結(jié)合背板膠質(zhì)乙酰酯酶的抗體本申請(qǐng)要求2010年11月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/416,927的權(quán)益，其通過(guò)引用整體并入本文用于任何目的。1.技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及背板膠質(zhì)乙酰酯酶的抗體抑制劑，包含所述抗體抑制劑的組合物及其使用方法。2.發(fā)明背景骨健康取決于形成骨的成骨細(xì)胞和骨再吸收的破骨細(xì)胞的協(xié)調(diào)活性?！肮寝D(zhuǎn)換影響這些同化和異化細(xì)胞功能之間的平衡并確保成熟骨骼在受損時(shí)可自身修復(fù)并且通過(guò)將礦物質(zhì)例如鈣和磷釋放至循環(huán)中維持其內(nèi)分泌功能?！盇llen，J.G等，J.Med.Chem.，53(2010年6月10日)，第4332-4353、4332頁(yè)。許多疾病狀態(tài)改變了這種平衡，導(dǎo)致骨量增加或減少或骨質(zhì)量變化。將骨礦物質(zhì)密度的逐漸流失稱為骨質(zhì)減少；嚴(yán)重的骨質(zhì)流失稱為骨質(zhì)疏松。同上。目前治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)利用二磷酸鹽類口服小分子抗骨吸收劑。同上4333頁(yè)。唑來(lái)膦酸、雷洛昔芬(raloxifene)、鈣和維生素D補(bǔ)充劑也常用于骨質(zhì)疏松治療。同上。雖然抗骨吸收劑可幫助防止骨質(zhì)流失，但是同化劑“能夠更大程度地增加骨量......并且還具有提高骨質(zhì)量和增加骨強(qiáng)度的能力?！盙uo，H.等，J.Med.Chem.，53(2010年2月25日)，第1819-1829、1819頁(yè)。在美國(guó)，人PTH是唯一經(jīng)FDA批準(zhǔn)的同化劑。同上；Allen，第4333頁(yè)?！坝捎谏倭客瘎┛捎糜诠琴|(zhì)疏松治療，所以迫切需要研發(fā)無(wú)毒、有成本效益且易于施用的小分子化合物來(lái)治療這種疾病?！盙uo，第1819頁(yè)?！氨M管與抗骨吸收療法相比，研發(fā)刺激骨形成的藥理學(xué)試劑不很先進(jìn)，但是已知促進(jìn)成骨細(xì)胞功能的幾個(gè)途徑?！盇llen，第4338頁(yè)。這些途徑包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、甲狀旁腺激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和無(wú)翼型MMTV整合位點(diǎn)(WNT)信號(hào)。同上。Guo和同事最近報(bào)道了關(guān)于這些途徑中第一種的結(jié)果。Guo，見(jiàn)上文。具體而言，他們報(bào)道某些經(jīng)取代的苯并噻吩和苯并呋喃化合物增強(qiáng)小鼠和大鼠體內(nèi)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2表達(dá)。據(jù)報(bào)道，這兩種化合物刺激體內(nèi)骨形成和小梁連接性恢復(fù)。同上，第1819頁(yè)。這些途徑中的另一種是牽連于多個(gè)發(fā)育和再生過(guò)程的WNT途徑。Allen，第4340頁(yè)。然而，所述途徑復(fù)雜并且很多關(guān)于它及其組分如何影響骨的信息仍不清楚。例如，已經(jīng)證實(shí)，其突變與人體內(nèi)骨質(zhì)增加相關(guān)的LRP-5和通過(guò)其發(fā)生規(guī)范WNT信號(hào)的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，“可能不通過(guò)WNT信號(hào)與骨量控制直接相關(guān)聯(lián)?！蓖?。最近對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析已使得鑒定了WNT信號(hào)的新靶標(biāo)。見(jiàn)例如Torisu，Y.等CancerSci.，99(6)：1139-11461143(2008)。一個(gè)這樣的靶標(biāo)為背板膠質(zhì)乙酰酯酶，也稱為NOTUM和LOC174111。3.發(fā)明概述在一些實(shí)施方案中，提供了一種結(jié)合人背板膠質(zhì)乙酰酯酶(NOTUM)并中和NOTUM的至少一種活性的單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與選自小鼠NOTUM、豚鼠NOTUM、食蟹猴NOTUM和恒河猴NOTUM的NOTUM結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述抗體具有選自降低體外8-辛酰氧基芘-1，3，6-三磺酸三鈉(OPTS)測(cè)定中的NOTUM活性，和降低體外Wnt信號(hào)測(cè)定中的NOTUM活性的至少一種活性。在一些實(shí)施方案中，所述抗體具有至少一種選自以下的活性：使體內(nèi)血清PINP水平升高，使體內(nèi)骨礦物質(zhì)密度升高，使體內(nèi)股骨中段皮質(zhì)厚度增大，使體內(nèi)股骨中段骨面積增大，使體內(nèi)肱骨中段皮質(zhì)厚度增大，使體內(nèi)內(nèi)皮質(zhì)骨形成增多，使體內(nèi)LV5椎體中皮質(zhì)骨體積的比例增大，和使體內(nèi)股骨頸骨體積與股骨頸總體積的比例增大。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合NOTUM的抗體與具有SEQIDNO：1的氨基酸序列的多肽結(jié)合，KD小于50nM、小于20nM或小于10nM。在一些實(shí)施方案中，所述抗體具有至少一種選自以下的結(jié)合特征：a)與具有SEQIDNO：83的氨基酸序列的多肽結(jié)合，結(jié)合親和力比所述抗體對(duì)具有SEQIDNO：84的氨基酸序列的多肽的結(jié)合親和力強(qiáng)至少5倍；b)與具有SEQIDNO：85的氨基酸序列的多肽結(jié)合，結(jié)合親和力比所述抗體對(duì)具有SEQIDNO：86的氨基酸序列的多肽的結(jié)合親和力強(qiáng)至少5倍；c)與具有SEQIDNO：1的氨基酸序列的多肽結(jié)合，結(jié)合親和力比所述抗體對(duì)具有SEQIDNO：94的氨基酸序列的多肽的結(jié)合親和力強(qiáng)至少5倍；d)與具有SEQIDNO：1的氨基酸序列的多肽結(jié)合，結(jié)合親和力比所述抗體對(duì)具有SEQIDNO：99的氨基酸序列的多肽的結(jié)合親和力強(qiáng)至少5倍；e)與具有SEQIDNO：95的氨基酸序列的多肽結(jié)合，結(jié)合親和力比所述抗體對(duì)具有SEQIDNO：2的氨基酸序列的多肽的結(jié)合親和力強(qiáng)至少5倍；f)與包含具有SEQIDNO：7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NOTUM；g)與包含具有SEQIDNO：15的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NOTUM；h)與包含具有SEQIDNO：23的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NOTUM；i)與包含具有SEQIDNO：31的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：32的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NOTUM；j)與包含具有SEQIDNO：39的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：40的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NOTUM；k)與包含具有SEQIDNO：47的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：48的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NOTUM；和1)與包含具有SEQIDNO：55的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：56的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NOTUM。在一些實(shí)施方案中，所述抗體選自小鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合NOTUM的抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包含至少一個(gè)選自以下的CDR：a)包含選自SEQIDNO：9、17、25、33、41、49和90的氨基酸序列的CDR1；b)包含選自SEQIDNO：10、18、26、34、42和50的氨基酸序列的CDR2；和c)包含選自SEQIDNO：11、19、27、35、43、51和91的氨基酸序列的CDR3。在一些實(shí)施方案中，所述重鏈包含含CDR1、CDR2和CDR3的集合，其中所述集合選自：a)包含具有SEQIDNO：9的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：10的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：11的氨基酸序列的CDR3的集合；b)包含具有SEQIDNO：90的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：18的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：91的氨基酸序列的CDR3的集合；c)包含具有SEQIDNO：17的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：18的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：19的氨基酸序列的CDR3的集合；d)包含具有SEQIDNO：90的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：26的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：27的氨基酸序列的CDR3的集合；e)包含具有SEQIDNO：25的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：26的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：27的氨基酸序列的CDR3的集合；f)包含具有SEQIDNO：90的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：34的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：91的氨基酸序列的CDR3的集合；g)包含具有SEQIDNO：33的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：34的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：35的氨基酸序列的CDR3的集合；h)包含具有SEQIDNO：41的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：42的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：43的氨基酸序列的CDR3的集合；i)包含具有SEQIDNO：49的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：50的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：51的氨基酸序列的CDR3的集合；和j)包含具有SEQIDNO：57的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：58的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：59的氨基酸序列的CDR3的集合。在一些實(shí)施方案中，所述重鏈包含含選自SEQIDNO：7、15、23、31、39、47、63、67、71、75和79的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合NOTUM的抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述輕鏈包含至少一個(gè)選自以下的CDR：a)包含選自SEQIDNO：12、20、28、36、44、52和92的氨基酸序列的CDR1；b)包含選自SEQIDNO：13、21、29、37、45、53、61和93的氨基酸序列的CDR2；和c)包含選自SEQIDNO：14、22、30、38、46、54和62的氨基酸序列的CDR3。在一些實(shí)施方案中，所述輕鏈包含含CDR1、CDR2和CDR3的集合，其中所述集合選自：a)包含具有SEQIDNO：12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：14的氨基酸序列的CDR3的集合；b)包含具有SEQIDNO：92的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：93的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：22的氨基酸序列的CDR3的集合；c)包含具有SEQIDNO：20的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：21的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：22的氨基酸序列的CDR3的集合；d)包含具有SEQIDNO：92的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：93的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：30的氨基酸序列的CDR3的集合；e)包含具有SEQIDNO：28的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：29的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：30的氨基酸序列的CDR3的集合；f)包含具有SEQIDNO：92的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：93的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：38的氨基酸序列的CDR3的集合；g)包含具有SEQIDNO：36的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：37的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：38的氨基酸序列的CDR3的集合；h)包含具有SEQIDNO：44的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：45的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：46的氨基酸序列的CDR3的集合；i)包含具有SEQIDNO：52的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：53的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：54的氨基酸序列的CDR3的集合；和j)包含具有SEQIDNO：60的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDNO：61的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：62的氨基酸序列的CDR3的集合。在一些實(shí)施方案中，所述輕鏈包含含選自SEQIDNO：8、16、24、32、40、48、56、65、69、73、77和81的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合NOTUM的抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中：a)所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：9的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：10的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：11的氨基酸序列的CDR3，并且其中所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：12的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：14的氨基酸序列的CDR3；或b)所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：90的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：18的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：91的氨基酸序列的CDR3，并且其中所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：92的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：93的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：22的氨基酸序列的CDR3；或c)所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：17的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：18的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：19的氨基酸序列的CDR3，并且其中所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：20的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：21的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：22的氨基酸序列的CDR3；或d)所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：90的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：26的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：27的氨基酸序列的CDR3，并且其中所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：92的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：93的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：30的氨基酸序列的CDR3；或e)所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：25的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：26的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：27的氨基酸序列的CDR3，并且其中所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：28的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：29的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：30的氨基酸序列的CDR3；或f)所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：90的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：34的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：91的氨基酸序列的CDR3，并且其中所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：92的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：93的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：38的氨基酸序列的CDR3；或g)所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：33的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：34的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：35的氨基酸序列的CDR3，并且其中所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：36的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：37的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：38的氨基酸序列的CDR3；或h)所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：41的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：42的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：43的氨基酸序列的CDR3，并且其中所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：44的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：45的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：46的氨基酸序列的CDR3；或i)所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：49的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：50的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：51的氨基酸序列的CDR3，并且其中所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：52的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：53的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：54的氨基酸序列的CDR3；或j)所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：57的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：58的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：59的氨基酸序列的CDR3，并且其中所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQIDNO：60的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：61的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：62的氨基酸序列的CDR3。