專利名稱：納米聚合物對免疫調(diào)節(jié)劑的腫瘤靶向遞送的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
闡述了包含生物可降解聚合物的納米構(gòu)建物(nanoconstruct),所述生物可降解聚合物與可靶向腫瘤并增強(qiáng)在腫瘤位點(diǎn)駐留的腫瘤結(jié)合配體和抗體綴合。通過讓納米構(gòu)建物與正協(xié)同刺激信號激動(dòng)劑和負(fù)免疫調(diào)節(jié)信號抑制劑聯(lián)合，來進(jìn)一步提高抗腫瘤免疫力。
背景技術(shù)：
因其遍及全身廣泛轉(zhuǎn)移的傾向，黑素瘤是皮膚癌中最為致命的。一旦其擴(kuò)散到遠(yuǎn)端部位，則生存中值小于6個(gè)月。當(dāng)前常規(guī)療法對抗轉(zhuǎn)移性黑素瘤的功效有限。現(xiàn)在有強(qiáng)有力的證據(jù)表明，對于一些轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者，免疫系統(tǒng)可在誘導(dǎo)長期益處中發(fā)揮重要作用。一種發(fā)展強(qiáng)烈免疫應(yīng)答的方法涉及通過使用特異性toll樣受體(“TLR”)來激活先天免疫細(xì)胞，例如漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(“PDC”)。在直接應(yīng)答CpG寡脫氧核苷酸刺激的pDC和B細(xì)胞中，TLR9是人TLR表達(dá)中最特異性的。不幸的是，CpG的全身注射導(dǎo)致主要免疫器官中pDC細(xì)胞的激活，并耗盡腫瘤之外的這一重要類型的抗腫瘤細(xì)胞庫。因此，存在將CpG靶向遞送至黑素瘤以增強(qiáng)抗腫瘤活性同時(shí)降低或消除PDC的全身性激活的需求。發(fā)明簡述
本文提出了通過生物可降解的L-PG在體內(nèi)將CpG靶向遞送至黑素瘤，其中該遞送系統(tǒng)有效產(chǎn)生所需的保護(hù)性免疫，增強(qiáng)抗腫瘤活性，并降低或甚至消除PDC的全身性激活。闡述了與可靶向腫瘤并增強(qiáng)在腫瘤位點(diǎn)駐留的腫瘤結(jié)合配體及抗體綴合的可降解聚合物。舉 例而言，一種所述聚合綴合物為多聚(L-谷氨酸)-CpG綴合物(“L-PG-CpG”)。已表明L-PG-CpG比游離CpG更好地降低腫瘤生長，并引發(fā)更強(qiáng)的對腫瘤抗原(OVA)的全身性⑶8T細(xì)胞應(yīng)答。這種親巨曬細(xì)胞的(macrophage-tropic)聚合物與腫瘤浸潤巨曬細(xì)胞相互作用，并聚積在腫瘤位點(diǎn)。附圖簡述


圖1提供的兩幅圖說明通過TLR激動(dòng)劑腫瘤內(nèi)激活PDC引發(fā)腫瘤抗原特異性的CD8應(yīng)答，該應(yīng)答隨后導(dǎo)致對遠(yuǎn)端腫瘤的排斥。具體而言，圖1A顯示瘤內(nèi)注射CpG誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的“引發(fā)階段”，將其定義為引發(fā)抗原特異性的適應(yīng)性免疫細(xì)胞(CD4和CD8 T細(xì)胞)。在弓丨發(fā)階段，CpG激活pDC以產(chǎn)生INF-α，INF-α進(jìn)一步激活NK細(xì)胞。NK細(xì)胞裂解腫瘤細(xì)胞并釋放腫瘤抗原至mDC。INF-α亦激活mDC以變成有效的專門抗原呈遞細(xì)胞。隨后mDC遷移至腫瘤引流淋巴結(jié)，在此其誘導(dǎo)抗原-特異性⑶4和⑶8 T細(xì)胞擴(kuò)增。圖1B說明⑶4和CD8 T細(xì)胞在淋巴結(jié)中擴(kuò)增后，其進(jìn)入血液循環(huán)，觸發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的“效應(yīng)階段”。在效應(yīng)階段，抗原特異性的CD8 T細(xì)胞和其它腫瘤殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)被募集至腫瘤位點(diǎn)。最重要的是，CD8 T細(xì)胞和NK細(xì)胞不但可進(jìn)入接受瘤內(nèi)注射的原發(fā)腫瘤，而且還可進(jìn)入瘤內(nèi)注射不可及的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移性腫瘤。遠(yuǎn)端腫瘤的免疫排斥是腫瘤內(nèi)CpG治療的另一個(gè)主要優(yōu)勢。圖2說明了決定⑶8 T細(xì)胞的腫瘤殺傷活性的負(fù)和正協(xié)同刺激途徑。⑶8細(xì)胞的腫瘤殺傷活性不但受通過T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的腫瘤抗原識(shí)別的調(diào)控，而且還受負(fù)和正協(xié)同刺激途徑的調(diào)控。以CTLA4途徑為代表的B7負(fù)協(xié)同刺激途徑，關(guān)閉CD8 T細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。正協(xié)同刺激途徑例如0X40和細(xì)胞因子(IL-2)增強(qiáng)CD8細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。已開發(fā)出靶向免疫-協(xié)同刺激途徑的抗腫瘤試劑。在治療人腎臟細(xì)胞癌中，針對CTLA4的拮抗劑抗體已顯示出初始希望。0X40的激動(dòng)劑抗體已顯示荷瘤小鼠的存活顯著提高。可合理地將這些試劑與TLR9激動(dòng)劑聯(lián)合用于癌癥治療。 圖3顯示用于磁共振成像(PG-Gd)、近紅外熒光成像(PG-NIR)、雙光學(xué)/MR成像(PG-Gd-NIR)的PG和基于PG的綴合物的結(jié)構(gòu)，以及為用光學(xué)/MR成像可顯現(xiàn)的免疫刺激試劑的PG-CpG綴合物[PG-Gd(111In)-CpG和PG-NIR-CpG]的結(jié)構(gòu)。當(dāng)多聚氨基酸由L-谷氨酸組成時(shí)，用L-PG來表示PG ;當(dāng)多聚氨基酸由D-谷氨酸組成時(shí)，用D-PG來表示PG，NIR、近紅外。DTPA為二亞乙基三胺五乙酸。圖4顯示僅瘤內(nèi)注射CpG來治療小鼠中的B16F10黑素瘤。在C57BL6小鼠的右側(cè)皮下接種B16F10黑素瘤細(xì)胞。在腫瘤接種的同一天采用流體動(dòng)力學(xué)的方法將FLT3配體DNA (10 μ g/小鼠)注射進(jìn)小鼠中，以在體內(nèi)擴(kuò)增樹突細(xì)胞。在腫瘤接種和樹突細(xì)胞擴(kuò)增后7天，注射20 yg CpG0對照組意指僅有FLT3配體治療而無CpG治療的荷瘤小鼠。通過腫瘤內(nèi)或腹膜內(nèi)注射來遞送CpG，劑量為每次注射20 Ug CpG (在50 μ I PBS中)。圖5Α、5Β和5C顯示PG-CpG增強(qiáng)CpG的免疫刺激效力和抗腫瘤功效。圖5Α顯示在小鼠模型中，當(dāng)腫瘤內(nèi)給予時(shí)，L-PG-CpG比CpG更有效地抵抗黑素瘤腫瘤移植物。給C57B6小鼠皮下接種B16-0VA腫瘤細(xì)胞七天之后，將L-PG-CpG (50 Pg當(dāng)量CpG)、CpG (50 Pg)或L-PG (500 Pg)注射到腫瘤中。每3天通過測量腫瘤的垂直直徑來測量腫瘤的大小(η =
5)。圖5Β顯示當(dāng)腫瘤內(nèi)給予時(shí)，L-PG-CpG在觸發(fā)抗原特異性的免疫應(yīng)答中比CpG更有效。以A圖中的方式處理荷有皮下B16-0VA腫瘤的小鼠。用荷載0VA257-264肽的四聚體(BDPharmingen, San Diego, CA)，將腫瘤抗原-特異性的⑶8應(yīng)答測量為OVA-特異性的⑶8T細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖5C顯示L-PG-CpG(而非可溶性CpG)特異性地激活腫瘤中的免疫細(xì)胞。在瘤內(nèi)注射每種藥物之后5天，提取來自腫瘤和脾臟的免疫細(xì)胞，通過用抗CD69抗體染色來分析NK細(xì)胞的激活作用。PG-CpG保留了其對腫瘤的特異性。相比之下，可溶性CpG同樣可激活脾臟中的NK細(xì)胞。實(shí)線未處理對照。虛線用CpG或L-PG-CpG處理。圖6說明瘤內(nèi)注射后L-PG聚合物的分布。圖6A為注射L-PG-NIR至裸小鼠舌的人DM14鱗狀細(xì)胞癌中后24小時(shí)獲得的NIRF圖像，其顯示了聚合物在注射位點(diǎn)和引流頸淋巴結(jié)中的駐留(箭頭)。圖6B為所切除的腫瘤和淋巴結(jié)的NIRF圖像。圖6C為所切除的淋巴結(jié)經(jīng)H&E染色后的顯微照片。圖6D顯示通過放射自顯影檢查的111In-標(biāo)記的L-PG-CpG和CpG在B16黑素瘤中的駐留。
圖7為接種B16-0VA黑素瘤后獲得的數(shù)據(jù)，用PBS、CpG、抗小鼠0X40或CpG加抗小鼠0X40治療小鼠。圖7A提供隨時(shí)間變化的腫瘤面積(mm3)。圖7B提供隨時(shí)間變化的特異性O(shè)VA抗原-陽性的⑶8+ T細(xì)胞占總的⑶8 T細(xì)胞的百分比。圖8為靜脈內(nèi)注射后CpG和PG-CpG的生物分布。肝和脾對PG-CpG的攝取顯著更少。圖9顯示PG-Gd-NIR被腫瘤中的巨噬細(xì)胞/APC所攝取。圖9A顯示靜脈內(nèi)注射后24小時(shí)，PG-Gd-NIR與CD68巨噬細(xì)胞/APC標(biāo)記共同位于裸大鼠的C6腫瘤中。圖9B-D顯示，在荷有A20 B-細(xì)胞淋巴瘤的同基因Balb/c小鼠中，用氯膦酸鹽(clodronate)脂質(zhì)體消耗巨噬細(xì)胞/APC，導(dǎo)致腫瘤中PG-Gd-NIR的攝取減少。在注射PG-Gd-NIR (O. 02毫摩爾當(dāng)量Gd/kg，48納摩爾NIR染料/小鼠)的24小時(shí)之前注射氯膦酸鹽脂質(zhì)體。圖9B提供用FMT2500 3D光學(xué)成像系統(tǒng)獲得的近紅外熒光圖像。圖9C為注射Pg-Gd-NIR后2天在
4.7T獲得的Tl-加權(quán)MR圖像。圖9D為經(jīng)切除腫瘤的免疫組織學(xué)染色，其證實(shí)了與注射鹽 水對照的小鼠相比，注射氯膦酸鹽脂質(zhì)體的小鼠腫瘤中，消耗了 CD68+細(xì)胞，并且熒光強(qiáng)度和MRI信號顯著降低。圖10顯示MSH-PG-CpG被表達(dá)MSH受體的B16-F10細(xì)胞代謝。在6孔板中將200Kg/ml 濃度的 MSH-L-PG-CpG 與 B16-F10 細(xì)胞一起孵育。讓 B16-F10 細(xì)胞攝取 MSH-PG-CpG2小時(shí)。然后用RPMI培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次。加入新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞12小時(shí)，以使其處理內(nèi)化的MSH-PG-CpG。收獲培養(yǎng)基，用其刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN- Y的活性來量化釋放到培養(yǎng)基中的CpG。IFN-y的產(chǎn)量用來自Pharmingen (San Diego, CA)的試劑盒經(jīng)ELISA測定來測定。圖11顯示以下物質(zhì)的結(jié)構(gòu)單谷氨酸L-Glu-CpG、Gd(111In)-或熒光染料標(biāo)記的L-PG-CpG (4 種不同 MW)、D-PG-CpG、多聚(L-Glu-Tyr)-CpG、多聚(L_Glu_Ala)-CpG、多聚(羥丙基L-谷氨酸)-CpG (L-PHPG-CpG)和帶有酸敏感接頭的L-PG-縮酮-CpG及D-PG-縮酮-CpG0圖12為GcK111In-或染料-標(biāo)記的L-PHPG-CpG的合成方案。圖13為用于靶向遞送CpG的Gd (111In)或染料-標(biāo)記的NDP-MSH-PEG-L-PG-CpG(聚合物5)的合成。圖14A描述通過酪氨酸酶將酪氨酸氧化為L-DOPA再氧化為鄰醌。圖14B為靶向MClR的酪氨酸酶可激活的、結(jié)合CpG的DNP-MSH-PEG-D-PG納米構(gòu)建物的合成。在酪氨酸酶存在時(shí)，該聚合綴合物經(jīng)歷邁克爾-型環(huán)化以釋放游離CpG。圖14C顯示CpG通過尿素接頭與衍生自Tyr的異氰酸酯偶聯(lián)。圖15顯示在瘤內(nèi)注射后的4小時(shí)時(shí)，PG-CpG-NIR與B16/F10黑素瘤中的巨噬細(xì)胞(⑶68 +)締合。PG-CpG-NIR及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞高度散布于整個(gè)腫瘤中。以更高倍放大顯示巨噬細(xì)胞吞噬聚合物到囊泡區(qū)室(箭頭)。巨噬細(xì)胞可能在內(nèi)溶酶體區(qū)室中吞噬聚合物。圖16為腫瘤靶向聚合物-藥物綴合物的圖解。圖17為遞送納米聚合物-CpG的假設(shè)機(jī)理的另一圖解。圖18顯示納米聚合物CpG的純度。圖19A和B顯示PG-CpG在體外激活脾臟NK細(xì)胞。
圖20A、B、C和D顯示腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(CDllb+)對PG聚合物的選擇性攝取。圖21顯示引流淋巴結(jié)中巨噬細(xì)胞和DC(而非B細(xì)胞)對PG聚合物的選擇性攝取。發(fā)明詳述
