的PhilipsCM200200kVTEM中檢查樣品。形態(tài)學(xué)分析的結(jié)果顯示在圖1中。圖1a顯示了完整草分枝桿菌(用作參比物質(zhì))，圖1b顯示了根據(jù)美國專利號(hào)6,326,357制備的MCC，且圖1c顯示了根據(jù)美國專利號(hào)5,759,554制備的MCWE。將未破碎的草分枝桿菌細(xì)胞觀察為電子致密結(jié)構(gòu)，且含有非常少的(如果有的話)細(xì)胞膜或細(xì)胞壁碎片。意外地觀察到，由于在MCWE和MCC的制備中使用的差速離心步驟，它們的組合物是電子致密的和電子透明的結(jié)構(gòu)的混合物，這與完整分枝桿菌和細(xì)胞壁碎片的混合物相一致(據(jù)估測(cè)分別為8.5和3.0％的完整細(xì)菌)。圖1d、1e和1f表明，通過使用在本發(fā)明的實(shí)施例3中的制備方法，可以控制分別在MpRNC低、中間和高中的完整分枝桿菌的數(shù)目(據(jù)估測(cè)分別為0.0、2.5和12.5％)。該形態(tài)學(xué)分析的結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的制備方法會(huì)導(dǎo)致MpRNC制劑的可控的完整分枝桿菌細(xì)胞含量。實(shí)施例8在分枝桿菌細(xì)胞壁組合物中的制備污染物根據(jù)美國專利號(hào)5,759,554(MCWE)和美國專利號(hào)6,326,357(MCC)的分枝桿菌細(xì)胞壁制備都使用與苯酚/脲處理步驟相結(jié)合的蛋白水解酶消化(灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)鏈霉蛋白酶/牛胰蛋白酶)。這樣的操作會(huì)導(dǎo)致蛋白水解酶和苯酚對(duì)最終的細(xì)胞壁組合物的污染，盡管這2篇專利都教導(dǎo)了洗滌操作用于消除這些和其它污染物的用途。在本實(shí)施例中，通過HPLC，測(cè)定根據(jù)美國專利號(hào)5,759,554、美國專利號(hào)6,326,357制備的分枝桿菌細(xì)胞壁和根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例3制備的MRNC的苯酚含量/污染。使用MpRNC中間作為MRNC的一個(gè)代表性例子，并且應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在本發(fā)明的實(shí)施例3中教導(dǎo)的制備原理可適用于所有MRNC以及BRNC。用12MHCl在100℃處理不同的分枝桿菌細(xì)胞壁組合物(1mg/mL，在注射用水中)或適當(dāng)苯酚標(biāo)準(zhǔn)品(0-10μg/mL)在水中的懸浮液60min。冷卻后，用乙醚(2mL乙醚/mg細(xì)胞壁組合物)萃取分枝桿菌細(xì)胞壁組合物或苯酚標(biāo)準(zhǔn)品。除去乙醚相，并與0.05MNaOH在甲醇中的溶液混合(3mL/mg細(xì)胞壁組合物)。使用氮?dú)饬髡舭l(fā)至干燥以后，將殘余物溶解在水中(0.2mL/mg分枝桿菌細(xì)胞壁)，并通過HPLC分析100μL的苯酚含量。用于分析的HPLC系統(tǒng)利用WatersBreezeHPLC系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：717plus自動(dòng)取樣器、Waters1525二元HPLC泵和Waters248L雙波長吸光度檢測(cè)器，該系統(tǒng)連接至C-18反相分析型4.6x150mm柱(Waters，Nova-PakC18，WAT044375)，該柱填充了4μm硅膠(silica)(WatersLtd.，Lachine，Quebec，加拿大)。使用100μL樣品體積，在1.0mL/min的流量，使用下述梯度洗脫條件，在室溫進(jìn)行HPLC分離：洗脫液A是用1％醋酸(v/v)酸化的水，洗脫液B是100％乙腈。將洗脫液A在95％維持2min，然后歷時(shí)15min線性地下降至60％，在此濃度保持3min。在270nm進(jìn)行苯酚的紫外檢測(cè)。就外源性蛋白的檢測(cè)而言，將20mL不同的分枝桿菌細(xì)胞壁組合物低壓凍干72h的時(shí)段。使用改良的RIPA提取緩沖液(1％TritonX-100，0.5％NP-40％，1％SDS，150mMNaCl，1mMEDTA，10mMTrispH7,5at4℃)，從低壓凍干的分枝桿菌細(xì)胞壁組合物中提取蛋白質(zhì)。根據(jù)Macart方法(Macart和Gerbaut，1982Clin.Chim.Acta122：93-101)，測(cè)量提取物的總蛋白含量。用Laemmli樣品緩沖液(62.5mMTris-HCl，pH6.8，2％SDS，25％甘油，0.01％溴酚藍(lán)和5％巰基乙醇)稀釋樣品，得到1mg蛋白/mL的濃度。將共60μL稀釋的樣品加載上10％-20％梯度SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad，Mississauga，Ontario，加拿大)，并在室溫在140V電泳6h-8h小時(shí)。就校準(zhǔn)而言，與樣品平行地電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)品混合物(Bio-Rad，Mississauga，Ontario，加拿大)。使用膠體藍(lán)染色(Invitrogen，Carlsbad，CA，美國)，將凝膠中的蛋白在室溫染色38h。從凝膠切離目標(biāo)帶(80，含有不同分子量的蛋白質(zhì))，并放入96-孔平板中，然后用水洗滌。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，在MassPrep液體處理機(jī)器人(Waters，Milford，MA，美國)上進(jìn)行胰蛋白酶消化。簡(jiǎn)而言之，用10mMDTT還原蛋白質(zhì)，并用55mM碘代乙酰胺烷基化。使用105mM改良的豬胰蛋白酶(測(cè)序級(jí)，Promega，Madison，WI，美國)，在58℃進(jìn)行胰蛋白酶消化1h。用1％甲酸、2％乙腈、隨后用1％甲酸、50％乙腈，提取消化產(chǎn)物。合并回收的提取物，真空離心干燥，然后懸浮于8μL0.1％甲酸中，并通過質(zhì)譜法分析4μL。通過在線反相(RP)納米級(jí)毛細(xì)管液相色譜法(nanoLC)分離肽樣品，并通過電噴射質(zhì)譜法(ESMS/MS)進(jìn)行分析。用ThermoSurveyorMS泵進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所述泵連接至配備納米電噴射離子源(ThermoFisher)的LTQ線性離子阱質(zhì)譜儀(ThermoFisher，SanJose，CA，美國)。用歷時(shí)30min的2-50％溶劑B(乙腈，0.1％甲酸)的線性梯度，在200nL/min(通過分流得到)，在PicoFrit柱BioBasicC18，10cmx0.075mm內(nèi)徑(NewObjective，Woburn，MA)上進(jìn)行肽分離。使用Xcalibur軟件2.0版，使用數(shù)據(jù)依賴性的獲取模式，獲得質(zhì)譜圖。每個(gè)全掃描質(zhì)譜圖(400-2000m/z)之后進(jìn)行7種最強(qiáng)離子的碰撞誘發(fā)的解離。啟動(dòng)動(dòng)態(tài)排除(30秒排除持續(xù)時(shí)間)功能，并將相對(duì)碰撞碎片能量設(shè)定為35％。使用Mascot(MatrixScience，倫敦，UK；2.2.0版)，分析所有MS/MS樣品。假定消化酶為胰蛋白酶，配置Mascot來檢索Uniref100數(shù)據(jù)庫。Mascot用0.50Da的碎片離子質(zhì)量容差和2.0Da的母離子容差進(jìn)行檢索。將半胱氨酸的碘代乙酰胺衍生物指定為固定的修飾，并將甲硫氨酸的氧化指定為可變的修飾。允許2個(gè)丟失的胰蛋白酶消化切割位點(diǎn)。使用Scaffold(ProteomeSoftwareInc.，Portland，OR)來驗(yàn)證基于MS/MS的肽和蛋白身份。如果按照肽預(yù)測(cè)(PeptideProphet)算法(Keller，A等人Anal.Chem.2002；74(20)：5383-92)的規(guī)定，可以以大于95.0％概率確定它們，則接受肽身份。如果可以以大于95.0％概率確定它們，且其含有至少2個(gè)經(jīng)鑒定的肽，則接受蛋白身份。通過蛋白預(yù)測(cè)(ProteinProphet)算法(Nesvizhskii，AIAnalChem.2003Sep1；75(17)：4646-58)，指定蛋白概率。將含有類似肽且不能基于單獨(dú)的MS/MS分析來區(qū)分的蛋白質(zhì)分組，以產(chǎn)生最少數(shù)目的蛋白質(zhì)。得到的結(jié)果(表8)表明，MCWE和MCC被苯酚和蛋白酶氨肽酶(在灰色鏈霉菌的鏈霉蛋白酶中發(fā)現(xiàn)的主要蛋白水解酶)污染。如在實(shí)施例3、表7中所述制備的MpRNC不含苯酚或任何可檢測(cè)的鏈霉蛋白酶組分。表8.分枝桿菌細(xì)胞壁組合物的苯酚、鏈霉蛋白酶和胰蛋白酶污染在表8中的數(shù)據(jù)證實(shí)，苯酚在分枝桿菌細(xì)胞壁的制備中的應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致可檢測(cè)的苯酚和外源性蛋白(鏈霉蛋白酶氨肽酶)污染，其在MCWE和MCC的情況下是可比較的。使用本發(fā)明的制備方法(其中僅使用無RNA酶的注射用水來得到MRNC組合物)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，得到的組合物沒有苯酚和外源性蛋白污染。苯酚是兩親的，并且它隨后在分枝桿菌細(xì)胞壁中的存在與在分枝桿菌細(xì)胞壁的疏水區(qū)(共價(jià)連接的分枝菌酸)中的定位相一致，盡管有重復(fù)的基于離心的洗滌，它仍然保持捕集在所述疏水區(qū)中。在MCWE和MCC中的污染蛋白質(zhì)(特別是灰色鏈霉菌氨肽酶)的分析是陽性的，從而證實(shí)，在分枝桿菌細(xì)胞壁的制備中使用的酶處理會(huì)導(dǎo)致外源的且潛在免疫原性的蛋白質(zhì)的存在。實(shí)施例9通過電泳確定的MpRNC組合物的核酸含量和分布使用MpRNC中間作為MRNC的一個(gè)代表性例子，并且應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在本實(shí)施例中教導(dǎo)的分析可適用于所有的MRNC和BRNC組合物。使用Bioanalyze系統(tǒng)(Bioanalyze#2100型，Agilent，SantaClara，CA，美國)，電泳分析在熱處理(121℃，30min)之前和之后收集的MpRNC中間在注射用水中的懸浮液的核酸分布。如在實(shí)施例6中所述，得到核酸級(jí)分。將核酸級(jí)分稀釋至30ng/μL的濃度。使用RNA6000納米試劑盒(Agilent#5067-1511)，用Bioanalyze電泳單元完成提取的核酸的長度的電泳分析。該試劑盒會(huì)提供關(guān)于在25-6000個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的RNA的質(zhì)量的信息。然后使用小RNA試劑盒(AgilentTechnologiesCanadaInc.，St.Laurent，Québec，加拿大，試劑盒編號(hào)5067-1548)，進(jìn)一步分析高壓滅菌以后的MpRNC中間，所述試劑盒設(shè)計(jì)用于分析在6-150個(gè)核苷酸的大小范圍內(nèi)的小核酸。還使用小RNA試劑盒(Agilent)，分析在熱處理(121℃，30min)以后的MpRNC高和MpRNC低。不同的電泳分析的結(jié)果顯示在圖2a和圖2b中。圖2a證實(shí)，當(dāng)使用RNA納米6000試劑盒分析時(shí)，在高壓滅菌之前的MpRNC中間具有在大約25個(gè)堿基至4000個(gè)堿基之間且接近后者的核酸分布。結(jié)果證實(shí)，高壓均質(zhì)化步驟(不同的循環(huán)壓力和次數(shù))用于制備MpRNC中間的用途，會(huì)產(chǎn)生含有鏈長度為25-4000個(gè)堿基的多核糖核苷酸的組合物。在高壓滅菌之后，MpRNC中間顯示出在25個(gè)堿基至200個(gè)堿基范圍內(nèi)的更緊湊的核酸分布(圖2b)。使用小RNA試劑盒的進(jìn)一步分析證實(shí)，與在高壓滅菌之前從制品得到的分布相比，所有MpRNC制品(高、中間和低)具有可比較的(圖2b)、但是在量上存在差別(高＞中間＞低)的核酸分布。圖2b證實(shí)，MpRNC中間具有最大值在20-40個(gè)堿基之間的寡核糖核苷酸峰，且具有在5-60個(gè)堿基長度之間的核酸分布。MpRNC組合物僅具有少量在100個(gè)堿基處洗脫的核酸材料，且具有甚至更少的在約150個(gè)堿基長度洗脫的寡核糖核苷酸材料。結(jié)果證實(shí)，高壓均質(zhì)化和熱處理步驟(不同的循環(huán)壓力和次數(shù)以及熱處理)用于制備MpRNC的用途，會(huì)產(chǎn)生含有鏈長度小于60個(gè)堿基的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的組合物。還在MpRNC低和MpRNC高中觀察到可比較的核酸分布(圖2b)。實(shí)施例10草分枝桿菌和MpRNC組合物中的核酸的分析在本實(shí)施例中，確定了草分枝桿菌和MpRNC組合物(高-、低-和中間-)的核酸含量。如在實(shí)施例3中所述制備MpRNC組合物。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在本實(shí)施例中，使用MpRNC作為MRNC的核酸含量的一個(gè)示例性的和代表性的例子。使用下述操作，從各種組合物提取核酸。用無DNA酶的且無RNA酶的溶菌酶消化各種組合物的等分試樣(700μL，在1mg/ml的濃度)，隨后滅活，并進(jìn)一步用無DNA酶的且無RNA酶的蛋白水解酶K(二者得自Sigma-AldrichCanada，Oakville，Ontario)消化。用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1v/v)萃取核酸，并通過加入糖原、醋酸鈉和乙醇進(jìn)行沉淀。用80％冰冷的乙醇洗滌沉淀物，并溶解在50μL蒸餾水中。通過在紫外分光光度計(jì)中測(cè)量在260/280nm的吸光度，確定濃度。每種組合物的核酸含量顯示在表9中。表9.MpRNC的核酸含量組合物核酸含量，ng/mg草分枝桿菌44,786MpRNC低2,683MpRNC中間4,470MpRNC高15,686這些結(jié)果證實(shí)，在MpRNC(例如MpRNC高)中遞增的完整分枝桿菌細(xì)胞的量與在MpRNC組合物中遞增的核酸的量有關(guān)。結(jié)果也表明，MpRNC的核酸含量(2,683-15,686ng/mg)明顯不同于完整草分枝桿菌的核酸含量(44,786ng/mg)。實(shí)施例11在MpRNC和高壓滅菌的草分枝桿菌中的DNA與RNA之比的確定使用MpRNC組合物作為MRNC的代表性例子并且應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在本實(shí)施例中教導(dǎo)的分析可適用于所有的MRNC和BRNC組合物。首先如下分析在實(shí)施例3中制備的MpRNC高、MpRNC中間和MpRNC低以及高壓滅菌的草分枝桿菌細(xì)胞(如在實(shí)施例1中所述制備)的DNA與RNA之比：使用RNA酶-A對(duì)提取的核酸進(jìn)行酶消化，隨后進(jìn)行Bioanalyze2100電泳分析，并使用Agilent小RNA試劑盒(試劑盒編號(hào)5067-1548)定量寡核糖核苷酸含量。使用無DNA酶的核糖核酸酶A(RNA酶-A，在100℃處理30min以除去DNA酶活性)，進(jìn)行提取的核酸(1260ng/μL，在RNA酶緩沖液中)的RNA酶-A消化(0.1μg酶，2h，在37℃)。所述RNA酶-A從Ameresco(Solon，OH，美國)得到。使用Bioanalyze，分析RNA酶A處理過的核酸樣品(20ng/μL)。使用下述方程式，確定MpRNC高、MpRNC中間和MpRNC低以及高壓滅菌的完整草分枝桿菌細(xì)胞中的DNA和RNA的量：DNA含量＝(總核酸含量-RNA酶-A處理以后的核酸含量)。Bioanalyze分析的結(jié)果顯示在圖3a(關(guān)于MpRNC高)、圖3b(關(guān)于MpRNC中間)、圖3c(關(guān)于MpRNC低)和圖3d(關(guān)于高壓滅菌的草分枝桿菌完整細(xì)胞)中。對(duì)MpRNC(高-、低-和中間-)的關(guān)于RNA和DNA含量的分析結(jié)果顯示在表10中。表10.MpRNC組合物的DNA和RNA含量組合物DNA含量(％總核酸)RNA含量(％總核酸)MpRNC低0100MpRNC中間0.2499.76MpRNC高3.696.4高壓滅菌的草分枝桿菌4.096.0其次，如下使用更靈敏的定量方法，分析本發(fā)明的MpRNC(低、中間和高)的核酸含量和DNA與RNA之比：使用Microsep1K單元(分子量截止＝1000Da，Sciences，AnnArbor，MI，美國)，通過超濾來回收在實(shí)施例6中得到的核酸級(jí)分。然后按照Liang報(bào)道的操作(Liang等人，Ann.Chim.Acta2009，650：106-110)，使用核酸酶P1(Sigma-Aldrich，Oakville，ON，加拿大)將核酸溶液消化成5’-單磷酸核苷的混合物。