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合NOTUM的抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中：a)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：7的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：8的氨基酸序列；或b)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：15的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：16的氨基酸序列；或c)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：71的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：73的氨基酸序列；或d)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：72的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：74的氨基酸序列；或e)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：23的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：24的氨基酸序列；或f)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：75的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：77的氨基酸序列；或g)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：76的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：78的氨基酸序列；或h)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：31的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：32的氨基酸序列；或i)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：79的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列；或j)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：80的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列；或k)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：39的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：40的氨基酸序列；或1)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：67的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：69的氨基酸序列；或m)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：68的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：70的氨基酸序列；或n)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：47的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：48的氨基酸序列；或o)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：55的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：56的氨基酸序列；或p)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：63的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：65的氨基酸序列；或q)所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：64的氨基酸序列并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：66的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，提供了一種核酸分子，其包含編碼結(jié)合NOTUM并中和NOTUM的至少一種活性的抗體的重鏈或輕鏈的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子包含編碼所述重鏈的第一多核苷酸序列和編碼所述輕鏈的第二多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子為載體。在一些實(shí)施方案中，提供了一種包含核酸分子的宿主細(xì)胞，所述核酸分子包含編碼結(jié)合NOTUM并中和NOTUM的至少一種活性的抗體的重鏈或輕鏈的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，提供了一種包含核酸分子的宿主細(xì)胞，所述核酸分子包含編碼重鏈的第一多核苷酸序列和編碼輕鏈的第二多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含含編碼重鏈的多核苷酸序列的第一核酸分子和含編碼輕鏈的多核苷酸序列的第二核酸分子。在一些實(shí)施方案中，提供了生成結(jié)合NOTUM并中和NOTUM的至少一種活性的抗體的方法，包括在足以表達(dá)所述抗體的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，提供了一種包含結(jié)合NOTUM并中和NOTUM的至少一種活性的抗體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，提供了一種刺激患者體內(nèi)內(nèi)皮質(zhì)骨形成的方法，包括施用有效量的所述藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，提供了一種治療、管理或預(yù)防特征在于患者體內(nèi)骨質(zhì)流失的疾病或病癥的方法，包括施用有效量的所述藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述疾病或病癥為骨質(zhì)疏松。在一些實(shí)施方案中，提供了一種包含所述藥物組合物的單一單位劑型。4.附圖簡(jiǎn)述圖1提供了NOTUM純合子敲除小鼠(“HOM”)及其野生型同窩小鼠(“WT”)體內(nèi)不同骨部位的皮質(zhì)厚度之間差異的圖示。圖2提供了在NOTUM純合子和雜合子(“HET”)敲除小鼠體內(nèi)觀察到的皮質(zhì)骨厚度與其野生型同窩小鼠相比增加的圖示。圖3提供了由對(duì)雄性NOTUM純合子和雜合子敲除小鼠及其野生型同窩小鼠進(jìn)行的股骨斷裂強(qiáng)度和脊柱壓縮試驗(yàn)獲得的結(jié)果的圖示。圖4提供了由對(duì)雌性NOTUM純合子和雜合子敲除小鼠及其野生型同窩小鼠進(jìn)行的股骨斷裂強(qiáng)度和脊柱壓縮試驗(yàn)獲得的結(jié)果的圖示。圖5提供了某些人/小鼠嵌合蛋白的圖示，并指出了Bin1中似乎牽涉于結(jié)合NOTUM中和抗體的區(qū)域，如實(shí)施例6.7所述。圖6提供了如實(shí)施例6.9.1所述，MAb2.1029或MAb2.78施用8周后在小鼠體內(nèi)獲得的股骨中段皮質(zhì)厚度測(cè)量的圖示。圖7提供了如實(shí)施例6.9.2所述，不同劑量的MAb2.1029施用4周后在小鼠體內(nèi)獲得的股骨中段皮質(zhì)厚度測(cè)量的圖示。圖8提供了如實(shí)施例6.9.3所述，不同劑量的MAb2.78b施用4周后在小鼠體內(nèi)獲得的股骨中段皮質(zhì)厚度測(cè)量的圖示。圖8A示出了3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg劑量的MAb2.78b。圖8B示出了0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg劑量的MAb2.78b。圖9提供了如實(shí)施例6.9.4所述，用和未用唑來(lái)膦酸鹽預(yù)處理，MAb2.78b施用4周后在小鼠體內(nèi)獲得的股骨中段皮質(zhì)厚度測(cè)量(A)和血清PINP水平(B)的圖示。圖10提供了如實(shí)施例6.9.5所述，MAb2.78a施用4周后在小鼠體內(nèi)獲得的股骨中段皮質(zhì)厚度測(cè)量的圖示。圖11提供了如實(shí)施例6.9.6所述，MAb2.78a施用12周后在小鼠體內(nèi)獲得的股骨中段皮質(zhì)厚度測(cè)量(A)和肱骨中段皮質(zhì)厚度測(cè)量(B)的圖示。圖12提供了如實(shí)施例6.9.6所述，MAb2.78a施用24周后在小鼠體內(nèi)獲得的股骨中段皮質(zhì)厚度測(cè)量(A)、肱骨中段皮質(zhì)厚度測(cè)量(B)和第九肋皮質(zhì)厚度(C)的圖示。圖13提供了如實(shí)施例6.10.3所述，施用了NOTUM中和抗體2.78b或?qū)φ湛贵w的假手術(shù)和去卵巢小鼠體內(nèi)股骨中段皮質(zhì)厚度(A)和股骨中段礦化骨面積(B)的圖示。圖14提供了如實(shí)施例6.10.3所述，施用了NOTUM中和抗體2.78b或?qū)φ湛贵w的假手術(shù)和去卵巢小鼠體內(nèi)LV5椎體中骨體積與總體積的比例(A)、LV5椎體中皮質(zhì)骨體積與總體積的比例(B)和LV5椎體中小梁骨體積與總體積的比例(C)。圖15提供了如實(shí)施例6.10.3所述，施用了NOTUM中和抗體2.78b或?qū)φ湛贵w的假手術(shù)和去卵巢小鼠體內(nèi)股骨頸骨體積與總體積的比例的圖示。圖16提供了如實(shí)施例6.10.4所述，施用了NOTUM中和抗體2.78b或?qū)φ湛贵w的假手術(shù)和去卵巢小鼠體內(nèi)標(biāo)記了鈣黃綠素(calcein)、茜素(alizarin)和四環(huán)素(tetracycline)的股骨中段橫截面的內(nèi)皮質(zhì)表面百分比的圖示。圖17提供了如實(shí)施例6.10.4所述，施用了NOTUM中和抗體2.78b或?qū)φ湛贵w的假手術(shù)和去卵巢小鼠體內(nèi)礦化沉積速率(A)和體積所指的骨形成率(B)。5.發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)抑制NOTUM可影響內(nèi)皮質(zhì)骨形成。本發(fā)明的特殊方面基于對(duì)缺乏功能NOTUM基因的小鼠(“敲除小鼠”)的研究，抑制NOTUM的抗體的研發(fā)和此類抗體可用于刺激小鼠和大鼠體內(nèi)的皮質(zhì)骨形成的發(fā)現(xiàn)。本文使用的章節(jié)標(biāo)題僅僅是為了組織目的而不得解釋為限制所述主題。本申請(qǐng)引用的所有文件或文件的一部分，包括專利、專利申請(qǐng)、論文、書(shū)籍和論述據(jù)此明確通過(guò)引用整體并入用于任何目的。如果一個(gè)或多個(gè)并入的文獻(xiàn)和類似材料定義的術(shù)語(yǔ)同本申請(qǐng)中術(shù)語(yǔ)的定義矛盾，以本申請(qǐng)為準(zhǔn)。5.1.定義如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“抗體”指完整抗體或與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)抗原結(jié)合的抗體片段?？贵w片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、雙鏈抗體和保持完整抗體可變區(qū)的至少一部分的其它抗體片段。見(jiàn)，例如，Hudson等(2003)Nat.Med.9：129-134。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)酶或化學(xué)切割完整抗體生成抗體片段。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)重組DNA技術(shù)生成抗體片段。術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合位點(diǎn)”指抗體能夠特異性結(jié)合抗原的部分。在一些實(shí)施方案中，由一個(gè)或多個(gè)抗體可變區(qū)提供抗原結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合親和力”指對(duì)抗體與抗原結(jié)合的強(qiáng)度的定性或定量測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合親和力是抗體對(duì)抗原的解離常數(shù)(KD)。在一些實(shí)施方案中，定性測(cè)定抗體對(duì)抗原的結(jié)合親和力，例如相對(duì)于不同抗體對(duì)抗原的結(jié)合親和力，或相對(duì)于相同抗體對(duì)不同抗原(例如其氨基酸序列中有一處或多處變化的抗原)的結(jié)合親和力。例如，當(dāng)抗體對(duì)第一抗原的KD小于抗體對(duì)第二抗原的KD時(shí)，認(rèn)為抗體對(duì)第一抗原的結(jié)合親和力比它對(duì)第二抗原的親和力“更強(qiáng)”。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)抗體對(duì)第一抗原的KD比抗體對(duì)第二抗原的KD小至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍時(shí)，認(rèn)為抗體對(duì)第一抗原的結(jié)合親和力“更強(qiáng)”。相反，例如當(dāng)抗體對(duì)第一抗原的KD大于抗體對(duì)第二抗原的KD時(shí)，認(rèn)為抗體對(duì)第一抗原的結(jié)合親和力比它對(duì)第二抗原的親和力“更弱”。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)抗體對(duì)第一抗原的KD比抗體對(duì)第二抗原的KD大至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍時(shí)，認(rèn)為抗體對(duì)第一抗原的結(jié)合親和力“更弱”?！扒逗稀笨贵w指由來(lái)自至少兩個(gè)不同來(lái)源的組分構(gòu)成的抗體。在一些實(shí)施方案中，嵌合抗體包含源自第一物種，與另一分子(例如源自第二物種的抗體部分)融合的抗體部分。在一些此類實(shí)施方案中，嵌合抗體包含源自非人類動(dòng)物，與源自人類的抗體部分融合的抗體部分。在一些此類實(shí)施方案中，嵌合抗體包含源自非人類動(dòng)物，與源自人類的抗體的恒定區(qū)融合的抗體的整個(gè)或一部分可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)“表位”指能夠與免疫球蛋白或T細(xì)胞受體特異性結(jié)合的任何多肽決定簇。在一些實(shí)施方案中，表位是抗體特異性結(jié)合的抗原區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，表位可包括化學(xué)活性表面類的分子，例如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；Ｔ谝恍?shí)施方案中，表位可可具有特定三維結(jié)構(gòu)特征(例如，“構(gòu)象”表位)和/或特定電荷特征。如果特殊抗體與兩個(gè)表位特異性結(jié)合，則將一個(gè)表位定義為與另一表位“相同”。在一些實(shí)施方案中，具有不同一級(jí)氨基酸序列的多肽可包含相同的表位。據(jù)稱如果不同抗體競(jìng)爭(zhēng)與該表位特異性結(jié)合，則它們與相同表位結(jié)合。參考多肽的“片段”指來(lái)自參考多肽的任一部分的相鄰段氨基酸。片段可具有小于參考多肽長(zhǎng)度的任何長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，片段為來(lái)自具有特殊活性或含有特殊表位的參考多肽的任一部分的相鄰段氨基酸。術(shù)語(yǔ)“人抗體”指含有人抗體序列而不含來(lái)自非人類動(dòng)物的抗體序列的單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，人抗體可含有在天然抗體中不存在的合成序列。術(shù)語(yǔ)不受制備抗體的方式限制。例如，在各個(gè)實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，通過(guò)噬菌體展示、人B-淋巴細(xì)胞或重組法制備人抗體?！叭嗽椿笨贵w指已經(jīng)修飾，以致其更加嚴(yán)密地匹配(氨基酸序列)人抗體的非人抗體。因此人源化抗體是一類嵌合抗體。在一些實(shí)施方案中，修飾了非人抗體可變區(qū)的抗原結(jié)合殘基外面的氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)用來(lái)自具有所需抗原結(jié)合特異性的另一抗體(例如非人抗體)的一個(gè)或多個(gè)CDR的全部或一部分置換人抗體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的全部或一部分構(gòu)建人源化抗體。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體包含其中全部或大體上全部CDR與非人抗體的CDR相對(duì)應(yīng)并且全部或大體上全部骨架區(qū)(FR)與人抗體的FR相對(duì)應(yīng)的可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，在人源化抗體中，例如通過(guò)親和力成熟過(guò)程改變了非人抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在本領(lǐng)域中已知親和力成熟的示例性方法。在一些此類實(shí)施方案中，人源化抗體進(jìn)一步包含人抗體的恒定區(qū)(Fc)。除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“包括(include)”具有與“包括但不限于”相同的含義，術(shù)語(yǔ)“包括(includes)”具有與“包括但不限于”相同的含義，并且術(shù)語(yǔ)“包括(including)”具有與“包括但不限于”相同的含義。類似地，術(shù)語(yǔ)“例如”具有與“例如但不限于”相同的含義。除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“管理(manage)”、“管理(managing)”和“管理(management)”涵蓋防止已經(jīng)患有疾病或病癥的患者指定疾病或病癥復(fù)發(fā)，和/或延長(zhǎng)已經(jīng)患有疾病或病癥的患者保持緩解的時(shí)間。所述術(shù)語(yǔ)涵蓋調(diào)節(jié)所述疾病或病癥的閾值、發(fā)展和/或持續(xù)時(shí)間，或改變患者對(duì)疾病或病癥響應(yīng)的方式。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指來(lái)自與相同表位特異性結(jié)合的大體同種抗體種群的抗體。在一些實(shí)施方案中，雜交瘤分泌單克隆抗體。在一些此類實(shí)施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相同方法生成雜交瘤。見(jiàn)，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature256：495-499。在一些實(shí)施方案中，使用重組DNA方法生成單克隆抗體(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.4,816,567)。在一些實(shí)施方案中，單克隆抗體指從噬菌體展示庫(kù)分離的抗體片段。見(jiàn)，例如，Clackson等(1991)Nature352：624-628，和Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597。各種其它單克隆抗體生成技術(shù)，見(jiàn)，(例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies：ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)。術(shù)語(yǔ)“中和抗體”或“中和的抗體”指降低包含抗體特異性結(jié)合的表位的多肽的至少一種活性的抗體。在一些實(shí)施方案中，中和抗體降低了體外和/或體內(nèi)多肽的活性。除非另外說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“NOTUM”指具有來(lái)自任何脊椎動(dòng)物或哺乳動(dòng)物來(lái)源，包括人、牛、雞、嚙齒動(dòng)物、小鼠、大鼠、豬、綿羊、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、猴子和豚鼠的氨基酸序列的背板膠質(zhì)乙酰酯酶。術(shù)語(yǔ)還指維持了天然NOTUM的至少一種體內(nèi)或體外活性的天然NOTUM的片段和變體。術(shù)語(yǔ)涵蓋未加工的全長(zhǎng)前體形式的NOTUM以及由翻譯后切割信號(hào)肽和其它形式的蛋白酶加工產(chǎn)生的成熟形式。在一些實(shí)施方案中，未加工的全長(zhǎng)人NOTUM具有SEQIDNO：1中示出的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，未加工的全長(zhǎng)小鼠NOTUM具有SEQIDNO：2中示出的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可交換用于指氨基酸殘基的聚合物。術(shù)語(yǔ)適用于含自然存在的氨基酸的氨基酸聚合物以及其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)自然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可具有任何長(zhǎng)度。術(shù)語(yǔ)“天然多肽”指自然存在的多肽。除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防(prevent)”、“預(yù)防(preventing)”和“預(yù)防(prevention)”考慮了在患者開(kāi)始患指定疾病或病癥之前產(chǎn)生的抑制或降低所述疾病或病癥的嚴(yán)重程度的作用。換言之，術(shù)語(yǔ)涵蓋預(yù)防。除非另外說(shuō)明，化合物的“預(yù)防有效量”是足以預(yù)防疾病或病狀，或與所述疾病或病狀相關(guān)的一種或多種癥狀，或防止其復(fù)發(fā)的量。化合物的“預(yù)防有效量”指單獨(dú)或與其它試劑組合的治療劑，在疾病預(yù)防中提供預(yù)防利益的量。術(shù)語(yǔ)“預(yù)防有效量”可涵蓋改善整體預(yù)防或增強(qiáng)另一種預(yù)防劑的預(yù)防功效的量。當(dāng)優(yōu)先識(shí)別蛋白質(zhì)和/或大分子的復(fù)合混合物中的抗原時(shí)，抗體“特異性結(jié)合”抗原。在一些實(shí)施方案中，抗體包含與特殊表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一些此類實(shí)施方案中，抗體能夠結(jié)合不同抗原，只要不同抗原包含所述特殊表位。在一些情況下，例如，來(lái)自不同物種的同源蛋白質(zhì)可包含相同表位。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)解離常數(shù)(KD)≤1μM時(shí)，在一些實(shí)施方案中，當(dāng)解離常數(shù)≤100nM時(shí)，和在一些實(shí)施方案中，當(dāng)解離常數(shù)≤10nM時(shí)，稱抗體特異性結(jié)合抗原。術(shù)語(yǔ)“受試者”和“患者”包括人和動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，受試者或患者為哺乳動(dòng)物。在一些此類實(shí)施方案中，受試者或患者為人。除非另外說(shuō)明，否則化合物的“治療有效量”是足以在疾病或病狀的治療或管理中提供治療利益，或延遲或?qū)⑴c所述疾病或病狀相關(guān)的一種或多種癥狀減到最低程度的量。化合物的“治療有效量”指單獨(dú)或與其它療法組合的治療劑，在所述疾病或病狀的治療或管理中提供了治療利益的量。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”可涵蓋改善整體療法，減少或避免疾病或病狀的癥狀或病因，或增強(qiáng)另一種治療劑的治療功效的量。除非另外說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“治療(treat)”、治療(treating)”和治療(treatment)”考慮了在患者患指定疾病或病癥同時(shí)產(chǎn)生的降低所述疾病或病癥的嚴(yán)重程度，或阻礙或減緩所述疾病或病癥的進(jìn)展的作用。5.2.抗體5.2.1.示例性抗體結(jié)構(gòu)天然抗體通常具有四聚體結(jié)構(gòu)。四聚物通常包含兩對(duì)相同的多肽鏈，每一對(duì)具有一條輕鏈(在一些實(shí)施方案中，約25kDa)和一條重鏈(在一些實(shí)施方案中，約50-70kDa)。在天然抗體中，重鏈包含1個(gè)可變區(qū)VH和3個(gè)恒定區(qū)CH1、CH2和CH3。VH結(jié)構(gòu)域在重鏈的氨基末端，而CH3結(jié)構(gòu)域在羧基末端。在天然抗體中，輕鏈包含1個(gè)可變區(qū)VL和1個(gè)恒定區(qū)CL。輕鏈的可變區(qū)在輕鏈的氨基末端。