無去污劑制備革蘭氏陰性細菌外膜泡囊的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和疫苗的領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及無去污劑制備在疫苗中使用的革蘭氏陰性細菌外膜泡囊(OMV)的方法、通過所述方法獲得的OMV，以及包含這樣的OMV的藥物組合物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的OMV作為藥劑的用途，特別是其在誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法中的用途。
【專利說明】無去污劑制備革蘭氏陰性細菌外膜泡囊的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和疫苗的領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及無去污劑制備在疫苗中使用的革蘭氏陰性細菌外膜泡囊(OMV)的方法、可通過所述方法獲得的0MV，以及包含這樣的OMV的藥物組合物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的OMV作為藥劑的用途，特別是其在誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法中的用途。
_2] 發(fā)明背景
[0003]腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是可引起急性腦膜炎和敗血癥的人病原體，其致死率約15% [Girard等人，2006]。血清群B腦膜炎在北美洲占腦膜炎病例的30-40 % [Sharip等人，2006 ；Kaplan等人，2006]，并且在一些歐洲國家中占高達80 %[TiOtter等人，2007 ;Gray等人，2006]，然而仍沒有可用的廣泛保護性疫苗。已經(jīng)基于綴合至載體蛋白的莢膜多糖，研發(fā)了針對其它血清群的有效疫苗[Snape等人，2008]。對于血清群B，由于較差的免疫原性[Morley等人，2001]，以及對于疫苗接種引發(fā)的自身免疫的擔(dān)心[Finne等人，1983]，該方法不可行。至今，基于外膜泡囊(OMV)的疫苗是唯一成功地控制血清群B傳染病的疫苗,如在挪威、古巴和新西蘭[Bjune等人，1991 ;Thornton等人,2006 ；Martin 等人，1998 ；Sierra 等人，F(xiàn)redriksen 等人，1991]的實例。
[0004]OMV從革蘭氏陰性細菌的外膜釋放，其由包含外膜蛋白的磷脂(PL)雙分子層、脂多糖(LPS)和胞質(zhì)組分組成[Deatherage等人，2009]。PorA蛋白被鑒定為是OMV中的主要保護性抗原，但它在傳播的血清群B菌株之間是高度可變的，這使疫苗的研發(fā)復(fù)雜化[Saukkonen 等人，1989 ；Martin 等人，2006]。因此，Rijks Instituut voorVolksgezondheid en Milieu(RIVM),即國家公共衛(wèi)生和環(huán)境研究所(BiIthoven,荷蘭)研發(fā)了基于表達多種PorA亞型的基因修飾的腦膜炎奈瑟球菌菌株的OMV疫苗。起初，該多價OMV疫苗由2種總共表達6種PorA亞型的三價PorA菌株制備[van der Ley等人，1995 ；Claassen等人,1996],并且在II期臨床試驗中提供了功能性免疫原性。為了確保對于全球傳播的血清群B菌株的足夠覆蓋,加入了第三種三價菌株[van den Dobbelsteen等人，2007]。