免疫治療將免疫抑制性微環(huán)境轉(zhuǎn)化為免疫刺激性微環(huán)境。對免疫系統(tǒng)先天裝備(innate arm)起作用的藥物因其在“跳躍式啟動(dòng)(jump-starting) ”免疫應(yīng)答中的獨(dú)特特征而已顯示出巨大前景。在過去十年中，先天免疫細(xì)胞受體的分子鑒定已導(dǎo)致一系列免疫調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)。本文提供了新型納米技術(shù)平臺(tái)和遞送系統(tǒng)，用于通過用刺激免疫細(xì)胞中的TLR9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的toll樣受體(TLR) TLR激動(dòng)劑激活漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(pDC)，來產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答。本文闡述了通過有效產(chǎn)生保護(hù)性免疫并增強(qiáng)抗腫瘤活性 (但降低或甚至消除pDC的全身性激活)的生物可降解聚合物在體內(nèi)靶向遞送TLR9激動(dòng)劑CpG至黑素瘤。主要免疫器官如肝和脾中PDC的激活可耗盡腫瘤外的這一重要類型的抗腫瘤細(xì)胞庫。在體內(nèi)通過有效產(chǎn)生保護(hù)性免疫并增強(qiáng)抗腫瘤活性的生物可降解聚合物來靶向遞送TLR9激動(dòng)劑CpG至黑素瘤，降低或甚至消除pDC的全身性激活。本文所述技術(shù)在與以下靶向遞送聯(lián)合時(shí)亦是有用的TLRl/2激動(dòng)劑，例如Pam3CSK4 ；TLR3激動(dòng)劑，例如多聚(1:C) ；TLR4激動(dòng)劑，例如合成的脂質(zhì)A模擬物；TLR5激動(dòng)劑，例如鞭毛蛋白；TLR6/2激動(dòng)劑，例如FSL-1(Pam2CGDPKHPKSF) ;TLR7 激動(dòng)劑，例如咪喹莫特(Imiquimod) ;TLR8 激動(dòng)劑，例如 ssRNA40 ;和N0D1/2激動(dòng)劑，例如三-DAP和胞壁酰二肽(MDP)。如本文所提供，開發(fā)出了通過受體介導(dǎo)的攝取主動(dòng)靶向黑素瘤細(xì)胞的PG-CpG納米構(gòu)建物。通過讓PG-CpG納米構(gòu)建物與正協(xié)同刺激信號激動(dòng)劑和負(fù)免疫調(diào)節(jié)信號抑制劑合理聯(lián)合，提高了抗腫瘤免疫。具體而言，在黑素瘤的小鼠模型中，我們已應(yīng)用了這種親巨噬細(xì)胞的聚合物技術(shù)遞送CpG 0DN2216至腫瘤位點(diǎn)。我們合成了多聚(L-谷氨酸)-CpG綴合物(“L-PG-CpG”)，在將其腫瘤內(nèi)給予B16-0VA黑素瘤皮下移植物時(shí)，通過與非綴合的CpG 0DN2216比較檢測了其抗癌作用。我們發(fā)現(xiàn)，L-PG-CpG比游離CpG更大程度地降低腫瘤生長。此外，對腫瘤抗原OVA，L-PG-CpG觸發(fā)更強(qiáng)的全身性⑶8 T細(xì)胞應(yīng)答。為進(jìn)一步開發(fā)本發(fā)明在黑素瘤的免疫治療中的應(yīng)用和瘤內(nèi)注射納米-CpG對CpG的抗腫瘤免疫應(yīng)答的作用，可建立聚合物載體的理化特性和瘤內(nèi)注射后CpG的免疫刺激活性之間的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。靶向黑素瘤細(xì)胞的納米-CpG (其中納米-CpG由黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行局部處理)可以以腫瘤-特異性的方式激活PDC。而且，基于免疫系統(tǒng)是復(fù)雜的這一事實(shí)，本文所述的黑素瘤的免疫治療可能需要對多種免疫刺激途徑的聯(lián)合干涉，需要納米-CpG與正協(xié)同刺激途徑的其它激動(dòng)劑和/或負(fù)協(xié)同刺激途徑的拮抗劑相聯(lián)合。此外，黑素瘤是對免疫療法敏感的幾種實(shí)體瘤之一。已顯示成功用于治療黑素瘤患者的其它類型的免疫療法包括高劑量的細(xì)胞因子，例如干擾素-α ( “IFN-α ”)和白細(xì)胞介素2 (“IL-2”)；基于黑素瘤腫瘤抗原的肽疫苗；樹突細(xì)胞疫苗和過繼轉(zhuǎn)移的腫瘤抗原-特異性的CD8 T細(xì)胞。可導(dǎo)致黑素瘤對免疫療法產(chǎn)生應(yīng)答的機(jī)理為免疫抑制的腫瘤微環(huán)境向免疫刺激的腫瘤微環(huán)境的轉(zhuǎn)換。免疫激活劑，例如含有未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤基序(本文中通常稱作“CpG”)的Toll -樣受體(“TLR”)激動(dòng)劑CpG寡核苷酸，顯著提高了免疫療法的功效，其如在黑素瘤小鼠模型中所示。
合成的CpG模仿微生物DNA，引起一組協(xié)調(diào)的免疫應(yīng)答，包括先天性免疫和獲得性免疫。漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(“PDC”)是人CpG的主要靶細(xì)胞。pDC具有產(chǎn)生IFN-α的特殊能力，IFN-α隨后激活T細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞和抗腫瘤免疫的其它組分。如小鼠模型中所示，CpG是癌癥的有效免疫調(diào)節(jié)劑，已證明其在人類臨床試驗(yàn)中是安全的。但是，如全身注射CpG—樣，腫瘤位點(diǎn)-特異性地遞送游離CpG導(dǎo)致主要免疫器官例如肝和脾中pDC的激活，并耗盡腫瘤外的這類重要的抗腫瘤細(xì)胞庫。通過將免疫刺激“集中”在腫瘤位點(diǎn)，瘤內(nèi)注射CpG顯著提高了其抗腫瘤作用。但是，瘤內(nèi)注射可溶性CpG存在兩個(gè)問題。第一，難以控制所注射的CpG在腫瘤內(nèi)的保留時(shí)間。第二，可溶性CpG仍可通過擴(kuò)散吸收而進(jìn)入循環(huán)。為解決這些問題，我們建議使用生物相容的生物可降解聚合物平臺(tái)來指引和控制CpG在腫瘤位點(diǎn)的釋放。為此目標(biāo)，如我們在本文中所示，只要有可行的藥物遞送系統(tǒng)，就可通過腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞的吞噬作用將合成的多聚(L-谷氨酸)(“L-PG”)和其它聚合物選擇性地保留在腫瘤中。可與本發(fā)明聯(lián)合使用的適宜聚合物包括但不限于多聚(DL-谷氨酸)；多聚 (L-天冬氨酸)；多聚(羥丙基谷氨酸酯)；多聚(羥乙基谷氨酸酯)；多聚(氨基酸)的共聚物；和其它合成的和天然的水溶性聚合物，包括但不限于聚乙烯醇、多羥基乙基甲基丙烯酰胺、葡聚糖、多糖、人血清白蛋白、透明質(zhì)酸等等。我們發(fā)現(xiàn)與通過瘤內(nèi)注射遞送游離CpG相比，通過瘤內(nèi)注射遞送的L-PG-CpG綴合物即與L-PG化學(xué)結(jié)合的CpG表現(xiàn)出顯著更強(qiáng)的針對已建立黑素瘤的抗腫瘤活性。如本文進(jìn)一步所提供，可通過合成和表征具有不同分子量(并因此大小不同)、降解性和電荷的一系列結(jié)合CpG的PG聚合物(本文中有時(shí)亦稱作“納米-CpG”)，來測定瘤內(nèi)注射后對其抗癌作用的最佳理化特性。然后就可評估瘤內(nèi)注射后納米構(gòu)建物誘導(dǎo)先天性和獲得性免疫的能力。此外，如下所述，業(yè)已開發(fā)并驗(yàn)證了通過受體介導(dǎo)的攝取和酪氨酸酶介導(dǎo)的CpG釋放兩者來主動(dòng)靶向黑素瘤細(xì)胞的PG-CpG納米構(gòu)建物。如本文更進(jìn)一步所述，通過PG-CpG納米構(gòu)建物與正及負(fù)協(xié)同刺激分子的聯(lián)合，可提高抗腫瘤免疫。例如，提出了納米-CpG與正協(xié)同刺激分子(例如0X40)的激動(dòng)劑抗體或負(fù)協(xié)同刺激分子(例如CTLA-4和B7)的拮抗劑抗體聯(lián)合的抗腫瘤作用。提供了用于測定納米-CpG和對協(xié)同刺激途徑起作用的治療性抗體連同細(xì)胞因子方案聯(lián)合的抗腫瘤作用的方法。用整個(gè)腫瘤作為抗原，基于本文所述的新型納米-CpG的疫苗可誘導(dǎo)對黑素瘤的有效的T-細(xì)胞免疫應(yīng)答。通過利用這些新型納米構(gòu)建物來靶向遞送免疫刺激劑，可產(chǎn)生改進(jìn)的抗腫瘤功效。此外，雖然已證明黑素瘤是測試免疫策略的極好模型系統(tǒng)，但本文所述的策略亦可用于治療其它類型的癌癥，例如肺癌和結(jié)腸癌。黑素瘤的免疫療法
2009年，美國約有69，000男性及女性被診斷為患黑素瘤，估計(jì)大約有8，600將死于這種疾病。Jemal k 等，Cancer Statistics (癌癥統(tǒng)計(jì))，CA Cancer J Clin 59:225-49，2009。有意義的是，診斷為黑素瘤的頻率正不斷增加，發(fā)病率每年增加3%。黑素瘤特征為其強(qiáng)大的侵入和轉(zhuǎn)移能力。在黑素瘤患者中，大約20%最后死于轉(zhuǎn)移性疾病。因此，黑素瘤仍是因惡性腫瘤而死亡的最常見原因之一。一旦黑素瘤擴(kuò)散到遠(yuǎn)端位點(diǎn)，則生存中值小于6個(gè)月。
在二十多年以前，發(fā)現(xiàn)黑素瘤患者可針對其腫瘤引發(fā)T-細(xì)胞應(yīng)答。Boon T等，Human T Cell Responses Against Melanom (針對黑素瘤的人 T 細(xì)胞應(yīng)答)，Annu RevImmunol 24:175-208, 2006。在黑素瘤患者中測試了幾種免疫療法,包括干擾素療法、同種異體全細(xì)胞疫苗、重組病毒載體、與淋巴耗盡聯(lián)合的過繼免疫療法和同種異體細(xì)胞裂解物。現(xiàn)有有力證據(jù)表明，對一些轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者，免疫系統(tǒng)在誘導(dǎo)長期益處中有重要作用。但是總體應(yīng)答率仍低，這可能是因?yàn)槿狈谒亓?特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答及在復(fù)雜的免疫應(yīng)答中僅激活單一步驟的策略缺陷。免疫的全面激活需要正協(xié)同刺激信號的刺激和負(fù)免疫調(diào)控信號的抑制。新興的納米技術(shù)和本文所述的新方法允許刺激正免疫應(yīng)答而不逆轉(zhuǎn)免疫抑制性微環(huán)境。在黑素瘤小鼠模型中，瘤內(nèi)注射免疫激活劑例如TLR9激動(dòng)劑CpG可提高殺死CD8(+)的功效。先天性免疫的激活是產(chǎn)生有效適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵 發(fā)展強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答所涉及的關(guān)鍵步驟包括通過使用特異性的TLR來激活先天免疫細(xì)胞例如 pDC。Degl1-Esposti MA, Smyth MJ. Close Encounters of Different Kinds:Dendritic Cells and NK Cells Take Centre Stage (不同種類的緊密相遇樹突細(xì)胞和 NK 細(xì)胞成為關(guān)注焦點(diǎn))，Nat Rev Immunol 5:112-24，2005 ；Kadowaki N, Liu YJ.Natural Type I In terferon-Producing Cell as a Link Be tween Innate and AdaptiveImmunity (作為先天性免疫和適應(yīng)性免疫之間連接的產(chǎn)生天然I型干擾素的細(xì)胞)，Hum Tmmunol 63:1126-32, 2002 ；Krutzik SR TLR Activation Triggers the RapidDifferentiation of Monocytes into Macrophages and Dendritic Cells (TLRi舌化弓I發(fā)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的快速分化)，Nat Med 11:653-60, 2005。這進(jìn)而導(dǎo)致NK細(xì)胞和骨髓樹突細(xì)胞(mDC)的激活、靶細(xì)胞裂解后抗原的釋放和最后激活特異性T細(xì)胞(適應(yīng)性免疫)。先天性免疫的激活誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，促炎細(xì)胞因子可直接激活對引發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答重要的細(xì)胞。例如，以IFN- α和IFN- β為代表的I型IFN和腫瘤壞死因子(TNF- β )，是mDC成熟的有效誘導(dǎo)物，其誘導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)和協(xié)同刺激分子的上調(diào)以及IL-12的產(chǎn)生，這兩者對幼稚T細(xì)胞的引發(fā)都是重要的。Banchereau J, Steinman RM. DendriticCells and The Control of Immunity (樹突細(xì)胞和免疫的控制)，Nature 392:245-52,1998 ；Montoya M^, Type I Interferons Produced By Dendritic Cells Promote TheirPhenotypic and Functional Activation (由樹突細(xì)胞產(chǎn)生的I型干擾素提高了其表型和功能的激活)，Blood 99:3263-71, 2002。另外，由pDC、細(xì)胞因子和TLR激動(dòng)劑激活NK細(xì)胞可導(dǎo)致增加腫瘤的裂解，并進(jìn)而可提供抗原至mDC以提呈至T細(xì)胞。先天性免疫的激活不但對抗原-特異性的T細(xì)胞的產(chǎn)生重要，而且對誘導(dǎo)炎癥也重要，所述炎癥導(dǎo)致抗原-特異性的T細(xì)胞向腫瘤位點(diǎn)的遷移增加。代表先天性和適應(yīng)性免疫之間的關(guān)鍵連接物