在天然抗體中，每個(gè)輕/重鏈對(duì)的可變區(qū)通常形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。恒定區(qū)通常負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能。通常將天然人輕鏈分類為κ和λ輕鏈。通常將天然人重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，并且將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有亞類，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亞類，包括IgM1和IgM2。IgA具有亞類，包括IgA1和IgA2。在天然人輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)通常通過(guò)約12個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“J”區(qū)域連接，重鏈還包括約10個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“D”區(qū)域。見(jiàn)，例如，F(xiàn)undamentalImmunology(1989)Ch.7(Paul，W.編輯，第2版RavenPress，N.Y.)。在天然抗體中，可變區(qū)通常展現(xiàn)出相同通用結(jié)構(gòu)，其中相對(duì)保守的骨架區(qū)(FR)通過(guò)3個(gè)也稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)連接。來(lái)自每一對(duì)的兩條鏈的CDR通常與骨架區(qū)對(duì)齊，其可能使得能夠與特定表位結(jié)合。從N端到C端，輕鏈和重鏈可變區(qū)通常包含結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈上的CDR稱為H1、H2和H3，而輕鏈上的CDR稱為L(zhǎng)1、L2和L3。通常，CDR3是抗原結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)分子多樣性的最大來(lái)源。例如，在某些情況下，H3可短至2個(gè)氨基酸殘基或大于26個(gè)。通常根據(jù)Kabat等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth，PublicationNo.91-3242，第1-3卷，Bethesda，MD)；Chothia，C.和Lesk，A.M.(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；或Chothia，C.等Nature342：878-883(1989)的定義為每個(gè)結(jié)構(gòu)域分配氨基酸。在本申請(qǐng)中，除非另外說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“CDR”指來(lái)自輕鏈或重鏈的CDR?！癋ab”片段包含一條輕鏈和一條重鏈的CH1和可變區(qū)。Fab分子的重鏈不可與另一個(gè)重鏈分子形成二硫鍵?！癋ab’”片段包含一條輕鏈和包含在CH1和CH2結(jié)構(gòu)域之間延伸的另外恒定區(qū)的重鏈。可在Fab’片段的2條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成“F(ab’)2”分子?！癋v”片段包含來(lái)自重鏈和輕鏈的可變區(qū)，但是缺乏恒定區(qū)。單鏈Fv(scFv)片段包含通過(guò)撓性連接子連接形成具有抗原結(jié)合區(qū)的多肽單鏈的重鏈和輕鏈可變區(qū)。在WO88/01649和美國(guó)專利No.4,946,778和5,260,203中詳細(xì)討論了示例性單鏈抗體。在某些情況下，單一可變區(qū)(即，重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū))可具有識(shí)別并結(jié)合抗原的能力。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“重鏈”指包含單獨(dú)或與輕鏈組合的足夠重鏈可變區(qū)序列以賦予抗原特異性的多肽。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“輕鏈”指包含單獨(dú)或與重鏈組合的足夠輕鏈可變區(qū)序列以賦予抗原特異性的多肽。5.2.2.示例性抗體在一些實(shí)施方案中，提供了與NOTUM特異性結(jié)合的單克隆抗體。在一些此類實(shí)施方案中，單克隆抗體為降低體內(nèi)和/或體外NOTUM的至少一種活性的中和抗體。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的中和抗體降低了體外8-辛酰氧基芘-1，3，6-三磺酸三鈉(OPTS)測(cè)定中的NOTUM活性。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的中和抗體降低了體外Wnt信號(hào)測(cè)定中的NOTUM活性。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)向受試者施用足夠量和足夠持續(xù)時(shí)間，抗NOTUM的中和抗體使體內(nèi)血清PINP水平升高。本文討論了施用足夠量足夠持續(xù)時(shí)間的示例性劑量和給藥方案。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的中和抗體使骨礦物質(zhì)密度升高。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的中和抗體使體內(nèi)股骨中段皮質(zhì)厚度增大。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的中和抗體使體內(nèi)股骨中段骨面積增大。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的中和抗體使體內(nèi)肱骨中段皮質(zhì)厚度增大。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的中和抗體使體內(nèi)內(nèi)皮質(zhì)骨形成增多。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的中和抗體使體內(nèi)LV5椎體中皮質(zhì)骨體積的比例增大。用“LV5椎體中皮質(zhì)骨體積的比例”指LV5椎體的皮質(zhì)骨體積與總體積的比例。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的中和抗體使體內(nèi)股骨頸骨體積與股骨頸總體積的比例增大。在一些實(shí)施方案中，提供了與小鼠NOTUM特異性結(jié)合的中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了與人NOTUM特異性結(jié)合的中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了與人NOTUM的Q47到M177的區(qū)域結(jié)合的中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了依賴于人NOTUM的Q47到M177的區(qū)域進(jìn)行結(jié)合的中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了與來(lái)自不同物種的NOTUM的相同區(qū)域特異性結(jié)合的中和抗體(即，證明交叉反應(yīng)性的抗體)。在一些實(shí)施方案中，提供了與人NOTUM和來(lái)自至少一個(gè)選自以下的物種的NOTUM結(jié)合的中和抗體：小鼠、大鼠、豚鼠、食蟹猴、狨猴和恒河猴。在一些此類實(shí)施方案中，所述抗體與非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物NOTUM和人NOTUM特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與小鼠NOTUM和人NOTUM特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，提供了與人NOTUM的Q47到M177的區(qū)域結(jié)合的中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了依賴于人NOTUM的Q47到M177的區(qū)域進(jìn)行結(jié)合的中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了與人-小鼠嵌合NOTUM(SEQIDNO：83)結(jié)合的NOTUM中和抗體，親和力比對(duì)小鼠-人嵌合NOTUM(SEQIDNO：84)的親和力強(qiáng)至少5倍、至少10倍或至少20倍。在一些實(shí)施方案中，提供了與人-小鼠-人嵌合NOTUM(SEQIDNO：85)結(jié)合的NOTUM中和抗體，親和力比對(duì)小鼠-人-小鼠嵌合NOTUM(SEQIDNO：86)的親和力強(qiáng)至少5倍、至少10倍或至少20倍。在一些實(shí)施方案中，提供了與人NOTUM(SEQIDNO：1)結(jié)合的NOTUM中和抗體，親和力比對(duì)NOTUMD141S(SEQIDNO：94)的親和力強(qiáng)至少5倍、至少10倍或至少20倍。在一些實(shí)施方案中，提供了與小鼠NOTUM(SEQIDNO：95)結(jié)合的NOTUM中和抗體，親和力比對(duì)小鼠NOTUM(SEQIDNO：2)的親和力強(qiáng)至少5倍、至少10倍或至少20倍。在一些實(shí)施方案中，提供了與人NOTUM(SEQIDNO：1)結(jié)合的NOTUM中和抗體，親和力比對(duì)人NOTUMR144A/R145A(SEQIDNO：99)的親和力強(qiáng)至少5倍、至少10倍或至少20倍。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的中和抗體與人NOTUM(SEQIDNO：1)結(jié)合，如實(shí)施例6.8中所述測(cè)定，親和力(KD)小于100nM、小于50nM、小于40nM、小于30nM、小于25nM、小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于5nM、小于3nM或小于2nM。在一些實(shí)施方案中，如實(shí)施例6.4.1中所述測(cè)定，抗NOTUM的中和抗體在OPTS測(cè)定中的IC50小于100nM、小于75nM、小于50nM、小于40nM、小于30nM、小于25nM、小于20nM、小于15nM或小于10nM。在一些實(shí)施方案中，如實(shí)施例6.4.2中所述測(cè)定，抗NOTUM的中和抗體在Wnt信號(hào)測(cè)定中的IC50小于100nM、小于75nM、小于50nM、小于40nM、小于30nM、小于25nM、小于20nM、小于15nM或小于10nM。在一些實(shí)施方案中，所述IC50是對(duì)于人NOTUM而言。在一些實(shí)施方案中，所述IC50是對(duì)于小鼠NOTUM而言。在一些實(shí)施方案中，中和抗體為非人單克隆抗體。在一些此類實(shí)施方案中，中和抗體為嚙齒動(dòng)物單克隆抗體。在一些此類實(shí)施方案中，中和抗體為小鼠單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，中和抗體為嵌合單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，中和抗體為人源化單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，中和抗體為人單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，嵌合、人源化和/或人單克隆抗體在人類中用作治療性抗體。在一些實(shí)施方案中，中和抗體為抗體片段。示例性抗體片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、雙鏈抗體等。非限制示例性NOTUM中和抗體包括MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55和2.78。MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55和2.78的每一種中和NOTUM的至少一種活性。進(jìn)一步地，至少M(fèi)Ab1.802、1.815、1.846和2.78依賴于人NOTUM的界限為氨基酸Q47-M177的區(qū)域的至少一部分與NOTUM結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體與選自MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55和2.78的至少一種抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NOTUM。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體結(jié)合與選自MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55和2.78的至少一種抗體結(jié)合的表位至少部分重疊的NOTUM表位。另外，在一些實(shí)施方案中，預(yù)計(jì)與選自MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55和2.78的至少一種抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NOTUM的抗體為NOTUM中和抗體。以下第7節(jié)中示出了MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55和2.78的CDR和可變區(qū)的序列。在一些實(shí)施方案中，提供了與MAb1.731結(jié)合的相同表位結(jié)合的NOTUM中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了與MAb1.802結(jié)合的相同表位結(jié)合的NOTUM中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了與MAb1.815結(jié)合的相同表位結(jié)合的NOTUM中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了與MAb1.846結(jié)合的相同表位結(jié)合的NOTUM中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了與MAb2.1029結(jié)合的相同表位結(jié)合的NOTUM中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了與MAb2.55結(jié)合的相同表位結(jié)合的NOTUM中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了與MAb2.78結(jié)合的相同表位結(jié)合的NOTUM中和抗體。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含選自SEQIDNO：7、15、23、31、39和47的重鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含選自SEQIDNO：8、16、24、32、40和48的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含具有SEQIDNO：7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含具有SEQIDNO：15的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含具有SEQIDNO：23的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含具有SEQIDNO：31的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：32的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含具有SEQIDNO：39的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：40的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含具有SEQIDNO：47的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO：48的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含選自SEQIDNO：9、17、25、33、41、49和90的重鏈CDR1。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含選自SEQIDNO：10、18、26、34、42和50的重鏈CDR2。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含選自SEQIDNO：11、19、27、35、43、51和91的重鏈CDR3。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：9的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：10的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：11的氨基酸序列的CDR3的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有選自SEQIDNO：17和90的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：18的氨基酸序列的CDR2和具有選自SEQIDNO：19和91的氨基酸序列的CDR3的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：17的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：18的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：19的氨基酸序列的CDR3的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有選自SEQIDNO：25和90的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：26的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：27的氨基酸序列的CDR3的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：25的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：26的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：27的氨基酸序列的CDR3的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有選自SEQIDNO：33和90的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：34的氨基酸序列的CDR2和具有選自SEQIDNO：35和91的氨基酸序列的CDR3的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：33的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：34的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：35的氨基酸序列的CDR3的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：41的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：42的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：43的氨基酸序列的CDR3的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：49的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：50的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：51的氨基酸序列的CDR3的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：57的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：58的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：59的氨基酸序列的CDR3的重鏈。在一些實(shí)施方案中，SEQIDNO：90中的X1選自Y和F。在一些實(shí)施方案中，SEQIDNO：91中的X2選自H和N。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含選自SEQIDNO：12、20、28、36、44、52、60和92的輕鏈CDR1。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含選自SEQIDNO：13、21、29、37、45、53、61和93的輕鏈CDR2。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含選自SEQIDNO：14、22、30、38、46、54和62的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：12的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：14的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有選自SEQIDNO：20和92的氨基酸序列的CDR1，具有選自SEQIDNO：21和93的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：22的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：20的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：21的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：22的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有選自SEQIDNO：28和92的氨基酸序列的CDR1，具有選自SEQIDNO：29和93的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：30的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：28的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：29的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：30的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有選自SEQIDNO：36和92的氨基酸序列的CDR1，具有選自SEQIDNO：37和93的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：38的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：36的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：37的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：38的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：44的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：45的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：46的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：52的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：53的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：54的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：60的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：61的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：62的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，SEQIDNO：92中的X3選自I和S；SEQIDNO：92中的X4選自T和E；并且SEQIDNO：92中的X5選自M和I。