為了確保最佳的核酸酶P1消化，將共50μL要消化的核酸水溶液在95-100℃在水浴中加熱10min，隨后立即在冰上冷卻。在30mM的含有0.5mMZnCl2的醋酸鈉緩沖液(pH5.3)中，制備5單位/μL的核酸酶P1。對(duì)于酶消化，將50μL核酸水溶液與相同體積的核酸酶P1溶液混合，然后在50℃溫育30min。將得到的混合物冷卻至室溫，并通過在10,000g在室溫離心20min，穿過Nanosep10K過濾器過濾，然后進(jìn)行HPLC分析。還對(duì)含有100、10、5、2.5、1ng/μL的每種單核苷酸(存在于DNA和RNA中)的單核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品(脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，Sigma-Aldrich)的混合物的系列稀釋物進(jìn)行核酸酶P1處理，并過濾，用作HPLC分析中的標(biāo)準(zhǔn)品。通過對(duì)比各種核苷酸在相同HPLC條件下的保留時(shí)間，確認(rèn)這些核苷酸的洗脫次序。使用1200系列HPLC系統(tǒng)(Agilent，St-Laurent，Quebec，加拿大)進(jìn)行HPLC分析，所述系統(tǒng)配備具有脫氣器的四元泵、自動(dòng)取樣器、柱加熱器和多波長紫外檢測(cè)器。使用ZorbaxBonus-RP柱(Agilent)，流動(dòng)相包含10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.2)和甲醇(0-10％甲醇)的線性梯度。在260nm檢測(cè)單核苷酸。在定量DNA和RNA脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸以后，確定DNA∶RNA比(表11)。表11.在MpRNC高、MpRNC中間和MpRNC低中的量和DNA/RNA比這些結(jié)果證實(shí)，按照從MpRNC高至MpRNC低的順序，核酸含量總體減少了～50％，這與減少的完整草分枝桿菌細(xì)胞含量相一致。在該分析中的所有MpRNC組合物具有在MpRNC中間和MpRNC低中可比較的DNA與RNA之比。這些數(shù)據(jù)與下述事實(shí)相一致：按照從MpRNC高至MpRNC低的順序，全部分枝桿菌細(xì)胞核酸被除去，使得MpRNC中的RNA與細(xì)胞壁結(jié)合，并因此就生物活性而言是最佳活性的。實(shí)施例12MpRNC、MbRNC、MsRNC和MvRNC的RNA與DNA比率使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，對(duì)分枝桿菌RNC組合物進(jìn)行它們的RNA∶DNA比率的電泳分析。應(yīng)當(dāng)理解，在本實(shí)施例中使用的分枝桿菌用作一般分枝桿菌的代表。如在實(shí)施例3和4中所述，從草分枝桿菌、牛分枝桿菌菌株BCG、恥垢分枝桿菌和牝牛分枝桿菌制備MRNC。如在實(shí)施例6中所述，制備核酸級(jí)分。將核酸級(jí)分(50μL)分成各25μL的2個(gè)等分試樣。用10μgRNA酶A(Amresco，Solon，Ohio，美國)處理1個(gè)等分試樣，并用注射用水(Wisent，RNA酶且無DNA酶的)處理另一個(gè)，所述處理在37℃進(jìn)行2小時(shí)，然后加載上在25V/cm預(yù)電泳的變性脲-PAGE凝膠保持2.5小時(shí)。用在1xTris硼酸鹽緩沖液(89mMTris，89mM硼酸，2mMEDTA，pH8.0)中10,000倍稀釋的溶液(Invitrogen)，將凝膠染色15min，然后在312nm的波長進(jìn)行紫外顯影。使用得自NIH的ImageJ圖像處理和分析軟件(Bethesda，馬里蘭州，美國)，將凝膠圖像數(shù)字化。結(jié)果顯示在圖4中。通過如在實(shí)施例11中關(guān)于草分枝桿菌RNC所述的微流體芯片RNA分析，確認(rèn)通過變性PAGE電泳表現(xiàn)出的核酸的大小分布(圖4a)。RNA酶敏感的RNA的比例顯示在圖4b中。用RNA酶A處理分枝桿菌RNC的RNA級(jí)分，會(huì)導(dǎo)致MbRNC的信號(hào)強(qiáng)度下降26.3％，MsRNC的信號(hào)強(qiáng)度下降46.1％，MpRNC的信號(hào)強(qiáng)度下降53％，和恥垢分枝桿菌RNC的信號(hào)強(qiáng)度下降60％。因此，本發(fā)明的MRNC組合物含有RNA酶敏感的RNA。牝牛分枝桿菌RNC、草分枝桿菌RNC和恥垢分枝桿菌RNC的RNA比例高于牛分枝桿菌BCGRNC，這與下述事實(shí)相一致：草分枝桿菌、恥垢分枝桿菌和牝牛分枝桿菌都是比牛分枝桿菌BCG生長得更快的物種，并且它們具有更強(qiáng)的核糖體RNA表達(dá)啟動(dòng)子和額外的核糖體RNA操縱子(Gonzalez-Y-Merchand，等人.1997.J.Bacteriol.179(22)：6949-6958)。這樣的數(shù)據(jù)與增加的代謝要求相一致，所述增加的代謝要求表現(xiàn)為在更快生長的分枝桿菌種的mRNA和rRNA集合中增加的RNA水平。實(shí)施例13MpRNC的脂質(zhì)含量確定了在MpRNC中存在的分子種類的脂質(zhì)含量。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在本實(shí)施例中，使用MpRNC中間作為用本發(fā)明的實(shí)施例2和3所述的操作制備的MRNC的脂質(zhì)含量的一個(gè)示例性的和代表性的例子。還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，不同的分枝桿菌種具有不同的分枝菌酸譜，但是在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于分枝桿菌科和分枝桿菌屬。在從分枝桿菌制備細(xì)胞壁組合物時(shí)，經(jīng)常用溶劑處理它們以除去脂質(zhì)(參見例如Ribi等人，1966，J.Bacteriol.，91：975-983，其中描述了石油醚或丙酮的應(yīng)用)。由于化學(xué)試劑對(duì)共價(jià)地連接的和不可提取的脂質(zhì)物質(zhì)的溶解，這樣的操作具有溶劑污染的風(fēng)險(xiǎn)。分枝桿菌的脂質(zhì)常規(guī)地分成2類：非共價(jià)地結(jié)合并因此是有機(jī)溶劑或去污劑可提取的脂質(zhì)(包括海藻糖單和二霉菌酸酯和脂蛋白質(zhì))，和與細(xì)胞壁共價(jià)地結(jié)合的脂質(zhì)(分枝菌酸)。除非進(jìn)行皂化，否則有機(jī)溶劑或去污劑提取僅會(huì)除去非共價(jià)地結(jié)合的脂質(zhì)。確定了在本發(fā)明的實(shí)施例3中描述的MpRNC的制備方法對(duì)MpRNC的脂質(zhì)含量的影響。使用改進(jìn)的Dole操作，其用于提取非共價(jià)地結(jié)合的游離脂質(zhì)，包括磷脂、糖脂和游離脂肪酸(Dole和Meinertz，1960，J.Biol.Chem.235：2595-2599，所述改進(jìn)參見Puttmann等人，1993Clin.Chem.39：825-832)。將1mLMpRNC中間沉淀物或上清液(得自實(shí)施例3的制備方法的步驟3，從10mg/mL的MpRNC中間在注射用水中的懸浮液制備，并進(jìn)行高速離心)加入3mL溶劑混合物正庚烷/異丙醇/磷酸(10/40/1，v/v/v)中，并在具有螺口帽的玻璃試管中劇烈混合。將所述混合物在室溫溫育30min。加入1mL正庚烷、隨后加入1mL水以后，擰緊試管的帽，徹底混合，并靜置沉降。收集上面的有機(jī)相，通過加入1mL庚烷，萃取含有去脂質(zhì)化的細(xì)胞壁或上清液的剩余水相。然后合并2個(gè)庚烷相(其含有可萃取的非共價(jià)地結(jié)合的游離脂質(zhì))，并在具有螺口帽的玻璃試管中在氮?dú)饬飨略?0℃干燥，直到徹底干燥。在衍生化之前，在4℃避光保存干燥的脂質(zhì)萃取物。收集含有除去游離脂質(zhì)的MpRNC的殘余物，在-20℃保存，并用于萃取共價(jià)地結(jié)合的脂質(zhì)(定義為共價(jià)地連接的分枝菌酸細(xì)胞壁級(jí)分)。如下進(jìn)行用于HPLC的脂肪酸的衍生化。首先，將0.1mLKHCO3溶液(4gKHCO3溶解在98mL水和98mL甲醇中)加入干燥的游離脂質(zhì)萃取物中，并在過濾空氣流下在50℃風(fēng)干。然后，加入1mL正庚烷和50μl對(duì)-溴苯?；?8試劑(PierceChemicalCo.Rockford，IL，美國)，并徹底混合。密封所述試管，并在85℃加熱30min。冷卻至室溫以后，通過加入1mLHCl(6M)-甲醇-水混合物(1∶2∶1)，澄清溶液，并劇烈渦旋。將所述試管靜置5min，然后將有機(jī)層收集在玻璃瓶中，并在氮?dú)饬飨赂稍?。在反?HPLC與紫外檢測(cè)分析聯(lián)用(RP-HPLC-UV)之前，將干燥的對(duì)-溴苯?；苌挠坞x脂質(zhì)在4℃避光保存。使用具有二元泵和雙波長吸光度紫外檢測(cè)器的WatersBreezeHPLC系統(tǒng)(WatersLtd.，Lachine，Quebec，加拿大)，進(jìn)行非共價(jià)地結(jié)合的脂質(zhì)和游離脂肪酸的對(duì)-溴苯酰酯衍生物的RP-HPLC-UV分析。使用4微米反相分離柱(Waters，Nova-Pak，C184.6mmx150mm)進(jìn)行分析。將干燥的對(duì)-溴苯酰酯脂肪酸衍生物溶解在100μL乙腈中，并將5μL注射進(jìn)柱中用于分離，其中在0-20min使用77％乙腈和23％水的梯度混合物：從20min至25min，使乙腈的濃度從77％升高至96％，然后在分析的最后5min，從96％下降至77％，流速為0.25mL/min。柱溫度為30℃，在254nm檢測(cè)到峰。使用肉豆蔻酸(C14:0)(Sigma-Aldrich，Oakville，Ontario，加拿大)作為用于定量游離脂質(zhì)的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品。在氮?dú)饬飨略?0℃干燥萃取非共價(jià)地結(jié)合的脂質(zhì)以后剩余的步驟3沉淀物和步驟3上清液的級(jí)分，然后在具有螺口帽的玻璃試管中，用2mL水解試劑(50％w/v的氫氧化鉀在水中的溶液和50％甲醇，1∶1，v/v)在100℃水解1小時(shí)，以釋放共價(jià)地結(jié)合的脂質(zhì)。冷卻至室溫以后，加入2mL氯仿，隨后加入1.5mL酸化試劑(濃HCl/甲醇(1∶1，v/v))。在劇烈混合以后，將所述試管靜置5min進(jìn)行相分離?；厥章确孪?下面的相)，并轉(zhuǎn)移進(jìn)具有-螺口帽的新玻璃試管中。然后用1mL氯仿重新萃取剩余的水相另外2次。合并3個(gè)氯仿相，并在氮?dú)饬飨略?0℃干燥，在衍生化之前在4℃避光保存。如關(guān)于可提取脂類所述，但是用氯仿替代正庚烷，進(jìn)行水解的共價(jià)結(jié)合的脂肪酸的衍生化。在RP-HPLC-UV游離脂質(zhì)分析之前，在4℃避光保存干燥的對(duì)-溴苯酰基衍生化的脂肪酸。使用具有二元泵和雙波長吸光度紫外檢測(cè)器的WatersBreezeHPLC系統(tǒng)，進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的脂質(zhì)的對(duì)-溴苯酰酯衍生物(在該分析定義為分枝菌酸級(jí)分)的RP-HPLC-UV分析。使用4微米反相分離柱(Waters，Nova-Pak，C184.6mmx150mm)進(jìn)行分離。將干燥的對(duì)-溴苯酰酯分枝菌酸衍生物溶解在100μL二氯甲烷中，將20μL注射進(jìn)柱中，并在254nm檢測(cè)。使用山崳酸(C22:0，Sigma-Aldrich)作為用于定量共價(jià)地結(jié)合的脂質(zhì)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品。使用甲醇/二氯甲烷梯度(歷時(shí)20min從98％甲醇/2％二氯甲烷至20％甲醇/80％二氯甲烷)，以2.5mL/min的流速，洗脫該柱。使用山崳酸(C22:00，Sigma-Aldrich，Oakville，Ontario，加拿大)作為用于定量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品，并使用內(nèi)部低和高分枝菌酸標(biāo)準(zhǔn)品(普遍認(rèn)為分別是～C40:n和～C110:n，最初得自CorixaCorporationSeattle，Washington，美國)來估測(cè)第1簇和第2簇中的分枝菌酸的碳鏈長度。MpRNC中間的非共價(jià)地連接的脂質(zhì)(可提取的)和共價(jià)地連接的脂質(zhì)分析的結(jié)果顯示在圖5a和圖5b中以及表5中。圖5A表明，在提取和水解以后結(jié)合的脂質(zhì)主要由碳鏈長度小于C22的短鏈脂肪酸構(gòu)成，并且存在草分枝桿菌特有的2個(gè)分枝菌酸簇。圖5B表明，在皂化以后得到的可水解的脂質(zhì)由低和高分子量物質(zhì)組成，并且2個(gè)分枝菌酸簇是在2種分枝菌酸標(biāo)準(zhǔn)品之間(圖5b)。分枝菌酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和碳鏈長度之間的關(guān)聯(lián)經(jīng)確定是線性的。在皂化以后得到的脂質(zhì)峰被分類為具有0.5-5min的洗脫時(shí)間的短鏈脂肪酸(在該分析中定義為，在水解過程中，分枝菌酸蠟酯分解為更低分子量的二羧酸和醇的結(jié)果)、分枝菌酸第1簇(洗脫時(shí)間7-9min，包含45-55個(gè)碳的分枝菌酸)和分枝菌酸第2簇(洗脫時(shí)間10.5-13.5min，包含70-85個(gè)碳的分枝菌酸)。這些級(jí)分各自在在步驟3沉淀物和上清液中的量顯示在表12中。表12.在MpRNC中間中的非共價(jià)地和共價(jià)地結(jié)合的脂質(zhì)得自實(shí)施例3的步驟3的MpRNC中間的高速離心沉淀物(其含有MpRNC組合物)含有可提取的脂質(zhì)以及共價(jià)地結(jié)合的脂質(zhì)。所述共價(jià)地結(jié)合的脂質(zhì)(被認(rèn)為代表分枝菌酸)占總脂質(zhì)的90％。相比而言，高速上清液含有極少的共價(jià)地結(jié)合的脂質(zhì)，大部分脂質(zhì)是非共價(jià)地結(jié)合的(93％)。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在氮?dú)饬飨略?0℃干燥共30mgMpRNC中間和MCC，然后在具有螺口帽的玻璃試管中用2mL水解試劑(50％w/v氫氧化鉀水溶液和50％甲醇，1∶1，v/v)在100℃水解1小時(shí)，以釋放共價(jià)地結(jié)合的脂質(zhì)。冷卻至室溫以后，加入2mL氯仿，隨后加入1.5mL酸化試劑(濃HCl/甲醇(1∶1，v/v))。在劇烈混合以后，將所述試管靜置5min進(jìn)行相分離。回收氯仿相(下面的相)，并轉(zhuǎn)移進(jìn)具有-螺口帽的新玻璃試管中。然后用1mL氯仿重新萃取剩余的水相另外2次。合并3個(gè)氯仿相，并在氮?dú)饬飨略?0℃干燥，稱重。進(jìn)行萃取2次，脂質(zhì)含量為14.1±5.1mg/30mgMCC和9.7±0.14mg/30mgMpRNC中間。這樣的高脂質(zhì)含量(和低分枝菌酸含量)在上清液中的存在與通過高壓均質(zhì)化破碎分枝桿菌以后非細(xì)胞壁脂質(zhì)(可提取的、非共價(jià)地結(jié)合的脂肪酸和非共價(jià)地連接的霉菌酸酯)的釋放相一致，且其通過實(shí)施例3所述的差速高速離心步驟從細(xì)胞壁組合物中除去。因此，該操作消除了為減少分枝桿菌細(xì)胞壁組合物的脂質(zhì)含量而用有機(jī)溶劑或去污劑提取的必要性和污染風(fēng)險(xiǎn)。但是，實(shí)施例3的制備方法會(huì)保留共價(jià)結(jié)合的分枝菌酸(分枝桿菌細(xì)胞壁的鑲嵌組分)，從而提供了通過分枝菌酸簇分析確定地鑒別來自給定的分枝桿菌種的細(xì)胞壁的益處。實(shí)施例14MpRNC高、MpRNC中間、MpRNC低和高壓滅菌的草分枝桿菌的二氨基庚二酸(DAP)和丙氨酸含量在本實(shí)施例中，使用MpRNC中間組合物作為MRNC的一個(gè)代表性例子，并且應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在本實(shí)施例中教導(dǎo)的分析可適用于所有的MRNC，且許多BRNC組合物從但不限于諾卡爾菌屬各種、紅球菌屬各種和棒桿菌屬各種制備。二氨基庚二酸(2，6-二氨基庚二酸，DAP)和丙氨酸(ALA)是草分枝桿菌的肽聚糖的主要組分。肽聚糖本身是分枝桿菌細(xì)胞壁的主要組分。DAP參與肽鏈間連接，且ALA是肽聚糖的肽鏈的組分。因此，DAP和ALA含量的測(cè)量會(huì)提供完整分枝桿菌細(xì)胞含量程度的間接測(cè)定，其中增加的分枝桿菌細(xì)胞含量會(huì)導(dǎo)致降低的DAP含量。通過HPLC分析，確定MpRNC高、MpRNC中間、MpRNC低和高壓滅菌的草分枝桿菌細(xì)胞的DAP和ALA含量。在HPLC級(jí)水中稀釋MpRNC高、MpRNC中間、MpRNC低和高壓滅菌的草分枝桿菌細(xì)胞至0.2mg/mL的濃度。將每個(gè)稀釋的樣品制品的20μL等分試樣連同各自的水解空白和牛血清白蛋白對(duì)照在熱解試管中在真空下干燥，并使用6MHCl蒸汽在165℃水解60min。