作為I型IFN的主要產(chǎn)生者，pDC代表先天性和適應(yīng)性免疫之間的最重要的連接物之一。Apostolou I 等，Origin of Regulatory T Cells With Known Specificity ForAntigen (具已知抗原特異性的調(diào)控T細(xì)胞的起源)，Nat Immunol 3:756-63, 2002 ；Bjorck P. , The Multifaceted Murine Plasmacytoid Dendritic Cell (多層面的鼠衆(zhòng)細(xì)胞樣樹突細(xì)胞)，Hum Immunol 63:1094-102，2002 ；Gilliet M 等，Developmentof Murine Plasmacytoid Dendritic Cell Precursors is Differentially Regulatedby FLT3~Ligand and Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor (鼠衆(zhòng)細(xì)胞樣樹突細(xì)胞前體的發(fā)育受FLT3-配體和粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落剌激因子的差異化調(diào)控)，J Exp Med 195:953-8，2002 ；Kadowaki N 等，Subsets Of Human Dendritic CellPrecursors Express Different Toll-Like Receptors And Respond To DifferentMicrobial Antigens (人樹突細(xì)胞前體的亞組表達(dá)不同的Toll-樣受體并對不同的微生物抗原進(jìn)行應(yīng)答)，J Exp Med 194:863-9，2001 ；Liu YJ.，IPC: Professional Type IIn terferon-Producing Cells and Plasmacytoid Dendri tic Cell Precursors (IPC 專門產(chǎn)生I型干擾素的細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞前體)，Annu Rev Immunol 23:275-306，2005ο在觸發(fā)TLR7或TLR9時(shí)，pDC快速產(chǎn)生大量I型IFN，激活多種免疫細(xì)胞，例如B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并分化為APC以誘導(dǎo)抗原-特異性的T-細(xì)胞應(yīng)答。Nestle FO等，Plasmacytoid Predendritic Cells Initiate Psoriasis Through Interferon-AIpha Production (衆(zhòng)細(xì)胞樣前樹突細(xì)胞通過產(chǎn)生干擾素_ α來引發(fā)銀屑病)，J Exp Med202:135-43，2005。mDC和NK細(xì)胞二者的激活亦可部分由I型IFN來誘導(dǎo)。IFN-a Re -/-mDC在充分應(yīng)答病毒感染的能力上是有缺陷的，這表明產(chǎn)生IFN的pDC可對mDC的激活和隨后適應(yīng)性免疫的發(fā)展至關(guān)重要。Honda I等，Spatiotemporal Regulation of Myd88~IRF~7Signaling For Robust Type-1 Interferon Induction (Myd88-1RF_7 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對強(qiáng)烈的I型干擾素誘導(dǎo)的時(shí)空調(diào)節(jié))，Nature 434:1035-40，2005。很多證據(jù)表明，pDC可與mDC相互作用來誘導(dǎo)抗病毒免疫發(fā)展過程中增強(qiáng)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。Dalod I等，Dendritic Cell Responses To Early Murine CytomegalovirusInfection: Subset Functional Specialization and Differential RegulationBy Interferon Alpha/Beta (樹突細(xì)胞對早期鼠巨細(xì)胞病毒感染的應(yīng)答干擾素α/β的亞組功能特化和差異調(diào)控)，J Exp Med 197:885-98，2003 ；Fonteneau JF等，Human Iwmunodeficiency Virus Type I Ac tiva tes Plasmacytoid Dendri tic Cellsand Concomitantly Induces the Bystander Maturation Of Myeloid DendriticCells (人免疫缺陷I型病毒激活漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞并伴隨性誘發(fā)骨髓樹突細(xì)胞的旁鄰成熟)，J Virol 78:5223-32，2004 ；Teleshova ^{等，Cpg-C IwmunostimulatoryOligodeoxyribonυαIeotide Activation of Plasmacytoid Dendritic Cells InRhesus Macaques to Augment The Acti vat ion of IFN-Gamma -Secre ti ng SimianImmunodefi ci ency Virus-Specific T Cells (恒河猴中衆(zhòng)細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的Cpg-C免疫剌激性寡脫氧核苷酸激活對IFN- Y -分泌型猿猴免疫缺陷病毒-特異的T細(xì)胞的激活的增強(qiáng))，J Immunol 173:1647-57，2004。已表明由雙鏈RNA或病毒感染對mDC的激活依賴于與 IFN-α 的接觸。Honda I 等，Selective Contribution of IFN-Alpha/BetaSignaling To The Maturation of Dendritic Cells Induced By Double-Stranded RNAor Viral Infection (IFN-a / β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對由雙鏈RNA或病毒感染誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞的成熟的選擇性貢獻(xiàn))，Proc Natl Acad Sci USA 100:10872-7，2003 ；Radvanyi LG 等，Low Levels of Interferon-Alpha Induce CD86 (Β7· 2) Expression and AcceleratesDendritic Cell Maturation From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (低水平干擾素-α誘導(dǎo)CD86 (B7. 2)的表達(dá)并加速來自人外周血單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞的成熟)，Scand J Immunol 50:499—509， 1999 ；Tough DF.， Type I In terferon as A Link BetweenInnate and Adaptive Inmunity Through Dendritic Cell Stimulation (I 型干擾素通過剌激樹突細(xì)胞作為先天性和適應(yīng)性免疫之間的連接物)，Leuk Lymphoma 45:257-64，2004。另外，發(fā)現(xiàn)HIV能夠激活pDC，pDC隨后可激活共培養(yǎng)時(shí)的mDC。Fonteneau JF等，Human Iwmunodefi ci ency Virus Type I Activates Plasmacytoi d Dendri ti c Cells andConcomitantly Induces the Bystander Maturation Of Myeloid Dendritic Cells (人免疫缺陷I型病毒激活漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞并伴隨性誘發(fā)骨髓樹突細(xì)胞的旁觀成熟)，J Virol78:5223-32，2004。另外，近來已證明在產(chǎn)生抗-HSV CTL的過程中，pDC可與淋巴結(jié)mDC相互作用。Tough DF.，Type I In terferon as A Link Be tween Innate and AdaptiveImmunity Through Dendritic Cell Stimulation (I型干擾素通過刺激樹突細(xì)胞作為先天性和適應(yīng)性免疫之間的連接物)，Leuk Lymphoma 45:257-64, 2004。這些觀測結(jié)果表明PDC是對病毒感染和癌癥的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的“跳躍式啟動(dòng)劑(jump-starter) ”。
作為免疫刺激劑的TLR9和CpG
TLR家族由識(shí)別微生物DNA和RNA結(jié)構(gòu)的13種不同受體組成。已發(fā)現(xiàn)在pDC、mDC、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活中，TLR激動(dòng)劑發(fā)揮必不可少的作用。因其在直接應(yīng)答CpG刺激的pDC和B細(xì)胞中的選擇性表達(dá)，TLR9是最特異的人TLR。到目前為止，已鑒定出三類CpG TLR激動(dòng)劑。硫代磷酸B-類CpG例如CpG7909，刺激B細(xì)胞和NK細(xì)胞但僅自pDC誘導(dǎo)中等量的IFN- α。相比之下，A-類CpG例如0DN2336和0DN2216，自pDC誘導(dǎo)極高量的I型IFN并高度刺激NK，但幾乎沒有B細(xì)胞刺激能力。在小鼠和人中A-類CpG配體0DN2216激活pDC-口 NK 細(xì)胞。Vollmer J. , Progress in Drug Development of Tmmunns timula tory CpGOligodeoxynucleo ti de Ligands For TLR9 (TLR9的免疫刺激性CpG寡脫氧核苷酸配體的藥物開發(fā)進(jìn)展)，Expert Opin Biol Ther 5:673-82，2005 ；Colonna, Μ. , TLR Pathwaysand IFN-Regulatory Factors: To Each Its Own (TLR途徑和 IFN-調(diào)控因子各自針對其自身)，Eur J Immunol 37:306-9, 2007。這些細(xì)胞隨后激活mDC，誘導(dǎo)腫瘤抗原-特異性的⑶8應(yīng)答。參見圖1。重要的是，我們已證明瘤內(nèi)注射CpG-活化的pDC導(dǎo)致遠(yuǎn)端腫瘤的免疫排斥。Liu C Plasmacy to id Dendri tic Cells Induce NK Cell-Dependent, TumorAntigen-Specific T Cell Cross-Priming and Tumor Regression in Mice (小鼠中衆(zhòng)細(xì)胞樣樹突細(xì)胞誘導(dǎo)NK細(xì)胞依賴性的腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞的交叉引發(fā)和腫瘤消退)，JClin Invest 118:1165-75， 2008。靶向協(xié)同刺激途徑
盡管有大量浸潤腫瘤的CD8 T細(xì)胞，但很多黑素瘤仍是免疫療法難以治療的。免疫治療失敗的主要機(jī)制之一是腫瘤內(nèi)的免疫抑制微環(huán)境。Lizee G等，Improving AntitumorTmmiine Responses by Circumventing Immunoregulatory Cells and Mechanisms (通過避開免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞及機(jī)理來提高抗腫瘤免疫應(yīng)答)，Clin Cancer Res 12:4794-803,2006 ;Liizee G 等，Immunosuppression in Melanoma Tmmunntherapy: PotentialOpportunities for Intervention (黑素瘤免疫治療中的免疫抑制干預(yù)的潛在機(jī)會(huì))，Clin Cancer Res 12:2359s_65s， 2006。我們已經(jīng)表明(i)⑶8 CTL是導(dǎo)致腫瘤消退的主要因素，消耗⑶8 T細(xì)胞顯著降低CpG的治療效果；和(ii) CD8 T細(xì)胞是多種免疫調(diào)節(jié)劑的效應(yīng)細(xì)胞群，所述免疫調(diào)節(jié)劑包括抗-CTLA-4抗體和抗-0X40抗體。Liu C，Lou Y，Lizee G等，Plasmacytoid Dendri tic Cells Induce NK Cell-Dependent，Tumor An ti gen -Sped fi cT Cell Cross -Priming and Tumor Regression in Mice (小鼠中衆(zhòng)細(xì)胞樣樹突細(xì)胞誘導(dǎo)NK細(xì)胞依賴性的腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞的交叉引發(fā)和腫瘤消退)，J Clin Invest118:1165-75，2008 ；Croft M 等，The Significance of 0X40 And 0X40L to T-CellBiology and Immune Disease (0X40和0X40L對T-細(xì)胞生物學(xué)和免疫疾病的重要性)，Immunol Rev 229:173-91，2009 ；Redmond WLj Ruby CE，Weinberg ADj The Role Of0X40~Media ted CoStimula ti on in T-Cell Activation and Survival (OX4O 介導(dǎo)的共剌激在T-細(xì)胞的激活和生存中的作用)，Crit Rev Immunol 29:187-201，2009。TNF家族配體限定T細(xì)胞記憶的小生境(niche)。Trends Immunol 28:333-9， 2007。這些結(jié)果形成將TLR-激動(dòng)劑和靶向免疫協(xié)同剌激途徑的試劑聯(lián)合的基礎(chǔ)(基本原理)。參見圖2。已將阻斷負(fù)協(xié)同剌激信號用于抗腫瘤治療。使用針對CTLA_4(其為T細(xì)胞上抑制最初的T-細(xì)胞活化和增殖的分子)的阻斷抗體的臨床試驗(yàn)，已在激活宿主對黑素瘤的免疫應(yīng)答方面取得了一些成功。Montoya M 等，Type I Interferons Produced By DendriticCells Promote Their Phenotypic and Functional Activation (由樹突細(xì)胞產(chǎn)生的 I 型干擾素提高了其表型和功能的激活)，Blood 99:3263-71, 2002 ;Apostolou I等，