[0005]傳統(tǒng)上通過去污劑提取(dOMV純化方法)來制備OMV疫苗，以移除LPS，并增強泡囊釋放。腦膜炎奈瑟球菌的LPS是高毒性的，但是需要殘留量(約1% )來維持泡囊結(jié)構(gòu)并輔助針對PorA的免疫應(yīng)答[Arigita等人，2005 ；Arigita等人，2003 ；Steeghs等人，2004]。通過適度的去污劑濃度，dOMV純化方法滿足這些要求，然而其還有重要缺點。連同LPS，去污劑移除有助于免疫原性的PL以及脂蛋白(例如因子H結(jié)合蛋白)[Koeberling等人，2009 ;Koeberling等人，2008]。所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答直接針對特定的PorA亞型，而不引發(fā)交叉保護[Morley等人,2001 ；van der Voort等人，1996]。此外，LPS和PL的選擇性移除改變原始的泡囊結(jié)構(gòu)，并且促進聚集[Holst等人,2009 ；Cametti等人,2008]。為了降低LPS毒性，需要進行去污劑處理，但這具有使疫苗研發(fā)復(fù)雜化的有害的副作用。
[0006]無去污劑OMV純化方法保留所有LPS，不僅導(dǎo)致保留的原始泡囊結(jié)構(gòu)，而且導(dǎo)致當(dāng)用于非消化道免疫法時自身有毒的疫苗[Holst等人，2009]。已經(jīng)記載了兩種無去污劑純化方法。原始的OMV(nOMV)方法[Zollinger等人，1979 ；US 6，558，677]包括與dOMV相似的步驟，然而其有無去污劑提取步驟，并且上清液OMV(sOMV)方法[Post等人，2005 ;Devoe等人，1973 ；Hoekstra等人，1976]利用超濾法或超速離心法來純化從培養(yǎng)物上清液自發(fā)釋放的0MV，而無提取。nOMV疫苗在動物和人中產(chǎn)生鼓舞人心的結(jié)果，但是高的LPS含量限制了該疫苗鼻內(nèi)給藥的適用性[Guthrie等人,2004 ；Katial等人,2002 ；Saunders等人，1999 ；Drabick等人，1999]。sOMV疫苗的臨床前數(shù)據(jù)限于在小鼠中的單個研究，其報告了針對一組血清群B菌株的交叉保護作用，這用dMOV時未發(fā)現(xiàn)，然而未討論毒性和穩(wěn)定性中可能的不同[Ferrari等人，2006]。sOMV方法帶來了額外的挑戰(zhàn)，因為它生產(chǎn)OMV的收率對于適合的工藝研發(fā)而言太低[Post等人，2005 ；Devoe等人，1973]。
[0007]在RIVMBiIthoven發(fā)現(xiàn)的 IpxLl 突變株[van der Ley 等人,2001]提供了對于LPS毒性問題的解決方案。IpxLl的缺失使LPS毒性減弱，同時保留免疫應(yīng)答需要的佐劑活性[Koeberling等人，2008 ；van der Ley 等人,2001 ;Fisseha等人，2005 ；van de Waterbeemd等人，2010]。
[0008]然而，對于nOMV/sOMV的臨床試驗或者GMP制備，需要強大的、可規(guī)?；纳a(chǎn)方法，其中為了高收率，需要EDTA提取步驟，但是至今，其導(dǎo)致不期望的效果，如細菌溶胞作用[Prachayasittikul等人,2010]。對于大規(guī)模生產(chǎn)，由溶胞作用導(dǎo)致的DNA釋放是問題，因為如超速離心法的移除方法僅具有有限的能力。
[0009]因此，由于至今可用于制備sOMV和nOMV的方法低收率和/或低純度和/或限于實驗室規(guī)模，需要改進的方法用于制備細菌0MV，特別需要工業(yè)規(guī)模的方法。
[0010]發(fā)明描述
[0011]令人驚奇地，現(xiàn)在已證明在一可以任意規(guī)模進行的方法中，可無去污劑且高收率和高純度地制備OMV。
[0012]因此，在本發(fā)明的第一方面中提供無去污劑制備在疫苗中使用的細菌外膜泡囊(OMV)的方法，所述方法包括以下步驟:
[0013]a)培養(yǎng)革蘭氏陰性細菌群落至靜止生長期；
[0014]b)在靜止生長期開始后至少約I小時的時間點，在調(diào)節(jié)至或具有高于約PH7.5或高于PH8.0的pH、濃度為約1-1OOmM的金屬螯合劑的培養(yǎng)基中，孵育在a)中獲得的細菌，以提取0MV，所述金屬螯合劑優(yōu)選為EDTA ；以及
[0015]c)回收在b)中提取的0MV，其中所述回收至少包括從所述OMV移除所述細菌。
[0016]靜止期開始后約I小時的時間點優(yōu)選為1-9小時的時間點，更優(yōu)選1-8小時、1-7小時、1-6小時、2-5小時、2-4小時、2-3.5小時或2.5-3.5小時。