用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)(AccQFluorReagent試劑盒，Waters，Milford，MA，美國)衍生化DAP和ALA。使用合成的和商購可得的DAP和ALA，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用一式三份樣品，通過HPLC(每種樣品5μL注射體積，使用ACCQ-TagNovo-PakC184μm，3.9x150mm柱[Waters]和配有熒光和紫外檢測(cè)器的AgilentModel1100，SantaClara，CA，USAHPLC)測(cè)定MpRNC高、MpRNC中間、MpRNC低和高壓滅菌的草分枝桿菌細(xì)胞的DAP和ALA含量。DAP和ALA含量測(cè)定結(jié)果顯示在表13中。表13.MpRNC高、MpRNC中間、MpRNC低和高壓滅菌的草分枝桿菌的DAP和ALA含量組合物ALA(mol％)*DAP(mol％)*MpRNC高15.82.6MpRNC中間21.67.0MpRNC低23.810.1高壓滅菌的草分枝桿菌14.82.7*將ALA和DAP的結(jié)果表示為氨基酸分析的mol％表13證實(shí)，隨著在MpRNC(高至低)中存在的完整分枝桿菌細(xì)胞的數(shù)目的減少，ALA和DAP含量相應(yīng)地增加。結(jié)果與下述事實(shí)相一致：按照從MpRNC高至MpRNC低的次序，MpRNC組合物中的細(xì)胞壁肽聚糖含量的增加伴隨著完整分枝桿菌細(xì)胞的減少。表11和表13還一起表明，含有細(xì)胞壁的寡核糖核苷酸/多核糖核苷酸制劑組合物的分離與增加的肽聚糖量(通過DAP和丙氨酸測(cè)量來確定，或通過丙氨酸測(cè)量(對(duì)于不含DAP的那些細(xì)菌和分枝桿菌)來確定)有關(guān)，并且減少的DAP和丙氨酸的量與增加的完整分枝桿菌水平有關(guān)。因此，這樣的測(cè)量可以用于準(zhǔn)確地證實(shí)和控制這樣的組合物的完整分枝桿菌(或細(xì)菌)含量。實(shí)施例15MpRNC蛋白含量在本實(shí)施例中，使用MpRNC中間組合物作為MRNC的一個(gè)代表性例子，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在本實(shí)施例中教導(dǎo)的分析可適用于所有的MRNC和BRNC組合物。將如本發(fā)明的實(shí)施例3所述制備的MpRNC中間的蛋白含量與草分枝桿菌細(xì)胞的含量進(jìn)行對(duì)比。為了確保蛋白含量的準(zhǔn)確測(cè)定，將樣品制成在注射用水中的1mg/mL懸浮液，并進(jìn)行探頭超聲處理，以確保任何完整分枝桿菌的破碎，并由此確保蛋白的準(zhǔn)確測(cè)定。在超聲處理之前和之后，測(cè)定蛋白含量。對(duì)草分枝桿菌完整細(xì)胞(使用MCMC-C，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1培養(yǎng))和根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例3制備的MpRNC中間(二者在1mg/mL的濃度，在注射用水中)進(jìn)行探頭超聲處理(MisonixInc，％”探頭，設(shè)置8，在冰上1-15min)。使用Macart方法，在不同的時(shí)間取出樣品用于蛋白分析。簡(jiǎn)而言之，如下測(cè)定蛋白含量：在微孔滴定板的孔中，將15μL適當(dāng)?shù)牟莘种U菌或MpRNC中間與300μLMACART溶液(L.Gerbaut和M.Macart，ClinicalChemistry(1982)32，353-355)混合，并在室溫溫育5min，此后使用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器在630nm測(cè)定OD。使用牛血清白蛋白的系列稀釋物(2mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma)作為參照，測(cè)定每個(gè)樣品中的蛋白的量。分析結(jié)果顯示在表14中。表14.草分枝桿菌和MpRNC中間的蛋白含量*一式三份分析的平均蛋白含量。在表14中顯示的數(shù)據(jù)表明，根據(jù)實(shí)施例3所述的方法制備的MpRNC中間具有與草分枝桿菌相比明顯不同的蛋白含量(分別是13％w/v相對(duì)于45％w/v)，從而證實(shí)，所述制備方法導(dǎo)致蛋白含量與起始細(xì)胞生物質(zhì)相比的下降。這些數(shù)據(jù)還表明，在不使用額外破碎操作的情況下，MpRNC的蛋白含量被低估了大約30％。在MpRNC中間的超聲處理以后得到的蛋白的輕微增加，與3個(gè)含有蛋白的隔室的存在相一致：蛋白分析試劑可接近的細(xì)胞壁碎片蛋白質(zhì)，蛋白分析試劑不可接近的在細(xì)胞壁碎片內(nèi)的蛋白質(zhì)，和在殘余的完整分枝桿菌內(nèi)并且蛋白分析試劑也不可接近的蛋白質(zhì)。在通過超聲處理或其它方式破碎細(xì)胞壁碎片或細(xì)胞以后，這些蛋白質(zhì)變得可接近。應(yīng)當(dāng)理解，MpRNC低和MpRNC中間和MpRNC高的蛋白水平將反映各種制劑中完整細(xì)胞與細(xì)胞壁碎片的比率。實(shí)施例16MpRNC會(huì)誘導(dǎo)人病原體相關(guān)分子模式受體(PAMP)NOD2的活化核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(NOD2)是一種模式識(shí)別受體(PRR)，即負(fù)責(zé)感知與微生物病原體或細(xì)胞應(yīng)激有關(guān)的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)的不同受體家族之一。NOD2是胞壁酰二肽(MDP)的受體，已知所述胞壁酰二肽是具有免疫刺激活性的細(xì)菌肽聚糖的最小結(jié)構(gòu)。已知NOD2MDP激動(dòng)劑會(huì)活化先天性的免疫系統(tǒng)細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞)、調(diào)節(jié)炎癥、具有鎮(zhèn)痛活性、具有抗癌活性、具有抗感染活性、誘導(dǎo)人骨髓CD34+細(xì)胞的分化和通過它們的免疫佐劑活性而增加疫苗保護(hù)。已經(jīng)證實(shí)，MDP和大量類似物和衍生物是用于治療癌癥和感染的有效試劑，且可以充當(dāng)疫苗佐劑。使用經(jīng)工程改造成表達(dá)人NOD2受體和下游信號(hào)傳遞標(biāo)志物IL-8(在NOD2驅(qū)動(dòng)的NF-κB的控制下)的HEK-293細(xì)胞，評(píng)價(jià)了MpRNC的NOD2活化活性。應(yīng)當(dāng)理解，使用MpRNC作為MRNC的一個(gè)例子，并且在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于得自分枝桿菌科的MRNC。將MpRNC中間的活化NOD2的能力與根據(jù)美國專利號(hào)6,326,357制備的MCC進(jìn)行了對(duì)比。在含有5％CO2的增濕氣氛下，在補(bǔ)充了10％胎牛血清(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)、100μg/mLNormocinTM和10μg/mL殺稻瘟素(二者得自InvivoGen)的高葡萄糖DMEM(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在37℃培養(yǎng)和維持人HEK293-NOD2細(xì)胞系(InvivoGen，SanDiego，CA，美國)。以5x105個(gè)細(xì)胞/mL，將HEK293-NOD2細(xì)胞接種于在無菌的96-孔平底組織培養(yǎng)微量培養(yǎng)板內(nèi)的0.2mL體積的上述細(xì)胞培養(yǎng)基中，并在含有5％CO2的增濕氣氛下，與0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160μg/mL的MpRNC中間或MCC一起在37℃溫育48小時(shí)。在溫育以后，收集上清液，在4℃在4,000xRCF離心5min以除去細(xì)胞和碎片，并在-20℃保存上清液用于分析。借助于得自BioSource，Camarillo，CA，USA的商業(yè)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，在與MpRNC中間懸浮液一起培養(yǎng)48小時(shí)以后，測(cè)量上清液中的人IL-8。使用KCJunior軟件包(BioTekInstruments，Winooski，VT，美國)，從ELISA平板讀數(shù)器(ELx-808IUBioTekInstruments，Winooski，VT，美國)捕獲數(shù)據(jù)，并表示為pg/mL的合成的IL-8。表15表明，MpRNC中間通過以濃度依賴性的方式誘導(dǎo)NOD2驅(qū)動(dòng)的IL-8釋放，以劑量相關(guān)的方式作為有效的NOD激動(dòng)劑起作用，而根據(jù)美國專利號(hào)6,326,357制備的MCC作為NOD激動(dòng)劑的有效性明顯更低，僅在最高試驗(yàn)濃度觀察到邊緣活性。表15.分枝桿菌細(xì)胞壁組合物的NOD2活化活性顯然，就通過NOD2受體介導(dǎo)的免疫刺激活性而言，MpRNC具有勝過其它分枝桿菌細(xì)胞壁組合物諸如MCC的顯著的且意外的優(yōu)點(diǎn)。在一項(xiàng)單獨(dú)的研究中，通過測(cè)定MpRNC高和MpRNC低相對(duì)于MpRNC中間的效能，對(duì)比了MpRNC高、MpRNC中間和MpRNC低的NOD2活化活性。如上所述在0.625、1.25、2.5、5、10、20、40和80μg/mL的劑量范圍內(nèi)測(cè)定了NOD2活化活性，并使用PHARM/PCS4.2版軟件(MicrocomputerSpecialists，Philadelphia，PA，美國)計(jì)算相對(duì)效能。在表16中顯示的結(jié)果證實(shí)，MpRNC高和MpRNC低的NOD2活化活性與MpRNC中間的活性沒有不同。表16.MpRNC(高、中間和低)用于活化NOD2的相對(duì)效能MpRNC相對(duì)效能MpRNC中間1.0MpRNC高0.9MpRNC低1.1這些數(shù)據(jù)證實(shí)，完整分枝桿菌在不同的MpRNC組合物中的不同存在水平，對(duì)它們的活化NOD2的能力沒有影響，并且所有的MpRNC組合物(高、中間和低)具有相同的活化該先天性免疫系統(tǒng)受體的能力。實(shí)施例17分枝桿菌RNC會(huì)誘導(dǎo)人病原體相關(guān)分子模式受體(PAMP)NOD2的活化使用HEK-BlueTM-NOD2細(xì)胞，將從牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌和牝牛分枝桿菌制備的分枝桿菌RNC的NOD2活化活性與得自草分枝桿菌的RNC進(jìn)行了對(duì)比，所述HEK-BlueTM-NOD2細(xì)胞被工程改造成表達(dá)人NOD2受體(InvivoGen，SanDiego，CA，美國)，后者的活化會(huì)驅(qū)動(dòng)在NOD2驅(qū)動(dòng)的NF-κB控制下的分泌型胚性堿性磷酸酶(secretoryembryonicalkalinephosphate，SEAP)的合成。上清液中的SEAP的測(cè)量，會(huì)提供NOD2活化的量度。應(yīng)當(dāng)理解，使用得自草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌和牝牛分枝桿菌的MRNC作為分枝桿菌科的代表性例子，并且在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理和顯示的數(shù)據(jù)可適用于得自其它分枝桿菌的MRNC。鑒于在實(shí)施例16中證實(shí)了MpRNC高、中間和低之間的活性的可比性，在本實(shí)施例中使用得自草分枝桿菌的MRNC中間組合物(MpRNC)。在含有5％CO2的增濕氣氛下，在補(bǔ)充了10％胎牛血清(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)、30μg/mL殺稻瘟素、100μg/mLNormocinTM和ZeocinTM(二者得自InvivoGen)以及50U/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素(都得自Wisent)的高葡萄糖DMEM(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在37℃培養(yǎng)和維持HEK293-NOD2細(xì)胞系(Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)。以1x105個(gè)細(xì)胞/mL，將所述細(xì)胞接種于在無菌的96-孔平底組織培養(yǎng)微量培養(yǎng)板內(nèi)的0.2mL體積的上述細(xì)胞培養(yǎng)基中，并與0.625、1.25、2.5、5、10、20、40和80μg/mL的MRNC中間一起溫育72小時(shí)。在溫育以后，收集上清液用于分析，并在4℃在4,000xRCF離心5min以除去細(xì)胞和碎片。在96-孔平底微孔滴定板中，將20μL上清液與180μLQUANTI-BlueTM(InvivoGen)在37℃混合2小時(shí)。使用KCJunior軟件包(BioTekInstruments)，使用ELx-808IU微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(BioTekInstruments，Winooski，VT)，在630nm測(cè)量SEAP表達(dá)。圖6顯示了所有4種MRNC組合物對(duì)NOD2的劑量相關(guān)的活化。所有MRNC組合物表現(xiàn)出NOD2活化活性。草分枝桿菌RNC是最有效的NOD2活化劑，其次是恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG和牝牛分枝桿菌。牛分枝桿菌BCG和牝牛分枝桿菌在最高試驗(yàn)劑量(80μg/mL)表現(xiàn)出NOD2的邊緣活化。使用PharmPCV4.2(MicrocomputerSpecialists，Philadelphia，PA)，確定分枝桿菌RNC組合物相對(duì)于草分枝桿菌RNC而言活化NOD2的效能，并顯示在表17中。表17.分枝桿菌RNC相對(duì)于草分枝桿菌MpRNC的NOD2活化分枝桿菌RNC相對(duì)于草分枝桿菌RNC的NOD2效能MpRNC中間1.00MbRNC中間0.014MsRNC中間0.021MvRNC中間0.013實(shí)施例18MpRNC會(huì)誘導(dǎo)人病原體相關(guān)分子模式受體(PAMP)TLR2的活化Toll-樣受體2(TLR2)是一種負(fù)責(zé)感知通常與微生物病原體有關(guān)的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)的模式識(shí)別受體(PRR)。細(xì)菌和分枝桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組分諸如肽聚糖、脂甘露聚糖(LM)、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、脂蛋白質(zhì)和脂肽似乎主要負(fù)責(zé)TLR2的活化。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，TLR2在包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的許多免疫系統(tǒng)細(xì)胞上表達(dá)，并且TLR2的激動(dòng)劑能夠誘導(dǎo)這類細(xì)胞對(duì)許多趨化因子和細(xì)胞因子的合成。使用經(jīng)工程改造成表達(dá)人TLR2受體的HEK293細(xì)胞，對(duì)比了如在本發(fā)明的實(shí)施例3中所述制備的MpRNC中間和根據(jù)美國專利號(hào)6,326,357制備的MCC的TLR2活化活性，從而提供了測(cè)定免疫刺激潛力的方便的且被接受的方法。應(yīng)當(dāng)理解，使用MpRNC中間作為MRNC的一個(gè)例子，并且在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于得自其它分枝桿菌的MRNC以及分枝桿菌科。人體HEK293-TLR2細(xì)胞系得自InvivoGen，SanDiego，CA，USA。用置于NF-kB基因控制下的TLR2基因和受體驅(qū)動(dòng)的分泌型胚性堿性磷酸酶基因(SEAP)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染HEK293-TLR2細(xì)胞。因此，TLR2的活化會(huì)導(dǎo)致堿性磷酸酶活性在細(xì)胞培養(yǎng)基中的產(chǎn)生，所述活性用于定量受體活化。在含有5％CO2的增濕氣氛下，在補(bǔ)充了10％胎牛血清(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)和1xNormocinTM(InvivoGen)的高葡萄糖DMEM(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在37℃培養(yǎng)和維持所述細(xì)胞。