of Regulatory T Cells With Known Specific!ty For Antigen (具已知抗原特異性的調(diào)控性 T 細(xì)胞的起源)，Nat Immunol 3:756-63，2002 ；Bjorck P.，The Mul ti facetedMurine Plasmacytoid Dendritic Cell (多層面的鼠衆(zhòng)細(xì)胞樣樹突細(xì)胞)，Hum Immunol63:1094-102，2002。但是，阻斷CTLA-4對多種T-細(xì)胞應(yīng)答的程度具有深遠(yuǎn)的影響，而自身免疫是主要的副作用。在T-細(xì)胞(尤其是腫瘤位點(diǎn)的浸潤腫瘤的淋巴細(xì)胞)的激活過程中和激活之后運(yùn)行的抑制其它負(fù)協(xié)同剌激信號進(jìn)一步定向的方法，是為治療目的而操縱這些負(fù)信號的另一種方法。在T細(xì)胞上表達(dá)的B7家族的分子及其受體是阻礙對腫瘤進(jìn)行有效免疫應(yīng)答的“關(guān)閉”機(jī)制之一。Martin-Orozco N，Dong C·，New Battlefields forCostimulation (協(xié)同剌激的新場所)，J Exp Med 203:817-20，2006 ；Martin-0rozco N，Dong C.1nhibitory Costimulation and An t1-Tumor Immunity (抑制性協(xié)同剌激和抗腫瘤免疫)，Semin Cancer Biol 17:288-98，2007。近來闡述了幾種新的B7分子及其作為T細(xì)胞的負(fù)調(diào)控物的功能，所述B7分子包括 B7S1、B7S3 和 B7H3。Prasad，m 等，B7S1，A Novel B7 Family Member ThatNegatively Regulates T Cell Activation (負(fù)調(diào)控 T 細(xì)胞活化的 B7 家族新成員 B7S1)，Immunity 18:863—73，2003 ；Sica GL 等，B7-H4，a Molecule Of The B7Family，Negatively Regulates T Cell Inmunity (負(fù)調(diào)控 T 細(xì)胞免疫的 B7 家族的分子 B7-H4)，Immunity 18:849-61，2003 ;Zang，\ 等，B7x:A Widely Expressed B7 FamilyMember That Inhibits T Cell Activation, (B7x :抑制 T 細(xì)胞活化的廣泛表達(dá)的 B7 家族成員)，Proc Natl Acad Sci USA 100:10388-92，2003。這些新分子在淋巴和非淋巴組織尤其是在APC中廣泛表達(dá)。亦發(fā)現(xiàn)這些分子中的一些在腫瘤中被上調(diào)，例如SZSi存在于源于卵巢、乳房、腎臟和肺組織的腫瘤中。Prasad，等，B7S1，A Novel B7 FamilyMember That Negatively Regulates T Cell Activation (負(fù)調(diào)控 T 細(xì)胞活化的 B7 家族新成員 B7S1)，Immunity 18:863-73，2003 ；Krambeck KE等，B7-H4 Expression in RenalCell Carcinoma And Tumor Vasculature: Associations with Cancer Progression andSurvival (腎細(xì)胞癌和腫瘤脈管系統(tǒng)中B7-H4的表達(dá)與癌癥進(jìn)展和存活的相關(guān)性)，Proc Natl Acad Sci USA 103:10391-6，2006 ；Tringler 義等，B7-H4 Overexpressionin Ovarian Tumors (卵巢腫瘤中 B7-H4 的過表達(dá))，Gynecol Oncol 100:44-52，2006 ；Tringler B 等，B7—H4 is Highly Expressed in Ductal And Lobular Breast Cancer(B7-H4在導(dǎo)管和小葉乳腺癌中高表達(dá))，Clin Cancer Res 11:1842-8, 2005。阻斷這些B7分子有效提高了 T-細(xì)胞的增殖和體外IL-2的產(chǎn)生，增加了體內(nèi)自體反應(yīng)性T細(xì)胞。Prasad, W 等，B7S1，A Novel B7 Family Member That Nega ti vely Regula tes T Cell
Activation (負(fù)調(diào)控 T 細(xì)胞活化的 B7 家族新成員 B7S1)，Immunity 18:863-73，2003。在轉(zhuǎn)移性黑素瘤的小鼠模型中在T-細(xì)胞疫苗接種期間阻斷B7S1，似乎基本上保護(hù)小鼠免于腫瘤發(fā)展，且完全保護(hù)存活的小鼠免于第二次腫瘤攻擊(未發(fā)表數(shù)據(jù))。與TLR激動(dòng)劑協(xié)作的靶向B7分子可在治療人黑素瘤中有巨大的治療價(jià)值。因此，靶向激活協(xié)同刺激分子例如0X40、⑶40和4-1BB，是增強(qiáng)T-細(xì)胞激活以提高T-細(xì)胞-介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答的另一選擇。先前發(fā)表的關(guān)于通迎的研究顯示了其在增強(qiáng)所述T-細(xì)胞的諸如增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和存活等效應(yīng)功能的重要性，并且已發(fā)現(xiàn)通過0X40來刺激是記憶T-細(xì)胞的發(fā)育中所必不可少的。Croft, M. , The Role of TNF SuperfamiIyMembers in T-Cell Function and Diseases (TNF超家族成員在T_細(xì)胞功能和疾病中的作用)，Nat Rev Immunol 9:271-85, 2009。具體到腫瘤微環(huán)境，已發(fā)現(xiàn)全身性給予激動(dòng)劑抗-0X40抗體降低了調(diào)控T細(xì)胞的數(shù)量，其功能為抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活性并增加腫瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量。Redmond WL, Ruby, CE和Weinberg, AD, The Role of 0X40~MediatedCo-stimulation in T-Cell Activation and Survival (在 T-細(xì)胞的激活和生存中 0X40介導(dǎo)的共刺激的作用)，Crit Rev Immunol 29:187-201, 2009。在其它腫瘤系統(tǒng)例如肉瘤、結(jié)腸直腸癌和乳腺癌的小鼠模型中使用的針對小鼠0X40的激動(dòng)劑抗體，顯示出顯著
Redmond, WL Ligation of the 0X40 Cos timula tory Receptor ReversesSelf-Ag and Tumor-1nduced CD8 T-Cell Anergy In Vivo (連接 0X40 協(xié)同刺激受體逆轉(zhuǎn)了體內(nèi)自身抗原和腫瘤誘導(dǎo)的⑶8 T-細(xì)胞無反應(yīng)性)，Eur J Immunol 39:2184-94,2009 ；Song k等,0X40 and Bcl-xL Promote The Persistence Of CD8 T Cells To RecallTumor-Associated Antigen (0X40和Bcl_xL促進(jìn)⑶8 T細(xì)胞調(diào)用腫瘤相關(guān)抗原的持久性)，J Immunol 175:3534-41， 2005。先前已發(fā)現(xiàn)⑶40在B細(xì)胞激活、增殖和抗原提呈以及在樹突細(xì)胞激活和抗原提呈中起重要作用。Croft, M. , The Role of TNF Super family Members in T-Cell Functionand Diseases (TNF超家族成員在T-細(xì)胞功能和疾病中的作用)，Nat Rev Immunol9:271-85, 2009。已發(fā)現(xiàn)針對⑶40的激動(dòng)劑抗體克服了⑶4+ T細(xì)胞耐性并增強(qiáng)了 T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。引人關(guān)注的是，CD40在大致70%的實(shí)體惡性腫瘤中表達(dá)，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌以及黑素瘤。Hurwitz AA, Kwon ED, van Elsas A. , Cos timula toryWars: The Tumor Menace (協(xié)同刺激戰(zhàn)爭腫瘤脅迫)，Curr Opin Tmmunol 12:589-96，
2000。已在癌癥的多種鼠模型中評估了激動(dòng)劑抗-CD40抗體，但是具體到黑素瘤，發(fā)現(xiàn)所述抗體僅減緩腫瘤的生長。Melief, CJ. , Cancer iimunotherapy by Dendritic Cells (樹突細(xì)胞的癌癥免疫治療)，Immunity 29:372-83, 2008。正在用靶向多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病的激動(dòng)劑抗體進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)。Schattner，EJ. , CD40 Ligand in CLL Pathogenesis and Therapy (在CLL發(fā)病機(jī)制和治療中的CD40配體)，Leuk Lymphoma 37:461-72，2000。已表明4-1BB可增強(qiáng)T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生、增殖和細(xì)胞毒性活性。其在建立記憶CTL中亦起必不可少的作用。在肉瘤和肥大細(xì)胞瘤小鼠模型中，激動(dòng)劑抗體可根除建立的腫瘤。Lynch, DH. , The Promise of 4_1BB (CD 137) -Media ted Immunomodula ti on andthe Immunotherapy of Cancer, (4-1BB (0)137)-介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)和癌癥的免疫治療的前景)，Immunol Rev 222:277-86, 2008。引人關(guān)注的是，在小鼠中，激動(dòng)劑抗-4-1BB抗體可 發(fā)揮改善自身免疫狀況和限制免疫治療的自身免疫副作用的作用。同前。雖然已充分研究了基于單獨(dú)的TLR激動(dòng)劑或抗體治療的癌癥治療，但卻沒有研究聯(lián)合TLR激動(dòng)劑和抗體治療的最佳策略，盡管這有很大潛力。最后，在給予IL-2和IFN-α至黑素瘤患者中所觀察到的臨床上的中等成功，留下了改進(jìn)的空間，所述改進(jìn)可能是通過加入TLR-激動(dòng)劑。IFN-α是在晚期黑素瘤中第一個(gè)顯示抗腫瘤活性的外源性細(xì)胞因子。1995年，IFN-α的不同重組形式INF-2 β ,成為首個(gè)FDA批準(zhǔn)的輔助治療II Β/ΙΙΙ期黑素瘤的免疫療法。Kirkwood JM等,Akri Generation ofImmunotherapy for Melanoma (黑素瘤的下一代免疫療法)，J Clin Oncol 26:3445-55,2008。研究顯不高劑量的IFN-2 β顯著降低了復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。Kirkwood ]y[等，Meehan isms andManagement of Toxicities Associated with High-Dose In terferon alfa~2b Therapy
(與高劑量干擾素a-2b治療有關(guān)的毒性的機(jī)理和控制)，J Clin Oncol 20:3703-18，2002。第二種顯示針對黑素瘤的抗腫瘤活件的外源件細(xì)胞因子IL-2,于1998年被FDA批準(zhǔn)用于治療患有晚期轉(zhuǎn)移性黑素瘤的成人。Phan GQ等，F(xiàn)actors Associated with Responseto High-Dose Interleukin-2 in Patients with Metastatic Melanoma (在轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者中與對高劑量的白細(xì)胞介素-2應(yīng)答有關(guān)的因子)，J Clin Oncol 19:3477-82,