[0017]在本發(fā)明任意的方法中，優(yōu)選將OMV滅菌，優(yōu)選通過過濾滅菌，優(yōu)選使用具有小于約0.3微米小孔的濾器。優(yōu)選在步驟c)期間進行滅菌；由于進行了本發(fā)明的步驟b)，大大降低了收率的損失。過濾滅菌也稱作無菌過濾，在本文中定義為將所關(guān)注的化合物通過濾器過濾，所述濾器優(yōu)選具有約0.5-0.2微米的小孔，以使包含所關(guān)注的化合物的濾液不包含任何微生物，或?qū)V液中微生物的量降低至可接受的低水平。 [0018]術(shù)語“無去污劑”在本文中優(yōu)選定義為在本發(fā)明任意方法的提取步驟期間，未加入和/或使用去污劑；更優(yōu)選地，在本發(fā)明任意方法期間，根本未加入和/或使用去污劑。如果在培養(yǎng)群落期間使用去污劑，例如作為消泡劑形式的加工助劑，如Sigma-Aldrich的消泡劑(貨號(cat.nr.)A6426、A5633、A5757、A8011或A5758)，或者來自其他生產(chǎn)商的具有類似功能的分子，認為這是在本發(fā)明方法的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的方法使用的溶液中，自身存在少量的去污劑也是可能的，例如在用于培養(yǎng)的復(fù)合培養(yǎng)基中的痕量去污劑；這樣的自身存在也被認為是在本發(fā)明方法的范圍內(nèi)。
[0019]在本文中去污劑優(yōu)選定義為具有表面活性劑能力，并且當(dāng)與細菌接觸時，具有從細菌中提取蛋白質(zhì)的能力的物質(zhì)，優(yōu)選為試劑。去污劑可為陰離子型的、陽離子型的、非離子型的(凈電荷為0，也稱作兩性離子的)或者為乙氧化物(ethyloxylate)。消泡劑，SP在工業(yè)處理液體中減少并阻止泡沫形成的物質(zhì),如來自Sigma-Aldrich的消泡劑(貨號:A6426、A5633、A5757、A8011或A5758)優(yōu)選不在去污劑的定義范圍內(nèi)。在本發(fā)明的任意方法中培養(yǎng)革蘭氏陰性細菌群落可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法進行。優(yōu)選的培養(yǎng)基為化學(xué)限定培養(yǎng)基，優(yōu)選地如在Baart等人，2007中記載的那些。溫度可在任意溫度下變化，例如約30°C -約40°C。pH可在任意pH下變化，如約5.5-8.5的pH。優(yōu)選的培養(yǎng)條件包含在通氣下，于約35°C，pH7.2下培養(yǎng)。可以數(shù)個步驟進行培養(yǎng)，包括但不限于預(yù)培養(yǎng)或種菌培養(yǎng)和主培養(yǎng)。培養(yǎng)可以任意規(guī)模進行，包括但不限于搖瓶培養(yǎng)、在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模培養(yǎng)(包括連續(xù)、分批、分批補料或固態(tài)培養(yǎng))。培養(yǎng)物的體積優(yōu)選地至少為約 10L，更優(yōu)選地至少約 20L、40L、60L、80L、100L、200L、300L、400L、500L、800L、1500L、5000L、10，000L、20, 000L 或 40，OOOL0
[0020]在本文中細菌群落定義為至少兩個細菌，優(yōu)選為相同屬和種。
[0021]OMV優(yōu)選從具有基因修飾的革蘭氏陰性細菌制備，所述基因修飾導(dǎo)致所述細菌產(chǎn)生修飾為具有降低的毒性 的LPS。所述革蘭氏陰性細菌優(yōu)選具有毒性降低的LPS，其中所述LPS(或者它的脂質(zhì)A基團(LA))修飾為具有降低的毒性。在本文中，修飾為具有降低的毒性的LPS要理解為修飾為比相應(yīng)的野生型LPS的毒性低的LPS。優(yōu)選地，修飾的LPS的毒性比相應(yīng)的野生型 LPS 的毒性低約 90%,80%,60%,40%,20%,10%,5%,2%,1%>0.5%或0.2%?？稍诒绢I(lǐng)域已知的任意適合的實驗中測定野生型和多種修飾的毒性降低的LPS的毒性。用于測定LPS的毒性(即生物活性)的優(yōu)選實驗為用于MM6巨噬細胞細胞系中TNF-alpha 誘導(dǎo)的 WEHI 試驗[Espevik 和 Niessen, 1986, J.1mmunol.Methods 95:99-105 ；Ziegler-Heitbrock 等人，1988, Int.J.Cancer41:456-461]。