以5x105個(gè)細(xì)胞/mL，將HEK293-TLR2細(xì)胞接種于在無菌的96-孔平底組織培養(yǎng)微量培養(yǎng)板內(nèi)的0.2mL體積的HEK-BlueTM檢測(cè)培養(yǎng)基(InvivoGen)中，并在含有5％CO2的增濕氣氛下，與0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160μg/mL的MpRNC中間或MCC一起在37℃溫育18小時(shí)。在溫育以后，收集上清液用于分析，并在4℃在4,000xRCF離心5min以除去細(xì)胞和碎片。加入所述孔中的HEK-BlueTM檢測(cè)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)用于檢測(cè)NF-kB誘導(dǎo)的可溶性的胚性堿性磷酸酶酶活性(SEAP活性)。在溫育18小時(shí)以后，使用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(ELx-808IU型，BioTekInstruments，Winooski，VT，美國)，在630nm測(cè)定光密度(其與通過TLR2結(jié)合活化的NF-kB成比例)。使用KCJunior軟件包(BioTekInstruments)，捕獲數(shù)據(jù)。表18顯示了TLR2的活化(表示為在630nm的OD)，并證實(shí)，使用在實(shí)施例3中描述的操作制備的MpRNC中間具有劑量相關(guān)的TLR2活化活性。MpRNC中間相對(duì)于MCC的效能測(cè)定表明，盡管活性與如在美國專利號(hào)6,326,357中所述制備的MCC的活性相當(dāng)，MpRNC中間作為TLR2活化劑比MCC的有效性高10.6倍(測(cè)定使用PHARM/PCS4.2版軟件，MicrocomputerSpecialists，Philadelphia，PA，美國)。表18.MpRNC中間和MCC的TLR2活化活性這些數(shù)據(jù)與如實(shí)施例16所示的MpRNC的活化NOD2的能力的評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)一起證實(shí)，MpRNC細(xì)胞壁組合物對(duì)先天性免疫系統(tǒng)的2種受體具有雙重激動(dòng)劑活性，具體而言，為在不借助于使用合成激動(dòng)劑的情況下活化NOD2和TLR2的能力。實(shí)施例19分枝桿菌RNC會(huì)誘導(dǎo)人病原體相關(guān)分子模式受體(PAMP)TLR2的活化使用經(jīng)工程改造成表達(dá)人TLR2受體的HEK-293細(xì)胞報(bào)告系統(tǒng)，測(cè)定如在實(shí)施例4中制備的分枝桿菌RNC組合物的TLR2活化活性，并與草分枝桿菌RNC中間進(jìn)行對(duì)比。人體HEK293-TLR2細(xì)胞系得自InvivoGen，SanDiego，CA，USA。用置于NF-kB基因控制下的TLR2基因和受體驅(qū)動(dòng)的分泌型胚性堿性磷酸酶基因(SEAP)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染HEK293-TLR2細(xì)胞。因此，TLR2的活化會(huì)導(dǎo)致堿性磷酸酶活性在細(xì)胞培養(yǎng)基中的產(chǎn)生，所述活性用于定量受體活化。在含有5％CO2的增濕氣氛下，在補(bǔ)充了10％胎牛血清(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)和1xNormocinTM(InvivoGen)的高葡萄糖DMEM(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在37℃培養(yǎng)和維持所述細(xì)胞。以5x105個(gè)細(xì)胞/mL，將HEK293-TLR2細(xì)胞接種于在無菌的96-孔平底組織培養(yǎng)微量培養(yǎng)板內(nèi)的0.2mL體積的HEK-BlueTM檢測(cè)培養(yǎng)基(InvivoGen)中，并在含有5％CO2的增濕氣氛下，與2.5、5、10、20、40和80μg/mL的分枝桿菌RNC一起在37℃溫育18小時(shí)。加入所述孔中的HEK-BlueTM檢測(cè)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)用于檢測(cè)TLR2/NF-kB誘導(dǎo)的可溶性的胚性堿性磷酸酶酶活性(SEAP活性)。在溫育18小時(shí)以后，使用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(ELx-808IU型，BioTekInstruments，Winooski，VT)，在630nm測(cè)定光密度(其與通過TLR2結(jié)合活化的NF-kB成比例)。使用KCJunior軟件包(BioTekInstruments)，捕獲數(shù)據(jù)。圖7表明，所有4種分枝桿菌RNC在2.5-80μg/mL的劑量范圍內(nèi)以劑量相關(guān)的方式誘導(dǎo)TLR2的活化。牝牛分枝桿菌RNC具有最高的活性，按照活性遞減的次序，其次是恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG和草分枝桿菌RNC。使用PharmPCv4.2(MicrocomputerSpecialists，Philadelphia，PA，美國)，確定分枝桿菌RNC組合物相對(duì)于草分枝桿菌RNC用于活化TLR2的效能，并顯示在表19中。表19.分枝桿菌RNC相對(duì)于草分枝桿菌MpRNC的TLR2活化關(guān)于TLR2的活化所觀察到的效能范圍(＜6倍差異范圍)指示，所有4種分枝桿菌RNC組合物具有可比較的TLR2激動(dòng)劑活性。顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本申請(qǐng)中的該實(shí)施例和其它實(shí)施例(例如NOD2活化)以后，在確定特定分枝桿菌RNC或它們的組合用于特定的或具體的預(yù)防性或治療性應(yīng)用的適用性時(shí)，將會(huì)利用與特定分枝桿菌RNC組合物有關(guān)的免疫刺激活性和免疫系統(tǒng)受體激動(dòng)劑功能的最適當(dāng)組合。實(shí)施例20MpRNC中間對(duì)TLR的刺激普遍認(rèn)為TLR2激動(dòng)劑與得自革蘭氏陽性細(xì)菌和分枝桿菌的細(xì)胞壁PAMP有關(guān)。普遍認(rèn)為TLR3激動(dòng)劑是雙鏈病毒RNA。普遍認(rèn)為TLR4激動(dòng)劑是脂多糖。TLR5與細(xì)菌鞭毛蛋白特異性地相互作用。普遍認(rèn)為TLR7和TLR8激動(dòng)劑是單鏈RNA。普遍認(rèn)為TLR9激動(dòng)劑是含有CpG二核苷酸序列(CpG基序)的未甲基化的DNA。實(shí)施例18表明，MpRNC中間會(huì)刺激TLR2。MpRNC中間也含有RNA和DNA(實(shí)施例10)。因此，確定了MpRNC中間的刺激TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9的能力，以觀察RNA和DNA在MpRNC中間中的存在是否導(dǎo)致核酸-特異性的TLR或任意其它TLR的活化。應(yīng)當(dāng)理解，使用MpRNC中間作為MRNC的一個(gè)例子，并且在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于得自分枝桿菌科的MRNC。在經(jīng)工程改造成表達(dá)一種特定TLR的HEK293細(xì)胞(InvivoGen)上，試驗(yàn)了MpRNC中間的TLR刺激活性。給定的TLR的活化導(dǎo)致NF-κB驅(qū)動(dòng)的SEAP合成，如在實(shí)施例19中所述檢測(cè)上清液中的所述SEAP的酶活性。如在實(shí)施例18中所述，使用90μg/mL的終濃度，用MpRNC中間處理表達(dá)不同TLR的HEK293細(xì)胞。在該研究中使用的陽性對(duì)照TLR激動(dòng)劑以及在測(cè)定中使用的終濃度顯示在表20中。表20.TLR激動(dòng)劑陽性對(duì)照評(píng)價(jià)結(jié)果顯示在表21中。所有的TLR激動(dòng)劑對(duì)照產(chǎn)生陽性應(yīng)答。用MpRNC中間觀察到表達(dá)TLR2的HEK293細(xì)胞的顯著刺激，并且盡管觀察到表達(dá)TLR3或TLR5的HEK293細(xì)胞的一些弱刺激，這顯著低于各自的陽性對(duì)照聚(I:C)和鞭毛蛋白(分別是陽性對(duì)照活性的3％和4％)。隨后證實(shí)了TLR3和TLR5的明顯刺激不是可再現(xiàn)的或劑量相關(guān)的，且在標(biāo)準(zhǔn)品濃度是無活性的，并因此認(rèn)為是偽像。MpRNC中間沒有刺激任意其它的TLR，包括RNA-特異性的TLR7和TLR8以及DNACpG-基序特異性的TLR9。表21.MpRNC中間的TLR激動(dòng)劑活性*4個(gè)制備的試驗(yàn)樣品的平均值。從這些數(shù)據(jù)得到3個(gè)結(jié)論。首先，MpRNC僅活化TLRTLR2；其次，RNA在MpRNC中間中的存在不會(huì)導(dǎo)致RNA-特異性的TLRTLR3、TLR7或TLR8的活化；第三，DNA在MpRNC中間中間中的存在不會(huì)導(dǎo)致CpG受體TLR9的活化，這證實(shí)了功能性CpG基序在MpRNC中間中的缺失。實(shí)施例21完整草分枝桿菌細(xì)胞對(duì)MpRNC組合物的免疫刺激活性的影響使用細(xì)胞因子/趨化因子-誘導(dǎo)測(cè)定，確定了完整草分枝桿菌細(xì)胞的存在對(duì)如實(shí)施例2所述制備的MpRNC的免疫刺激活性的影響。具體地，測(cè)定了含有不同比例的完整草分枝桿菌細(xì)胞的MpRNC組合物的免疫刺激活性。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，該實(shí)施例用作完整分枝桿菌細(xì)胞對(duì)MRNC的免疫刺激活性的影響的一個(gè)示例性的和代表性的例子。應(yīng)當(dāng)理解，MpRNC用作MRNC的一個(gè)例子，并且在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于得自分枝桿菌科的MRNC。通過在蔗聚糖-泛影葡胺(GEHealthcare，Ste-Anne-de-Bellevue，Québec，加拿大)上的密度-離心，從6個(gè)健康個(gè)體分離出外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在低速離心抗凝血(肝素的鋰鹽)以除去血小板，并使用蔗聚糖-泛影葡胺通過墊層離心，分離PBMC。通過低速離心(在4℃在150xRCF離心10min)，在含有10％熱滅活的胎牛血清(WisentInc.)和10μg/mL慶大霉素(Sigma-Aldrich，Oakville，Ontario，加拿大)的RPMI1640(WisentInc.，StBruno，Québec，加拿大)中洗滌分離的PBMC，并以5x105活細(xì)胞/mL培養(yǎng)基的濃度懸浮。將1mL鋪板在24-孔組織培養(yǎng)板的孔中。將細(xì)胞在5％CO2氣氛中在37℃溫育24小時(shí)。將MpRNC中間或含有不同量的熱處理的草分枝桿菌細(xì)胞(121℃，30min)的MpRNC中間加入組織培養(yǎng)板(對(duì)于IL-10誘導(dǎo)，終濃度為10μg/mL，對(duì)于IL-12p40誘導(dǎo)，終濃度為1μg/mL)，并將細(xì)胞在5％CO2氣氛中在37℃溫育另外48小時(shí)。除去上清液，通過0.2微米膜過濾進(jìn)行澄清，并使用生產(chǎn)商的推薦操作，通過試劑盒ELISA(BioSource，Camarillo，CA，美國，目錄號(hào)分別為KHC0102和KHC0122)，測(cè)定IL-10和IL-12p40的水平。結(jié)果顯示在圖8中。可以看出，含有不同比例的高壓滅菌的完整草分枝桿菌細(xì)胞(試驗(yàn)范圍是100％MpRNC中間至100％高壓滅菌的完整草分枝桿菌細(xì)胞，以反映在新制備方法和組合物中固有的完整分枝桿菌的潛在水平)的MpRNC中間(含有計(jì)算的0.7％w/w完整分枝桿菌)會(huì)以鐘形應(yīng)答誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生(圖8上面的圖)，高壓滅菌的完整草分枝桿菌細(xì)胞的最佳比例是在約5-30％w/w的范圍內(nèi)。發(fā)現(xiàn)含有約5-30％w/w比例的高壓滅菌的完整草分枝桿菌細(xì)胞的MpRNC中間對(duì)IL-10的誘導(dǎo)高于100％MpRNC中間組合物或包含100％高壓滅菌的完整草分枝桿菌細(xì)胞的組合物。圖8(下面的圖)表明，含有不同比例的高壓滅菌的完整草分枝桿菌細(xì)胞(試驗(yàn)范圍：100％MpRNC中間至100％高壓滅菌的完整草分枝桿菌)的MpRNC中間組合物會(huì)以鐘形應(yīng)答誘導(dǎo)IL-12p40產(chǎn)生，高壓滅菌的完整草分枝桿菌細(xì)胞的最佳比例是在約10-50％w/w的范圍內(nèi)。含有約10-50％w/w比例的高壓滅菌的完整草分枝桿菌細(xì)胞的MpRNC中間組合物對(duì)IL-12的誘導(dǎo)高于包含100％MpRNC中間的組合物或包含100％高壓滅菌的完整草分枝桿菌細(xì)胞的組合物。方差分析(沒有副本的雙因素方差分析)表明，在MpRNC中的完整草分枝桿菌細(xì)胞的比例顯著地影響細(xì)胞因子誘導(dǎo)(p＜0.025，在0.05的α)，并且由MpRNC誘導(dǎo)的IL-10和IL-12的水平是統(tǒng)計(jì)上不同的(p＜0.05E-6，在0.05的α)。實(shí)施例22MpRNC會(huì)誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞中的趨化因子和細(xì)胞因子合成通過使用趨化因子/細(xì)胞因子分析試劑盒，分析了MpRNC的趨化因子和細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性。應(yīng)當(dāng)理解，使用MpRNC作為MRNC的一個(gè)例子，并且在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于得自分枝桿菌科的MRNC。通過全血(共13個(gè)健康個(gè)體)的蔗聚糖密度-梯度離心，分離出人PBMC。在含有10％v/v熱滅活的胎牛血清(56℃/30min)(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)和50μg/mL硫酸慶大霉素(Sigma-AldrichCanada，Oakville，Ontario，加拿大)的RPMI1640培養(yǎng)基(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，制備PBMC。將PBMC(1x106細(xì)胞)接種在6-孔平底微量培養(yǎng)板的1.0mL體積中，并在含有或不含(未處理的對(duì)照)160μg/mL終濃度MpRNC中間的上述細(xì)胞培養(yǎng)基中在37℃/5％CO2/100％濕度溫育。在Bio-Plex200系統(tǒng)(BioRadLaboratories，Hercules，CA，美國)上溫育48小時(shí)以后，使用用于測(cè)定人趨化因子/細(xì)胞因子的MAP試劑盒(MilliporeCorporation，Billerica，MA，美國)，測(cè)量培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子、趨化因子和造血生長因子水平。將顯示的結(jié)果表示為趨化因子/細(xì)胞因子水平相對(duì)于未處理的PBMC的增加倍數(shù)平均值。在表22中顯示的結(jié)果證實(shí)，MpRNC中間具有刺激在PBMC中存在的免疫效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生許多趨化因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞生長因子的能力，從而證實(shí)了它的充當(dāng)免疫刺激物用于誘導(dǎo)趨化因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞生長因子的能力。表22.MpRNC中間對(duì)趨化因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞生長因子的誘導(dǎo)實(shí)施例23刺激ofGM-CSF，MU-CSF，M-CSF，G-CSF，SDF-1a和LIF合成in人外周血單核細(xì)胞byMpRNC多集落刺激因子(MU-CSF；也被稱作IL-3)(其除了刺激紅細(xì)胞、樹突細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞和單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、間質(zhì)細(xì)胞衍生的因子-1α(SDF-1a)和白血病抑制因子(LIF)的產(chǎn)生以外，還刺激多能造血細(xì)胞分化成骨髓祖細(xì)胞)是表現(xiàn)出寬范圍的生物學(xué)活性的人造血生長因子，所述活性包括：不同類型的靶細(xì)胞(祖細(xì)胞)的生長促進(jìn)和細(xì)胞分化，血細(xì)胞生成和干細(xì)胞動(dòng)員的刺激。