在一些實(shí)施方案中，SEQIDNO：93中的X6選自D和N。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：9的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：10的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：11的氨基酸序列的CDR3的重鏈；和含具有SEQIDNO：12的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：14的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有選自SEQIDNO：17和90的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：18的氨基酸序列的CDR2和具有選自SEQIDNO：19和91的氨基酸序列的CDR3的重鏈；和含具有選自SEQIDNO：20和92的氨基酸序列的CDR1，具有選自SEQIDNO：21和93的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：22的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：17的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：18的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：19的氨基酸序列的CDR3的重鏈；和含具有SEQIDNO：20的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：21的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：22的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有選自SEQIDNO：25和90的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：26的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：27的氨基酸序列的CDR3的重鏈；和含具有選自SEQIDNO：28和92的氨基酸序列的CDR1，具有選自SEQIDNO：29和93的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：30的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：25的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：26的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：27的氨基酸序列的CDR3的重鏈；和含具有SEQIDNO：28的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：29的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：30的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有選自SEQIDNO：33和90的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：34的氨基酸序列的CDR2和具有選自SEQIDNO：35和91的氨基酸序列的CDR3的重鏈；和含具有選自SEQIDNO：36和92的氨基酸序列的CDR1，具有選自SEQIDNO：37和93的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：38的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：33的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：34的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：35的氨基酸序列的CDR3的重鏈；和含具有SEQIDNO：36的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：37的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：38的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：41的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：42的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：43的氨基酸序列的CDR3的重鏈；和含具有SEQIDNO：44的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：45的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：46的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：49的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：50的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：51的氨基酸序列的CDR3的重鏈；和含具有SEQIDNO：52的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：53的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：54的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含具有SEQIDNO：57的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：58的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：59的氨基酸序列的CDR3的重鏈；和含具有SEQIDNO：60的氨基酸序列的CDR1，具有SEQIDNO：61的氨基酸序列的CDR2和具有SEQIDNO：62的氨基酸序列的CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，SEQIDNO：90中的X1選自Y和F。在一些實(shí)施方案中，SEQIDNO：91中的X2選自H和N。在一些實(shí)施方案中，SEQIDNO：92中的X3選自I和S；SEQIDNO：92中的X4選自T和E；并且SEQIDNO：92中的X5選自M和I。在一些實(shí)施方案中，SEQIDNO：93中的X6選自D和N。在一些實(shí)施方案中，提供了特異性結(jié)合人NOTUM的NOTUM中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了特異性結(jié)合來(lái)自不同物種的NOTUM中的相同表位的NOTUM中和抗體(即，證明交叉反應(yīng)性的抗體)。在一些實(shí)施方案中，提供了特異性結(jié)合人NOTUM并且還特異性結(jié)合選自小鼠、大鼠、豚鼠、食蟹猴、狨猴和恒河猴的至少一種NOTUM的NOTUM中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了特異性結(jié)合人NOTUM和來(lái)自至少一種非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的NOTUM的NOTUM中和抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了特異性結(jié)合人NOTUM和小鼠NOTUM的NOTUM中和抗體。5.2.2.1.嵌合和人源化單克隆抗體在一些實(shí)施方案中，嵌合化非人抗體。在一些實(shí)施方案中，嵌合化特異性結(jié)合人NOTUM的小鼠單克隆抗體。例如，在Morrison等(1984)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA81：6851-6855；Neuberger等(1984)Nature312：604-608；Takeda等(1985)Nature314：452-454；和美國(guó)專利No.6,075,181和5,877,397中提供了制備嵌合抗體的某些示例性方法。在一些實(shí)施方案中，“人源化”非人抗體。在一些實(shí)施方案中，人源化特異性結(jié)合人NOTUM的小鼠單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，人源化對(duì)小鼠NOTUM產(chǎn)生的，但與人NOTUM特異性結(jié)合(即，交叉反應(yīng))的小鼠單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)施用給人時(shí)，人源化抗體保持其結(jié)合特異性并且免疫原性降低(例如，人抗小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答降低)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)如以下詳細(xì)描述，包括CDR移植和人體工程學(xué)的方法完成人源化。在人源化抗體的一些實(shí)施方案中，將來(lái)自具有所需結(jié)合特異性的抗體(即，“供體”抗體)的輕鏈和重鏈可變區(qū)的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到“受體”抗體中的人骨架區(qū)(FR)上。例如，在美國(guó)專利No.6，180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089和5,530,101；Queen等(1989)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86：10029-10033中描述了示例性CDR移植。在一些實(shí)施方案中，將來(lái)自輕鏈和重鏈可變區(qū)的一個(gè)或多個(gè)CDR移植到受體抗體中的共有人FR上。為產(chǎn)生共有人FR，在一些實(shí)施方案中，比對(duì)來(lái)自若干人重鏈或輕鏈氨基酸序列的FR以鑒定共有氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，用來(lái)自供體抗體的FR氨基酸置換受體抗體中的某些FR氨基酸。在某些實(shí)施方案中，來(lái)自供體抗體的FR氨基酸是有助于供體抗體對(duì)靶抗原的親和力的氨基酸。見(jiàn)，例如，在美國(guó)專利No.6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089和5,530,101；Queen等(1989)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86：10029-10033中。在一些實(shí)施方案中，使用計(jì)算機(jī)程序模擬供體和/或受體抗體以鑒定有可能牽涉結(jié)合抗原和/或有助于抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)的殘基，從而幫助選擇供體抗體中待置換的殘基，例如FR殘基。在一些實(shí)施方案中，將來(lái)自供體抗體的CDR移植到包含人恒定區(qū)的受體抗體上。在一些此類實(shí)施方案中，還將FR移植到受體上。在一些實(shí)施方案中，來(lái)自供體抗體的CDR源自單鏈Fv抗體。在一些實(shí)施方案中，來(lái)自供體抗體的FR源自單鏈Fv抗體。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步修飾(例如，通過(guò)氨基酸取代、缺失或插入)人源化抗體中移植的CDR以增強(qiáng)人源化抗體對(duì)靶抗原的親和力。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步修飾(例如，通過(guò)氨基酸取代、缺失或插入)人源化抗體中移植的FR以增強(qiáng)人源化抗體對(duì)靶抗原的親和力。在一些實(shí)施方案中，可使用“人體工程學(xué)”方法人源化非人抗體。見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5,766,886和5,869,619。在人體工程學(xué)的一些實(shí)施方案中，關(guān)于抗體可變結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的信息(例如，由晶體結(jié)構(gòu)和/或分子模型獲得的信息)用于評(píng)估可變區(qū)中指定氨基酸殘基(a)牽涉抗原結(jié)合，(b)暴露于抗體表面(即，易接近溶劑)，或(c)埋在抗體可變區(qū)中(即，牽涉維持可變區(qū)的結(jié)構(gòu))的可能性。此外，在一些實(shí)施方案中，生成人可變區(qū)共有序列以鑒定人可變區(qū)中的保守殘基。在一些實(shí)施方案中，所述信息提供了關(guān)于是否應(yīng)取代非人抗體可變區(qū)中的氨基酸殘基的指導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，人源化NOTUM中和抗體包含含選自MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55和2.78的抗體的CDR1、CDR2和CDR3中至少一個(gè)的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含選自MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55和2.78的抗體的CDR1、CDR2和CDR3的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含選自MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55和2.78的抗體的CDR1、CDR2和CDR3中至少一個(gè)的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含選自MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55和2.78的抗體的CDR1、CDR2和CDR3的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含來(lái)自選自MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55和2.78的抗體的重鏈CDR1、CDR2和CDR3和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含選自SEQIDNO：63、67、71、75和79的氨基酸序列的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含選自SEQIDNO：64、68、72、76和80的氨基酸序列的重鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含選自SEQIDNO：65、69、73、77和81的氨基酸序列的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含選自SEQIDNO：66、70、74、78和82的氨基酸序列的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含SEQIDNO：63的氨基酸序列的重鏈和含SEQIDNO：65的氨基酸序列的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含SEQIDNO：67的氨基酸序列的重鏈和含SEQIDNO：69的氨基酸序列的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含SEQIDNO：71的氨基酸序列的重鏈和含SEQIDNO：73的氨基酸序列的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含SEQIDNO：75的氨基酸序列的重鏈和含SEQIDNO：77的氨基酸序列的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含SEQIDNO：79的氨基酸序列的重鏈和含SEQIDNO：81的氨基酸序列的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含SEQIDNO：64的氨基酸序列的重鏈和含SEQIDNO：66的氨基酸序列的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含SEQIDNO：68的氨基酸序列的重鏈和含SEQIDNO：70的氨基酸序列的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含SEQIDNO：72的氨基酸序列的重鏈和含SEQIDNO：74的氨基酸序列的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含SEQIDNO：76的氨基酸序列的重鏈和含SEQIDNO：78的氨基酸序列的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體包含含SEQIDNO：80的氨基酸序列的重鏈和含SEQIDNO：82的氨基酸序列的輕鏈。5.2.2.2.抗體同種型在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的抗體具有選自IgM、IgD、IgG、IgA和IgE的任何同種型。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的抗體具有IgG同種型。在某些此類實(shí)施方案中，抗體具有亞類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的抗體具有IgM同種型。在某些此類實(shí)施方案中，抗體具有亞類IgM1或IgM2。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的抗體具有IgA同種型。在某些此類實(shí)施方案中，抗體具有亞類IgA1或IgA2?？筃OTUM的抗體可包含(例如)人或小鼠來(lái)源的λ或κ輕鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的抗體包含人κ輕鏈恒定區(qū)和人IgG1、IgG2或IgG4重鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的抗體包含小鼠κ輕鏈和小鼠IgG1或IgG2重鏈。5.2.2.3.經(jīng)修飾抗體在一些實(shí)施方案中，修飾抗體以改變其一種或多種性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)修飾抗體可能比未修飾抗體具有優(yōu)勢(shì)，例如穩(wěn)定性增強(qiáng)、循環(huán)時(shí)間增加，或免疫原性降低(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.4,179,337)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使其與非蛋白質(zhì)部分連接修飾抗體。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)改變抗體的糖基化狀態(tài)，例如通過(guò)改變抗體上碳水化合物鏈的數(shù)量、類型、連接和/或位置修飾抗體。在一些實(shí)施方案中，改變抗體以致其未糖基化。在一些實(shí)施方案中，使一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分與抗體的氨基酸骨架和/或碳水化合物殘基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知使化學(xué)部分與抗體連接的某些示例性方法。此類方法包括但不限于?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)。見(jiàn)，例如，EP0401384；Malik等(1992)，Exp.Hematol.，20：1028-1035；Francis(1992)FocusonGrowthFactors3(2)：4-10，由Mediscript，MountainCourt，F(xiàn)riernBarnetLane，LondonN20OLD，UK出版；EP0154316；EP0401384；WO92/16221；WO95/34326；WO95/13312；WO96/11953；WO96/19459和WO96/19459。在一些實(shí)施方案中，任何這些反應(yīng)用于生成在其氨基末端經(jīng)化學(xué)修飾的抗體。在一些實(shí)施方案中，使抗體與可檢測(cè)標(biāo)記連接，例如酶、熒光、同位素或親和標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，可檢測(cè)標(biāo)記允許檢測(cè)或分離抗體。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)標(biāo)記允許檢測(cè)抗體結(jié)合的抗原。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使其與一種或多種聚合物連接修飾抗體。在一些實(shí)施方案中，使抗體與一種或多種水溶性聚合物連接。在某些此類實(shí)施方案中，與水溶性聚合物的連接降低了抗體在水環(huán)境，例如生理環(huán)境中沉淀的可能性。在一些實(shí)施方案中，使治療性抗體與水溶性聚合物連接。在一些實(shí)施方案中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可基于包括在患者的治療中是否會(huì)使用聚合物/抗體綴合物的考慮并且，如果是這樣，基于抗體的藥理學(xué)性質(zhì)(例如，半衰期、劑量、活性、抗原性和/或其它因素)選擇適合的水溶性聚合物。某些示例性臨床上可接受的水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)；聚乙二醇丙醛；乙二醇/丙二醇共聚物；單甲氧基-聚乙二醇；羧甲基纖維素；葡聚糖；聚乙烯醇(PVA)；聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊環(huán)；聚-1，3，6-三噁烷；乙烯/馬來(lái)酸酐共聚物；聚-β-氨基酸(均聚物或無(wú)規(guī)共聚物)；聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物(PPG)和其它聚環(huán)氧烷烴；聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物；聚氧乙基化多元醇(POG)(例如，丙三醇)和其它聚氧乙基化多元醇；聚氧乙基化山梨糖醇、聚氧乙基化葡萄糖、結(jié)腸酸或其它碳水化合物聚合物；和聚蔗糖(Ficoll)、葡聚糖或其混合物。某些示例性PEG包括但不限于本領(lǐng)域已知在抗體修飾中有用的某些形式，例如單-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-PEG。在一些實(shí)施方案中，PEG丙醛由于其在水中穩(wěn)定，在生產(chǎn)上可能有優(yōu)勢(shì)。在一些實(shí)施方案中，水溶性聚合物具有任何分子量。在一些實(shí)施方案中，水溶性聚合物是分支或不分支的。在一些實(shí)施方案中，水溶性聚合物的平均分子量為約2kDa至約100kDa，包括所述范圍端點(diǎn)之間的所有值。在一些實(shí)施方案中，水溶性聚合物的平均分子量為約5kDa至約40kDa。在一些實(shí)施方案中，水溶性聚合物的平均分子量為約10kDa至約35kDa。在一些實(shí)施方案中，水溶性聚合物的平均分子量為約15kDa至約30kDa。在一些實(shí)施方案中，使抗體與聚乙二醇連接(PEG；即，“聚乙二醇化”抗體)。在各個(gè)實(shí)施方案中，PEG在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的毒性低。見(jiàn)Carpenter等(1971)Toxicol.Appl.Pharmacol.，18：35-40。尤其，在美國(guó)批準(zhǔn)將腺苷脫氨酶的PEG加成物用于人類治療嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷綜合征。在各個(gè)實(shí)施方案中，PEG可降低抗體的免疫原性。例如，在一些實(shí)施方案中，PEG與具有非人序列的抗體的連接可降低施用給人時(shí)所述抗體的抗原性。在一些實(shí)施方案中，使聚合物與抗體中一個(gè)或多個(gè)活性氨基酸殘基連接。某些示例性活性氨基酸殘基包括但不限于氨基端氨基酸的α-氨基、賴氨酸側(cè)鏈的ε氨基、半胱氨酸側(cè)鏈的巰基、天冬氨酰和谷氨?