[0022]然而，盡管所述革蘭氏陰性細菌的LPS(或它的LA基團)優(yōu)選具有降低的毒性，所述LPS也優(yōu)選保留至少部分免疫刺激活性(即佐劑活性)。從而，在本發(fā)明中使用的革蘭氏陰性細菌的毒性降低的LPS優(yōu)選具有至少約10 %、20 %、40 %、80 %、90 %或100 %的相應(yīng)的野生型LPS的免疫刺激活性，其中免疫刺激活性如下測量:如WO 2005/107798的實施例3中記載的，在將樹突細胞(DC)與產(chǎn)生毒性降低的LPS的革蘭氏陰性細菌共同培養(yǎng)時，測量至少一種細胞因子的產(chǎn)生或至少一種共刺激分子的表達。由DC產(chǎn)生的細胞因子優(yōu)選選自IL12、IL10、TNF- a、IL6和IL-1 β，并且由DC表達的共刺激分子優(yōu)選選自CD40和⑶86。
[0023]如在WO 02/09746中所總結(jié)，具有脂質(zhì)A基團的降低的毒性但保留(部分)佐劑活性的革蘭氏陰性LPS可例如從基因修飾的革蘭氏陰性病原體中獲得。產(chǎn)生脂質(zhì)A基團毒性降低的LPS但保留(部分)它們的佐劑活性的基因修飾的革蘭氏陰性病原體包括例如如下革蘭氏陰性細菌，其具有一處或多處減少或敲除一種或多種選自IpxLl和lpxL2基因或其同源物(先前稱作htrB和msbB ;參見例如WO 00/26384 ；US 5，997，881)以及編碼脂質(zhì)A4,-激酶的IpxK基因或其同源物(也參見以下)的表達的基因修飾；以及引起一種或多種外源IpxE和pagL基因表達的基因修飾。優(yōu)選的基因修飾為減少或敲除一種或多種選自IpxLl和lpxL2基因或其同源物的基因的表達的修飾。優(yōu)選的脂質(zhì)A基團毒性降低但保留(部分)它的佐劑活性的LPS為WO 00/26384中記載的LPS，并且為具有如下脂質(zhì)A的LPS，與相應(yīng)的未修飾的LPS分子相比,所述脂質(zhì)A的每LPS分子的仲(secondary)酰基鏈數(shù)量減少，并且所述脂質(zhì)A在葡糖胺二糖的還原端具有至少一個連接至伯(primary)酰基鏈的仲?；?；所述脂質(zhì)A優(yōu)選具有與未修飾的LPS分子相同數(shù)量的伯酰基鏈，和/或所述脂質(zhì)A在葡糖胺二糖還原端的葡糖胺2位的伯酰基鏈上具有仲?；?，和/或所述LPS為如下LPS，其中所述仲酰基鏈為月桂?；?，和/或所述脂質(zhì)A具有結(jié)合至還原端磷酸酯基團的磷酸乙醇胺，和/或所述脂質(zhì)A具有以下分子結(jié)構(gòu):
[0024]
【權(quán)利要求】
1.無去污劑制備在疫苗中使用的細菌外膜泡囊(OMV)的方法，所述方法包括以下步驟: a)培養(yǎng)革蘭氏陰性細菌群落至靜止生長期； b)在靜止生長期開始后至少約I小時的時間點，在調(diào)節(jié)至或具有高于pH8.0的pH、濃度為約1-1OOmM的金屬螯合劑的培養(yǎng)基中，孵育在a)中獲得的細菌，以提取0MV，所述金屬螯合劑優(yōu)選為EDTA ；以及 c)回收在b)中提取的0MV，其中所述回收至少包括從所述OMV移除所述細菌。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌具有基因修飾，所述基因修飾導(dǎo)致所述細菌產(chǎn)生毒性降低的LPS，但是所述LPS保留至少部分它的佐劑活性；所述基因修飾優(yōu)選為降低或敲除一種或多種基因的表達的修飾，所述一種或多種基因選自IpxLl和lpxL2基因或其同源物和1pxK基因或其同源物，和/或所述基因修飾為引起一種或多種IpxE和/或pagL基因表達的修飾。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中在b)中，將所述細菌在所述培養(yǎng)基中孵育的靜止生長期開始后的所述時間點為約1-9小時，優(yōu)選約2-5小時。