2001。IL-2在免疫調(diào)節(jié)和T-細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。在晚期轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者中，表明高劑量靜脈內(nèi)推注IL-2顯示具有抗腫瘤作用。Stoutenburg JP, Schrope B和Kaufman, HL, Adjuvant Therapy for Malignant Melanoma (惡性黑素瘤的輔助治療)，Expert Rev Anticancer Ther 4:823-35，2004 ；Rosenberg SA 和 White, DE. , Vitiligoin Patients with Melanoma: Normal Tissue Antigens can be Targets for CancerImmunotherapy (黑素瘤患者中的白癜風(fēng)正常組織抗原可為癌癥免疫治療的靶標(biāo))，JImmunother Emphasis Tumor Tmmunol 19:81-4，1996。這些 II 期研究的追溯性長期分析顯示客觀應(yīng)答率為16%，持久應(yīng)答率為4%，這表明建立了記憶T-細(xì)胞應(yīng)答。Kirkwood JM等，Next Generation of Immunotherapy for Melanoma (黑素瘤的下一代免疫療法)，JClin Oncol 26:3445-55， 2008。用于遞送CpG的納米顆粒
CpG作為有效的和腫瘤-特異性的免疫刺激劑在臨床上應(yīng)用的主要障礙是需要有效的遞送系統(tǒng)。通過靜脈內(nèi)注射給予的游離CpG以及其它穩(wěn)定的硫代磷酸寡核苷酸會(huì)隨著廣泛的組織分布而被迅速清除。Link撒等，Oligodeoxynucleotide CpG 7909 Deliveredas Intravenous Infusion Demonstrates Immunologic Modulation in Patients VithPre viously Trea ted Non -Hodgkin Lymphoma (以靜脈輸注遞送的寡脫氧核苷酸CpG7909在先前治療過的非霍奇金淋巴瘤患者中顯示免疫調(diào)節(jié))，J Immunother 29:558-68，2006 ；Wang H 等，Inmunomodulatory Oligonucleotides as Novel Therapy for BreastCancer: Pharmacokine ti cs, In Vitro And In Vi vo Anticancer Acti vi ty, andPotentiation Of Antibody Therapy (作為乳腺癌的新型療法的免疫調(diào)節(jié)的寡核苷酸藥代動(dòng)力學(xué)、體外和體內(nèi)抗癌活性和抗體治療的增強(qiáng))，Mol Cancer Ther 5:2106-14，2006 ；Yu RZ 等，Comparison of Pharmacokinetics and Tissue Disposition of anAnti sense Phosphorothioate O ligonucleotide Targeting Human Ha-Ras mRNA in Mouseand Monkey (在小鼠和猴中祀向人Ha-Ras mRNA的反義硫代磷酸寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布的比較)，J Pharm Sci 90:182-93，2001。認(rèn)為這促成以下所觀測到的在人志愿者中全身給予游離CpG未能引發(fā)可察覺的免疫應(yīng)答；和誘導(dǎo)可能有害的對免疫系統(tǒng)的非特異全身性激活。Krieg AM 等，Induction of Systemic THl-Like Innate Immunity inNormal Volunteers Following Subcutaneous but not Intravenous Administration OfCPG 7909，A Synthetic B-Class CpG Oligodeoxynucleotide TLR9 Agonist (正常志愿者皮下而非靜脈內(nèi)給予合成的B-類CpG寡脫氧核苷酸TLR9激動(dòng)劑CPG 7909后的全身性THl-樣先天性免疫的誘導(dǎo))，J Immunother 27:460-71，2004 ；Krieg AM. Therapeuticpotential of Toll-like Receptor 9 Activation (Toll-樣受體 9 激活的治療潛能)，Nat Rev Drug Discov 5:471-84， 2006。納米技術(shù)提供了使CpG靶向APC的可能性，特別是靶向腫瘤中的pDC。全身性給予之后，含有CpG的納米顆粒通常發(fā)揮出比游離CpG更好的免疫治療活性，這是由于APC對CpG納米顆粒的天然聚集能力和貯庫作用，其中CpG在作用位點(diǎn)的持久性將提供增強(qiáng)的活性。Whitmore WA 等，Systemic Administration of LPD Prepared With CpgOligonucleotides Inhibits the Growth of Established Pulmonary Metastases ByStimulating Innate and Acquired An ti tumor Immune Responses (全身給予用 Cpg 寡核苷酸制備的LPD通過剌激先天性和獲得性抗腫瘤免疫應(yīng)答來抑制建立的肺轉(zhuǎn)移的生長)，Cancer Immunol Immunother 50:503—14， 2001 ；Sakurai F 等，Therapeutic Effect ofIntravenous Deli very of Lipoplexes Containing The In terferon-[Be ta] Gene AndPoly1: Poly C In A Murine Lung Metastasis Model (在鼠肺轉(zhuǎn)移模型中靜脈內(nèi)遞送含有干擾素-[β ]基因和聚/ :聚C的Lipoplex的療效)，Cancer Gene Ther 10:661-8;Higgins R等，Growth Inhibition Of An Orthotopic Glioblastoma In InmunocompetentMice By Cationic Lipid-DNA Complexes (陽離子脂質(zhì)-DNA復(fù)合物對免疫活性小鼠中原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長抑制)，Cancer Immunol Immunother 53:338-44，2004。迄今為止，已測試了皮下給藥途徑，表明在黑素瘤動(dòng)物模型中用一些CpG納米顆粒導(dǎo)致顯著增加的免疫剌激和抗腫瘤活性。de Jong S 等，Encapsulation in Liposomal NanoparticlesEnhances The Immunos timula tory, Adjuvant and An t1-Tumor Acti vi ty ofSubcutaneously Administered CpG ODN (在脂質(zhì)體納米顆粒中包封增強(qiáng)皮下給予的CpGODN 的免疫刺激、佐劑和抗腫瘤活性)，Cancer Tmmunol Immunother 56:1251-64，2007 ；Standley SM ^, Incorpora ti on of CpG Oligonucleo ti de Ligand Into Pro tein~LoadedParticle Vaccines Promo tes Anti gen -Sped fi c CD8 T-Cell Immunity ( ^ CpG 寡核苷酸配體納入裝載蛋白質(zhì)的顆粒疫苗中提高抗原-特異性的CD8 T-細(xì)胞免疫)，Bioconjug Chem 18:77-83， 2007 ；Li WM, Bally MB, Schutze-Redelmeier MP, EnhancedImmune Response To T-1ndependent Antigen By Using CpG OligodeoxynucleotidesEncapsula ted In Liposomes (通過使用脂質(zhì)體包封的CpG寡脫氧核苷酸提高對T-非依賴性抗原的免疫應(yīng)答)，Vaccine20:148-57，2001 ；Bourquin C 等，TargetingCpG Oligonucleo ti des to the Lymph Node by Nanopar ti cles Elicits EfficientAntitumoral Iimunity (由納米顆粒將CpG寡核苷酸祀向淋巴結(jié)引發(fā)有效的抗腫瘤免疫)，J Immunol 181:2990-8, 2008。但是，皮下CpG納米顆粒通常需要將腫瘤相關(guān)抗原(TAA)共同引入到CpG納米顆粒中，以誘導(dǎo)腫瘤-特異性的CTL應(yīng)答。另一方面，在TAA存在下或緊密接近TAA時(shí)，腫瘤內(nèi)或腫瘤旁給予可允許自腫瘤本身發(fā)出TLR9 “危險(xiǎn)信號”。在我們的初步研究中，在黑素瘤動(dòng)物模型中，直接瘤內(nèi)注射游離CpG已顯示有前 景。此外,瘤內(nèi)注射聚合物-CpG綴合物已顯示出比瘤內(nèi)注射游離CpG更好的抗腫瘤活性。這些鼓舞人心的初步數(shù)據(jù)引導(dǎo)我們假設(shè)遞送至腫瘤的聚合物-CpG綴合物可顯著提高抗腫瘤免疫應(yīng)答而不激活全身性免疫，其中所述聚合物-CpG綴合物直接暴露在特異性的腫瘤微環(huán)境和免疫細(xì)胞群中。最終，殺死黑素瘤患者的是轉(zhuǎn)移性疾病。因此，在理想的情形下，應(yīng)全身遞送CpG以便該TLR9激動(dòng)劑有機(jī)會(huì)深入黑素瘤轉(zhuǎn)移灶。挑戰(zhàn)是獲得局部免疫激活而不誘導(dǎo)全身性免疫應(yīng)答。納米技術(shù)提供了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的極好機(jī)會(huì)。迄今為止，尚未研究腫瘤-選擇性遞送CpG納米顆粒。在所提出的這項(xiàng)工作中，我們意欲配制和評估靶向黑素瘤以誘導(dǎo)腫瘤-特異性的免疫應(yīng)答的水溶性聚合物_CpG。作為藥物載體的L-PG
L-PG的獨(dú)特性在于其是由通過酰胺鍵主鏈連接在一起的天然存在的L-谷氨酸組成。L-谷氨酸的每一重復(fù)單元中側(cè)鏈自由Y-羧基在中性pH下帶負(fù)電，這使得聚合物是水溶性的。羧基亦提供連接多種組分的官能團(tuán)(functionality),所述多種組分包括藥物分子和顯像劑。參見圖3。例如，我們實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的L-PG-紫杉醇綴合物，在許多臨床前動(dòng)物腫瘤模型和早期I期試驗(yàn)中顯示出顯著抗腫瘤活性，其中紫杉醇在其2’-羥基通過酯鍵與L-PG共價(jià)連接0Li C等,Biodistribution of Paclitaxel and Poly (L-glutamic acid)-paclitaxelConjugate in Mice with Ovarian OCa-1 Tumor (紫杉醇和多聚(L_ 谷氨酸)-紫杉醇綴合物在患卵巢Oca-1腫瘤的小鼠中的生物分布)，Cancer Chemother Pharmacol46:416-22, 2000 ；Li C等，Antitumor Activity of Poly (L-glutamic acid) -pacli taxelon Syngeneic and Xenografted Tumors (多聚(L_谷氨酸)-紫杉醇對同源和異種移植腫瘤的抗腫瘤活性)，Clin Cancer Res 5:891-7，1999 ；Li C 等，Complete Regressionof Wel !-Established Tumors Using a Novel Water-soluble poly (L ~gl utamicacid) -paclitaxel Conjugate (使用新型水溶性多聚(L_谷氨酸)-紫杉醇綴合物使完全建立的腫瘤完全消退)，Cancer Res 58:2404-9，1998 ；Boddy AV 等，J Phase I andPharmacokine ti c Study of Pacli taxel Poliglumex (XYOTAX), Investigating Both3-Weekly and 2-Weekly Schedules (聚谷氨酸紫杉醇(XYOTAX)的I期和藥代動(dòng)力學(xué)研究研究每周3次和每周2次兩種方案)，Clin Cancer Res 11:7834-40, 2005。在體外通過巨噬細(xì)胞-樣細(xì)胞和在體內(nèi)通過多種腫瘤將L-PG-紫杉醇降解為單谷氨酸紫杉醇和二谷氨酸紫杉醇。Shaffer SA等,// Vitro and In Vivo Metabolism ofPacli taxel Poliglumex:1dentification of Metaboli tes and Active Pro teases (聚谷氨酸紫杉醇的體外和體內(nèi)代謝代謝產(chǎn)物和活性蛋白酶的鑒定)，Cancer ChemotherPharmacol 59:537-48, 2007。半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶B是腫瘤中L-PG降解的重要介導(dǎo)物，但其它蛋白降解途徑亦有貢獻(xiàn)。Shaffer SA等,J/ Vitro and In Vivo Metabolismof Pacli taxel Poliglumex:1dentification of Metabolites and Acti ve Pro teases(聚谷氨酸紫杉醇的體外和體內(nèi)代謝代謝產(chǎn)物和活性蛋白酶的鑒定)，Cancer ChemotherPharmacol 59:537-48，2007 ；Melancon MP 等，J Novel Method for Imaging In VivoDegradation of Poly(L-Glutamic Acid), a Biodegradable Drug Carrier (用于生物可降解的藥物載體一多聚(L-谷氨酸)的體內(nèi)降解的新型成像方法)，Pharm Res 24:1217-24, 2007。這種基于L-PG的抗癌劑是首個(gè)已經(jīng)進(jìn)行到III期臨床研究的合成