；鶄?cè)鏈的羧基、羧基端氨基酸的α-羧基、酪氨酸側(cè)鏈和與某些天冬酰胺、絲氨酸和蘇氨酸殘基連接的活化糖基鏈。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知適合與蛋白質(zhì)直接反應(yīng)的PEG的某些示例性活化形式(“PEG試劑”)。例如，在一些實(shí)施方案中，適合與氨基連接的PEG試劑包括但不限于PEG的活性羧酸酯或碳酸鹽衍生物，例如，其中離去基團(tuán)為N-羥基琥珀酰亞胺、對(duì)硝基苯酚、咪唑或1-羥基-2-硝基苯-4-磺酸酯的PEG活性羧酸酯或碳酸鹽衍生物。在一些實(shí)施方案中，含馬來(lái)酰亞胺基或鹵代乙?；腜EG試劑用于修飾巰基。在一些實(shí)施方案中，含氨基、肼和/或酰肼基團(tuán)的PEG試劑可用于和通過(guò)高碘酸鹽氧化蛋白質(zhì)中的碳水化合物基團(tuán)生成的醛反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，水溶性聚合物具有至少一個(gè)活性基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使水溶性聚合物與活化基團(tuán)反應(yīng)生成水溶性聚合物(例如PEG)的活化衍生物。在一些實(shí)施方案中，活化基團(tuán)可為單官能、雙官能或多官能。可用于使水溶性聚合物與一種或多種抗體連接的某些示例性活化基團(tuán)包括但不限于以下基團(tuán)：砜(例如，氯砜、乙烯砜和二乙烯砜)、馬來(lái)酰亞胺、巰基、硫醇、三氟甲磺酸、三氟乙磺酸、氮丙啶、環(huán)氧乙烷和5-吡啶基。在一些實(shí)施方案中，PEG衍生物通常在pH約11或更低的水環(huán)境中對(duì)水解穩(wěn)定時(shí)間更長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，與另一分子(例如抗體)連接的PEG衍生物賦予所述分子水解穩(wěn)定性。某些示例性同型雙功能PEG衍生物包括但不限于PEG-二-氯砜和PEG-二-乙烯砜(見(jiàn)WO95/13312)。5.2.3.制備單克隆抗體的某些方法5.2.3.1.某些雜交瘤方法在一些實(shí)施方案中，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生成單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)基于雜交瘤的方法生成單克隆抗體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知某些此類方法。見(jiàn)，例如，Kohler等(1975)Nature256：495-497；Harlow和Lane(1988)Antibodies：ALaboratoryManual第6章(ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)。在某些此類實(shí)施方案中，用免疫原使適合動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、猴子或其它哺乳動(dòng)物免疫以產(chǎn)生抗體分泌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，抗體分泌細(xì)胞為B細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在體外使淋巴細(xì)胞(例如，人淋巴細(xì)胞)免疫以產(chǎn)生抗體分泌細(xì)胞。見(jiàn)，例如，Borreback等(1988)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA85：3995-3999。在一些實(shí)施方案中，使抗體分泌細(xì)胞與“永生化”細(xì)胞系，例如髓型細(xì)胞系融合，以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，例如通過(guò)ELISA鑒定了生成所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，然后可使用標(biāo)準(zhǔn)方法亞克隆并培養(yǎng)此類細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，也可使此類細(xì)胞在適合動(dòng)物宿主體內(nèi)作為腹水瘤生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)分離法，例如親和色譜法，從雜交瘤培養(yǎng)基、血清或腹水分離出單克隆抗體。例如，在Harlow和Lane(1988)Antibodies：ALaboratoryManual第8章(ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)中提供了根據(jù)某些實(shí)施方案生成雜交瘤并純化單克隆抗體的指導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)用免疫原使基因改變的小鼠免疫生成小鼠單克隆抗體。在某些此類實(shí)施方案中，所述小鼠為部分或完全缺乏NOTUM功能的NOTUM缺陷型小鼠。在某些此類實(shí)施方案中，所述小鼠為缺乏整個(gè)或部分編碼NOTUM的基因的“敲除”小鼠。在一些實(shí)施方案中，用小鼠NOTUM使此類敲除小鼠免疫。在一些實(shí)施方案中，用人NOTUM使此類敲除小鼠免疫。在一些實(shí)施方案中，在能夠生成人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)體內(nèi)產(chǎn)生人單克隆抗體。見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.6,075,181A和6,114,598A；和WO98/24893A2。例如，在一些實(shí)施方案中，將免疫球蛋白基因引入(例如，使用酵母人工染色體、人類染色體片段或種系整合)其中內(nèi)源Ig基因已經(jīng)滅活的小鼠體內(nèi)。見(jiàn)，例如，Jakobovits等(1993)Nature362：255-258；Tomizuka等(2000)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA97：722-727；和Mendez等(1997)Nat.Genet.15：146-156(描述了轉(zhuǎn)基因小鼠的系)。在一些實(shí)施方案中，用免疫原使此類轉(zhuǎn)基因小鼠免疫。在某些此類實(shí)施方案中，從表達(dá)抗體的小鼠獲得淋巴細(xì)胞(例如B細(xì)胞)。在某些此類實(shí)施方案中，使此類回收細(xì)胞與“永生化”細(xì)胞系，例如髓型細(xì)胞系融合，以生成雜交瘤細(xì)胞。在某些此類實(shí)施方案中，篩選并選擇雜交瘤細(xì)胞以鑒定生成對(duì)目標(biāo)抗原有特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞。例如，在Jakobovits等(1993)Nature362：255-258；Jakobovits(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6：561-566；Lonberg等(1995)Int’lRev.Immunol.13：65-93；Fishwild等(1996)Nat.Biotechnol.14：845-851；Mendez等(1997)Nat.Genet.15：146-156；Green(1999)J.Immunol.Methods231：11-23；Tomizuka等(2000)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA97：722-727中描述了適合生成人單克隆抗體的某些示例性方法和轉(zhuǎn)基因小鼠；并且在Little等(2000)Immunol.Today21：364-370；和WO98/24893中有評(píng)論。在一些實(shí)施方案中，抗NOTUM的人單克隆抗體適合用作治療性抗體。見(jiàn)以下的V.G.部分。5.2.3.2.某些基于展示的方法在一些實(shí)施方案中，使用基于展示的方法，例如以下描述的任一種方法，生成人單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，使用噬菌體展示技術(shù)生成單克隆抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種抗體噬菌體展示方法并且(例如)在Hoogenboom，OverviewofAntibodyPhage-DisplayTechnologyandItsApplications，來(lái)自MethodsinMolecularBiology：AntibodyPhageDisplay：MethodsandProtocols(2002)178：1-37(O’Brien和Aitken編輯，HumanPress，Totowa，NJ)中有描述。例如，在一些實(shí)施方案中，使抗體庫(kù)在絲狀噬菌體，例如非切割絲狀噬菌體fd或M13的表面展示。在一些實(shí)施方案中，所述抗體為具有工程化分子間二硫鍵以穩(wěn)定VH-VL對(duì)的抗體片段(例如scFv、Fab、Fv)和雙鏈抗體。在一些實(shí)施方案中，然后可選擇具有所需結(jié)合特異性的抗體。以下更詳細(xì)地描述了抗體噬菌體展示方法的非限制示例性實(shí)施方案。在一些實(shí)施方案中，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的某些方法制備抗體噬菌體展示庫(kù)。見(jiàn)例如Hoogenboom，OverviewofAntibodyPhage-DisplayTechnologyandItsApplications，來(lái)自MethodsinMolecularBiology：AntibodyPhageDisplay：MethodsandProtocols(2002)178：1-37(O’Brien和Aitken編輯，HumanPress，Totowa，NJ)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)PCR擴(kuò)增源自抗體分泌細(xì)胞mRNA的基因組DNA或cDNA制備可變基因譜系。例如，在一些實(shí)施方案中，由B細(xì)胞的mRNA制備cDNA。在一些實(shí)施方案中，例如通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA。在一些實(shí)施方案中，將重鏈cDNA和輕鏈cDNA克隆至適合載體中。在一些實(shí)施方案中，在克隆過(guò)程中隨機(jī)組合重鏈cDNA和輕鏈cDNA，從而導(dǎo)致編碼不同scFv或Fab的cDNA庫(kù)組裝。在一些實(shí)施方案中，在克隆至適合載體之前連接重鏈cDNA和輕鏈cDNA。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)分步克隆至適合載體中連接重鏈cDNA和輕鏈cDNA。在一些實(shí)施方案中，將cDNA克隆至噬菌體展示載體，例如噬菌粒載體中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知某些示例性噬菌粒載體，例如pCES1。在一些實(shí)施方案中，在相同載體上存在編碼重鏈和輕鏈的cDNA。例如，在一些實(shí)施方案中，在具有編碼小噬菌體外殼蛋白pIII的整個(gè)基因III或一部分的框架中克隆編碼scFv的cDNA。在某些此類實(shí)施方案中，噬菌粒指導(dǎo)scFv-pIII融合蛋白在噬菌體表面表達(dá)?？蛇x地，在一些實(shí)施方案中，在具有整個(gè)基因III或一部分的框架中克隆編碼重鏈(或輕鏈)的cDNA，并且在相同載體中信號(hào)序列的下游克隆編碼輕鏈(或重鏈)的cDNA。信號(hào)序列指導(dǎo)輕鏈(或重鏈)表達(dá)進(jìn)入宿主細(xì)胞的外周胞質(zhì)，其中重鏈和輕鏈組裝成Fab片段?？蛇x地，在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈的cDNA和編碼輕鏈的cDNA存在于單獨(dú)載體上。在某些此類實(shí)施方案中，單獨(dú)克隆重鏈和輕鏈cDNA，一個(gè)克隆至噬菌粒中而另一個(gè)克隆至噬菌體載體中，兩者均含在宿主細(xì)胞中體內(nèi)重組的信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，將重組噬菌?；蚴删w載體引入適合細(xì)菌宿主，例如大腸桿菌(E.coli.)中。在使用噬菌粒的一些實(shí)施方案中，用輔助噬菌體感染宿主以供給噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白，從而使攜帶抗體-pIII融合蛋白的噬菌體顆粒在噬菌體表面上表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，使用體外重排的可變基因譜系構(gòu)建“合成”抗體庫(kù)。例如，在一些實(shí)施方案中，使用PCR隨機(jī)組合編碼重鏈或輕鏈的單獨(dú)基因片段(分別為V-D-J或V-J)。在一些實(shí)施方案中，例如通過(guò)易錯(cuò)PCR可向CDR和(可能)FR中引入另外的序列多樣性。在一些此類實(shí)施方案中，可向CDR3，例如重鏈的H3中引入另外的序列多樣性。在一些實(shí)施方案中，如上所述使用來(lái)自未免疫動(dòng)物的核酸構(gòu)建“天然”或“通用”噬菌體展示庫(kù)。在一些實(shí)施方案中，未免疫動(dòng)物為人。在一些實(shí)施方案中，如上所述使用來(lái)自免疫動(dòng)物的核酸構(gòu)建“免疫”噬菌體展示庫(kù)。在一些實(shí)施方案中，免疫動(dòng)物為人、大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠或猴子。在某些此類實(shí)施方案中，用以下所述任何免疫原使動(dòng)物免疫。某些示例性通用人抗體噬菌體展示庫(kù)可從商業(yè)來(lái)源獲得。某些示例性庫(kù)包括但不限于來(lái)自MorphoSysAG(Martinstreid/Munich，Germany)的系列庫(kù)；來(lái)自Crucell(Leiden，theNetherlands)使用技術(shù)的庫(kù)；來(lái)自BioInvent(Lund，Sweden)的n-CoDeRTMFab庫(kù)；和可從CambridgeAntibodyTechnology(Cambridge，UK)獲得的庫(kù)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)連續(xù)淘選步驟實(shí)現(xiàn)從噬菌體展示庫(kù)選擇具有所需結(jié)合特異性的抗體。在淘選的一些實(shí)施方案中，向抗原暴露庫(kù)噬菌體制劑。在某些此類實(shí)施方案中，洗滌噬菌體-抗原復(fù)合物，并丟棄未結(jié)合的噬菌體。在某些此類實(shí)施方案中，回收結(jié)合的噬菌體并隨后通過(guò)感染大腸桿菌擴(kuò)增。在某些此類實(shí)施方案中，可通過(guò)挑選單個(gè)斑塊克隆生成單克隆抗體的噬菌體。在一些實(shí)施方案中，重復(fù)以上過(guò)程。在一些實(shí)施方案中，用于淘選的抗原是以下所述任何免疫原。在一些實(shí)施方案中，將抗原固定在固體載體上以允許通過(guò)親和色譜法純化結(jié)合抗原的噬菌體。在一些實(shí)施方案中，生物素化所述抗原，從而允許使用涂有鏈霉親和素的磁珠將結(jié)合噬菌體與未結(jié)合噬菌體分開(kāi)。在一些實(shí)施方案中，可將抗原固定在細(xì)胞上(以直接淘選)、組織冷凍切片中或膜(例如，尼龍或硝酸纖維膜)上。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可常規(guī)性決定某些淘選方法的其它變化。在一些實(shí)施方案中，使用酵母展示系統(tǒng)生成單克隆抗體。在某些此類系統(tǒng)中，使抗體表達(dá)為與整個(gè)或部分酵母AGA2蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白變得在酵母細(xì)胞壁的表面展示。在某些此類實(shí)施方案中，然后可通過(guò)使細(xì)胞暴露于熒光標(biāo)記抗原鑒定表達(dá)具有所需結(jié)合特異性的抗體的酵母細(xì)胞。在某些此類實(shí)施方案中，然后可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分離結(jié)合抗原的酵母細(xì)胞。見(jiàn)，例如，Boder等(1997)Nat.Biotechnol.15：553-557。5.2.3.3.某些親和力成熟方法在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使抗體進(jìn)行體外親和力成熟(或“定向進(jìn)化”)增強(qiáng)抗體對(duì)特殊抗原的親和力。在體內(nèi)，天然抗體通過(guò)體細(xì)胞高頻突變、隨后選擇進(jìn)行親和力成熟。一些體外方法模擬體內(nèi)過(guò)程，從而允許生成親和力等于或超過(guò)天然抗體親和力的抗體。在親和力成熟的一些實(shí)施方案中，向編碼具有所需結(jié)合特異性的抗體的可變區(qū)的核酸序列引入突變。見(jiàn)，例如，Hudson等(2003)Nat.Med.9：129-134；Brekke等(2002)Nat.Reviews2：52-62。在一些實(shí)施方案中，向重鏈、輕鏈或二者的可變區(qū)中引入突變。在一些實(shí)施方案中，向一個(gè)或多個(gè)CDR引入突變。在某些此類實(shí)施方案中，向H3、L3或二者中引入突變。在一些實(shí)施方案中，向一個(gè)或多個(gè)FR引入突變。在一些實(shí)施方案中，例如在噬菌體、核糖體或酵母展示庫(kù)中創(chuàng)建突變庫(kù)，以致可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)篩選方法鑒定親和力增強(qiáng)的抗體。見(jiàn)，例如，Boder等(2000)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA97：10701-10705；Foote等(2000)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA97：10679-10681；Hoogenboom，OverviewofAntibodyPhage-DisplayTechnologyandItsApplications，來(lái)自MethodsinMolecularBiology：AntibodyPhageDisplay：MethodsandProtocols(2002)178：1-37(O’Brien和Aitken編輯，HumanPress，Totowa，NJ)；和Hanes等(1998)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95：14130-14135。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)基于關(guān)于抗體結(jié)構(gòu)，例如抗原結(jié)合位點(diǎn)的信息的定點(diǎn)誘變引入突變。在一些實(shí)施方案中，使用CDR的組合誘變引入突變。在一些實(shí)施方案中，例如使用大腸桿菌突變細(xì)胞、同源基因重排或易錯(cuò)PCR隨機(jī)誘變整個(gè)或部分可變區(qū)編碼序列。在一些實(shí)施方案中，使用“DNA改組”引入突變。見(jiàn)，例如，Crameri等(1996)Nat.Med.2：100-102；Fermer等(2004)TumorBiol.25：7-13。在一些實(shí)施方案中，使用“鏈改組”生成親和力增強(qiáng)的抗體。在鏈改組的一些實(shí)施方案中，用輕鏈譜系置換其中一條鏈，例如輕鏈，而不改變另一條鏈，例如重鏈，從而提供特異性。在某些此類實(shí)施方案中，創(chuàng)建鏈改組抗體庫(kù)，其中未改變重鏈與來(lái)自所述輕鏈譜系的每條輕鏈聯(lián)合表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，然后可篩選此類庫(kù)中親和力增強(qiáng)的抗體。在一些實(shí)施方案中，依次置換重鏈和輕鏈。在一些實(shí)施方案中，僅置換重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，僅置換重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)的一部分，例如CDR。見(jiàn)，例如，Hudson等(2003)Nat.Med.9：129-134；Brekke等(2002)Nat.Reviews2：52-62；Kang等(1991)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA88：11120-11123；Marks等(1992)Biotechnol.10：779-83。在一些實(shí)施方案中，使特異性結(jié)合人NOTUM的小鼠單克隆抗體(包括對(duì)小鼠NOTUM產(chǎn)生的，但是與人NOTUM特異性結(jié)合(即交叉反應(yīng))的小鼠單克隆抗體)進(jìn)行依次鏈改組。在一些實(shí)施方案中，例如，使指定小鼠單克隆抗體的重鏈與新的人輕鏈譜系組合，并選擇具有所需親和力的抗體。在某些此類實(shí)施方案中，然后使所選抗體的輕鏈與新的人重鏈譜系組合，并選擇具有所需親和力的抗體。因此，在一些實(shí)施方案中，選擇具有所需抗原結(jié)合特異性和親和力的人抗體?？蛇x地，在一些實(shí)施方案中，使指定小鼠單克隆抗體的重鏈與新的人輕鏈譜系組合，并從這第一輪改組中選擇具有所需親和力的抗體。在一些實(shí)施方案中，使原小鼠單克隆抗體的輕鏈與新的人重鏈譜系組合，并從這第二輪改組中選擇具有所需親和力的抗體。在一些實(shí)施方案中，然后使來(lái)自第一輪改組中所選抗體的人輕鏈與來(lái)自第二輪改組中所選抗體的人重鏈組合。因此，在一些實(shí)施方案中，選擇具有所需抗原結(jié)合特異性和親和力的人抗體。在一些實(shí)施方案中，使用“核糖體展示”方法使抗體選擇與親和力成熟交替。在核糖體展示方法的一些實(shí)施方案中，通過(guò)在選擇步驟之間進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增抗體編碼核酸。因此，在一些實(shí)施方案中，可使用易錯(cuò)聚合酶向核酸中引入突變。在Hanes等(1998)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95：14130-14135中詳細(xì)描述了此類方法的非限制實(shí)例。5.2.3.4.某些重組方法在一些實(shí)施方案中，通過(guò)重組技術(shù)生成單克隆抗體。見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.4,816,567。在某些此類實(shí)施方案中，在適合宿主細(xì)胞中克隆并表達(dá)編碼單克隆抗體鏈的核酸。例如，在一些實(shí)施方案中，可使用標(biāo)準(zhǔn)方法由表達(dá)所需抗體的細(xì)胞，例如成熟B細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞制備RNA。在一些實(shí)施方案中，然后可使用標(biāo)準(zhǔn)方法用RNA制備cDNA。在一些實(shí)施方案中，例如使用特異性寡核苷酸引物通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼重鏈或輕鏈多肽的cDNA。在一些實(shí)施方案中，將cDNA克隆至適合表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方案中，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至適合宿主細(xì)胞，例如未內(nèi)源性生成抗體的宿主細(xì)胞中。某些示例性宿主細(xì)胞包括但不限于大腸桿菌、COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。在其中重鏈和輕鏈在相同宿主中共同表達(dá)的一些實(shí)施方案中，可分離重構(gòu)抗體。在一些實(shí)施方案中，可修飾編碼重鏈或輕鏈的cDNA。例如，在一些實(shí)施方案中，可用人重鏈或輕鏈的恒定區(qū)置換小鼠重鏈或輕鏈的恒定區(qū)。用這種方式，在一些實(shí)施方案中，可生成具有人抗體恒定區(qū)，但是保持小鼠抗體的結(jié)合特異性的嵌合抗體。在一些實(shí)施方案中，核酸分子包含編碼NOTUM中和抗體的重鏈或輕鏈的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，單個(gè)核酸分子包含編碼NOTUM中和抗體的重鏈的第一多核苷酸序列和編碼NOTUM中和抗體的輕鏈的第二多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，例如，當(dāng)抗體為單鏈Fv(scFv)時(shí)，重鏈的編碼序列和輕鏈的編碼序列是連續(xù)編碼序列的一部分，以致表達(dá)包含所述抗體的重鏈和輕鏈的單個(gè)多肽。在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈和輕鏈的單個(gè)核酸分子能夠表達(dá)兩條呈單獨(dú)多肽的鏈。