確定了MpRNC中間的刺激免疫細(xì)胞合成這些生長因子的能力。應(yīng)當(dāng)理解，使用MpRNC中間作為MRNC的一個(gè)例子，并且在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于得自分枝桿菌科的MRNC。通過在蔗聚糖-泛影葡胺上的密度-離心，從6個(gè)健康個(gè)體分離出外周血單核細(xì)胞(PBMC)。以0.5x106個(gè)細(xì)胞/mL，在6-孔組織培養(yǎng)板中將PBMC與1.6-160μg/mLMpRNC中間(如本文所述制備，參見表2和3)一起溫育48小時(shí)。在48小時(shí)以后，使用具有適當(dāng)珠子和抗體(使用Bi-Rad或Millipore試劑)的系統(tǒng)(Bio-Rad，Mississauga，Ontario，加拿大)，測(cè)量在上清液中的MU-CSF、M-CSF、GM-CSF、G-CSF、SDF-1a和LIF的水平。在用MpRNC中間處理PBMC以后，上清液中的生長因子水平相對(duì)于對(duì)照處理的細(xì)胞的50％增加(≥1.5倍增加)用于定義陽性刺激效應(yīng)。表23表明，MpRNC中間會(huì)在所有測(cè)量的生長因子的合成中誘導(dǎo)劑量相關(guān)的刺激(＞1.5倍增加)。表23：MpRNC中間對(duì)人PBMC中的GM-CSF、MU-CSF、M-CSF、G-CSF、SDF-1a和LIF合成的刺激*將增加倍數(shù)表示為平均值±SD，n＝6得自表23的數(shù)據(jù)表明，MpRNC會(huì)刺激存在于外周血中的免疫細(xì)胞合成造血生長因子，觀察到GM-CSF和G-CSF的最大增加倍數(shù)，其次是多能生長因子MU-CSF。M-CSF、SDF-1a和LIF也表現(xiàn)出超過定義的應(yīng)答閾值水平的增加。實(shí)施例24MpRNC對(duì)正常人泌尿道上皮細(xì)胞中的GM-CSF、MU-CSF和LIF合成的刺激使用人膀胱上皮細(xì)胞，檢查了MpRNC中間的刺激非免疫細(xì)胞的生長因子合成的能力。使用這些作為一般上皮細(xì)胞的一個(gè)例子。應(yīng)當(dāng)理解，使用MpRNC中間作為MRNC的一個(gè)例子，并且在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于得自分枝桿菌科的MRNC。以1.0x105個(gè)細(xì)胞/mL組織培養(yǎng)基(按照ATCC的推薦)，在96-孔組織培養(yǎng)板中將正常人泌尿道上皮細(xì)胞系SV-HUC-1(得自ATCC，馬納薩斯，VA)與0.016-160μg/mL終濃度的MpRNC中間(如在實(shí)施例3中所述制備)一起溫育48小時(shí)。在48小時(shí)以后，使用適當(dāng)?shù)闹樽雍涂贵w(MilliporeCorporation，Billerica，Massachusetts，美國)，使用系統(tǒng)(Bio-RadLaboratories(Canada)Inc.，Mississauga，Ontario，加拿大)，測(cè)量上清液中的MU-CSF、M-CSF、GM-CSF、G-CSF、SDF-1a和LIF。生長因子水平相對(duì)于對(duì)照處理的細(xì)胞的50％增加(≥1.5倍增加)，用于鑒別在MpRNC中間處理以后的陽性刺激。表24顯示了在用MpRNC中間處理以后，正常人膀胱上皮細(xì)胞的生長因子生產(chǎn)的增加。表24：在用MpRNC中間處理以后，人SV-HUC-1細(xì)胞中的生長因子合成的刺激得自表24的數(shù)據(jù)表明，用MpRNC中間處理正常人泌尿道上皮細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致MU-CSF(鐘形應(yīng)答)、GM-CSF和LIF(鐘形應(yīng)答)的合成的劑量相關(guān)的刺激，正如＞1.5倍增加的閾值所定義。實(shí)施例25MpRNC對(duì)人膀胱癌細(xì)胞中的GM-CSF和MU-CSF合成的刺激使用人膀胱癌細(xì)胞，檢查了MpRNC中間的刺激非免疫細(xì)胞中的生長因子合成的能力。使用這些作為一般癌細(xì)胞的一個(gè)例子。應(yīng)當(dāng)理解，使用MpRNC中間作為MRNC的一個(gè)例子，并且在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于得自分枝桿菌科的MRNC。以1.0x105個(gè)細(xì)胞/mL，在96-孔組織培養(yǎng)板(使用ATCC推薦的組織培養(yǎng)基)中，將人膀胱癌細(xì)胞系SV-HUC-2和T24(二者得自ATCC，馬納薩斯，VA)與0.016-160μg/ml終濃度的MpRNC中間一起溫育48小時(shí)。在48小時(shí)以后，使用具有適當(dāng)珠子和抗體(使用Bio-Rad和/或Millipore試劑)的200系統(tǒng)，測(cè)量上清液中的MU-CSF、M-CSF、GM-CSF、G-CSF、SDF-1a和LIF的水平。生長因子水平相對(duì)于對(duì)照處理的細(xì)胞的50％增加(≥1.5倍增加)，用于鑒別在MpRNC中間處理以后的陽性刺激。表25顯示了在用MpRNC中間處理以后SV-HUC-2細(xì)胞的生長因子生產(chǎn)的增加，表23顯示了在用MpRNC中間處理以后T24細(xì)胞的生長因子生產(chǎn)的增加。表25：在用MpRNC處理以后人SV-HUC-2細(xì)胞中的生長因子合成的刺激從在表26中顯示的數(shù)據(jù)顯而易見，用MpRNC中間溫育人膀胱癌細(xì)胞系SV-HUC-2會(huì)導(dǎo)致GM-CSF和MU-CSF的合成的劑量相關(guān)的刺激。表26：在用MpRNC處理以后人T24細(xì)胞中的生長因子合成的刺激在表26中顯示的數(shù)據(jù)證實(shí)，用MpRNC中間處理人膀胱癌細(xì)胞系T24會(huì)以劑量相關(guān)的方式刺激GM-CSF合成的誘導(dǎo)(在1.6μg/mLMpRNC時(shí)增加50％，在160μg/mLMpRNC時(shí)增加100％)。因此，MpRNC會(huì)刺激癌細(xì)胞的造血生長因子合成。實(shí)施例26在給小鼠腹膜內(nèi)(IP)施用以后，MpRNC對(duì)集落刺激因子的刺激本實(shí)施例用于表明，MpRNC中間會(huì)在體內(nèi)刺激生長因子的產(chǎn)生。應(yīng)當(dāng)理解，使用MpRNC中間作為MRNC的一個(gè)例子，并且在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于得自分枝桿菌科的MRNC。經(jīng)由腹膜內(nèi)途徑，用1.0mg/kg體重的MpRNC中間(如在實(shí)施例3中所述，以1mg/mL的濃度在注射用水中制備)處理各組的2只雌性C57BL/6小鼠。在注射后1、4、7和24小時(shí)，使用具有適當(dāng)珠子和抗體(Bio-Rad和/或Millipore試劑)的系統(tǒng)，測(cè)定血清中的粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的水平。生長因子水平相對(duì)于對(duì)照處理的小鼠的50％增加(≥1.5倍增加閾值水平)，用于鑒別MpRNC處理以后的陽性生長因子刺激。表27顯示了在注射MpRNC中間以后，處理的小鼠的血清中的GM-CSF和G-CSF水平在不同時(shí)間的增加。表27.在給雌性C57BL/6小鼠腹膜內(nèi)施用MpRNC中間以后，GM-CSF和G-CSF合成的刺激*2只小鼠/治療組。得自表27的數(shù)據(jù)表明，MpRNC中間會(huì)在體內(nèi)刺激GM-CSF和G-CSF的合成，GM-CSF在處理后4小時(shí)達(dá)到峰值，G-CSF在處理后4-7小時(shí)達(dá)到峰值。結(jié)果表明，與對(duì)照處理的小鼠相比，在MpRNC中間注射以后4小時(shí)，GM-CSF血清水平最大值增加了平均56倍，并且與對(duì)照小鼠相比，在注射后4-7小時(shí)，G-CSF血清水平最大值增加了平均300倍。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，MpRNC中間在全身施用以后在體內(nèi)具有免疫刺激活性(集落刺激因子誘導(dǎo))。實(shí)施例27MpRNC的抗癌活性和完整草分枝桿菌細(xì)胞的影響本實(shí)施例用于表明，MpRNC具有抗癌活性。應(yīng)當(dāng)理解，使用MpRNC中間作為MRNC的一個(gè)例子，并且在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于得自分枝桿菌科的MRNC。使用癌細(xì)胞增殖抑制測(cè)定，確定完整草分枝桿菌細(xì)胞的存在對(duì)如在實(shí)施例3中制備的MpRNC中間或MpRNC低(也就是說，使用分枝桿菌RNC細(xì)胞壁制劑)的抗癌活性的影響。應(yīng)當(dāng)理解，使用本實(shí)施例作為完整分枝桿菌細(xì)胞對(duì)一般MRNC的抗癌活性的影響的一個(gè)示例性的和代表性的例子。以5x105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度，將RT4人膀胱癌細(xì)胞(ATCC，馬納薩斯，VA，目錄號(hào)HTB-2TM)鋪板在96-孔組織培養(yǎng)板內(nèi)的補(bǔ)充了10％熱滅活的FBS(二者得自Wisent)和10μg/mL慶大霉素(Sigma-Aldrich)的DMEM培養(yǎng)基(50μL體積)中，并在5％CO2氣氛中在37℃的溫度讓細(xì)胞附著孔表面過夜。將在50μL體積的組織培養(yǎng)基中的高壓滅菌的草分枝桿菌細(xì)胞(121℃，30min)、熱處理的MpRNC中間或低(121℃，30min)、或與高壓滅菌的MpRNC中間或低相混合的高壓滅菌的草分枝桿菌細(xì)胞的組合加給細(xì)胞，達(dá)到0.01、0.1、1.0和10μg/mL的MpRNC終濃度。然后將細(xì)胞在5％CO2氣氛中在37℃溫育48小時(shí)。使用MTT((3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)還原測(cè)定，確定針對(duì)RT4膀胱癌細(xì)胞系的抗增殖活性。簡(jiǎn)而言之，在溫育48小時(shí)以后，將10μLMTT溶液(5mg/mL在PBS中)加入每個(gè)孔中，并繼續(xù)溫育另外4小時(shí)。然后通過加入100μL異丙醇∶HCl(24∶1v/v)，停止反應(yīng)。MTT的還原導(dǎo)致甲臢的產(chǎn)生。通過使用微量移液器，溶解甲臢，并相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照在570nm的波長在微量培養(yǎng)板讀數(shù)器中測(cè)定光密度(O.D.)。使用下述方程式，確定細(xì)胞增殖的抑制百分比：％抑制＝100-[(試驗(yàn)O.D.-對(duì)照O.D.)/對(duì)照O.D.]。分別在表28和29中顯示了使用人膀胱癌細(xì)胞系RT4用MpRNC低(參見實(shí)施例3、表6；第三種組合物)+受控的草分枝桿菌細(xì)胞含量和MpRNC中間(實(shí)施例3、表6；第二種組合物)+受控的草分枝桿菌細(xì)胞含量得到的結(jié)果。使用PharmPCv4.2(MicrocomputerSpecialists，Philadelphia，PA，美國)，確定相對(duì)于草分枝桿菌的效能測(cè)定。表28.高壓滅菌的MpRNC低、高壓滅菌的草分枝桿菌或不同比例的高壓滅菌的MpRNC(低)和高壓滅菌的草分枝桿菌的組合對(duì)RT4膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制表29.MpRNC中間、高壓滅菌的草分枝桿菌或不同比例的高壓滅菌的MpRNC中間和高壓滅菌的草分枝桿菌的組合對(duì)RT-4膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制結(jié)果表明，MpRNC低和MpRNC中間具有抗癌活性，并且與含有添加的草分枝桿菌(其與在MpRNC低或MpRNC高中的草分枝桿菌等效)的MpRNC相比，高壓滅菌的草分枝桿菌(即，包含完整分枝桿菌細(xì)胞的制品)對(duì)RT4膀胱癌細(xì)胞具有更低的抗增殖活性。此外，含有完整草分枝桿菌的MpRNC組合物具有小于最適的抗增殖活性。沒有添加完整分枝桿菌細(xì)胞的MpRNC相對(duì)于含有遞增的完整分枝桿菌細(xì)胞含量的MpRNC的相對(duì)效能的計(jì)算證實(shí)，兩種分枝桿菌RNC比完整草分枝桿菌明顯更有效(MpRNC低和中間分別為91倍和263倍)。10％w/w或更大的完整分枝桿菌細(xì)胞的添加導(dǎo)致效能的顯著下降，并且最佳的完整分枝桿菌細(xì)胞含量是≤1.0％w/w，取決于完整分枝桿菌細(xì)胞含量的初始程度(MpRNC中間為0％，MpRNC低為1％)。因此，MRNC組合物和意圖用于抗癌應(yīng)用的制劑會(huì)受益于低完整分枝桿菌細(xì)胞含量。實(shí)施例28MpRNC中間針對(duì)Lewis肺癌的抗癌活性本實(shí)施例用于表明，MpRNC中間在體外和在體內(nèi)都具有抗癌活性。應(yīng)當(dāng)理解，使用MpRNC中間作為MRNC的一個(gè)例子，并且在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于得自分枝桿菌科的MRNC。使用Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞系，測(cè)定了根據(jù)本發(fā)明的方法制備并在無RNA酶的水中配制的MpRNC中間的直接抗癌活性。LLC細(xì)胞得自ATCC(馬納薩斯，VA，美國)。LLC被廣泛地用于化療和免疫治療抗癌劑的開發(fā)中(參見例如Kimura，Y.NewAnticanceragents：Invitroandinvivoevaluationofantitumorandantimetastaticactionofvariouscompoundsisolatedfrommedicinalplants.invivo2005；19：37-60)。在5％CO2氣氛中，在含有10％v/v熱滅活的胎牛血清(56℃30min)(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)和10.0μg/mL硫酸慶大霉素(Sigma-Aldrich，Oakville，Ontario，加拿大)的DMEM培養(yǎng)基(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在37℃維持LLC細(xì)胞。以4.0x104個(gè)細(xì)胞/0.1mL體積，將在不含慶大霉素的DMEM/10％熱滅活的FBS中的LLC細(xì)胞接種在96-孔平底組織培養(yǎng)微量培養(yǎng)板中，并將MpRNC中間懸浮液(0.1mL)加入一式三份孔，達(dá)到0.01-100.0μg/mL的終濃度。然后在5％CO2氣氛中在37℃溫育平板48小時(shí)。如在實(shí)施例27中關(guān)于RT4膀胱癌細(xì)胞系(甲臢還原)所述，測(cè)定MpRNC的抗增殖活性。結(jié)果顯示在表30中。表30.MpRNC中間對(duì)LLC細(xì)胞增殖的抑制顯示的結(jié)果是2個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。在表30中顯示的結(jié)果證實(shí)，MpRNC對(duì)LLC細(xì)胞具有劑量相關(guān)的抗癌活性，正如通過增殖抑制的測(cè)量所確定的。因此，實(shí)施例27和本實(shí)施例(實(shí)施例28)證實(shí)，MpRNC的直接抗癌活性不是癌細(xì)胞類型特異性的，并擴(kuò)展為不是癌癥特異性的。遠(yuǎn)部位轉(zhuǎn)移是癌癥相關(guān)的死亡的主要原因(Kim等人，CarcinomaproducedfactorsactivatemyeloidcellsviaTLT2tostimulatemetastasis.Nature2009；457：102-106)。通過將LLC細(xì)胞注射進(jìn)脾中，可以產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)性肝轉(zhuǎn)移(Ligo等人，TherapeuticactivityandtissuedistributionofME2303，anewanthracyclinecontainingfluorin，anditsmetabolitesinmicebearinghepaticmetastasesofLewislungcarcinoma.Anti-CancerDrugs1990；1：77-82和Alino等人Morpho-functionalstudyofvascularfluorochromedeliverytolungandlivermetastasesofLewislungcarcinoma(3LL)，Tumori1991；77：206-211)。通過脾內(nèi)注射LLC細(xì)胞在肝臟中誘導(dǎo)的腫瘤部位，被視作向肝臟的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散模型，并且其中通過用角叉菜膠阻斷枯否細(xì)胞(襯在肝臟血竇內(nèi)的專門化巨噬細(xì)胞)的活性，會(huì)增加腫瘤部位的數(shù)目。