M ^lo Li C, Wallace S. , Polymer-Drug Conjugates: Recent Development InClinical Oncology (聚合物-藥物綴合物臨床腫瘤學(xué)的最新進(jìn)展)，Adv Drug DelivRev 60:886-98, 2008。L-PG是水溶性的、生物可降解的且無毒性的。通用化學(xué)可用于合成基于PG的聚合物，且具有完全受控的分子量、降解性和電荷。這些特征使得L-PG成為作為CpG載體以及用于了解聚合物載體和CpG的免疫刺激活性之間的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的特別有前景的候選物。作為黑素瘤治療靶標(biāo)的黑皮質(zhì)素I型受體和酪氨酸酶
黑皮質(zhì)素I型受體(MClR)在黑素瘤細(xì)胞中過量表達(dá)。Giblin細(xì)等，Design andCharac teriza ti on of Alpha-Melanotropin Peptide Analogs Cyclized Through Rheniumand Technetium Metal Coordination (通過錸和锝金屬配位而環(huán)化的α-促黑素細(xì)胞激素肽類似物的設(shè)計(jì)和表征)，Proc Natl Acad Sci USA 95:12814-8，1998 ；Miao Y,Benwell K, Quinn TP. , 99mTc~ and lllln-labeled Alpha-Melanocytes timula tingHormone Pep ti des as Imaging Probes for Primary and Pulmonary MetastaticMelanoma Detection (99mTc_和IllIn-標(biāo)記的α -促黑素細(xì)胞激素肽作為用于檢測原發(fā)性和肺轉(zhuǎn)移性黑素瘤的成像探針)，J Nucl Med 48:73-80, 2007 ；Lopez MN等，Melanocortin I Receptor is Expressed by Uveal Malignant Melanoma and can beConsidered a New Target for Diagnosis and Immunotherapy (由葡萄膜惡性黑素瘤表達(dá)黑皮質(zhì)素I受體并可作為診斷和免疫治療的新祀標(biāo))，Invest Ophthalmol Vis Sci48:1219-27， 2007。小分子量肽[Nle4，D-Phe7] α -促黑素細(xì)胞激素(“NDP-MSH”)是MClR的有效激動(dòng)劑，其與 MClR 以高親和力(IC5tl= O. 21 ηΜ)結(jié)合。Chen J 等，Melanoma-Targeting·Properties of (99m) Technetium-Labeled Cyclic Alpha-MelanocyteStimulatingHormone Pep ti de Analogues ((99m)锝標(biāo)記的環(huán)狀α -促黑素細(xì)胞激素肽類似物的黑素瘤 _祀向特性)，Cancer Res 60:5649-58，2000 ； Sawyer Ι 等，4_Nor I euc ine，7 ~D~Ph enylalan ine~Alpha -Melan ocyte~S timula ti ng Hormone: A Highly PotentA Ipha -Melano tropin With Ultralong Biological Acti vi ty (4_ 正亮氨酸、7_D_ 苯丙氨酸-α -促黑素細(xì)胞激素具有超長生物活性的高效α -促黑素細(xì)胞激素)，Proc NatlAcad Sci USA 77:5754-8，1980。已提出將NDP-MSH和其它a-MSH類似物作為黑素瘤-預(yù)防性藥劑，其通過防止黑素細(xì)胞向黑素瘤的惡性轉(zhuǎn)化來發(fā)揮作用。Abdel-Malek ZA等，The Melanocortin I Receptor and The UV Response of Human MelanocytesA ShiftIn Paradigm (黑皮質(zhì)素I受體和人黑素細(xì)胞的UV應(yīng)答一示例性的轉(zhuǎn)變)，PhotochemPhotobiol 84:501-8, 2008。最近，我們讓NDP-MSH與中空金納米顆粒(直徑約40 nm)綴合，在靜脈內(nèi)注射后用光學(xué)和正電子成像術(shù)兩種成像技術(shù)，已顯示MClR介導(dǎo)金納米顆粒主動(dòng)革巴向 B16 黑素瘤。Lu ff, Xiong C，Zhang G 等，Targeted Photothermal Ablation ofMurine Melanomas wi th MelanocyteSt imula ting Hormone Analog-Conjugated HollowGold Nanospheres (用綴合促黑素細(xì)胞激素類似物的中空納米金球?qū)κ蠛谒亓龅陌邢蚬鉄崆谐?，Clin Cancer Res 15:876-86, 2009。靜脈內(nèi)注射后，注射劑量的約12. 6%被遞送至B16黑素瘤，這顯著多于遞送至脾臟的劑量(4%)。這些數(shù)據(jù)表明NDP-MSH是用于靶向遞送納米顆粒至黑素瘤的極好尋靶配體。
將納米顆粒靶向腫瘤-相關(guān)受體雖然有吸引力，但不能完全避免肝和脾中吞噬細(xì)胞對納米顆粒的攝取。在理想情況下，CpG納米顆粒在腫瘤特異性的酶的作用下僅可在腫瘤位點(diǎn)釋放CpG。以這種方式，在器官而不是腫瘤中，CpG-誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活將大幅降低，即使一些注射納米顆粒分布在這些器官(即肝和脾)中亦如此。在抗體定向的酶前藥治療(“ADEPT”)方案中癌癥的化學(xué)療法已經(jīng)利用了這一方法。Jungheim L, ShepherdT. , Design of Anti tumor Prodrugs: Substrates for Antibody Targeted Enzymes (抗腫瘤前藥的設(shè)計(jì)用于祀向抗體的酶的底物)，Chem Rev 94:1553-66, 1994。但是，由于抗體-酶綴合物可與其它組織非特異性結(jié)合，ADEPT方法有其自身的局限性。幸運(yùn)的是，可能依賴?yán)野彼崦高@種酶，酪氨酸酶已經(jīng)存在于黑素瘤細(xì)胞中，其與黑素細(xì)胞有著獨(dú)特的關(guān)系。當(dāng)黑素細(xì)胞變成惡性時(shí)，表達(dá)酪氨酸酶的基因變得上調(diào)，導(dǎo)致癌細(xì)胞中酪氨酸酶的水平顯著增力口° Land EJ, Ramsden CA, Riley PA, Quinone Chemistry and Melanogenesis(醌化學(xué)和黑素生成)，Methods Enzymol 378:88-109，2004 ；Riley PA. , Melanogenesisand Melanoma (黑素生成和黑素瘤)，Pigment Cell Res 16:548-52，2003。因此，由于酪氨酸酶天然存在于腫瘤中并事實(shí)上不存在于其它細(xì)胞中，其提供了內(nèi)置式的藥物靶向機(jī)制。Alena F，Jimbow K, Ito S·，Melanocytotoxicity and An time lanoma Effectsof Phenolic Amine Compounds in Mice In Vivo (小鼠體內(nèi)酌■胺化合物的黑素細(xì)胞毒性和抗黑素瘤作用)，Cancer Res 50:3743-7，1990 ；Jordan 狐等，Melanocyte-DirectedEnzyme Prodrug Therapy (MDEPT):Development of Second Generation Prodrugs ForTargeted Treatment of Malignant Melanoma (黑素細(xì)胞定向的酶前藥治療(MDEPT)用于靶向治療惡性黑素瘤的第二代前藥的開發(fā))，Bioorg Med Chem 9:1549-58，2001 ；Jordan ,Melanocyte-directed Enzyme Prodrug Therapy (MDEPT): Development ofa Targeted Treatment for Malignant Melanoma (黑素細(xì)胞定向的酶前藥治療(MDEPT)開發(fā)針對惡性黑素瘤的靶向治療)，Bioorg Med Chem 7:1775-80, 1999 ；Knaggs S等，New Prodrugs Derived from 6-amino dopamine and 4-aminophenol as Candidatesfor Melanocyte-Directed Enzyme Prodrug Therapy (MDEPT)(衍生自 6_ 氨基多巴胺和4-氨基苯酚的新型前藥作為黑素細(xì)胞定向的酶前藥治療(MDEPT)的候選物)，OrgBiomol Chem 3:4002-10，2005 ；Morrison ME, Yagi MJj Cohen G.，In Vitro Studies of2，4-Dihydroxyphenylalanine, A Prodrug Targeted Against Malignant Melanoma Cells(靶向惡性黑素瘤細(xì)胞的前藥2，4-二羥苯丙氨酸的體外研究)，Proc Natl Acad Sci USA82:2960-4, 1985。亦測試了用于治療黑素瘤的很多酪氨酸酶-依賴性的前藥。例如，經(jīng)由環(huán)化-藥物釋放機(jī)制，利用酪氨酸酶以介導(dǎo)自氨基甲酸酯和尿素前藥釋放細(xì)胞毒素劑。Jordan 碰等，Melanocyte-Directed Enzyme Prodrug Therapy(MDEPT): Development of Second Generation Prodrugs For Targe ted Treatmentof Malignan t Melanoma (黑素細(xì)胞定向的酶前藥治療(MDEPT):用于靶向治療惡性黑素瘤的第二代前藥的發(fā)展)，Bioorg Med Chem 9:1549-58，2001 ;Jordan AM 等，Melanocyte-directed Enzyme Prodrug Therapy (MDEPT): Development of a Targe tedTreatment for Malignant Melanoma (黑素細(xì)胞定向的酶前藥治療(MDEPT):惡性黑素瘤 的靶向治療的開發(fā))，Bioorg Med Chem 7:1775-80, 1999。但是，尚未使用所述機(jī)制來遞送免疫刺激劑。初步結(jié)果
瘤內(nèi)注射CpG比全身性注射更好
如圖4所示，我們發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi)注射CpG顯著降低了 B16F10腫瘤的生長，而這種作用在腹膜內(nèi)注射CpG中沒有觀察到。我們亦發(fā)現(xiàn)CpG與癌癥疫苗聯(lián)合的途徑是關(guān)鍵性的。雖然靜脈內(nèi)注射CpG能夠誘導(dǎo)腫瘤抗原-特異性的T-細(xì)胞應(yīng)答的激活和擴(kuò)增，但大多數(shù)激活后的T細(xì)胞無法遷移至腫瘤。相比之下，瘤內(nèi)注射CpG導(dǎo)致抗原-特異性T細(xì)胞的廣泛的腫瘤浸潤。這些結(jié)果導(dǎo)致我們推斷CpG在局部起作用，并且必須集中在腫瘤位點(diǎn)。增強(qiáng)CpG的免疫刺激效力和抗腫瘤功效
使用皮下小鼠B16黑素瘤模型，我們證明與用游離CpG作為針對已建立的腫瘤的獨(dú)立藥劑相比，瘤內(nèi)注射L-PG-CpG綴合物觸發(fā)顯著更強(qiáng)的抗腫瘤活性，導(dǎo)致抑制腫瘤生長(圖5A)。與游離CpG相比，L-PG-CpG顯著增強(qiáng)了對腫瘤-非特異性的⑶8 T-細(xì)胞群的激活。有意義的是，盡管游離CpG誘導(dǎo)全身性免疫效應(yīng)NK細(xì)胞的非特異性激活，但PG-CpG卻不能(圖5C)。這些結(jié)果表明L-PG-CpG增強(qiáng)了 CpG的免疫刺激效力和抗腫瘤功效而不導(dǎo)致全身性免疫應(yīng)答。尚未完全了解增強(qiáng)CpG的免疫效力和介導(dǎo)L-PG-CpG的強(qiáng)烈抗腫瘤作用的機(jī)制，但是若干因素可促成這種活性，包括(i)貯庫作用，PG-CpG藉此在延長的時(shí)間內(nèi)駐留在腫瘤中，CpG從其注射位點(diǎn)緩慢釋放；(ii)增強(qiáng)CpG至腫瘤內(nèi)的pDC和APC的遞送；(iii)L-PG-CpG和用于抗原呈遞的腫瘤內(nèi)腫瘤抗原的共定位。自發(fā)的腫瘤細(xì)胞死亡/重塑可提供“危險(xiǎn)”信號，這可形成L-PG和腫瘤相關(guān)抗原之間的物理聯(lián)系，導(dǎo)致抗癌免疫力增強(qiáng)。我們已實(shí)施了若干初步研究來評估這些可能方案的潛在貢獻(xiàn)。遞送系統(tǒng)增加了瘤內(nèi)注射后的腫瘤內(nèi)駐留
為評價(jià)L-PG的體內(nèi)分布和腫瘤內(nèi)分布，我們使用了近紅外熒光(NIRF)成像，其中用L-PG-NIR (圖3)作為L-PG-CpG的替代物，用111In-標(biāo)記的L-PG-CpG進(jìn)行放射自顯影(圖