在一些此類實(shí)施方案中，每條鏈均受單獨(dú)啟動(dòng)子的控制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)預(yù)期用途選擇NOTUM中和抗體的重鏈和輕鏈的適合構(gòu)型和適合控制元件。在一些實(shí)施方案中，所述核酸為載體，例如適合在特殊宿主細(xì)胞中表達(dá)重鏈和/或輕鏈的表達(dá)載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)待用于表達(dá)的宿主細(xì)胞選擇一種或多種適合表達(dá)載體。本領(lǐng)域已知此類示例性載體。在一些實(shí)施方案中，核酸分子包含編碼選自MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55、2.78和此類MAb的人源化形式的NOTUM中和抗體的重鏈的多核苷酸序列。在一些此類實(shí)施方案中，核酸分子包含選自SEQIDNO：101、103、105、107、109、111、112、115、116、119、120、123、124、127和128的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，核酸分子包含編碼選自MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55、2.78和此類MAb的人源化形式的NOTUM中和抗體的輕鏈的多核苷酸序列。在一些此類實(shí)施方案中，核酸分子包含選自SEQIDNO：102、104、106、108、110、113、114、117、118、121、122、125、126、129和130的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，核酸分子包含編碼選自MAb1.731、1.802、1.815、1.846、2.1029、2.55、2.78和此類MAb的人源化形式的NOTUM中和抗體的重鏈的第一多核苷酸序列和編碼其輕鏈的第二多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，可在某些細(xì)胞系中表達(dá)重組抗體。在一些實(shí)施方案中，編碼特殊抗體的序列可用于轉(zhuǎn)化適合哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。根據(jù)某些實(shí)施方案，可通過(guò)將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的任何已知方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。某些示例性方法包括但不限于將多核苷酸包裝在病毒(或病毒載體)中，并且用病毒(或載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞和使用本領(lǐng)域已知的某些轉(zhuǎn)染方法，如美國(guó)專利No.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455例證。在一些實(shí)施方案中，所用轉(zhuǎn)化方法可取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的某些示例性方法在本領(lǐng)域中已知并且包括但不限于葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、凝聚胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將多肽封裝在脂質(zhì)體中和將DNA直接顯微注射至細(xì)胞核中。可用作表達(dá)宿主的某些示例性哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在本領(lǐng)域中已知并且包括但不限于許多可從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)獲得的永生化細(xì)胞系，包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、海拉(HeLa)細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，HepG2)和許多其它細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)確定哪些細(xì)胞系生成高水平的特異性結(jié)合NOTUM的抗體選擇細(xì)胞系。5.3.治療方法本發(fā)明涵蓋一種刺激患者的內(nèi)皮質(zhì)骨形成的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明抗體。本發(fā)明還涵蓋一種使皮質(zhì)骨厚度增加的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明抗體。本發(fā)明涵蓋一種治療、管理或預(yù)防與骨質(zhì)流失相關(guān)的疾病或病癥的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明抗體。疾病和病癥的實(shí)例包括骨質(zhì)疏松(例如，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、類固醇或糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松、男性骨質(zhì)疏松和特發(fā)性骨質(zhì)疏松)、骨質(zhì)減少和佩吉特病(Paget’sdisease)。本發(fā)明還涵蓋了一種治療、管理或預(yù)防骨折的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明抗體。特定骨折與轉(zhuǎn)移性骨病相關(guān)，即已轉(zhuǎn)移至骨的癌癥?？赊D(zhuǎn)移至骨的癌癥的實(shí)例包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌和腎癌。本發(fā)明還涵蓋了一種治療、管理或預(yù)防與疾病或病癥相關(guān)或由疾病或病癥引起的骨質(zhì)流失，所述方法包括向有需要的患者施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明抗體。疾病和病癥的實(shí)例包括乳糜瀉、克羅恩病(Crohn’sDisease)、庫(kù)興綜合征(Cushing’ssyndrome)、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、炎癥性腸病和潰瘍性結(jié)腸炎?？墒芤嬗诒景l(fā)明方法的非限制示例性患者包括55歲或以上的男女、絕經(jīng)后的婦女和患有腎機(jī)能不全的患者。本發(fā)明的抗體與已知對(duì)治療、管理或預(yù)防影響骨的疾病或病癥有用的其它藥物聯(lián)合施用(例如，同時(shí)或在不同時(shí)間)。實(shí)例包括：雄激素受體調(diào)節(jié)劑；二膦酸鹽；降鈣素；鈣傳感受體拮抗劑；RANKL抗體、組織蛋白酶K抑制劑；雌激素和雌激素受體調(diào)節(jié)劑；整聯(lián)蛋白粘合劑、抗體和受體拮抗劑；甲狀旁腺激素(PTH)及其類似物和模擬物；和維生素D和合成維生素D類似物。雄激素受體調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括非那雄胺(finasteride)和其它5α-還原酶抑制劑、尼魯米特(nilutamide)、氟他胺(flutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、利阿唑(liarozole)和醋酸阿比特龍(abirateroneacetate)。二膦酸鹽的實(shí)例包括阿侖膦酸鹽(alendronate)、英卡膦酸鹽(cimadronate)、氯膦酸鹽(clodronate)、依替膦酸鹽(etidronate)、伊班膦酸鹽(ibandronate)、伊卡膦酸鹽(incadronate)、米諾膦酸鹽(minodronate)、奈立膦酸鹽(neridronate)、奧帕膦酸鹽(olpadronate)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、吡膦酸鹽(piridronate)、利塞膦酸鹽(risedronate)、替魯膦酸鹽(tiludronate)和唑來(lái)膦酸鹽(zolendronate)及其藥學(xué)上可接受的鹽和酯。組織蛋白酶K抑制劑的實(shí)例包括VEL-0230、AAE581(巴利卡替(balicatib))、MV061194、SB-462795(瑞拉卡替(relacatib))、MK-0822(奧達(dá)卡替(odanacatib))和MK-1256。雌激素和雌激素受體調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括自然存在的雌激素(例如，7-雌二醇、雌酮和雌三醇)、結(jié)合雌激素(例如，結(jié)合馬雌激素)、口服避孕藥、磺化雌激素、孕激素、雌二醇、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬、拉索昔芬(lasofoxifene)、TSE-424、他莫昔芬(tamoxifen)、艾多昔芬(idoxifene)、LY353381、LY117081、托瑞米芬(toremifene)、氟維司群(fulvestrant)、4-[7-(2，2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2，2-二甲基丙酸酯、4，4′-二羥基二苯甲酮-2，4-二硝基苯-腙和SH646。整聯(lián)蛋白粘合劑、抗體和受體拮抗劑的實(shí)例包括整合素拮抗劑(vitaxin)(MEDI-522)、西侖吉肽(cilengitide)和L-000845704。5.4.藥物制劑本發(fā)明涵蓋包含本發(fā)明的一種或多種抗體和任選一種或多種其它藥物，例如上述藥物的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，NOTUM中和抗體可用作治療性抗體。待用作治療性抗體的示例性NOTUM中和抗體包括但不限于嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉抗體作為治療劑的用途。在一些實(shí)施方案中，提供了包含有效量的NOTUM抗體和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，提供了包含有效量的NOTUM抗體和有效量的至少一種另外的治療劑，連同藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，至少一種另外的治療劑選自上述治療劑。在一些實(shí)施方案中，在所用劑量和濃度下，藥物組合物的配制材料對(duì)受體無(wú)毒。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含改變、維持或保持(例如)所述組合物的pH、滲透壓、粘度、清澈度、顏色、等滲性、氣味、無(wú)菌度、穩(wěn)定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透率。在一些實(shí)施方案中，適合配制材料包括但不限于氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和賴氨酸)；抗菌劑；抗氧化劑(例如，抗壞血酸、亞硫酸鈉和亞硫酸氫鈉)；緩沖液(例如，硼酸鹽、重碳酸鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽和其它有機(jī)酸)；填充劑(例如，甘露糖醇和甘氨酸)；螯合劑(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))；絡(luò)合劑(例如，咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環(huán)糊精和羥丙基-β-環(huán)糊精)；填料；單糖、二糖和其它碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖和糊精)；蛋白質(zhì)(例如，血清白蛋白、明膠和免疫球蛋白)；著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑；乳化劑；親水聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成鹽反離子(例如，鈉)；防腐劑(例如，苯扎氯胺、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、洗必泰、山梨酸和過(guò)氧化氫)；溶劑(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇)；糖醇(例如，甘露糖醇和山梨糖醇)；助懸劑；表面活性劑或潤(rùn)濕劑(例如，pluronics、PEG、山梨醇酐酯、聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)、三硝基甲苯、氨基丁三醇、卵磷脂、膽固醇和泰洛沙泊(tyloxapal))；穩(wěn)定性增強(qiáng)劑(例如，蔗糖和山梨糖醇)；張力增強(qiáng)劑(例如、堿金屬鹵化物(例如，氯化鈉或氯化鉀)、甘露糖醇和山梨糖醇)；遞送媒介物；稀釋劑；賦形劑和藥物佐劑。(Remington′sPharmaceuticalSciences，第18版，A.R.Gennaro編輯，MackPublishingCompany(1990)。在一些實(shí)施方案中，NOTUM抗體或其它治療分子與半衰期延長(zhǎng)媒介物連接。非限制示例性半衰期延長(zhǎng)媒介物包括本領(lǐng)域已知的半衰期延長(zhǎng)媒介物。此類媒介物包括但不限于Fc結(jié)構(gòu)域、聚乙二醇和葡聚糖。例如，在公開(kāi)的PCT申請(qǐng)No.WO99/25044中描述了此類示例性媒介物。在一些實(shí)施方案中，將由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)(例如)預(yù)期施用途徑、遞送形式和所需劑量決定最佳藥物組合物。見(jiàn)，例如，Remington′sPharmaceuticalSciences，同上。在一些實(shí)施方案中，此類組合物可影響中和抗體的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率或體內(nèi)清除速率。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物中的主要媒介物或載體實(shí)際上含水或無(wú)水。例如，在一些實(shí)施方案中，適合媒介物或載體可為注射用水、生理鹽水或人工腦脊液，很可能補(bǔ)充了在供腸胃外施用的組合物中常見(jiàn)的其它物質(zhì)。示例性媒介物包括但不限于中性緩沖鹽水和混合了血清白蛋白的鹽水。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約pH7.0-8.5的Tris緩沖液或約pH4.0-5.5的醋酸鹽緩沖液，其可進(jìn)一步包括山梨糖醇或其適合代用品。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)使選擇的具有所需純度的組合物與任選配制試劑混合(Remington′sPharmaceuticalSciences，同上)制備成凍干餅狀或水溶液形式的包含NOTUM抗體(有或無(wú)至少一種另外的治療劑)的組合物用于儲(chǔ)存。在一些實(shí)施方案中，可使用適當(dāng)賦形劑，例如蔗糖將包含NOTUM抗體(有或無(wú)至少一種另外的治療劑)的組合物配制成凍干產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，選擇藥物組合物供腸胃外遞送。在一些實(shí)施方案中，選擇藥物組合物供吸入或通過(guò)消化道遞送，例如口服。制備藥學(xué)上可接受的組合物的各種技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，配制組分以施用部位可接受的濃度存在。在一些實(shí)施方案中，使用緩沖液將組合物維持在生理pH或稍微更低的pH下，通常在約5至約8的pH范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)考慮腸胃外施用時(shí)，藥物組合物在藥學(xué)上可接受的媒介物中可呈無(wú)熱原、腸胃外可接受的水溶液形式，其包含所需NOTUM抗體(有或無(wú)另外的治療劑)。在一些實(shí)施方案中，供腸胃外注射的媒介物為無(wú)菌蒸餾水，在其中將NOTUM抗體(有或無(wú)至少一種另外的治療劑)配制成無(wú)菌等滲溶液，妥善保存。在一些實(shí)施方案中，制備可牽涉與可提供產(chǎn)物(然后可通過(guò)貯庫(kù)型注射遞送)的控釋或緩釋的試劑，例如注射用微球、生物易蝕顆粒、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂質(zhì)體一起配制所需分子。在一些實(shí)施方案中，也可使用透明質(zhì)酸，并且可具有促進(jìn)在循環(huán)中持續(xù)的作用。在一些實(shí)施方案中，可使用可植入藥物遞送裝置引入所需分子。在一些實(shí)施方案中，可配制藥物組合物用于吸入。在一些實(shí)施方案中，可將NOTUM抗體(有或無(wú)至少一種另外的治療劑)配制呈供吸入的干粉。在一些實(shí)施方案中，可與推進(jìn)劑一起配制包含NOTUM抗體(有或無(wú)至少一種另外的治療劑)的吸入溶液用于氣溶膠遞送。在一些實(shí)施方案中，可霧化溶液。在一些實(shí)施方案中，可口服施用制劑。在一些實(shí)施方案中，以這種方式施用的NOTUM抗體(有或無(wú)至少一種另外的治療劑)與或不與在固體劑型，例如片劑和膠囊的配混中通常使用的載體一起配制。在一些實(shí)施方案中，可將膠囊設(shè)計(jì)為在胃腸道中當(dāng)生物利用率最大化而系統(tǒng)前降解最小化時(shí)釋放制劑的活性部分。在一些實(shí)施方案中，可包括至少一種另外的試劑以促進(jìn)吸收NOTUM抗體(有或無(wú)任何另外的治療劑)。在一些實(shí)施方案中，也可采用稀釋劑、調(diào)味劑、低熔點(diǎn)蠟、植物油、潤(rùn)滑劑、助懸劑、片劑崩解劑和/或粘合劑。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含有效量的與適合生產(chǎn)片劑的無(wú)毒賦形劑混合的NOTUM抗體(有或無(wú)至少一種另外的治療劑)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將片劑溶于無(wú)菌水或另一種適當(dāng)媒介物中，制備呈單位劑型的溶液。示例性賦形劑包括但不限于惰性稀釋劑(例如，碳酸鈣、碳酸鈉、碳酸氫鈉、乳糖和磷酸鈣)；粘合劑(例如，淀粉、明膠和阿拉伯膠)；和潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸和滑石)。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，另外的藥物組合物將顯而易見(jiàn)，包括在持續(xù)或控制遞送制劑中包含NOTUM抗體(有或無(wú)至少一種另外的治療劑)。示例性持續(xù)或控制遞送制劑包括但不限于脂質(zhì)體載體、生物易蝕微粒、多孔珠和貯庫(kù)型注射劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知制備制劑的各種技術(shù)。在一些實(shí)施方案中，緩釋制劑可包括呈成形物品形式的半滲透聚合物基質(zhì)，例如膜或微膠囊。示例性緩釋基質(zhì)包括但不限于聚酯、水凝膠、聚交酯(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.3,773,919和EP058,481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯(見(jiàn)，例如，Sidman等(1983)Biopolymers22：547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(見(jiàn)，例如，Langer等(1981)J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer(1982)Chem.Tech.12：98-105)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等，同上)和聚-D(-)-3-羥丁酸(EP133,988)。在一些實(shí)施方案中，緩釋組合物可包括脂質(zhì)體，在一些實(shí)施方案中可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的幾種方法的任一種制備脂質(zhì)體。見(jiàn)，例如，Eppstein等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688-3692；EP036,676；EP088,046；和EP143,949。在一些實(shí)施方案中，待用于體內(nèi)施用的藥物組合物通常是無(wú)菌的。在一些實(shí)施方案中，這可通過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾實(shí)現(xiàn)。在使組合物凍干的一些實(shí)施方案中，可在凍干和重構(gòu)之前或之后使用這種方法進(jìn)行滅菌。在一些實(shí)施方案中，供腸胃外施用的組合物可呈凍干形式或溶液儲(chǔ)存。在一些實(shí)施方案中，通常將腸胃外組合物置于具有無(wú)菌入口孔的容器中，例如具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈注射溶液袋或小瓶。在一些實(shí)施方案中，一旦配制了藥物組合物，就可將其作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或作為脫水或凍干粉末儲(chǔ)存在無(wú)菌小瓶中。在一些實(shí)施方案中，可將此類制劑儲(chǔ)存為隨時(shí)可用的形式或在施用之前重構(gòu)的形式(例如，凍干)。在一些實(shí)施方案中，提供了產(chǎn)生單劑量施用單元的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可各自裝有有干燥蛋白質(zhì)的第一容器和有含水制劑的第二容器。在一些實(shí)施方案中，包括裝有單室或多室預(yù)填充注射器(例如，液體注射器和凍干注射器)的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，待在治療上采用的包含NOTUM抗體(有或無(wú)至少一種另外的治療劑)的藥物組合物的有效量將取決于(例如)治療背景和目的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，根據(jù)一些實(shí)施方案，用于治療的適當(dāng)劑量水平因此將部分根據(jù)遞送的分子、對(duì)其使用NOTUM抗體(有或無(wú)至少一種另外的治療劑)的適應(yīng)癥、施用途徑和患者的大小(體重、體表或器官大小)和/或狀況(年齡和健康狀況)改變。在一些實(shí)施方案中，臨床醫(yī)師可滴定劑量并修改施用途徑以獲得最佳療效。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)以上提到的因素，典型劑量范圍可從約0.1μg/kg患者體重至約100mg/kg或更高。在一些實(shí)施方案中，劑量范圍可從0.1μg/kg至約100mg/kg；1μg/kg至約100mg/kg；或5μg/kg至約100mg/kg，包括前述任何端點(diǎn)之間的所有值(包括分?jǐn)?shù))。在一些實(shí)施方案中，劑量介于約1mg/kg體重與60mg/kg體重之間。在一些實(shí)施方案中，劑量為約1mg/kg體重、約3mg/kg體重、約5mg/kg體重、約10mg/kg體重、約20mg/kg體重、約30mg/kg體重、約40mg/kg體重、約50mg/kg體重或約60mg/kg體重。在一些實(shí)施方案中，基于相同抗體在另一物種，例如小鼠、狗、猴子等中的有效劑量，確定抗NOTUM的中和抗體的人體劑量。在一些實(shí)施方案中，使用“GuidanceforIndustry：EstimatingtheMaximumSafeStartingDoseinInitialClinicalTrialsforTherapeuticsinAdultHealthyVolunteers，”U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，F(xiàn)oodandDrugAdministration，andCenterforDrugEvaluationandResearch(CDER)，2005年7月(PharmacologyandToxicology)確定抗NOTUM的中和抗體的人體劑量。在一些實(shí)施方案中，可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員(例如)基于動(dòng)物研究確定適合劑量。在各個(gè)實(shí)施方案中，向患者施用抗NOTUM的中和抗體每周2次、每周1次、每2周1次、每月1次、每隔一個(gè)月1次或甚至更低頻率。在一些實(shí)施方案中，給藥頻率將考慮到所用制劑中NOTUM抗體和(若適用)任何另外的治療劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在一些實(shí)施方案中，臨床醫(yī)師將施用組合物直至達(dá)到獲得所需效果的劑量。在一些實(shí)施方案中，因此組合物可作為單次劑量，或隨時(shí)間推移作為兩次或更多次劑量(可能含有或不含相同量的所需分子)，或作為連續(xù)輸注通過(guò)植入裝置或?qū)Ч苁┯?。