因此，該模型會(huì)提供一種用于研究肝轉(zhuǎn)移的不同方面的有用工具(Kopper等人，ExperimentalmodelforlivermetastasisformationusingLewislungtumor.J.CancerResandClin.Oncol.1982；103：31-38)。下述研究的目的是，確定MpRNC懸浮液在靜脈內(nèi)(IV)施用以后用于治療在C57BL/6小鼠中通過脾內(nèi)注射LLC細(xì)胞誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性肝轉(zhuǎn)移的效力。如上所述，在含有10％v/v熱滅活的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中維持LLC細(xì)胞。每3-4天連續(xù)傳代細(xì)胞，并在第2-3代時(shí)使用。通過胰蛋白酶消化(4min，37℃)收獲細(xì)胞，在不含胎牛血清和硫酸慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基中洗滌2次，在4℃在250xg離心5min，并將細(xì)胞沉淀物懸浮于不含胎牛血清和硫酸慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基中。在使用錐蟲藍(lán)排除測(cè)定細(xì)胞生存力并在血球計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)以后，將細(xì)胞的數(shù)目調(diào)至所需的濃度。在脾內(nèi)注射之前，將細(xì)胞保持在冰上。10-12周齡的雌性C57BL/6小鼠得自CharlesRiverLaboratoriesLtd.，St.Constant，Québec，加拿大。該小鼠品系是LLC細(xì)胞同源的。通過在全身麻醉下脾內(nèi)注射LLC細(xì)胞(1.0-3.0x105個(gè)LLC細(xì)胞/100μL體積)，誘導(dǎo)肝轉(zhuǎn)移。在癌細(xì)胞注射以后，切離脾。首先檢查在LLC注射之前(預(yù)防性處理)或LLC細(xì)胞注射之后(治療性處理)治療小鼠的作用。使用各組的10只小鼠，在LLC細(xì)胞注射之前1天(預(yù)防方案)、LLC細(xì)胞注射以后第2、5、7、9和12天(治療方案)、或LLC細(xì)胞注射以后第-1、2、45、7、9和12天(預(yù)防和治療方案)，注射MpRNC中間。以100μL的劑量體積(與5mg/kg體重的劑量對(duì)應(yīng))，施用如在實(shí)施例3中所述在無RNA酶的注射用水中配制的MpRNC中間。在LLC細(xì)胞注射以后第15天，測(cè)定肝轉(zhuǎn)移的數(shù)目。結(jié)果(表31)表明，治療性+預(yù)防性施用方案是最有效的處理方案，其次是預(yù)防性處理方案，并且治療性處理方案的有效性最低。因此，就LLC肝轉(zhuǎn)移的治療而言，預(yù)防性和治療性療法的組合是最有效的。表31.MpRNC中間對(duì)實(shí)驗(yàn)性的LLC肝轉(zhuǎn)移的治療這些數(shù)據(jù)證實(shí)，MRNC中間作為單獨(dú)療法或在新輔助場(chǎng)合和輔助場(chǎng)合中用于自含了癌癥的用途，將會(huì)有益地減少由原發(fā)性癌的轉(zhuǎn)移引起的腫瘤。在表31中顯示的結(jié)果與下述效果相一致：暴露于癌細(xì)胞之前靶器官中的宿主-防御機(jī)制的活化(預(yù)防活性)，從而導(dǎo)致在肝臟中減少的腫瘤細(xì)胞傳播，以及在癌細(xì)胞最初植入靶器官中以后對(duì)癌細(xì)胞的治療效果(治療活性)。在表30中證實(shí)的針對(duì)LLC細(xì)胞靶標(biāo)的直接抗癌的表現(xiàn)支持這樣的作用模式。使用預(yù)防/治療方案在更大數(shù)目的動(dòng)物中進(jìn)行第二項(xiàng)研究，以確定MpRNC中間懸浮液治療對(duì)LLC肝轉(zhuǎn)移的影響。使用各組的20只小鼠，如上所述建立實(shí)驗(yàn)性的LLC肝轉(zhuǎn)移。并以5mg/kg體重的劑量用MpRNC中間進(jìn)行預(yù)防性/治療性處理。該研究的結(jié)果表明，在對(duì)照組中存在141±72(平均值±SD)個(gè)轉(zhuǎn)移，并且通過使用如上所述的預(yù)防性和治療性處理方案，MpRNC中間治療顯著地減少轉(zhuǎn)移數(shù)目至62±41(平均值±SD，p＜0.0002，Mann-WhitneyU-檢驗(yàn))，因此證實(shí)了針對(duì)實(shí)驗(yàn)性地誘導(dǎo)的肝轉(zhuǎn)移的顯著體內(nèi)抗癌活性。因此，在體外針對(duì)LLC細(xì)胞表現(xiàn)出的抗癌活性被證實(shí)為在體內(nèi)針對(duì)肝轉(zhuǎn)移的發(fā)展的抑制作用的預(yù)測(cè)措施。實(shí)施例29分枝桿菌RNC的抗癌活性本實(shí)施例用于表明，MRNC具有抗癌活性。應(yīng)當(dāng)理解，在本實(shí)施例中教導(dǎo)的原理可適用于得自分枝桿菌科的MRNC。使用癌細(xì)胞增殖抑制測(cè)定，確定了如在實(shí)施例3和4中制備的分枝桿菌RNC的抗癌活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，已知這樣的研究會(huì)預(yù)測(cè)體內(nèi)抗癌活性。在本實(shí)施例中，使用膀胱癌細(xì)胞系作為一般癌細(xì)胞系的代表，并且應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)立即明白，使用這樣的癌細(xì)胞系的抗癌活性研究可以容易地外推至其它癌細(xì)胞系。在本實(shí)施例中使用了共4種人膀胱癌細(xì)胞，它們都得自ATCC(馬納薩斯，VA，美國)。按照ATCC的推薦，培養(yǎng)細(xì)胞系。在表32中顯示了膀胱癌細(xì)胞系的細(xì)節(jié)。表32.膀胱癌細(xì)胞系特征以5x105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度，將膀胱癌系細(xì)胞鋪板在96-孔組織培養(yǎng)板(50μL體積)內(nèi)的補(bǔ)充了10％熱滅活的FBS(得自Wisent)和10μg/mL慶大霉素(Sigma-Aldrich)的DMEM培養(yǎng)基(得自Wisent)中，并使其在5％CO2氣氛中在37℃的溫度附著孔表面過夜。將在50μL體積的組織培養(yǎng)基中的如實(shí)施例3和實(shí)施例4所述制備的分枝桿菌RNC中間加給細(xì)胞，達(dá)到0.0016、0.016、0.16、1.6、16和80μg/mL的MpRNC終濃度。然后將細(xì)胞在5％CO2氣氛中在37℃溫育48小時(shí)。使用MTT((3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)還原測(cè)定，確定抗增殖活性。簡(jiǎn)而言之，在溫育48小時(shí)以后，將10μLMTT溶液(5mg/mL在PBS中)加入每個(gè)孔中，并繼續(xù)溫育另外4小時(shí)。然后通過加入100μL異丙醇∶HCl(24∶1v/v)停止反應(yīng)。MTT的還原導(dǎo)致甲臢的產(chǎn)生。通過使用微量移液器，溶解甲臢，并使用KCJunior軟件包(BioTekInstruments)，使用ELx-808IU微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(BioTekInstruments，Winooski，VT，美國)，在570nm的波長相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照測(cè)定光密度(O.D.)。使用下述方程式，確定癌細(xì)胞增殖的抑制百分比：％抑制＝100-[(試驗(yàn)O.D.-對(duì)照O.D.)/對(duì)照O.D.]。使用PharmPCv4.2(ComputerAssociates，Philadelphia，PA)，確定MRNC組合物的效能。在表33中顯示了使用4種人膀胱癌細(xì)胞系用MRNC得到的結(jié)果。所有MRNC組合物表現(xiàn)出針對(duì)膀胱癌細(xì)胞系的劑量依賴性的抗增殖活性。得自牛分枝桿菌菌株BCG的MbRNC的有效性最低，從而證實(shí)了劑量相關(guān)的抗增殖活性，在最高試驗(yàn)劑量具有～20-40％的抑制(取決于膀胱癌細(xì)胞系)。所有的其它MRNC表現(xiàn)出劑量相關(guān)的抗增殖活性，在最高試驗(yàn)劑量具有～35-70％抑制(取決于膀胱癌細(xì)胞系)。由于該原因，確定了不同的MRNC相對(duì)于得自牛分枝桿菌菌株BCG的MRNC的效能，結(jié)果顯示在表33中。表33.MRNC相對(duì)于牛分枝桿菌BCGMbRNC的抗增殖效能就膀胱癌增殖的抑制而言，最有效的MRNC是得自牝牛分枝桿菌的MRNC，按照效能遞減次序，其次是得自草分枝桿菌的MpRNC、得自恥垢分枝桿菌的MsRNC和得自牛分枝桿菌菌株BCG的MbRNC。對(duì)于所有4種膀胱癌細(xì)胞系，不論它們的起源(低等級(jí)、高等級(jí))或突變狀態(tài)，分枝桿菌RNC組合物的效能等級(jí)和次序得到維持，牝牛分枝桿菌MvRNC和草分枝桿菌MpRNC的有效性分別是牛分枝桿菌BCGMbRNC的～6800倍和～4000倍。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本實(shí)施例教導(dǎo)了3個(gè)重要原理。首先，從不同的分枝桿菌種(致病性的、非致病性的、快速生長的、緩慢生長的)制備的MRNC具有抗癌活性，并且因此，這樣的活性可適用于從分枝桿菌科家族的成員物種制備的MRNC。其次，癌細(xì)胞靶標(biāo)的突變狀態(tài)似乎不在決定抗癌活性中起作用。實(shí)際上，用具有已知的治療抗性的基因型(p53和p21突變)和MDR表型(例如HT1376)的癌細(xì)胞系觀察到顯著的抗癌活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，這樣的突變和抗性表型是一般癌癥的特征，且不限于膀胱癌細(xì)胞，并且會(huì)明白，MRNC的抗癌活性因此可適用于許多其它癌癥類型。第三，從3種快速生長的分枝桿菌種制備的MRNC比從緩慢生長的分枝桿菌種(諸如牛分枝桿菌菌株BCG)制備的MRNC更有效。實(shí)施例30含有鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種RNA的組合物(MapRNC)的制備和抗癌活性的測(cè)定在本實(shí)施例中，首先通過低速離心洗滌完整的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種細(xì)胞以除去培養(yǎng)基組分，然后如在實(shí)施例3中所述，使用高壓均質(zhì)化用AvestinEmulsiFlex-C5高壓勻漿器破碎。在高壓均質(zhì)化以后，通過差速離心，使用為任何殘余的、完整的且未破碎的分枝桿菌的受控除去優(yōu)化的相對(duì)離心力，除去剩余的完整分枝桿菌。通過在更高的相對(duì)離心力的離心洗滌，進(jìn)一步純化除去了分枝桿菌細(xì)胞的級(jí)分(其包含與分枝桿菌細(xì)胞壁碎片相混合的分枝桿菌核酸和最佳抗癌活性所需的且受控量的完整分枝桿菌細(xì)胞)，以除去可溶性的污染物。在高相對(duì)離心力離心洗滌以后，分離出MapRNC作為沉淀物。然后將MapRNC在121℃熱處理5-30min。如在實(shí)施例8和9中所述，使用代表主要癌細(xì)胞類型的癌細(xì)胞系，測(cè)定MapRNC的抗癌活性。結(jié)果表明，熱處理過的MapRNC對(duì)癌細(xì)胞系和對(duì)肝轉(zhuǎn)移具有劑量相關(guān)的抗增殖活性。實(shí)施例31草分枝桿菌的總RNA的抗癌活性使用癌細(xì)胞增殖測(cè)定，確定了得自草分枝桿菌細(xì)胞的總RNA制品的生物活性。在使用FastPrepFP120珠子破碎裝置(Savant，Thermo-Fisher，Nepean，ON，加拿大)在水平4.5在FastRNABlue-Tubes(Bio-101Inc.)中裂解細(xì)胞1min以后，使用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，美國)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書制備RNA。然后根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Ambion，Austin，TX，美國)，用‘無DNA的’試劑處理RNA制品，以除去殘余的基因組DNA。以2x105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度，將RT4(ATCC目錄號(hào)HTB-2)和HT1376人膀胱癌細(xì)胞(ATCC目錄號(hào)CRL-1472)鋪板在96-孔組織培養(yǎng)板內(nèi)的補(bǔ)充了10％FBS(得自Wisent)和10μg/ml慶大霉素(Sigma-Aldrich)的DMEM培養(yǎng)基(得自Wisent)(50μL體積)中，并使其在5％CO2氣氛中在37℃的溫度附著孔表面過夜。將在50μL體積的組織培養(yǎng)基中的總RNA加給細(xì)胞，達(dá)到0.01、0.1、1.0μg/mL的RNA終濃度。然后將細(xì)胞在37℃在5％CO2氣氛中溫育72小時(shí)。使用MTT((3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)還原測(cè)定，確定針對(duì)癌細(xì)胞系的抗增殖活性。簡(jiǎn)而言之，在溫育72小時(shí)以后，將10μLMTT溶液(5mg/mL在PBS中)加入每個(gè)孔中，并繼續(xù)溫育另外4小時(shí)。然后通過加入100μL異丙醇∶HCl(24∶1v/v)停止反應(yīng)。MTT的還原導(dǎo)致甲臢的產(chǎn)生。通過使用微量移液器，溶解甲臢，并相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照在570nm的波長在微量培養(yǎng)板讀數(shù)器中測(cè)定光密度(O.D.)。使用下述方程式，確定細(xì)胞增殖的抑制百分比：％抑制＝100-[(試驗(yàn)O.D.-對(duì)照O.D.)/對(duì)照O.D.]。結(jié)果表明草分枝桿菌的總RNA針對(duì)HT1376的中等抗癌活性(0.1ug/mL、1.0μg/mL和10.0μg/mL的RNA的分別具有2.2％、7.1％和6.8％的抑制活性)，以及針對(duì)RT4的稍微更高的抑制活性(0.1μg/mL、1.0μg/mL和10.0μg/mL的RNA分別具有3.1％、7.6％和18.6％的增殖抑制)。與在實(shí)施例27或?qū)嵤├?9(其中分枝桿菌RNA是與分枝桿菌細(xì)胞壁混合的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式)中得到的結(jié)果相比，顯然，當(dāng)使用分枝桿菌細(xì)胞壁RNA組合物(或其它藥學(xué)上可接受的載體諸如聚氨基葡糖或陽離子脂質(zhì)體)時(shí)，就生物活性而言得到了不同的且意外的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例32分枝桿菌細(xì)胞壁RNC的整體效能指數(shù)的確定本發(fā)明的分枝桿菌細(xì)胞壁RNC(MRNC)具有通過2種不同的受體系統(tǒng)刺激免疫系統(tǒng)和抑制癌細(xì)胞分裂的能力，并因而是三功能的治療性組合物。使用得自實(shí)施例29、17和19(分別是抗增殖效能、NOD2活化效能和TLR2活化效能)的數(shù)據(jù)，確定了MpRNC中間、MsRNC中間和MvRNC中間相對(duì)于MbRNC中間的整體效能指數(shù)，作為整合總抗癌和免疫刺激活性的方式。因?yàn)椴煌瑴y(cè)定之間的相對(duì)效能的寬數(shù)值范圍(≥3數(shù)量級(jí))，在該測(cè)定中使用了自然對(duì)數(shù)(log)轉(zhuǎn)化，并累加每種活性的值。給MbRNC分配1的效能，相對(duì)于MbRNC確定其它MRNC的效能。應(yīng)當(dāng)理解，1的自然對(duì)數(shù)是0。結(jié)果顯示在表34中。表34.MRNC中間的整體效能指數(shù)顯然，盡管所有MRNC就TLR2活化而言具有類似的、可比較的效能，MpRNC、MsRNC和MvRNC就抗癌活性而言都比MbRNC更有效。但是，MpNAC就NOD2活化而言是最有效的MRNC。整體效能指數(shù)的確定表明，MpRNC具有最高的總效能，按照遞減次序，其次是MvRNC、MsRNC和MbRNC。實(shí)施例33用于免疫刺激的含有受控量的完整分枝桿菌細(xì)胞的MpRNC組合物的制備如下方便地制備含有受控量的高壓滅菌的完整分枝桿菌的MpRNC：制備MpRNC低(如在實(shí)施例2和實(shí)施例3中詳述)，并將高壓滅菌的完整分枝桿菌細(xì)胞加入MpRNC中，達(dá)到對(duì)于免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)而言最佳的期望比例。