6)。瘤內(nèi)注射后，L-PG-NIR大部分駐留在注射位點(diǎn)。注射劑量的顯著部分亦轉(zhuǎn)運(yùn)至引流淋巴結(jié)(圖6A-C)。在B16黑素瘤中，與CpG相比，更多的111In-標(biāo)記的L-PG-CpG駐留在腫瘤內(nèi)，而且L-PG-CpG在整個(gè)腫瘤內(nèi)的分布更加廣泛，而CpG主要局限在腫瘤周圍區(qū)域(圖6D)。腫瘤內(nèi)CpG治療和靶向協(xié)同刺激途徑的試劑聯(lián)合增強(qiáng)抗腫瘤作用
我們對瘤內(nèi)注射CpG和靶向協(xié)同刺激途徑的全身性抗體治療聯(lián)合是否導(dǎo)致強(qiáng)烈抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。例如，我們的初步研究表明，0X40抗體和CpG的聯(lián)合產(chǎn)生比單獨(dú)的CpG顯著更強(qiáng)的CTL應(yīng)答和抗腫瘤作用(圖7)?；谶@些結(jié)果，我們進(jìn)一步用如下所述的最好的納米-CpG探索靶向正和負(fù)協(xié)同刺激分子二者的新方法，以提高T-細(xì)胞對黑素瘤的免疫力。靜脈內(nèi)給藥后肝和脾對L-PG-CpG的攝取顯著少于CpG
除鑒定在瘤內(nèi)注射后具有顯著免疫刺激活性的基于PG的納米-CpG外，還開發(fā)了用于 腫瘤-特異性免疫應(yīng)答而無全身性激活的基于PG的納米-CpG。為測試可行性，我們進(jìn)行了三個(gè)關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)來解決以下問題1) L-PG是否可顯著降低肝和脾中CpG的攝??；2)分布于腫瘤中的L-PG聚合物是否被腫瘤中的巨噬細(xì)胞攝??；和3)靶向黑素瘤細(xì)胞的L-PG-CpG是否被黑素瘤細(xì)胞處理以引發(fā)強(qiáng)烈免疫應(yīng)答。在以下三個(gè)研究中總結(jié)了這些問題的答案。為比較靜脈內(nèi)注射后CpG與PG-CpG的生物分布，我們用111In (半衰期為3天的Y發(fā)射體)標(biāo)記了這兩種化合物。如圖8所示，肝和脾對PG-CpG的攝取顯著少于CpG。這一結(jié)果表明L-PG是全身給藥后靶向遞送CpG的有前景的納米載體。靜脈內(nèi)注射后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞攝取L-PG聚合物
使用經(jīng)Gd和NIR染料二者標(biāo)記的L-PG-Gd-NIR (圖3)，用磁共振和NIRF成像來非侵襲性監(jiān)測組織和腫瘤內(nèi)分布，我們發(fā)現(xiàn)通過靜脈內(nèi)途徑給藥后，PG-Gd-NIR被腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞攝取(圖9)。PG-Gd-NIR和CD-68+共同定位于裸大鼠的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤中(圖9A)。此夕卜，消耗巨噬細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤中PG-Gd-NIR的攝取顯著減少(圖9B-D)。定量研究顯示用氯膦酸鹽脂質(zhì)體消耗巨噬細(xì)胞后，腫瘤區(qū)域的熒光強(qiáng)度降低超過100倍。該數(shù)據(jù)表明PG-Gd-NIR被遞送至腫瘤中的巨噬細(xì)胞/APC。被B16黑素瘤細(xì)胞攝取和處理
我們合成MSH-L-PG-CpG來測試黑素瘤細(xì)胞經(jīng)由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取的L-PG-CpG是否可被處理并保持其免疫刺激活性。如圖10所示，B16細(xì)胞攝取的MSH-L-PG-CpG能夠釋放活性CpG至培養(yǎng)基中來誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y。用過量MSH肽共同處理的B16細(xì)胞阻斷了 MSH-L-PG-CpG的攝取，消除了隨后由脾細(xì)胞導(dǎo)致的IFN- Y產(chǎn)生，這暗示黑素瘤細(xì)胞能夠處理MSH-L-PG-CpG并呈遞活性CpG物質(zhì)至腫瘤中的pDC。因此，這些結(jié)果證實(shí)了將CpG靶向黑素瘤細(xì)胞可作為用于誘導(dǎo)腫瘤-特異性免疫的新策略。引人關(guān)注的是，不含MSH的PG-CpG可被B16F10黑素瘤細(xì)胞有效攝取，這不依賴于MClR-介導(dǎo)的攝取。很明顯，需要更多的研究來闡明黑素瘤細(xì)胞中L-PG-CpG和MSH-L-PG-CpG的細(xì)胞運(yùn)輸和處理。初步數(shù)據(jù)推論
歸納起來，我們的初步結(jié)果表明L-PG是用于治療黑素瘤的免疫刺激TLR激動(dòng)劑的有前景的新型CpG載體。通過延長其腫瘤駐留，L-PG可顯著增強(qiáng)CpG的活性，并因此充當(dāng)允許持續(xù)釋放CpG的藥物儲(chǔ)庫。包括巨噬細(xì)胞和DC在內(nèi)的APC，大量積聚基于L-PG的聚合造影劑。亦有可能在黑素瘤-特異性的酪氨酸酶的作用下，將L-PG-CpG靶向黑素瘤細(xì)胞并產(chǎn)生“智能的(smart) ”基于L-PG的CpG遞送系統(tǒng)來僅釋放CpG,這可讓腫瘤-特異性的CTL應(yīng)答進(jìn)一步增強(qiáng)。因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)是復(fù)雜的，有必要探索納米-CpG與調(diào)節(jié)協(xié)同刺激途徑及詢問(interrogate)腫瘤微環(huán)境的其它分子的組合。通過這些組合方法，我們了解了腫瘤中普遍的局部免疫作用，并且可開發(fā)有效的抗腫瘤免疫療法，可將所述抗腫瘤免疫療法轉(zhuǎn)移到臨床上，以對黑素瘤患者的護(hù)理產(chǎn)生顯著的積極作用。預(yù)示性實(shí)施例1
測定瘤內(nèi)注射后PG-CpG對于其抗癌作用的最佳理化特性· 瘤內(nèi)注射后,具有最佳理化性質(zhì)的基于PG的CpG納米構(gòu)建物局部激活pDC，而不誘導(dǎo)全身性免疫應(yīng)答，這導(dǎo)致有效的免疫治療效果。基本原理和總體策略
在以上初步研究中，我們已表明瘤內(nèi)注射L-PG-CpG比瘤內(nèi)注射游離CpG的抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)。但是，未完全了解增強(qiáng)CpG的免疫效力和介導(dǎo)PG-CpG的強(qiáng)抗腫瘤作用的機(jī)制。若干因素可促成這種活性，包括(i)貯庫作用，L-PG-CpG藉此在延長的時(shí)間內(nèi)駐留在腫瘤內(nèi)，且CpG從其注射位點(diǎn)緩慢釋放；(ii)在腫瘤內(nèi)增強(qiáng)將CpG遞送至APC和DC ; (iii)在腫瘤內(nèi)共同遞送L-PG-CpG和TAA至DC。自發(fā)的腫瘤細(xì)胞死亡/重塑可提供TAA，其然后在腫瘤中形成L-PG聚合物和抗原之間的物理聯(lián)系，導(dǎo)致抗癌免疫力增強(qiáng)。為了完全了解這些可促成L-PG-CpG的抗腫瘤活性增強(qiáng)的因素所起的可能作用，系統(tǒng)的方法是必要的。另外，期望獲自這些類型的研究的數(shù)據(jù)，導(dǎo)致鑒別在瘤內(nèi)注射基于PG的CpG納米構(gòu)建物后PG聚合物對激活有效的免疫效應(yīng)細(xì)胞起關(guān)鍵作用的理化特性，這將有助于設(shè)計(jì)新一代改進(jìn)的CpG遞送系統(tǒng)。與將CpG摻合在納米顆粒內(nèi)的其它研究相比，讓CpG與水溶性L-PG綴合，這可有利于確保以其完整形式，或作為因聚合物降解而致的活性物質(zhì)，PG-CpG可容易地接近結(jié)合內(nèi)體中的TLR9。具體而言，可通過系統(tǒng)性地檢測聚合物的大小(分子量;MW)、電荷和降解性如何影響其在B16黑素瘤中的駐留和其在腫瘤pDC中的攝取，來研究瘤內(nèi)注射PG-CpG增強(qiáng)抗腫瘤活性的作用機(jī)制。PG-CpG的腫瘤駐留和pDC對PG-CpG的攝取可與先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)有關(guān)聯(lián)。下表I總結(jié)了為所提出的研究而合成和測試的基于PG的聚合物。包括單谷氨酸-CpG綴合物作為對照。期望瘤內(nèi)注射后L-PG-CpG的腫瘤駐留受其MW支配，因?yàn)榉肿訑U(kuò)散系數(shù)的大小約為其MW的立方根的倒數(shù)。較小尺寸的分子可從注射位點(diǎn)迅速清除，而較大尺寸的大分子則大多數(shù)可以以極不均勻的腫瘤內(nèi)分布限定在注射位點(diǎn)。另外，多聚陰離子PG和腫瘤中帶正電荷的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合親和力亦應(yīng)該作為多聚陰離子鏈長度增加的函數(shù)而增加。自PG-CpG降解和釋放CpG可通過兩種方法開始聚合物主鏈降解；和在CpG與PG聚合物之間引入水解不穩(wěn)定接頭。因此，CpG可與不可降解的多聚(D-谷氨酸)(D-PG)及含L-酪氨酸和L-丙氨酸的L-PG共聚物[多聚(L-Glu-Tyr)和多聚(L-Glu-Ala)]綴合，所述 L-PG 共聚物比 L-PG 的降解更迅速。Chiu Vl-C 等，Lysosomal Degradability ofPoly (alpha-amino acids)(多聚(ct -氨基酸)的溶酶體降解性)，J Biomed Mat Res34:381-92, 1997。CpG亦可通過酸不穩(wěn)定的接頭與L-PG和D-PG綴合，這可在酸性的內(nèi)體環(huán)境下迅速釋放CpG。最后，讓CpG與可降解但電荷中性的多聚(羥丙基L-谷氨酸)(L-PHPG)綴合，允許檢測多聚陰離子L-PG-CpG和來自腫瘤本身的帶正電荷的蛋白質(zhì)之間的物理相互作用的可能作用。同前。因此，可檢測CpG遞送對體內(nèi)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答二者的影響。但是，考慮到因免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性，體外研究預(yù)測疫苗功效的能力有限，我們的焦點(diǎn)集中在用同基因的B16黑素瘤模型進(jìn)行體內(nèi)評估。在很多臨床前的黑素瘤研究中一直使用C57BL/6小鼠的B16黑素瘤。弱免疫原性和B16細(xì)胞表達(dá)非常少量的MHC I類分子這一事實(shí)使得B16模型為基于T-細(xì)胞的免疫治療的挑戰(zhàn)性模型。Mansour 等，Therapyof Established B16-F10 Melanoma Tumors by a Single Vaccina tion of CTL/T HelperPeptides in VacciMax(R)(單獨(dú)接種 VacciMax (R)中的 CTL/R 輔助肽對建立的 B16-F10黑素瘤腫瘤的治療)，2007.第20頁。采用了各種方法用于產(chǎn)生CTL對B16的應(yīng)答，包括在納米顆粒中共同遞送分離的TAA和CpG。但是，我們提出的研究顯著不同于這些其它研究，因?yàn)樵谄渌芯恐性谧⑸渲皼]有純化的TAA與PG-CpG的混合。應(yīng)該使用來自腫瘤本身的更加接近實(shí)際的及臨床相關(guān)的黑素瘤原位抗原
表1.待合成和測試的基于PG的聚合物
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圖11總結(jié)了靶化合物的結(jié)構(gòu)。在於羥基苯并三唑存在下，可用1，3-二異丙基碳二亞胺-介導(dǎo)的在Boc-Glu(OH)-OtBu的側(cè)鏈羧基和3’-NH2-CpG氨基之間的偶聯(lián)反應(yīng)來合成單體L-谷氨酸CpG。可用三氟乙酸除去所得產(chǎn)物的Boc和叔丁基保護(hù)基團(tuán)。通常通過用溴化氫去除芐基保護(hù)基自多聚(L-谷氨酸Y-芐酯)(L-PBLG)獲得L-PG。為制備同聚物和隨機(jī)共聚物，三乙胺-引發(fā)的L-谷氨酸Y-芐酯(NCA-L-Glu)中的羧基酸酐(NCA)和相應(yīng)氨基酸(即NCA-D-Glu、NCA-L-Tyr或NCA-L-Ana)的聚合是最常使用的方法。Li C·，Poly (L-glutamic acid)-■Anticancer Drug Conjugates(多聚(L-谷氨酸)一抗癌藥物綴合物)，Adv Drug Deliv Rev 54:695-713, 2002。這種方法通常產(chǎn)生廣泛麗分布(多分散性>2.0)的多聚氨基酸。過去十年報(bào)道了一些受控的NCA聚合作用，包括使用過渡金屬絡(luò)合物和六甲基二硅氮烷作為引發(fā)劑。Deming TJ.， Cobalt and Iron Initiators for the Controlled Polymerizationof Alpha-Amino Aci d-N~Carboxyanhydri des (用于 α -氨基酸-N-羧基酸酐的受控聚合作用的鈷和鐵引發(fā)劑)，Macromolecules 32:4500-2，1999 ；Lu H，Cheng J.，Hexame thyIdi si Iazane-Medi a ted Controlled Polymerization of Alpha-Amino AcidN-Carboxyanhydrides (六甲基二娃氮焼介導(dǎo)的α -氨基酸-N-羧基酸酐的受控的聚合作用)，J Am Chem Soc 129:14114-5, 2007。因?yàn)樵摲椒扇菀椎靥峁┚呖深A(yù)測MW和窄MW分布的多聚氨基酸，所以使用六甲基二硅氮烷作為引發(fā)劑的反應(yīng)尤其有吸引力。因此，將該方法用于合成Glu = Tyr和Glu = Ala摩爾比為5:1的多聚(L-Glu-Tyr)和多聚(L-Glu-Ala)。Chiu等的研究表明L-Glu與L-Tyr和L-Ala的共聚物的降解比L-PG 的同聚物快約 3 倍。Chiu H-C 等，Lysosomal Degradabili ty of Poly (alpha-aminoacids)(多聚(ct -氛基酸)的溶酶體降解性)，J Biomed Mat Res 34:381-92，1997。為促進(jìn)體外和體內(nèi)成像研究，按照前面報(bào)道的程序讓DTPA或適宜的熒光染料與不同MW的L-PG (MW = 2K、20K、50K 或 100Κ)、D-PG (MW = 50Κ)、多聚(L-Glu-Tyr) (MW = 50Κ)和多聚(L-Glu-Ala) (MW = 50Κ)綴合。可在最后階段用水溶性的偶聯(lián)劑(1-乙基_3_( 二甲基氨基丙基)碳二亞胺)在2-嗎啉乙磺酸緩沖液中讓3’ -氨基-CpG (0DC 2216)與這些綴合物綴合。Melancon MP 等，A Novel Method for Imaging In Vivo Degradation ofPoly (L-Glutamic Acid), a Biodegradable Drug Carrier (用于體內(nèi)成像降解生物可降解的藥物載體多聚(L-谷氨酸)的新型方法)，Pharm Res 24:1217-24, 2007 ；Melancon