在一些?shí)施方案中，適當(dāng)劑量的進(jìn)一步細(xì)化通常由本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)行并且在他們通常進(jìn)行的工作范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)使用適當(dāng)劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)確定適當(dāng)劑量。在一些實(shí)施方案中，患者接受一個(gè)劑量的包含NOTUM抗體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，患者每天接受1、2、3或4個(gè)劑量的包含NOTUM抗體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，患者每周接受1、2、3、4、5或6個(gè)劑量的包含NOTUM抗體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，患者每月接受1、2、3或4個(gè)劑量的包含NOTUM抗體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物的施用途徑與已知方法一致，例如口服、通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)(實(shí)質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)或病灶內(nèi)途徑注射；通過(guò)緩釋系統(tǒng)或通過(guò)植入裝置注射。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)快速注射或連續(xù)地通過(guò)輸注或用植入裝置施用組合物。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)植入上面已經(jīng)吸附或封裝了所需分子的膜、海綿或另一種適當(dāng)材料局部施用組合物。在使用植入裝置的一些實(shí)施方案中，可將所述裝置植入任何適合組織或器官中，并且可通過(guò)擴(kuò)散、定時(shí)釋放團(tuán)注劑(bolus)或連續(xù)施用遞送所需分子。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使用例如本文所述的方法，植入已經(jīng)基因工程化來(lái)表達(dá)并分泌多肽的某些細(xì)胞，從而遞送NOTUM抗體(有或無(wú)至少一種另外的治療劑)。在一些實(shí)施方案中，此類細(xì)胞可為動(dòng)物或人類細(xì)胞，并且可為自體同源、異源或異種。在一些實(shí)施方案中，可永生化所需細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，為了減少免疫反應(yīng)的機(jī)會(huì)，可封裝細(xì)胞以免周圍組織浸潤(rùn)。在一些實(shí)施方案中，封裝材料通常為允許蛋白質(zhì)產(chǎn)物釋放，但防止患者免疫系統(tǒng)或來(lái)自周圍組織的其它有害因子破壞細(xì)胞的生物相容、半滲透性聚合物外殼或膜。6實(shí)施例6.1.敲除小鼠使用來(lái)自突變鼠ES細(xì)胞克隆OMNIBANK收藏中心的相應(yīng)突變胚胎干(ES)細(xì)胞克隆生成在人NOTUM基因的鼠直系同源物中基因工程化突變的純合小鼠(通常見(jiàn)，美國(guó)專利No.6,080,576)。簡(jiǎn)言之，將在鼠NOTUM基因座中含誘變病毒插入的ES細(xì)胞克隆顯微注射至胚泡中，依次將胚泡植入假孕雌性宿主中并使其足月。隨后使所得嵌合后代繁殖為6只C57黑色雌性小鼠并檢查后代敲除NOTUM等位基因的種系傳播。隨后繁殖突變NOTUM等位基因的雜合動(dòng)物以產(chǎn)生1∶2∶1適當(dāng)比例的突變NOTUM等位基因的純合后代、突變NOTUM等位基因的雜合后代或野生型后代。連同NOTUM基因破壞的雜合(+/-)小鼠和野生型(+/+)同窩小鼠一起研究NOTUM基因破壞的純合(-/-)小鼠。這項(xiàng)分析期間，使用設(shè)計(jì)用于評(píng)估哺乳動(dòng)物受試者體內(nèi)主要器官系統(tǒng)的功能的醫(yī)學(xué)診斷程序集成套件使小鼠進(jìn)行醫(yī)學(xué)檢查。通過(guò)連同雜合(+/-)和野生型(+/+)同窩小鼠研究所述數(shù)量的純合(-/-)“敲除”小鼠，獲得更可靠且可重復(fù)的數(shù)據(jù)。如圖1所示，NOTUM基因純合性破壞的雄性小鼠(“homs”)與其16周齡的野生型同窩小鼠相比，在不同骨部位表現(xiàn)出更大的皮質(zhì)厚度(兩組小鼠的數(shù)量N＝10)。通過(guò)microCT(ScancoμCT40)測(cè)量的這些差異為：股骨中段28％(p＜0.001)；肱骨中段19％(p＜0.001)；脛骨中段17％(p＜0.001)；和脛骨腓骨結(jié)11％(p＜0.001)。如圖2所示，16周齡時(shí)，NOTUM突變的雜合小鼠(“hets”)的股骨中段皮質(zhì)骨厚度也大于其野生型同窩小鼠：與野生型同窩小鼠(N＝23)相比，雄性hets(N＝50)表現(xiàn)出增大6％(p＝0.007)；并且與野生型同窩小鼠(N＝22)相比，雌性hets(N＝57)表現(xiàn)出增大9％(p＜0.001)。圖3和4中反映了NOTUM動(dòng)物中觀察到的骨形成重新分布的實(shí)際表現(xiàn)，其示出了使用標(biāo)準(zhǔn)4點(diǎn)彎曲試驗(yàn)進(jìn)行的股骨斷裂強(qiáng)度試驗(yàn)(由SkeleTech進(jìn)行，現(xiàn)今由RicercaBiosciences進(jìn)行)的結(jié)果。如提供了由16周齡雄性小鼠獲得的結(jié)果的圖3所示，hets(N＝20)與其野生型同窩小鼠(N＝23)相比，表現(xiàn)出股骨斷裂強(qiáng)度增強(qiáng)5％(p＝0.54)，而homs(N＝17)表現(xiàn)出增強(qiáng)28％(p＜0.001)。另一方面，與野生型對(duì)照相比，NOTUMhoms和hets的脊柱壓縮試驗(yàn)均未顯示出最大脊柱壓縮負(fù)載顯著降低。對(duì)16周齡的雌性小鼠獲得相似結(jié)果。如圖4所示，hets(N＝20)與其野生型同窩小鼠(N＝21)相比，表現(xiàn)出股骨斷裂強(qiáng)度增強(qiáng)12％(p＝0.04)，而homs(N＝18)表現(xiàn)出增強(qiáng)28％(p＜0.001)。對(duì)這些和其它數(shù)據(jù)的分析顯示皮質(zhì)厚度與股骨斷裂強(qiáng)度之間密切相關(guān)。6.2.生成和純化重組NOTUM蛋白將各自具有C端6XHis表位標(biāo)簽的人、非催化活性人(S232A)、小鼠、非催化活性小鼠(S239A)、大鼠、豚鼠、食蟹猴和恒河猴NOTUM的全長(zhǎng)編碼序列亞克隆至表達(dá)載體pIRESpuro2(Clontech)中?？墒褂帽磉_(dá)構(gòu)建體通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生成含分泌的NOTUM蛋白的條件培養(yǎng)基，或建立轉(zhuǎn)染子以生成更大量的(例如)用于NOTUM蛋白的后續(xù)純化條件培養(yǎng)基。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞并且在搖瓶中的Freestyle293表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen)中懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)。對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染4天后收獲條件培養(yǎng)基，無(wú)菌過(guò)濾并儲(chǔ)存在4℃下。為了生成穩(wěn)定表達(dá)NOTUM蛋白的細(xì)胞系，在嘌呤霉素的存在下選擇表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行基因組整合。通過(guò)細(xì)胞溶解產(chǎn)物和/或條件培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)印跡，使用抗His抗體確認(rèn)NOTUM蛋白的表達(dá)和分泌。通過(guò)有限稀釋法亞克隆生成NOTUM的散裝穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子使得能夠通過(guò)在相對(duì)高水平下通過(guò)表達(dá)NOTUM的單獨(dú)克隆的抗His蛋白質(zhì)印跡鑒定。為生成10-20mg規(guī)模的純化小鼠和人NOTUM蛋白，使表達(dá)小鼠或人NOTUM的克隆HEK293F細(xì)胞系在懸浮培養(yǎng)中擴(kuò)展至體積為3L。當(dāng)該體積下的細(xì)胞密度達(dá)到1x10^6個(gè)活細(xì)胞/ml，通過(guò)離心粒化細(xì)胞并重新懸浮于新鮮的Freestyle293表達(dá)培養(yǎng)基中并且不做另外的培養(yǎng)基變化，再保持培養(yǎng)96h。96h后，收獲培養(yǎng)物，通過(guò)離心?；?xì)胞，并且無(wú)菌過(guò)濾條件培養(yǎng)基并儲(chǔ)存在4℃下用于后續(xù)加工。純化之前立即將含NOTUM的條件培養(yǎng)基從3L濃縮至1L，然后使用標(biāo)稱截留分子量為10kDa的膜，通過(guò)切向流過(guò)濾將緩沖液更換為鎳固定化金屬親和色譜(IMAC)緩沖液(20mMTris-HCl、10mM咪唑、0.5MNaCl，pH7.4)。然后將經(jīng)濃縮、緩沖液更換的條件培養(yǎng)基涂在平衡、鎳帶電、金屬螯合柱上。使用咪唑濃度梯度洗滌并洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)?；旌虾僋OTUM蛋白質(zhì)的洗脫成分并用磷酸鹽緩沖鹽水透析以去除洗脫緩沖液。等分經(jīng)純化、透析的蛋白質(zhì)并于-80℃下冷凍。對(duì)于每批蛋白質(zhì)，使用一個(gè)等分試樣通過(guò)二喹啉甲酸(BCA)測(cè)定(ThermoScientific，Rockford，IL)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，通過(guò)SDSPAGE，接著進(jìn)行考馬斯或銀染色測(cè)定純度，在無(wú)細(xì)胞OPTS酶學(xué)測(cè)定(以下實(shí)施例6.4.1中有描述)和基于細(xì)胞的Wnt信號(hào)測(cè)定(以下實(shí)施例6.4.2中有描述)測(cè)定活性，并且通過(guò)鱟變形細(xì)胞溶解物(LAL)測(cè)定(Lonza，Basel，Switzerland)測(cè)定內(nèi)毒素濃度。6.3.生成NOTUM小鼠單克隆抗體在兩次單獨(dú)免疫活動(dòng)中，對(duì)純化重組人和小鼠NOTUM蛋白產(chǎn)生抗體。在活動(dòng)1中，用如下的人NOTUM蛋白使NOTUM基因中插入基因陷阱并因此缺乏內(nèi)源NOTUM蛋白的純合小鼠。在腹腔內(nèi)注射的完全弗氏佐劑(completeFreund’sadjuvant)中用20μg人NOTUM蛋白使小鼠致敏。每2-3周在腹腔內(nèi)注射的非完全弗氏佐劑中用20μg人NOTUM蛋白使小鼠加強(qiáng)免疫。通過(guò)ELISA測(cè)定，對(duì)人NOTUM表現(xiàn)出穩(wěn)健血清滴度的小鼠接受于靜脈內(nèi)(i.v.)注射的PBS中最后加強(qiáng)10μg人NOTUM蛋白。在活動(dòng)2中，經(jīng)由后足墊用10μg于具有CpGDNA的TiterMax佐劑中的小鼠NOTUM蛋白初始免疫使NOTUM基因中插入基因陷阱的純合小鼠免疫，接著間隔3或4天用10μg于具有CpGDNA的明礬佐劑中的小鼠NOTUM蛋白加強(qiáng)免疫10次。用10μg于PBS中的小鼠NOTUM蛋白在足墊最后加強(qiáng)免疫后，從高滴度小鼠體內(nèi)收獲腹股溝和膝后彎淋巴結(jié)。最后加強(qiáng)免疫4天后從經(jīng)靜脈內(nèi)加強(qiáng)免疫的小鼠收獲脾臟或從經(jīng)足墊免疫的小鼠收獲淋巴結(jié)并切碎和染色以獲得細(xì)胞懸浮液。溶解紅血球并通過(guò)使用涂有對(duì)非B細(xì)胞群有特異性的抗體的磁珠進(jìn)行陰性選擇富集細(xì)胞懸浮液的B細(xì)胞。通過(guò)富集B細(xì)胞與小鼠NS1骨髓瘤細(xì)胞的電細(xì)胞融合生成雜交瘤并接種至含次黃嘌呤和氨基蝶呤的雜交瘤培養(yǎng)基中的96孔板中以選擇活B細(xì)胞/骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤。通過(guò)用ELISA形式的被動(dòng)吸附NOTUM蛋白測(cè)定雜交瘤條件培養(yǎng)基的免疫反應(yīng)性，篩選雜交瘤用于生成NOTUM特異性抗體。從兩次免疫活動(dòng)中發(fā)現(xiàn)成百個(gè)分泌對(duì)小鼠和/或人NOTUM有特異性的抗體的雜交瘤。6.4.NOTUM中和測(cè)定6.4.1.OPTS測(cè)定在OPTS測(cè)定中，使用8-辛酰氧基芘-1，3，6-三磺酸三鈉(OPTS)(一種用于酯酶和脂肪酶的熒光測(cè)定的水溶性酶底物)測(cè)量NOTUM活性。酶切割OPTS中的酯鍵產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)雜交瘤條件培養(yǎng)基通常干擾OPTS測(cè)定，可能是因?yàn)閺乃兰?xì)胞釋放也可切割OPTS的水解酶。為此，生成另外的雜交瘤條件培養(yǎng)基用于通過(guò)ELISA測(cè)定最初顯示出結(jié)合活性水平最高的細(xì)胞系并且使用蛋白質(zhì)A珠通過(guò)親和色譜法以96孔形式純化抗體。然后在OPTS測(cè)定中，在4倍稀釋下測(cè)試這些純化抗體，無(wú)需預(yù)先定量。于384孔板中測(cè)試抗體，一式四份。將12.5μl含125ng于4×反應(yīng)緩沖液(20mMCaC12、2mMMgCl2、50mMTris-HCl，pH7.4)中的純化NOTUM添加到12.5μl純化抗體中。混合后，在室溫下孵育抗體和NOTUM20min，接著添加25μl于50mMTric-HCl(pH7.4)中的1.25μMOPTS(Sigma，目錄編號(hào)#74875)?；旌虾?，在通過(guò)添加25μl的3％SDS終止之前，使酶反應(yīng)在室溫下進(jìn)行10min。用485nm激發(fā)波長(zhǎng)和535nm發(fā)射波長(zhǎng)在Envision酶標(biāo)儀上讀取板以量化切割產(chǎn)物的量。從活動(dòng)1篩選1,135個(gè)人NOTUM免疫反應(yīng)性雜交瘤產(chǎn)生對(duì)人NOTUM顯示出高于70％抑制的3種抗體。選擇這3種抗體連同在OPTS測(cè)定中表現(xiàn)出一定程度中和作用的另外5種雜交瘤用于通過(guò)有限稀釋法亞克隆并且通過(guò)使用50ml條件培養(yǎng)基進(jìn)行蛋白質(zhì)A親和色譜法由克隆雜交瘤小規(guī)模生產(chǎn)純化抗體。OPTS測(cè)定篩選從活動(dòng)2鑒定的1,056個(gè)小鼠NOTUM免疫反應(yīng)性雜交瘤產(chǎn)生對(duì)小鼠NOTUM顯示出高于50％抑制的6種抗體。選擇這6種抗體連同在OPTS測(cè)定中表現(xiàn)出一定程度中和作用的另外6種雜交瘤用于通過(guò)有限稀釋法亞克隆并且通過(guò)使用50ml條件培養(yǎng)基進(jìn)行蛋白質(zhì)A親和色譜法由克隆雜交瘤小規(guī)模生產(chǎn)純化抗體。6.4.2.Wnt信號(hào)測(cè)定NOTUM可用作Wnt信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)因子。在使用技術(shù)和如以下制備的條件培養(yǎng)基的Wnt信號(hào)測(cè)定中，測(cè)定了抗體中和活性，通過(guò)對(duì)Wnt信號(hào)的影響測(cè)定。將pcDNA3.1(+)載體中含有人NOTUM的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中并且通過(guò)在400μg/mL的G418存在下生長(zhǎng)，選擇克隆。來(lái)自這些細(xì)胞的條件培養(yǎng)基用于測(cè)定。從ATCC購(gòu)買過(guò)表達(dá)并向條件培養(yǎng)基中分泌Wnt3a的L細(xì)胞。測(cè)定方法如下。使FreeStyleTM293F細(xì)胞(Invitrogen)在具有10％透析FBS、5μg/ml殺稻瘟菌素(Blasticidin)(Invitrogen，R210-01)、0.1mMNEAA、25mMHEPES和1×GPS的DMEM中的15-cm板中生長(zhǎng)至接近融合。首先用PBS洗滌，接著添加5mL胰蛋白酶并且在室溫下孵育板2min使細(xì)胞受胰蛋白酶作用。然后每張15cm板添加總計(jì)10mL的測(cè)定培養(yǎng)基(Opti-MEM，加上0.5％透析FBS、0.1mMNEAA、1mM丙酮酸鈉、10mMHEPES、1×GPS)。對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)并按50,000個(gè)細(xì)胞/mL懸浮。按每個(gè)孔10000個(gè)細(xì)胞/20μL的密度將細(xì)胞接種至Biocoat384孔板(Fisher，目錄編號(hào)#356663)。在37℃下孵育細(xì)胞3h后，每個(gè)孔添加10μL于測(cè)定培養(yǎng)基中的30mMLiCl，接著在37℃下孵育過(guò)夜。第二天，在室溫下于96孔板中，于總體積45μL的測(cè)定培養(yǎng)基中共同孵育15μL抗體和15μL純化NOTUM(均在測(cè)定培養(yǎng)基中)30min。NOTUM用于先前所述的濃度以在所述測(cè)定中產(chǎn)生50％抑制，通常為25nM。孵育30min后，將15μL未稀釋的L-Wnt3a條件培養(yǎng)基添加到45μL抗體/NOTUM混合物中，并將10μl所得混合物添加到裝有細(xì)胞的384孔板的孔中，一式四份。對(duì)照包括沒(méi)有任何細(xì)胞的孔，沒(méi)有NOTUM的孔和沒(méi)有L-Wnt3a條件培養(yǎng)基的孔。在37℃下孵育測(cè)定板5h以實(shí)現(xiàn)Wnt介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶上調(diào)，然后向每個(gè)孔添加8μlLiveBLAzerTM-FRETB/G底物(CCF4-AM，Invitrogen)并且在室溫下黑暗孵育所述板3h。然后使用400nm激發(fā)波長(zhǎng)以及460nm和535nm發(fā)射波長(zhǎng)在Envision酶標(biāo)儀上讀取板。6.5.表征NOTUM中和抗體通過(guò)ELISA表征從克隆雜交瘤純化的抗體的物種交叉反應(yīng)性，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡表征其識(shí)別還原、變性NOTUM蛋白的能力，并且表征其在以上實(shí)施例6.4中均有描述的無(wú)細(xì)胞OPTS測(cè)定和基于細(xì)胞的Wnt信號(hào)測(cè)定中的中和潛能。對(duì)來(lái)自活動(dòng)1的單克隆抗體的功能性測(cè)試揭示，在OPTS和Wnt信號(hào)測(cè)定中，3種抗體1.802、1.815、1.846中和人NOTUM，IC50在1-10nM的范圍內(nèi)。這些抗體對(duì)小鼠NOTUM的活性沒(méi)有任何影響并且經(jīng)ELISA證實(shí)結(jié)合人NOTUM，而非小鼠NOTUM。此外，這些抗體在NOTUM蛋白被動(dòng)吸附至測(cè)定板上時(shí)僅較弱地識(shí)別人NOTUM而對(duì)展示的抗His人NOTUM蛋白更敏感。表1示出了對(duì)來(lái)自活動(dòng)1的某些抗體的各種表征實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。使用以下實(shí)施例6.6中描述的方法產(chǎn)生“Bin”欄的數(shù)據(jù)。表1：對(duì)人NOTUM產(chǎn)生的某些抗體的表征對(duì)來(lái)自活動(dòng)2的單克隆抗體的功能性測(cè)試揭示了令人感興趣的活性。具體而言，在OPTS和Wnt信號(hào)測(cè)定中MAb2.78中和小鼠和人NOTUM，IC50在3-50nM的范圍內(nèi)，而在OPTS測(cè)定中MAb2.1029中和小鼠和人NOTUM，IC50在5-30nM的范圍內(nèi)，但是在Wnt信號(hào)測(cè)定中僅中和人NOTUM，IC50為14nM。這后一種觀察歸因于，重組小鼠和人NOTUM蛋白質(zhì)的量存在一些差異。蛋白質(zhì)之間一個(gè)已知的差異是，重組小鼠NOTUM作為多聚體/聚集物存在的程度比重組人NOTUM高得多。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定，2.78和2.1029均不識(shí)別還原、變性NOTUM蛋白并且實(shí)質(zhì)上對(duì)抗His展示NOTUM比對(duì)被動(dòng)吸附NOTUM更具免疫反應(yīng)性。表2示出了對(duì)來(lái)自活動(dòng)2的某些抗體的各種表征實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。使用以下實(shí)施例6.6中描述的方法產(chǎn)生“Bin”欄的數(shù)據(jù)。表2：對(duì)小鼠NOTUM產(chǎn)生的某些抗體的表征最大限度抑制≈50％。6.6.使用NOTUM中和抗體進(jìn)行結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)研究評(píng)估來(lái)自免疫活動(dòng)的抗體干擾其它抗體在表位分級(jí)測(cè)定中與NOTUM蛋白結(jié)合的能力。使用抗His捕獲NOTUM蛋白以ELISA形式進(jìn)行這項(xiàng)測(cè)定。用過(guò)量未標(biāo)記的NOTUM特異性抗體(‘阻斷’抗體)孵育捕獲NOTUM蛋白，接著添加生物素化NOTUM特異性抗體(‘探針’抗體)。使用與鏈霉親和素偶聯(lián)的HRP測(cè)量探針抗體的結(jié)合。如果兩種抗體競(jìng)爭(zhēng)在相同表位空間中結(jié)合或者如果阻斷抗體(例如)通過(guò)變構(gòu)干擾影響探針抗體結(jié)合的能力，則不產(chǎn)生信號(hào)。如果兩種抗體不相互干擾，則生成與在無(wú)阻斷抗體時(shí)測(cè)試的生物素化抗體相似的信號(hào)。以互反矩陣形式測(cè)試抗體。通常，不管二者中哪一個(gè)為阻斷抗體和哪一個(gè)為探針抗體，一對(duì)抗體都將顯示出相同的干擾水平。將表現(xiàn)出相似性質(zhì)的抗體分配至相同表位‘bin’。使用這種方法證實(shí)，MAb1.802、1.815、1.846、2.78和2.1029全部相互干擾與人NOTUM的結(jié)合，而它們不干擾幾種其它不太有效的中和劑或非中和劑的結(jié)合。6.7.NOTUM中和抗體的表位作圖為了繪制牽涉于人NOTUM特異性MAb1.802、1.815和1.846的結(jié)合的氨基酸圖譜，通過(guò)在HEK293F瞬時(shí)轉(zhuǎn)染編碼具有人和小鼠混合序列的NOTUM開(kāi)放閱讀框的表達(dá)構(gòu)建體生成人/小鼠嵌合NOTUM蛋白。通過(guò)用抗His抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法和通過(guò)OPTS測(cè)定，證實(shí)來(lái)自這些轉(zhuǎn)染的條件培養(yǎng)基含有功能性NOTUM嵌合體。圖5示出了該實(shí)驗(yàn)中使用的人/小鼠嵌合NOTUM蛋白的示意圖。第7節(jié)(序列表)中示出了那些蛋白質(zhì)的序列。條件培養(yǎng)基以ELISA形式使用以測(cè)定抗體特異性?；谌颂禺愋訫Ab喪失與特殊嵌合體的結(jié)合，確定MAb1.802、1.815和1.846(全部為“Bin1”抗體)依賴于Q47和M177之間的人NOTUM氨基酸進(jìn)行結(jié)合。見(jiàn)圖5。在該區(qū)域中，小鼠和人NOTUM有5個(gè)位置不同(R115K、D141S、R150K、R154H和Y171H，基于人序列編號(hào))。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)在這5個(gè)位置的每一個(gè)有小鼠氨基酸的人NOTUM的構(gòu)建體產(chǎn)生人NOTUM點(diǎn)突變體并且在OPTS測(cè)定中證實(shí)點(diǎn)突變體全部有功能性。通過(guò)ELISA，MAb1.802、1.815和1.846結(jié)合除人NOTUMD141S外的所有點(diǎn)突變體，表明該氨基酸對(duì)于其和人NOTUM的結(jié)合很重要。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生成具有互反點(diǎn)突變的小鼠NOTUM，小鼠NOTUMS148D，證實(shí)在OPTS測(cè)定中有活性，并且證實(shí)支持結(jié)合人NOTUM特異性MAb。因此，MAb1.802、1.815和1.846的物種特異性似乎取決于人NOTUM中位置141處的氨基酸，這是天然人NOTUM蛋白中的天冬氨酸。