一般而言，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答所需的完整草分枝桿菌細(xì)胞的最佳比例是在約5-50重量％范圍內(nèi)，這樣的比例產(chǎn)生最佳的免疫刺激活性。實(shí)施例34用于免疫刺激的含有受控量的完整分枝桿菌細(xì)胞的MRNC組合物的制備如下方便地從分枝桿菌科的給定分枝桿菌種(諸如但不限于牛分枝桿菌菌株BCG、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種、恥垢分枝桿菌或牝牛分枝桿菌)制備MRNC：制備MpRNC低(如在實(shí)施例3中關(guān)于MpRNC所述)，并將高壓滅菌的完整分枝桿菌細(xì)胞加入MRNC中，達(dá)到對(duì)于免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)而言最佳的期望比例。一般而言，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答所需的完整草分枝桿菌細(xì)胞的最佳比例是在約5-50重量％范圍內(nèi)，這樣的比例產(chǎn)生最佳的免疫刺激活性。實(shí)施例35用核糖核酸酶-A處理MpRNC用核糖核酸酶處理MpRNC(例如，在實(shí)施例10中描述的酶消化條件)會(huì)導(dǎo)致在MRNC或MpRNC組合物中含有的RNA的量顯著減少。這樣的減少會(huì)顯著降低MRNC或MpRNC的充當(dāng)治療劑的能力。如在實(shí)施例3中所述制備MpRNC中間，但是在最終的2個(gè)高壓均質(zhì)化循環(huán)之前，將洗滌過的MpRNC中間沉淀物再懸浮于含或不含RNA酶A(Sigma，終濃度10μg/mL；分別是MpRNC-RNA酶和MpRNC-對(duì)照)的注射用水中在37℃保持3小時(shí)。然后通過高速離心洗滌MpRNC以除去RNA酶A，并以1mg/mL的濃度再懸浮于注射用水中。隨后將懸浮液均質(zhì)化，并最終滅菌。如在實(shí)施例27中所述，使用膀胱癌細(xì)胞系HT1376和RT-4，測(cè)定MpRNC-RNA酶和MpRNC對(duì)照的抗癌活性。使用PharmPCv4.2(MicrocomputerSpecialists，Philadelphia，PA，美國)，從劑量-響應(yīng)曲線的線性部分計(jì)算出2種MpRNC制劑的相對(duì)效能。兩種MpRNC制劑以劑量相關(guān)的方式抑制HT1376和RT-4膀胱癌細(xì)胞的增殖(分別見表35和36)。但是，RNA酶處理導(dǎo)致MpRNC對(duì)兩種膀胱癌細(xì)胞系的抗增殖活性的下降。表35.RNA酶處理會(huì)降低MpRNC對(duì)HT1376膀胱癌細(xì)胞的抗增殖活性表36.RNA酶處理會(huì)降低MpRNC對(duì)RT-4膀胱癌細(xì)胞的抗增殖活性在表37中顯示了MpRNC中間-RNA酶處理相對(duì)于MpRNC中間-對(duì)照處理對(duì)HT-1376和RT-4膀胱癌細(xì)胞系的抗增殖效能。表37.RNA酶處理會(huì)降低MpRNC中間的抗癌效能RNA酶處理引起的MpRNC中間中的RNA的除去，會(huì)導(dǎo)致抗癌效能的顯著下降(對(duì)HT1376和RT-4膀胱癌細(xì)胞分別下降4倍和7倍)，從而證實(shí)，RNA在MpRNC中的保留是最佳抗癌活性的必要條件。實(shí)施例36含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的陽離子脂質(zhì)體制劑和抗癌活性的測(cè)定所有下述操作都在無菌條件下進(jìn)行。如下制備BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC：使用高壓均質(zhì)化破碎完整的細(xì)菌、分枝桿菌或草分枝桿菌，通過在低RCF離心，除去未破碎的細(xì)菌、分枝桿菌或草分枝桿菌，并使用苯酚/氯仿/異戊醇和乙醇沉淀，提取RNC組合物。通過在121℃熱處理5min，降低在RNC組合物中的提取的RNA的鏈長度，以制備含有大約20-40個(gè)堿基的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。如下制備由1∶1摩爾比的1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺/1，2-二油酰基-3-三甲銨-丙烷(DOPE/DOTAP)組成的陽離子脂質(zhì)體：將磷脂和陽離子脂質(zhì)溶解在無水氯仿(1mg/mL)中，隨后通過在圓底燒瓶中在減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，形成磷脂/脂質(zhì)薄膜。如下制備對(duì)照脂質(zhì)體：將所需體積的NaCl(0.85％w/v)加入磷脂/脂質(zhì)薄膜，并在65℃攪拌以形成脂質(zhì)體。如下制備含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的陽離子脂質(zhì)體：將含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的NaCl溶液以0.1mg/mL的濃度加入磷脂/脂質(zhì)薄膜，并在65℃攪拌以形成脂質(zhì)體。含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的陽離子脂質(zhì)體將具有大約825nm的平均直徑和大約+36mV的ζ-電勢(shì)。使用0.01-10μg/mL的脂質(zhì)體BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC濃度范圍，如在實(shí)施例27中所述進(jìn)行鼠B16黑素瘤增殖抑制測(cè)定。使用對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)照陽離子脂質(zhì)體或非脂質(zhì)體BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC，進(jìn)行對(duì)照溫育。如在實(shí)施例27中所述進(jìn)行MTT還原，并測(cè)定細(xì)胞增殖抑制的量。結(jié)果表明，含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的陽離子脂質(zhì)體以劑量依賴性的方式抑制B16黑素瘤細(xì)胞的增殖，并且單獨(dú)的陽離子脂質(zhì)體不具有抑制活性。含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的陽離子脂質(zhì)體的抑制活性顯著大于單獨(dú)的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，陽離子脂質(zhì)體制劑會(huì)充當(dāng)BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的藥物遞送系統(tǒng)。應(yīng)當(dāng)理解，RNA可以分離自革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌，以及分離自分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種和牝牛分枝桿菌，并如在本實(shí)施例中所述用陽離子脂質(zhì)體配制，無需加入得自這些物種的細(xì)胞壁。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，B16黑素瘤細(xì)胞在本實(shí)施例中用作典型癌細(xì)胞的代表，并且陽離子脂質(zhì)體在本實(shí)施例中用作NA的典型藥物遞送系統(tǒng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白使用這些類型的藥物遞送系統(tǒng)和制劑治療一般癌癥的適用性。實(shí)施例37含有BRNC、MRNC、MRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的聚氨基葡糖納米顆粒制劑和抗癌活性的測(cè)定所有下述操作都在無菌條件下進(jìn)行。如下制備BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC：使用高壓均質(zhì)化破碎完整的細(xì)菌、分枝桿菌或草分枝桿菌，通過在低RCF離心，除去未破碎的細(xì)菌、分枝桿菌或草分枝桿菌，并使用苯酚/氯仿/異戊醇和乙醇沉淀，提取RNC。通過在121℃高壓滅菌5min，降低提取的RNA的鏈長度，以制備含有大約20-40個(gè)堿基的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。如下制備聚氨基葡糖納米顆粒：將等體積的三聚磷酸鹽(0.5mg/mL在水中)和聚氨基葡糖(平均分子量500,000，在水中的濃度為1mg/mL)在20℃混合2min，以形成對(duì)照聚氨基葡糖納米顆粒，或者將等體積的細(xì)菌、分枝桿菌或草分枝桿菌寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸(BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC，0.5mg/mL在水中)和聚氨基葡糖(平均分子量500,000，在水中的濃度為1mg/mL)在20℃混合2min。BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC在聚氨基葡糖納米顆粒中的摻入是100％。通過離心，洗滌聚氨基葡糖納米顆粒，并測(cè)定它們的大小和ζ-電勢(shì)(顆粒表面電荷的間接量度)。聚氨基葡糖納米顆粒具有在大約200-1000nm范圍內(nèi)的大小和大約-20至-35mV的ζ-電勢(shì)。在補(bǔ)充了MEM非必需氨基酸、慶大霉素(50μg/mL)和10％v/v熱滅活的胎牛血清的MEM中，在37℃和5％CO2培養(yǎng)B16黑素瘤細(xì)胞至匯合。通過胰蛋白酶消化，收獲細(xì)胞，將其再懸浮于MEM組織培養(yǎng)基中，并鋪板在組織培養(yǎng)板的孔中(96孔板，100μL含有5x103個(gè)細(xì)胞)，使其在5％CO2中在37℃附著3小時(shí)。然后將含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的聚氨基葡糖納米顆粒加給B16黑素瘤細(xì)胞(ATCC)，達(dá)到在0.001-100μg/mL范圍內(nèi)的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC終濃度。將對(duì)照聚氨基葡糖納米顆粒或不含BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的聚氨基葡糖納米顆粒加給B16黑素瘤細(xì)胞，達(dá)到與BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC聚氨基葡糖納米顆?？杀容^的濃度。在37℃/5％CO2溫育鼠B16黑素瘤細(xì)胞48小時(shí)，并使用MTT還原測(cè)定確定細(xì)胞在該時(shí)間內(nèi)的生長。使用ELISA平板讀數(shù)器，在570nm測(cè)定還原的MTT的水平，其與活細(xì)胞的數(shù)目相對(duì)應(yīng)。結(jié)果表明，含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的聚氨基葡糖納米顆粒以劑量依賴性的方式抑制B16黑素瘤細(xì)胞的增殖，并且單獨(dú)的聚氨基葡糖納米顆粒不具有抑制活性，含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的聚氨基葡糖納米顆粒的抑制活性顯著大于單獨(dú)的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，聚氨基葡糖納米顆粒制劑會(huì)充當(dāng)BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的藥物遞送系統(tǒng)。應(yīng)當(dāng)理解，RNA可以分離自革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌，以及分離自分枝桿菌、草分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種和牝牛分枝桿菌，并如在本實(shí)施例中所述用聚氨基葡糖納米顆粒配制，無需加入得自這些物種的細(xì)胞壁。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，B16黑素瘤細(xì)胞在本實(shí)施例中用作典型癌細(xì)胞的代表，并且聚氨基葡糖納米顆粒在本實(shí)施例中用作NA的典型藥物遞送系統(tǒng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白使用這些類型的藥物遞送系統(tǒng)和制劑治療一般癌癥的適用性。實(shí)施例38含有鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種RNA的組合物(MapRNC)的制備在本實(shí)施例中，首先通過低速離心洗滌完整的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種細(xì)胞以除去培養(yǎng)基組分，然后使用高壓均質(zhì)化用AvestinEmulsiFlex-C5高壓勻漿器破碎。在高壓均質(zhì)化以后，通過差速離心，使用為任何殘余的、完整的且未破碎的分枝桿菌的受控除去優(yōu)化的相對(duì)離心力，除去剩余的完整分枝桿菌。通過在更高的相對(duì)離心力的離心洗滌，進(jìn)一步純化除去了分枝桿菌細(xì)胞的級(jí)分(其包含與分枝桿菌細(xì)胞壁碎片相混合的分枝桿菌核酸和最佳抗癌活性所需的且受控量的完整分枝桿菌細(xì)胞)，以除去可溶性的污染物。在高相對(duì)離心力離心洗滌以后，分離出除去分枝桿菌細(xì)胞的級(jí)分作為沉淀物。然后將除去分枝桿菌細(xì)胞的級(jí)分在121℃熱處理5-30min，并用作得自副結(jié)核分枝桿菌的分枝桿菌RNC(MapRNC)。實(shí)施例39MapRNC中的核酸的分析在本實(shí)施例中，確定了MapRNC中的核酸類型、寡核糖核苷酸鏈長度和含量。如在實(shí)施例38中所述制備MapRNC。使用下述操作，提取核酸。用無DNA酶的且無RNA酶的溶菌酶(得自Sigma-AldrichCanada，Oakville，Ontario)消化700μL濃度為1mg/ml的等分試樣，隨后滅活，并用無DNA酶的且無RNA酶的蛋白水解酶K(得自Sigma-AldrichCanada，Oakville，Ontario)進(jìn)一步消化。用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1v/v)提取核酸，并通過加入糖原、醋酸鈉和乙醇進(jìn)行沉淀。用80％冰冷的乙醇洗滌沉淀物，并再懸浮于50μL蒸餾水中。通過在紫外分光光度計(jì)中測(cè)量在260/280nm的吸光度，測(cè)定濃度。確定每種組合物的核酸含量。使用Bioanalyze系統(tǒng)(Bioanalyze#2100型，Agilent，SantaClara，CA，美國)，對(duì)在熱處理(121℃，30min)之前和之后收集的MapRNC制品進(jìn)行關(guān)于它們的核酸分布的電泳分析。將核酸級(jí)分稀釋至30ng/μL的濃度。使用RNA6000納米試劑盒(Agilent#5067-1511)，用Bioanalyze電泳單元完成提取的核酸的長度的電泳分析。該試劑盒會(huì)提供關(guān)于在25-6000個(gè)核苷酸的大小范圍內(nèi)的RNA的質(zhì)量的信息。然后使用小RNA試劑盒(AgilentTechnologiesCanadaInc.，St.Laurent，Québec，加拿大，試劑盒編號(hào)5067-1548)，進(jìn)一步分析在高壓滅菌以后的MapRNC，所述試劑盒設(shè)計(jì)用于分析在6-150個(gè)核苷酸的大小范圍內(nèi)的小核酸。當(dāng)使用RNA納米6000試劑盒分析時(shí)，在熱處理之前的MapRNC具有在大約25個(gè)堿基至4000個(gè)堿基之間且接近后者的核酸分布。結(jié)果證實(shí)，高壓均質(zhì)化步驟(不同的循環(huán)壓力和次數(shù))用于制備MapRNC的用途，會(huì)產(chǎn)生這樣的組合物：其含有鏈長度為25-4000個(gè)堿基的多核糖核苷酸。在熱處理以后，MapRNC顯示出更緊湊的分布。MapRNC具有在20-40個(gè)堿基之間達(dá)到最大值的寡核糖核苷酸峰，且具有5-60個(gè)堿基長度的核酸分布。MapRNC組合物僅具有微量的在100個(gè)堿基處洗脫的核酸和甚至更少的在約150個(gè)堿基長度處洗脫的寡核糖核苷酸材料。結(jié)果證實(shí)，高壓均質(zhì)化和熱處理步驟(不同的循環(huán)壓力和次數(shù)以及高壓滅菌)用于制備MapRNC的用途，會(huì)產(chǎn)生這樣的組合物：其含有鏈長度小于60個(gè)堿基的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。首先如下分析在實(shí)施例38中制備的MapRNC的DNA與RNA之比：使用RNA酶-A對(duì)提取的核酸進(jìn)行酶消化，隨后進(jìn)行Bioanalyze2100電泳繪圖，并使用Agilent小RNA試劑盒(試劑盒編號(hào)5067-1548)，定量寡核糖核苷酸含量。