4.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中將所述OMV滅菌，優(yōu)選通過過濾滅菌，優(yōu)選使用具有小于約0.3微米小孔的濾器。
5.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在步驟b)中，優(yōu)選為EDTA的所述金屬螯合劑的濃度為約5-15mM，和/或其中所述pH為約pH7.5_pH9.5，優(yōu)選約pH8.0-pH9.0,更優(yōu)選約pH8.2-pH8.8，更優(yōu)選約 ρΗ8.4_ρΗ8.7。
6.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中a)中培養(yǎng)物的體積和/或b)中培養(yǎng)基的體積至少為約 10L,更優(yōu)選至少為約 20L、40L、60L、80L、100L、200L、300L、400L、500L、800L、1500L、5000L、10, 000L、20, 000L 或 40，OOOL0
7.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌為奈瑟球菌屬(Neisseria)或博德特菌屬(Bordetella)的菌種，優(yōu)選為腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)或百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)。
8.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌具有一種或多種降低或敲除基因產(chǎn)物表達的突變，所述基因產(chǎn)物優(yōu)選選自cps、包括lpxLl、rmpM、porA、porB和opA的脂質(zhì)A生物合成基因產(chǎn)物。
9.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌表達多種porA亞型。
10.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述群落包含多于一種革蘭氏陰性細菌的菌株，并且其中每種菌株表達不同的PorA亞型。
11.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌表達對所述革蘭氏陰性細菌而言外來的抗原。
12.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其還包括將所述OMV與藥學(xué)可接受的賦形劑組合的步驟。
13.0MV，其可通過前述權(quán)利要求中任一項的方法獲得。
14.藥物組合物，其包含權(quán)利要求13的OMV和藥學(xué)可接受的賦形劑。
15.權(quán)利要求13的OMV或權(quán)利要求14的藥物組合物，其用作藥劑，其優(yōu)選在腦膜炎的治療中用作藥劑。
16.在個體中誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法,所述免疫反應(yīng)優(yōu)選針對腦膜炎奈瑟球菌,所述方法包括向所述個體給藥權(quán)利要求13的OMV或權(quán)利要求14的藥物組合物。
17.權(quán)利要求13的OMV或權(quán)利要求14的藥物組合物在個體中誘發(fā)免疫反應(yīng)的用途，所述免疫反應(yīng)優(yōu)選針對腦膜炎奈瑟球菌，所述用途包括向所述個體給藥權(quán)利要求13的OMV或者權(quán)利要求14 的藥物組合物。
【文檔編號】A61P39/04GK103687612SQ201280033688
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月7日
【發(fā)明者】B·范德沃特比姆德, L·A·范德波爾 申請人:由衛(wèi)生福利和體育大臣代表的荷蘭王國