嵌合體方法不可用于繪制牽涉于MAb2.78或2.1029的結(jié)合的氨基酸圖譜，因?yàn)镸Ab2.78或2.1029與人和小鼠NOTUM交叉反應(yīng)。基于MAb1.802、1.815、1.846、2.78和2.1029相互干擾結(jié)合的發(fā)現(xiàn)，對(duì)人D141附近的帶電氨基酸殘基進(jìn)行丙氨酸掃描誘變。構(gòu)建5種人NOTUM突變體，每一種均具有一對(duì)帶電殘基突變?yōu)楸彼幔喝薔OTUMN132A/R133A(SEQIDNO：96)；人NOTUME134A/N135A(SEQIDNO：97)；人NOTUMD137A/R139A(SEQIDNO：98)；人NOTUMR144A/R145A(SEQIDNO：99)；和人NOTUMR150A/D151A(SEQIDNO：100)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后5種人突變體全部有效表達(dá)并分泌。5種突變體中有4種在OPTS測(cè)定中表現(xiàn)出顯著活性，而第5種(人NOTUMD137A/R139A)顯示出很少或沒(méi)有活性。以ELISA形式，用至少一些活動(dòng)1和活動(dòng)2MAb檢測(cè)所有這5種突變體。MAb2.78不能結(jié)合人NOTUMD137A/R139A和人NOTUMR144A/R145A，而MAb1.802、1.815和1.846僅僅不能結(jié)合NOTUMR144A/R145A。MAb2.1029對(duì)5種丙氨酸突變體全部有免疫反應(yīng)性。6.8.NOTUM中和抗體的結(jié)合親和力使用Biacore3000測(cè)定了某些抗NOTUMMAb的結(jié)合親和力。為了獲得與多聚體小鼠NOTUM蛋白結(jié)合的有意義的親和力值，通過(guò)用無(wú)花果蛋白酶(Ficin)消化完整IgG，接著通過(guò)蛋白質(zhì)A親和色譜法去除未消化的IgG和Fc片段生成抗體FAb片段。FAb和完整IgG與人NOTUM結(jié)合的親和力值相當(dāng)，并且其親和力值在單位數(shù)至低雙位數(shù)nM范圍內(nèi)，如表3所示。表3：對(duì)人和小鼠NOTUM產(chǎn)生的某些抗體的結(jié)合親和力6.9.向小鼠施用NOTUM中和抗體6.9.1.每周一次施用NOTUM中和抗體，持續(xù)8周通過(guò)每周一次腹腔內(nèi)注射30mg/kg，為8周齡雄性F1雜交(129×C57)小鼠施用NOTUM中和抗體2.1029或2.78b或?qū)φ湛贵w，持續(xù)8周。每組有12只小鼠。研究結(jié)束時(shí)，處死小鼠。在驗(yàn)尸后通過(guò)microCT，使用ScancoμCT40測(cè)定骨量和結(jié)構(gòu)，閾值為240，積分時(shí)間為200ms而X-射線管電壓為55keV。如圖6所示，與對(duì)照抗體相比，施用NOTUM中和抗體2.1029使股骨中段皮質(zhì)厚度增加12％(P＜0.001)，而施用NOTUM中和抗體2.78b增加16％(P＜0.001)。6.9.2.每周一次施用NOTUM中和抗體2.1029，持續(xù)4周通過(guò)每周一次腹腔內(nèi)注射3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg，為8周齡雄性F1雜交(129×C57)小鼠施用NOTUM中和抗體2.1029，持續(xù)4周。每組有10只小鼠。研究結(jié)束時(shí)，處死小鼠。在驗(yàn)尸后通過(guò)microCT，使用ScancoμCT40測(cè)定骨量和結(jié)構(gòu)，閾值為240，積分時(shí)間為200ms而X-射線管電壓為55keV。如圖7所示，相對(duì)于施用對(duì)照抗體，施用30mg/kgNOTUM中和抗體2.1029使股骨中段皮質(zhì)厚度增加5％(P＝0.12)。6.9.3.每周一次施用NOTUM中和抗體2.78b，持續(xù)4周通過(guò)每周一次腹腔內(nèi)注射3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg，為8周齡雄性F1雜交(129×C57)小鼠施用NOTUM中和抗體2.78b，持續(xù)4周。在第一次實(shí)驗(yàn)中每組有10只小鼠。在第二次實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)每周一次腹腔內(nèi)注射0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg施用NOTUM中和抗體2.78b，持續(xù)4周。在第二次實(shí)驗(yàn)中每組有12只小鼠。研究結(jié)束時(shí)，處死小鼠。在驗(yàn)尸后通過(guò)microCT，使用ScancoμCT40測(cè)定骨量和結(jié)構(gòu)，閾值為240，積分時(shí)間為200ms而X-射線管電壓為55keV。如圖8A所示，在第一次實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于施用對(duì)照抗體，施用3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的NOTUM中和抗體2.78b分別使股骨中段皮質(zhì)厚度增加13％(P＜0.001)、17％(P＜0.001)和16％(P＜0.001)。如圖8B所示，在第二次實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于施用對(duì)照抗體，施用0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg的NOTUM中和抗體2.78b分別使股骨中段皮質(zhì)厚度增加3％(P＝0.46)、7％(P＝0.01)和10％(P＜0.001)。6.9.4.用唑來(lái)膦酸鹽預(yù)處理，每周一次施用NOTUM中和抗體2.78b，持續(xù)4周通過(guò)腹腔內(nèi)注射為28周齡雄性F1雜交小鼠(129×C57)施用單劑量50μg/kg唑來(lái)膦酸鹽。所述劑量的唑來(lái)膦酸鹽后4周，通過(guò)每周一次腹腔內(nèi)注射為小鼠施用10mg/kgNOTUM中和抗體2.78b，持續(xù)4周。研究結(jié)束時(shí)，處死小鼠。每組有11或12只小鼠。在驗(yàn)尸后通過(guò)microCT，使用ScancoμCT40測(cè)定骨量和結(jié)構(gòu)，閾值為240，積分時(shí)間為200ms而X-射線管電壓為55keV。另外，在第一個(gè)劑量的Mab2.78b7天后使用商用ELISA測(cè)定(ImmunodiagnosticSystems，Scottsdale，AZ)測(cè)量為骨形成標(biāo)記的PINP的血清水平。如圖9A所示，相對(duì)于施用了鹽水和對(duì)照抗體的小鼠，在施用了唑來(lái)膦酸鹽和對(duì)照抗體的小鼠體內(nèi)，股骨中段皮質(zhì)厚度增加10μm或4％(P＝0.31)。相對(duì)于施用了鹽水和對(duì)照抗體的小鼠，在未經(jīng)唑來(lái)膦酸鹽預(yù)處理的情況下，施用了NOTUM中和抗體2.78b的小鼠體內(nèi)，股骨中段皮質(zhì)厚度增加23μm或9％(P＜0.001)，并且相對(duì)于施用了唑來(lái)膦酸鹽和對(duì)照抗體的小鼠，在經(jīng)唑來(lái)膦酸鹽預(yù)處理的情況下，施用了NOTUM中和抗體2.78b的小鼠體內(nèi)，股骨中段皮質(zhì)厚度增加14μm或5％(P＝0.06)。圖9B顯示，相對(duì)于施用了鹽水和對(duì)照抗體的小鼠，在施用了唑來(lái)膦酸鹽處理和對(duì)照抗體的小鼠體內(nèi)，血清PINP水平降低15ng/mL或50％(P＜0.001)。相對(duì)于施用了鹽水和對(duì)照抗體的小鼠，在未經(jīng)唑來(lái)膦酸鹽預(yù)處理的情況下，施用了NOTUM中和抗體2.78b的小鼠體內(nèi)，PINP水平升高14ng/mL或47％(P＜0.001)，并且相對(duì)于施用了唑來(lái)膦酸鹽和對(duì)照抗體的小鼠，在經(jīng)唑來(lái)膦酸鹽預(yù)處理的情況下，施用了NOTUM中和抗體2.78b的小鼠體內(nèi)，PINP水平升高12ng/mL或79％(P＜0.001)。6.9.5.施用NOTUM中和抗體2.78a，持續(xù)4周對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，將為IgG2b抗體的Mab2.78(也稱為“2.78b”)重新格式化為IgG2a抗體(往往IgG2a抗體的半衰期比IgG2b抗體長(zhǎng))。重新格式化的Mab2.78稱為“2.78a”。通過(guò)每周一次腹腔內(nèi)注射0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg，為13周齡雄性F1雜交小鼠(129×C57)施用NOTUM中和抗體2.78a，持續(xù)4周。每組有10或12只小鼠。每次研究結(jié)束時(shí)，處死小鼠。在驗(yàn)尸后通過(guò)microCT，使用ScancoμCT40測(cè)定骨量和結(jié)構(gòu)，閾值為240，積分時(shí)間為200ms而X-射線管電壓為55keV。如圖10所示，在該實(shí)驗(yàn)中施用0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg的NOTUM中和抗體2.78a使股骨中段皮質(zhì)厚度分別增加3％(P＝0.57)、7％(P＝0.02)、9％(P＝0.002)和10％(P＜0.001)。6.9.6.每周一次或每?jī)芍芤淮问┯肗OTUM中和抗體2.78a，持續(xù)12周通過(guò)每周一次腹腔內(nèi)注射為10周齡雄性F1雜交小鼠(129×C57)施用對(duì)照抗體、0.3mg/kgNOTUM中和抗體2.78a，持續(xù)12周，或通過(guò)每隔一周(兩周一次)腹腔內(nèi)注射施用1mg/kgNOTUM中和抗體2.78a，持續(xù)12周或24周。每個(gè)施用組有12只小鼠。在研究結(jié)束時(shí)，處死小鼠。在驗(yàn)尸后通過(guò)microCT，使用ScancoμCT40測(cè)定骨量和結(jié)構(gòu)，閾值為240，積分時(shí)間為200ms而X-射線管電壓為55keV。如圖11A所示，在分別每周一次施用0.3mg/kg和每?jī)芍芤淮问┯?mg/kgNOTUM中和抗體2.78a，持續(xù)12周的小鼠體內(nèi)，股骨中段皮質(zhì)厚度增加6％(P＜0.001)和9％(P＜0.001)。類似地，如圖11B所示，在分別每周一次施用0.3mg/kg和每?jī)芍芤淮问┯?mg/kgNOTUM中和抗體2.78a，持續(xù)12周的小鼠體內(nèi)，股骨中段皮質(zhì)厚度增加5％(P＝0.007)和7％(P＜0.001)。如圖12A所示，在分別每周一次施用0.3mg/kg和每?jī)芍芤淮问┯?mg/kgNOTUM中和抗體2.78a，持續(xù)24周的小鼠體內(nèi)，股骨中段皮質(zhì)厚度增加7％(P＝0.002)和9％(P＜0.001)。如圖12B所示，在分別每周一次施用0.3mg/kg和每?jī)芍芤淮问┯?mg/kgNOTUM中和抗體2.78a，持續(xù)24周的小鼠體內(nèi)，股骨中段皮質(zhì)厚度增加3％(P＝0.09)和8％(P＜0.001)。最后，如圖12C所示，在分別每周一次施用0.3mg/kg和每?jī)芍芤淮问┯?mg/kgNOTUM中和抗體2.78a，持續(xù)24周的小鼠體內(nèi)，第九肋皮質(zhì)厚度增加7％(P＝0.02)和9％(P＝0.003)。6.10.向去卵巢小鼠施用NOTUM中和抗體6.10.1.卵巢切除術(shù)為16周齡白化C57BL/6J雌性小鼠切除卵巢或給予假手術(shù)。在卵巢切除術(shù)之后和施用NOTUM中和抗體之前的間隔，使用商用ELISA測(cè)定(ImmunodiagnosticSystems，Scottsdale，AZ)測(cè)量為骨形成標(biāo)記的PINP和為骨吸收標(biāo)記的CTX的血清水平，以確認(rèn)在卵巢切除術(shù)之后發(fā)生的骨再造增多。手術(shù)之后和開(kāi)始治療之前，如表4所示，去卵巢小鼠相對(duì)于假手術(shù)小鼠顯示出骨再造增多。因?yàn)樾×汗呛斜绕べ|(zhì)骨更多的骨細(xì)胞，所以這些數(shù)據(jù)很可能反映主要是小梁骨再造增多。表4：手術(shù)后的骨標(biāo)記水平6.10.2.向去卵巢小鼠施用NOTUM中和抗體2.78b從手術(shù)后8周開(kāi)始，通過(guò)每周一次腹腔內(nèi)注射10mg/kg，施用NOTUM中和抗體2.78b或?qū)φ湛贵w4周。研究包括表5所示的處理組。表5：卵巢切除(OVX)研究中的處理組小鼠數(shù)量手術(shù)抗體13假對(duì)照13*假NOTUM10OVX對(duì)照11OVXNOTUM*該組中最初有14只小鼠，但是研究期間一只小鼠死亡。為評(píng)估新骨形成的位置和程度，在處理第7、14和21天(即，第2、3和4次處理)施用熒光染料骨標(biāo)記。在第7天施用發(fā)出綠色熒光的鈣黃綠素；在第14天施用發(fā)出紅色熒光的茜素；并且在第21天施用發(fā)出黃色熒光的四環(huán)素。在4周處理結(jié)束時(shí)處死小鼠。驗(yàn)尸時(shí)子宮重量證實(shí)卵巢切除手術(shù)成功。(數(shù)據(jù)未示出)。6.10.3.經(jīng)NOTUM中和抗體處理的去卵巢小鼠的骨量和結(jié)構(gòu)在驗(yàn)尸后通過(guò)microCT，使用ScancoμCT40測(cè)定骨量和結(jié)構(gòu)，閾值為240，積分時(shí)間為200ms而X-射線管電壓為55keV。掃描股骨中段、LV5椎體和股骨頸。如圖13A所示，相對(duì)于施用了對(duì)照抗體的假手術(shù)小鼠，在施用了NOTUM中和抗體2.78b的假手術(shù)小鼠體內(nèi)股骨中段皮質(zhì)厚度增加22μm或9％，并且相對(duì)于施用了對(duì)照抗體的去卵巢小鼠，在施用了NOTUM中和抗體2.78b的去卵巢小鼠體內(nèi)增加26μm或12％。如圖13B所示，相對(duì)于施用了對(duì)照抗體的假手術(shù)小鼠，在施用了NOTUM中和抗體2.78b的假手術(shù)小鼠體內(nèi)股骨中段礦化骨面積增加0.1mm2或11％，并且相對(duì)于施用了對(duì)照抗體的去卵巢小鼠，在施用了NOTUM中和抗體2.78b的去卵巢小鼠體內(nèi)增加0.08mm2或10％。如圖14A所示，相對(duì)于施用了對(duì)照抗體的假手術(shù)小鼠，在施用了NOTUM中和抗體2.78b的假手術(shù)小鼠體內(nèi)LV5椎體中總(皮質(zhì)加上小梁)骨體積與總體積的比例增大9％，并且相對(duì)于施用了對(duì)照抗體的去卵巢小鼠，在施用了NOTUM中和抗體2.78b的去卵巢小鼠體內(nèi)增大3％。如圖14B所示，相對(duì)于施用了對(duì)照抗體的假手術(shù)小鼠，在施用了NOTUM中和抗體2.78b的假手術(shù)小鼠體內(nèi)LV5椎體中皮質(zhì)骨體積與總體積的比例增大13％，并且相對(duì)于施用了對(duì)照抗體的去卵巢小鼠，在施用了NOTUM中和抗體2.78b的去卵巢小鼠體內(nèi)增大9％。如圖14C所示，在假手術(shù)小鼠或去卵巢小鼠體內(nèi)施用NOTUM中和抗體2.78b不顯著影響LV5椎體中小梁骨體積與總體積的比例。最后，如圖15所示，相對(duì)于施用了對(duì)照抗體的假手術(shù)小鼠，在施用了NOTUM中和抗體2.78b的假手術(shù)小鼠體內(nèi)股骨頸骨體積與總體積的比例增大4％，并且相對(duì)于施用了對(duì)照抗體的去卵巢小鼠，在施用了NOTUM中和抗體2.78b的去卵巢小鼠體內(nèi)增大6％。6.10.4.經(jīng)NOTUM中和抗體處理的去卵巢小鼠的骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)使用快速包埋方法將股骨干包埋在甲基丙烯酸甲酯中。見(jiàn)Brommage和Vafai，CalcifiedTissueInt’l67：479(2000)。使用LeicaSP1600骨鋸制備約80μm厚的中段橫切片。然后用OlympusBX60熒光顯微鏡檢查切片。使用OsteoMeasureTM軟件(OsteoMetrics，Decatur，GA)測(cè)定各個(gè)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)。在100×放大倍數(shù)下測(cè)量靜態(tài)參數(shù)(例如骨面積和厚度)和動(dòng)態(tài)參數(shù)(例如單標(biāo)表面(SLS)、礦化沉積速率(MAR)和骨形成率(BFR))。圖16示出了經(jīng)第7天施用的鈣黃綠素、第14天施用的茜素和第21天施用的四環(huán)素標(biāo)記的股骨中段橫切片的內(nèi)皮質(zhì)表面百分比。表6示出了對(duì)圖16中的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。與施用了對(duì)照抗體的小鼠相比，施用了NOTUM中和抗體2.78b的小鼠在第7和14天顯示出明顯更高的內(nèi)皮質(zhì)標(biāo)記百分比。表6：?jiǎn)螛?biāo)表面％的雙因素ANOVA雙因素ANOVA第7天第14天第21天卵巢切除術(shù)的影響P＝0.16P＝0.65P＝0.28處理的影響P＜0.001P＜0.001P＝0.02相互作用的影響P＝0.66P＝0.74P＝0.77圖17示出了施用了對(duì)照抗體或NOTUM中和抗體2.78b的假手術(shù)和去卵巢小鼠的礦化沉積速率(A)和體積所指的骨形成率(B)。通過(guò)測(cè)量鈣黃綠素標(biāo)記(第7天)和茜素標(biāo)記(第14天)之間的距離并除以7獲得“第7-14天速率”，并且測(cè)量茜素標(biāo)記(第14天)和四環(huán)素標(biāo)記(第21天)之間的距離并除以7獲得“第14-21天速率”測(cè)定礦化沉積速率(圖17A)。表7示出了對(duì)圖17A中的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。在從第7天到第14天的時(shí)間段內(nèi)，施用了NOTUM中和抗體2.78b的小鼠顯示出比施用了對(duì)照抗體的小鼠更高的礦化沉積速率。表7：礦化沉積速率的雙因素ANOVA通過(guò)牽涉內(nèi)皮質(zhì)礦化表面(源自圖16的雙標(biāo)表面加上一半單標(biāo)表面的百分比)乘以礦化沉積速率(見(jiàn)圖17A)的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算測(cè)定體積所指的骨形成率(圖17B)。結(jié)果為骨形成率除以骨體積，表示為每7天的百分比。表8示出了對(duì)圖17B中的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。如圖17B所示，在施用了NOTUM中和抗體2.78b的小鼠體內(nèi)每個(gè)骨體積的骨形成率比施用了對(duì)照抗體的小鼠明顯更高。表8：體積所指的骨形成率的雙因素ANOVA雙因素ANOVA第7-14天第14-21天卵巢切除術(shù)的影響P＝0.95P＝0.80處理的影響P＜0.001P＜0.001相互作用的影響P＝0.39P＝0.306.11.鑒定適合測(cè)試NOTUM中和抗體的物種基于從公共領(lǐng)域獲得的多物種蛋白序列比對(duì)，預(yù)計(jì)MAb1.802、1.815和1.846會(huì)與豚鼠NOTUM結(jié)合并且因此該物種可能適合臨床前研究。為檢驗(yàn)這個(gè)假設(shè)，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染克隆并表達(dá)豚鼠NOTUM，并且證實(shí)在OPTS測(cè)定中有活性。通過(guò)ELISA發(fā)現(xiàn)MAb1.802、1.815和1.846與豚鼠NOTUM結(jié)合并且在OPTS測(cè)定中證實(shí)MAb1.802中和豚鼠NOTUM活性。MAb2.78以低于MAb1.802的親和力結(jié)合豚鼠NOTUM，并且在OPTS測(cè)定中具有相應(yīng)更低的抑制活性。MAb2.1029僅弱結(jié)合豚鼠NOTUM，并且在OPTS測(cè)定中未明顯抑制豚鼠NOTUM。從來(lái)自所述物種的cDNA制劑克隆食蟹猴和恒河猴NOTUM。序列分析揭示，與人NOTUMD141等效的位置處的氨基酸為天冬酰胺，與小鼠和人NOTUM中該位置處的氨基酸不同。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生成活性(通過(guò)OPTS測(cè)定確定)食蟹猴和恒河猴NOTUM蛋白，并且發(fā)現(xiàn)MAb1.802既不結(jié)合也不抑制任一種蛋白質(zhì)。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生成活性人NOTUM點(diǎn)突變體，人NOTUMD141N，并且發(fā)現(xiàn)MAb1.802不與人NOTUM點(diǎn)突變體結(jié)合。通過(guò)ELISA，MAb2.78弱結(jié)合食蟹猴和恒河猴NOTUM，但是在OPTS測(cè)定中并不顯著抑制任一種蛋白質(zhì)。相反，通過(guò)ELISA，MAb2.1029不但結(jié)合食蟹猴和恒河猴NOTUM而且結(jié)合人NOTUM，并且在OPTS測(cè)定中不但抑制兩種蛋白質(zhì)而且抑制人NOTUM。6.12.抗體測(cè)序和人源化通過(guò)使用來(lái)自有關(guān)雜交瘤細(xì)胞的總RNA進(jìn)行特異性RT-PCR，接著為PCR產(chǎn)物測(cè)序，為重鏈和輕鏈可變區(qū)測(cè)序。為來(lái)自4種活動(dòng)1抗體：1.731、1.802、1.815和1.846和3種活動(dòng)2抗體：2.1029、2.55和2.78的重鏈和輕鏈可變區(qū)測(cè)序。在以下第7節(jié)(序列表)中示出了所述抗體中每一種的可變區(qū)序列(無(wú)信號(hào)序列)。第7節(jié)還示出了所述抗體中每一種的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的序列。下表示出了與所述抗體中每一種的重鏈和輕鏈可變區(qū)以及CDR1、CDR2和CDR3相對(duì)應(yīng)的SEQIDNO。表9：重鏈和輕鏈可變區(qū)以及CDR的SEQIDNO發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)或更多個(gè)測(cè)序抗體之間，某些重鏈和輕鏈CDR具有高同源性。MAb1.802和1.846共有相同重鏈CDR1(GFTFSDYGMH；SEQIDNO：17和33)；而MAb1.815的重鏈CDR1(GFTFSDFGMH；SEQIDNO：25)與MAb1.802和1.846僅有一個(gè)保守性氨基酸取代(苯丙氨酸(F)代替酪氨酸(Y))不同。因此所述抗體重鏈CDR1的共有序列為GFTFSDX1GMH(SEQIDNO：90)，其中X1為F或Y。MAb1.802和1.846的重鏈CDR3僅有一個(gè)保守性氨基酸取代(組氨酸(H)與天冬酰胺(N))不同。因此所述抗體重鏈CDR3的共有序列為KX2YNGGYFDV(SEQIDNO：91)，其中X2為H或N。MAb1.802和1.846共有相同輕鏈CDR2(LASNLES；SEQIDNO：21和37)，而MAb1.815的輕鏈CDR2(LASDLES；SEQIDNO：29)與MAb1.802和1.846僅有一個(gè)保守性氨基酸取代(天冬氨酸(D)代替天冬酰胺(N))不同。因此所述抗體輕鏈CDR2的共有序列為L(zhǎng)ASX6LES(SEQIDNO：93)，其中X6為D或N。最后，來(lái)自活動(dòng)1的3種抗體1.802、1.846和1.815的輕鏈CDR1的共有序列為RASKX3VSX4SGYSYX5H(SEQIDNO：92)，其中X3為I或S，X4為T或E，并且X5為M或I。對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索以鑒定與每個(gè)小鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)的相似性最大的人種系可變區(qū)序列。使用AbM定義，然后將硅片上來(lái)自小鼠可變區(qū)的CDR移植到這些人種系可變序列中，代替人種系CDR。用編碼框內(nèi)信號(hào)肽的5’前導(dǎo)序列合成5種小鼠抗體(2.78、2.1029、1.802、1.815和1.846)的所得人源化可變區(qū)并且在重鏈可變序列的情況下克隆在編碼人IgG2恒定區(qū)的序列上游或在輕鏈可變序列的情況下克隆在編碼人κ恒定區(qū)的序列上游。以下第7節(jié)(序列表)中示出了每個(gè)人源化可變區(qū)的序列，連同全長(zhǎng)人源化重鏈和輕鏈(無(wú)信號(hào)肽)的序列。將全長(zhǎng)人源化重鏈和輕鏈的編碼序列亞克隆至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中并且將相應(yīng)重鏈和輕鏈構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞中。通過(guò)用抗人二級(jí)抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢查所得條件培養(yǎng)基以確認(rèn)完整人源化抗體的表達(dá)和分泌。然后以ELISA形式測(cè)試條件培養(yǎng)基以確定人源化抗體是否保持結(jié)合人NOTUM蛋白的能力。人源化MAb1.802、1.815、1.846和2.1029結(jié)合人NOTUM，而人源化MAb2.78表現(xiàn)出與人或小鼠NOTUM很少或不結(jié)合。以上引用的所有參考通過(guò)引用整體并入本文用于任何目的。7.序列表