使用無DNA酶的核糖核酸酶A(RNA酶A，在100℃處理30min，以除去DNA酶活性)，對(duì)提取的核酸進(jìn)行RNA酶-A消化(0.1μg酶，在37℃保持2h)。所述RNA酶A得自Ameresco(Solon，OH，美國)。使用Bioanalyze，分析RNA酶A處理過的核酸的樣品(20ng/μL)。使用下述方程式，確定在MapRNC中的DNA和RNA的量：DNA含量＝(總核酸含量-RNA酶-A處理以后的核酸含量)。MapRNC的分析表明DNA和RNA在MapRNC的提取物中的存在。如下分析本發(fā)明的MapRNC中的DNA與RNA之比。使用Microsep1K單元(分子量截止＝1000Da，Sciences，AnnArbor，MI，美國)，通過超濾來回收核酸級(jí)分。然后按照Liang報(bào)道的操作(Liang等人，Ann.Chim.Acta2009，650：106-110)，使用核酸酶P1(Sigma-Aldrich，Oakville，ON，加拿大)將核酸溶液消化成5’-單磷酸核苷的混合物。為了確保最佳的核酸酶P1消化，在95-100℃在水浴中加熱共50μL要研究的核酸水溶液10min，隨后立即在冰上冷卻。在含有0.5mMZnCl2的30mM醋酸鈉緩沖液(pH5.3)中，制備5單位/μL的核酸酶P1。對(duì)于酶消化，將50μL核酸水溶液與相同體積的核酸酶P1溶液混合，然后在50℃溫育30min。將得到的混合物冷卻至室溫，并通過在室溫在10,000g離心20min，穿過Nanosep10K過濾器進(jìn)行過濾，然后進(jìn)行HPLC分析。還對(duì)單核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品(5’-脫氧核糖核苷酸和5’-核糖核苷酸，Sigma-Aldrich)的混合物的系列稀釋物(其含有100、10、5、2.5、1ng/μL的每種存在于DNA和RNA中的單核苷酸)進(jìn)行核酸酶P1處理，并過濾，用作HPLC分析的標(biāo)準(zhǔn)品。通過對(duì)比各種核苷酸在相同HPLC條件下的保留時(shí)間，確認(rèn)這些核苷酸的洗脫次序。使用1200系列HPLC系統(tǒng)(Agilent，St-Laurent，Quebec，加拿大)進(jìn)行HPLC分析，所述系統(tǒng)配有具有脫氣器的四元泵、自動(dòng)采樣器、柱加熱器和多波長紫外檢測(cè)器。使用ZorbaxBonus-RP柱(Agilent)，并且流動(dòng)相包含10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.2)和甲醇(0-10％甲醇)的線性梯度。在260nm檢測(cè)單核苷酸。在確定DNA和RNA含量以后，確定DNA∶RNA比。結(jié)果證實(shí)，除了DNA以外，RNA存在于MapRNC中。實(shí)施例40MapRNC會(huì)誘導(dǎo)人病原體相關(guān)分子模式受體(PAMP)NOD2的活化使用經(jīng)工程改造成表達(dá)人NOD2受體驅(qū)動(dòng)的NF-κB和下游信號(hào)傳遞標(biāo)志物IL-8的HEK-293細(xì)胞，評(píng)價(jià)了如在實(shí)施例38中制備的MapRNC的NOD2活化活性。在補(bǔ)充了10％胎牛血清(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)、100μg/mLNormocinTM和10μg/mL殺稻瘟素(二者得自InvivoGen)的高葡萄糖DMEM(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在含有5％CO2的增濕氣氛下，在37℃培養(yǎng)和維持人HEK293-NOD2細(xì)胞系(InvivoGen，SanDiego，CA，美國)。以5x105個(gè)細(xì)胞/mL，將HEK293-NOD2細(xì)胞接種在無菌的96-孔平底組織培養(yǎng)微量培養(yǎng)板內(nèi)的0.2mL體積的上述細(xì)胞培養(yǎng)基中，并在含有5％CO2的增濕氣氛下，與0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160μg/mL的MapRNC一起在37℃溫育48小時(shí)。在溫育后收集上清液，在4℃在4,000xRCF離心5min以除去細(xì)胞和碎片，并在-20℃保存上清液用于分析。在與MapRNC一起培養(yǎng)48小時(shí)以后，借助于商業(yè)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)(得自BioSource，Camarillo，CA，USA)，測(cè)量上清液中的人IL-8。使用KCJunior軟件包(BioTekInstruments，Winooski，VT，美國)，從ELISA平板讀數(shù)器(ELx-808IUBioTekInstruments，Winooski，VT，美國)捕獲數(shù)據(jù)，并以pg/mL表示合成的IL-8。MapRNC會(huì)以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)IL-8的合成和分泌。因此，結(jié)果表明，MapRNC通過以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)NOD2驅(qū)動(dòng)的IL-8釋放而起NOD2激動(dòng)劑的作用。實(shí)施例41MapRNC具有人TLR2活化活性使用經(jīng)工程改造成表達(dá)人TLR2受體的HEK-293細(xì)胞，測(cè)量如在實(shí)施例38中制備的MapRNC的TLR2活化活性。人體HEK293-TLR2細(xì)胞系得自InvivoGen，SanDiego，CA，USA。用置于NF-kB基因控制下的TLR2基因和TLR2受體驅(qū)動(dòng)的分泌型胚性堿性磷酸酶基因(SEAP)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染HEK293-TLR2細(xì)胞。因此，TLR2的活化會(huì)導(dǎo)致堿性磷酸酶活性在細(xì)胞培養(yǎng)基中的產(chǎn)生，所述活性用于定量受體活化。在含有5％CO2的增濕氣氛下，在補(bǔ)充了10％胎牛血清(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)和1xNormocinTM(InvivoGen)的高葡萄糖DMEM(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在37℃培養(yǎng)和維持所述細(xì)胞。以5x105個(gè)細(xì)胞/mL，將HEK293-TLR2細(xì)胞接種于在無菌的96-孔平底組織培養(yǎng)微量培養(yǎng)板內(nèi)的0.2mL體積的HEK-BlueTM檢測(cè)培養(yǎng)基(InvivoGen)中，并在含有5％CO2的增濕氣氛下，與0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160μg/mL的MapRNC一起在37℃溫育18小時(shí)。加入所述孔中的HEK-BlueTM檢測(cè)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)用于檢測(cè)NF-kB誘導(dǎo)的可溶性的胚性堿性磷酸酶酶活性(SEAP活性)。在溫育18小時(shí)以后，使用微量培養(yǎng)板分光光度計(jì)讀數(shù)器(ELx-808IU型，BioTekInstruments，Winooski，VT，美國)，在630nm測(cè)定光密度(其與通過TLR2結(jié)合活化的NF-kB成比例)。使用KCJunior軟件包(BioTekInstruments)，捕獲數(shù)據(jù)。在MapRNC處理以后，細(xì)胞上清液中的SEAP活性以劑量相關(guān)的方式增加。因此，結(jié)果表明，MapRNC能夠以劑量依賴性的方式活化TLR2(即，MapRNC充當(dāng)TLR2激動(dòng)劑)。實(shí)施例42MapRNC的抗癌活性使用代表主要癌細(xì)胞類型的癌細(xì)胞系，測(cè)定如在實(shí)施例38中制備的MapRNC的抗癌活性。以5x105個(gè)細(xì)胞/mL的濃度，將RT4人膀胱癌細(xì)胞(ATCC目錄號(hào)HTB-2TM)鋪板在DMEM培養(yǎng)基(50μL體積)中，并將CT26鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系(ATCC目錄號(hào)CRL-2638TM)鋪板在RPMI1640培養(yǎng)基(50μL體積)中，兩種培養(yǎng)基均補(bǔ)充了10％熱滅活的FBS(二者得自Wisent)和10μg/mL慶大霉素(Sigma-Aldrich)，并在96-孔組織培養(yǎng)板中，并使所述細(xì)胞在37℃的溫度在5％CO2氣氛中附著孔表面過夜，然后處理。以1x106個(gè)細(xì)胞/mL的濃度，將人白血病細(xì)胞Jurkat(ATCCTIB-152TM)懸浮于在96-孔組織培養(yǎng)板內(nèi)的補(bǔ)充了10％熱滅活的FBS和10μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基(50μL體積)中。將在50μL體積的組織培養(yǎng)基中的熱處理過的MapRNC(例如121℃，30min)加給細(xì)胞，以達(dá)到0.01、0.1、1.0和10μg/mL的MapRNC終濃度。然后將細(xì)胞在5％CO2氣氛中在37℃溫育48小時(shí)。使用MTT((3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)還原測(cè)定，測(cè)定針對(duì)癌細(xì)胞系的抗增殖活性。簡(jiǎn)而言之，在溫育48小時(shí)以后，將10μLMTT溶液(5mg/mL在PBS中)加入每個(gè)孔中，并繼續(xù)溫育另外4小時(shí)。然后通過加入100μL異丙醇∶HCl(24∶1v/v)，停止反應(yīng)。MTT的還原導(dǎo)致甲臢的產(chǎn)生。通過使用微量移液器，溶解甲臢，并相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照在570nm的波長在微量培養(yǎng)板讀數(shù)器中測(cè)定光密度(O.D.)。使用下述方程式，確定細(xì)胞增殖的抑制百分比：％抑制＝100-[(試驗(yàn)O.D.-對(duì)照O.D.)/對(duì)照O.D.]。結(jié)果表明，熱處理過的MapRNC對(duì)RT4膀胱癌細(xì)胞和CT26結(jié)腸癌細(xì)胞以及Jurkat白細(xì)胞細(xì)胞具有劑量相關(guān)的抗增殖活性。因此，MapRNC具有不限于癌癥類型的抗癌活性。實(shí)施例43用于免疫刺激的聯(lián)合MRNC制劑本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀上述實(shí)施例以后將會(huì)使用MRNC的適當(dāng)組合來實(shí)現(xiàn)對(duì)于目標(biāo)適應(yīng)癥而言最佳的治療活性。因而，MpRNC和MvRNC的組合將會(huì)產(chǎn)生對(duì)于免疫刺激和細(xì)胞因子誘導(dǎo)而言最佳的NOD2和TLR2活化。類似地，MpRNC和MvRNC的組合將會(huì)產(chǎn)生最佳的抗癌活性和免疫刺激。實(shí)施例44MRNC與用于治療癌癥的治療劑的組合為了增強(qiáng)臨床有效性，將本發(fā)明的MRNC組合物與化學(xué)療法和/或免疫療法相組合。MRNC向下述化療方案中的添加，無意成為窮盡列表(這樣的列表可在例如TheElsevierGuidetoOncologyDrugsandRegimens，2006中得到，它描述了超過220種在癌癥的治療中常見的藥物方案)，并且應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明的實(shí)施例以后，將會(huì)在癌癥的治療中在具有最適當(dāng)?shù)幕煼桨傅男螺o助或輔助場(chǎng)合使用本發(fā)明的組合物。下述的2個(gè)方案用于例證如何與化學(xué)療法和免疫療法聯(lián)合使用MRNC的原理：結(jié)腸和直腸癌：具有局部晚期疾病的結(jié)腸和直腸癌患者處于肝轉(zhuǎn)移(通過肝臟的肝門靜脈傳播)的高危中。經(jīng)常在外科手術(shù)切除術(shù)之前或之后(新輔助或輔助場(chǎng)合)開始化學(xué)療法，其目的是，減少肝轉(zhuǎn)移和隨后向其它器官的二次轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。5-氟尿嘧啶經(jīng)常用于治療轉(zhuǎn)移性或晚期疾病，其中使用1000mg/m2的方案，每天靜脈內(nèi)輸注連續(xù)5天，每28天進(jìn)行重復(fù)。在用5-氟尿嘧啶治療之前、過程中或之后，本發(fā)明的MRNC可以以治療活性劑量(通過臨床評(píng)價(jià)研究確定)作為靜脈內(nèi)推注或輸注來施用。可以以在臨床前試驗(yàn)和臨床評(píng)價(jià)(1期、2期和3期臨床研究)中確定為最有效的劑量，施用MRNC制劑。這樣的劑量將在每劑0.00001mg/kg至約100mg/kg的范圍內(nèi)。與接受單獨(dú)的5-氟尿嘧啶療法的患者相比，接受聯(lián)合治療的患者會(huì)受益于達(dá)到復(fù)發(fā)的時(shí)間增加、轉(zhuǎn)移的減少、腫瘤負(fù)荷的減少或腫瘤的根除。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它化療方案，諸如但不限于：5-氟尿嘧啶、亞葉酸和奧沙利鉑，用或不用貝伐單抗；伊立替康、亞葉酸和5-氟尿嘧啶，用或不用西妥昔單抗；或絲裂霉素c和5-氟尿嘧啶，而不限制MRNC的有效性。肺癌：與其它化學(xué)治療劑聯(lián)合使用的環(huán)磷酰胺被用于治療以前未治療過的患者，或者具有晚期的、復(fù)發(fā)的或轉(zhuǎn)移的癌癥的患者。典型的方案是，但不限于，環(huán)磷酰胺、多柔比星(亞德里亞霉素)和依托泊苷(CAE)，其中在第1天以1000mg/m2的劑量靜脈內(nèi)施用環(huán)磷酰胺，在第1天以45mg/m2的劑量靜脈內(nèi)施用多柔比星，并在第1-3天以100mg/m2的劑量靜脈內(nèi)施用依托泊苷。每28天重復(fù)治療循環(huán)。在每個(gè)化療藥物治療循環(huán)之前、過程中或之后，以在臨床前試驗(yàn)和臨床評(píng)價(jià)(1期、2期和3期臨床研究)中確定為最有效地增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞產(chǎn)生(通過MU-CSF、G-CSF和GM-CSF的刺激)的最佳劑量，施用本發(fā)明的MRNC作為靜脈內(nèi)推注。這樣的劑量將在每劑0.00001mg/kg至約100mg/kg的范圍內(nèi)。與用單獨(dú)的化學(xué)療法治療的患者相比，用MRNC治療的患者具有減少的傳染性發(fā)作發(fā)病率以及與化學(xué)療法誘導(dǎo)的單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞數(shù)減少有關(guān)的延遲的治療循環(huán)。可以使用用于治療肺癌(原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性)的其它化療方案，而不限制MRNC的有效性。宮頸癌：宮頸癌與HPV感染有關(guān)。盡管15個(gè)HPV類型是致癌的，認(rèn)為HPV16和16會(huì)引起所有宮頸癌中的70％。當(dāng)前的免疫接種方案可有效地防止感染，但是不能有效地治療既存的感染。在宮頸癌的治療中存在未得到滿足的需求：如果要保留子宮功能，需要針對(duì)癌細(xì)胞和發(fā)展中的病毒感染的療法。在第1天用卡鉑(50-100mg/m2，靜脈內(nèi))和多柔比星(45-60mg/m2，靜脈內(nèi))治療晚期的、復(fù)發(fā)的或轉(zhuǎn)移性的疾病，并每21天重復(fù)該循環(huán)。在化學(xué)療法之前、過程中或之后，以通過先前的臨床研究確定為對(duì)于免疫刺激而言最佳的劑量，通過頸內(nèi)注射將MRNC局部地施用進(jìn)子宮頸中?？梢砸栽谂R床前試驗(yàn)和臨床評(píng)價(jià)(1期、2期和3期臨床研究)中確定為最有效的劑量，施用MRNC制劑。這樣的劑量將在每劑0.00001mg/kg至約100mg/kg的范圍內(nèi)。MRNC具有2種效應(yīng)：首先，通過誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生針對(duì)病毒感染的細(xì)胞的免疫應(yīng)答，使在子宮頸中的HPV病毒(包括HPV16和18)的病毒載量減少，其次通過誘導(dǎo)MU-CSF、G-CSF和GM-CSF，增加化學(xué)治療劑的臨床有效性。上面引用的所有專利、出版物和摘要都通過引用整體并入本文。應(yīng)當(dāng)理解，前述內(nèi)容僅僅涉及本發(fā)明的不同實(shí)施方案，在其中可以做出許多修改或改變，而不背離在下述權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的精神和范圍。