MP Development of a Macromolecular Dual-Modality MR-Optical Imaging forSentinel Lymph Node Mapping (用于警戒淋巴結(jié)作圖的大分子雙重模態(tài)MR-光學(xué)成像的進(jìn)展)，Invest Radiol 42:569-78，2007; Wen \ 等，Synthesis and Characterizationof Poly (L-glutamic acid) Gadolinium Chelate: A New Biodegradable MRI ContrastAgent (多聚(L-谷氨酸)釓螯合物的合成和表征生物可降解的新型MRI造影劑)，Bioconjug Chem 15:1408-15, 2004。可用Gd標(biāo)記所得綴合物用于MRI，用111In標(biāo)記所得綴合物用于核成像研究。染料的選擇可視研究目的而定。對于體內(nèi)成像，使用在813nm處發(fā)射熒光信號的NIR染料。對于流式細(xì)胞術(shù)研究，可選擇FACS-相容的染料(即AlexaFluor488)。用裝有superdex-75 SEC柱的AKTA快速蛋白液相色譜系統(tǒng)來純化綴合物并用PBS緩沖液洗脫。對于L-PHPG-CpG合成，可通過3_氨基丙醇氨解L-PBLG來獲得L-PHPG。用對-硝基氯甲酸酯活化L-PHPG的羥基后，可用胺終止的DTPA或染料分子經(jīng)由氨基甲酸酯鍵來處理聚合物。然后可讓CpG與聚合物綴合，接著是螯合Gd或111In以得到Gd-、mIn-或染料-標(biāo)記的 L-PHPG-CpG (圖 12)。自含CpG(其經(jīng)由穩(wěn)定的酰胺或氨基甲酸酯鍵與PG連接)的PG-CpG納米構(gòu)建物釋放CpG，依賴于腫瘤中組織蛋白酶B和/或其它酶對PG主鏈的降解來釋放單體和寡聚谷氨酸CpG。因?yàn)槟[瘤與腫瘤之間和患者與患者之間酶的活性可不同，我們希望設(shè)計(jì)一個(gè)系統(tǒng)，其釋放CpG不依賴酶的活性，而是依賴內(nèi)吞溶酶體區(qū)室的酸性環(huán)境。這種方法可降低CpG遞送中的變化，并增加CpG的細(xì)胞內(nèi)遞送。為達(dá)到該目的，我們通過酸敏感的縮酮接頭將CpG接枝到L-PG和D-PG上(圖11)。與pH為7. 4的胞質(zhì)大不相同，內(nèi)體和溶酶體存在于5. 0-6. 5的酸性pH值下。已在設(shè)計(jì)pH-應(yīng)答的寡核苷酸和蛋白質(zhì)疫苗的遞送中米用了酸敏感的連接。Knorr V, Ogris M, Wagner E. , An Acid SensitiveKetal—based Polyethylene Glycol-Oligo e thylenimine Copolymer Media tes ImprovedTransfection Efficiency at Reduced Toxicity (酸敏感的基于縮酮的聚乙烯乙二醇-寡乙烯亞胺共聚物以低毒性介導(dǎo)提高的轉(zhuǎn)染率)，Pharm Res 25:2937-45, 2008 ；Murthy N 等，Design and Synthesis of pH~responsive polymeric Carriers thatTarget Uptake and Enhance the Intracellular Deli very of Oligonucleo ti des (革巴向攝取和增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)遞送寡核苷酸的pH-應(yīng)答的聚合物載體的設(shè)計(jì)和合成)，J ControlRelease 89:365-74，2003 ；Murthy N 等，J Macromolecular Deli very Vehicle forProtein-Based Vaccine: A ci d~Degradable Pro tein~Loaded Mi crogels (用于基于蛋白質(zhì)的疫苗的大分子遞送溶媒裝載酸可降解的蛋白質(zhì)的微凝膠)，Proc Natl Acad SciUSA 100:4995-5000， 2003。我們將在我們的設(shè)計(jì)中采用相似的縮酮接頭來讓CpG與L-PG和D-PG 二者綴合。此處包括D-PG以便可排除主鏈降解對CpG釋放的可能作用。從丙酮-二 _(氨乙基)縮酮開始，我們將馬來酰亞胺引入到二胺縮酮的一個(gè)末端以得到丙酮_(馬來酰亞胺基氨乙基)縮酮。然后用碳二亞胺介導(dǎo)的偶聯(lián)反應(yīng)讓該接頭與PG綴合，接著將3’-SH-CpG與馬來酰亞胺基接頭連接。如前所述，讓成像探針與聚合物綴合。表征
從下列幾方面來表征所得聚合的綴合物1)共聚物的結(jié)構(gòu)和組成比率；2)與每一聚合物連接的CpG、DTPA-Gd和染料的數(shù)量；3)麗和麗分布；和4)降解性?？赏ㄟ^1H-核磁共振來表征共聚物的組成比率?？赏ㄟ^從起始物質(zhì)的量中減去反應(yīng)混合物中回收的分子的量，來測定與每一聚合物連接的CpG、DTPA-Gd和染料的數(shù)量。需要時(shí)，亦可根據(jù)聚合物完全水解后的氨基酸分析來測定CpG、DTPA-Gd和染料分子的數(shù)量?？赏ㄟ^元素分析來測定Gd含量?？捎醚b有記錄折光率、粘度和光散射信號的Viscotek E-Zpm三元檢測器的系統(tǒng)(Viscotek, Houston, TX)，通過凝膠滲透色譜法(GPC)來測量每一聚合的綴合物的MW和碼分布。在組織蛋白酶B存在和不存在下按照Wen等的方法用GPC來實(shí)施每一聚合的綴合物的酶降解。Wen \^，Synthesis and Charac teri za ti on of Poly (L ~glu tami c acid)Gadolinium Chelate: A New Biodegradable MRI Contrast Agent (新型生物可降解的MRI造影劑多聚(L-谷氨酸)禮螯合物的合成和表征)，Bioconjug Chem 15:1408-15,2004。隨時(shí)間監(jiān)測每一聚合的綴合物的峰面積的減少，并表示為“降解百分率”。通過在pH
5、pH 6和pH 7. 4下用高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)分析隨時(shí)間變化的CpG釋放，來研究PG-縮酮-CpG綴合物的水解降解。為評估新合成的CpG-結(jié)合的納米構(gòu)建物在體外的細(xì)胞攝取和運(yùn)輸及在瘤內(nèi)注射至B16腫瘤后的體內(nèi)駐留，可按照我們發(fā)表的實(shí)驗(yàn)方案自C57BL/6小鼠的骨髓產(chǎn)生巨噬細(xì)胞 ο Thapa P, Zhang G, Xia C ^,Nanoparti cle Formula ted A Ipha -Galac tosylcerami deActivates NKT Cells Without Inducing Anergy (a半乳糖神經(jīng)酰胺制成的納米顆粒激活NKT細(xì)胞而不誘導(dǎo)無反應(yīng)性)，Vaccine 27:3484-8，2009。為研究聚合物-CpG的內(nèi)化，可用熒光標(biāo)記的聚合物脈沖巨噬細(xì)胞達(dá)I小時(shí)，固定，用針對EEA (早期內(nèi)體標(biāo)記)、甘露糖-6磷酸受體(晚期內(nèi)體受體)和LAMPl (溶酶體標(biāo)記)的單克隆抗體來染色。所有的抗體都來自Abeam (Cambridge, MA)?？赏ㄟ^共焦顯微術(shù)來研究聚合物的共區(qū)域化和不同的內(nèi)吞溶酶體標(biāo)記。體內(nèi)駐留、腫瘤內(nèi)分布和降解
我們將使用核和MR成像技術(shù)來非侵襲性地評估B16黑素瘤中PG-CpG納米構(gòu)建物的駐留和分布(共11種制備物)(表I和圖11)。僅用mIn標(biāo)記的游離CpG作對照。用Gd/mIn對所有PG-CpG納米構(gòu)建物進(jìn)行雙重標(biāo)記。在單次注射中通過瘤內(nèi)注射將每種標(biāo)記的試劑遞送至C57BL/6小鼠皮下已長成的B16黑素瘤(直徑6-8 mm) (100 μ Ci, 100 μ I)。在注射后的不同時(shí)間用Y-照相機(jī)對小鼠成像?？赏ㄟ^將目的區(qū)域放置在整個(gè)身體、肝/脾區(qū)域和腫瘤周圍，來量化腫瘤中和身體其它部位的放射性。這允許我們測量在同一小鼠中隨時(shí)間推移從腫瘤中清除的CpG和PG-CpG的量。因?yàn)镸RI提供極好的空間分辨率，我們亦將使用MRI來監(jiān)測不同時(shí)間點(diǎn)PG-CpG納米構(gòu)建物的腫瘤內(nèi)分布。在成像期結(jié)束(注射后3天)時(shí)，殺死小鼠。移出肝、脾、引流淋巴結(jié)和腫瘤，計(jì)數(shù)其放射性。腫瘤駐留可表示為注射劑量的百分比?？蓪λ星谐哪[瘤進(jìn)行放射自顯影研究?？赏ㄟ^測量放射性區(qū)域和整個(gè)腫瘤區(qū)的比率(以百分比表示)來分析腫瘤內(nèi)分布的均勻性。可根據(jù)其腫瘤駐留(%)以及腫瘤內(nèi)分布的程度(%)來對CpG和基于PG的CpG納米構(gòu)建物分等級。為檢測聚合物在Β16黑素瘤中的生物降解，對每一切除腫瘤組織的一半進(jìn)行處理，以便用NaCl晶體檢測器監(jiān)測柱中放射性完整聚合物和聚合物片段的洗脫來進(jìn)行GPC分析。(12組X 10只小鼠)。評估瘤內(nèi)注射后通過CpG和基于PG的CpG納米構(gòu)建物誘導(dǎo)的先天性免疫和獲得 性免疫
體內(nèi)細(xì)胞的攝取
為評價(jià)CpG-結(jié)合的PG納米構(gòu)建物在不同免疫細(xì)胞群中的攝取，可將圖11中所示的L-Glu-染料單體和每一種PG-CpG-染料綴合物(染料=AlexaFluor 647)經(jīng)瘤內(nèi)注射至Β16腫瘤中(η = 10)。使用CpG-染料作為對照。可在1、3和7天之后，通過流式細(xì)胞術(shù)測量腫瘤、引流淋巴結(jié)和脾中⑶lie+ DC和⑶llb+F480+巨噬細(xì)胞對CpG的攝取。因?yàn)楫?dāng)聚合物分解時(shí)，與PG聚合物連接的熒光染料將自連接到同一聚合物鏈上的CpG解離，其直接報(bào)告聚合物或聚合物片段的細(xì)胞攝取。為此，我們亦將熒光標(biāo)記的CpG (例如3’-NH2-CpG-AlexaFluor 647, Alpha DNA, Montreal, Canada)與圖 11 所不的 PG 聚合物連接，用于對CpG和PG-CpG綴合物中的CpG的細(xì)胞攝取進(jìn)行FACS研究。以下抗體將用于細(xì)胞標(biāo)記對于DC為CDllc ;對于巨噬細(xì)胞，為CDllb和F480。另外，將在單核細(xì)胞譜系細(xì)胞中表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠(在鼠c-fms啟動(dòng)子的控制下)用作腫瘤移植受者，這允許我們在活體動(dòng)物中用非侵襲性成像來研究NIR熒光染料標(biāo)記的聚合物和單核細(xì)胞-巨曬細(xì)胞的共區(qū)域化。動(dòng)物得自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor,Maine)。局部細(xì)胞因子產(chǎn)生
用來自 R&D systems (Minneapolis, MN)的標(biāo)準(zhǔn) ELISA 試劑盒來測量 IFN-α、IL-12和 IFN- Y。在B16黑素瘤中遞送至APA激活pDC
用針對DC (⑶IIc+)和巨噬細(xì)胞(⑶llb+F480+)的抗體經(jīng)多色流式細(xì)胞儀來研究聚合物至腫瘤APC的遞送。通過用⑶69對pDC (BDCA2+)進(jìn)行IHC染色來監(jiān)測pDC的激活。腫瘤中黑素瘤-特異的⑶8+ T-細(xì)胞應(yīng)答
作為OVA-特異性的四聚體(Pharmingen, San Jose, CA)來監(jiān)測腫瘤-特異性的⑶8應(yīng)答。全身性應(yīng)答
通過測量包括IFN- α、IFN- Y、TNF- α和IL-12在內(nèi)的細(xì)胞因子的血清水平來研究全身性應(yīng)答。可用來自R&D systems的ELISA試劑盒或Luminex來測量所有細(xì)胞因子。
最終，在以上所有研究中，用不含CpG的L-PG (MW = 50K)作為對照?？鼓[瘤活性的確認(rèn)
研究瘤內(nèi)注射后所有結(jié)合CpG的PG及單谷氨酸CpG (共11種化合物)的抗腫瘤活性。這是因?yàn)樵隗w外測定(刺激淋巴細(xì)胞)和體內(nèi)抗腫瘤活性之間沒有明確的關(guān)聯(lián)。將鹽水和游離CpG作為對照。將在雙腿上都荷有皮下B16黑素瘤腫瘤(平均直徑4-6 mm)的C57BL/6小鼠隨機(jī)分配到13個(gè)處理組中(10只小鼠/組)。在1、7和10天時(shí)每組中的小鼠都將接受鹽水、CpG和表I中所列的每種藥劑的瘤內(nèi)注射，劑量為50 μ g當(dāng)量CpG/注射(100 μ I)。僅處理每只小鼠的2個(gè)腫瘤中的I個(gè)。從第7天開始測量腫瘤大小，然后每2-3天測量一次直至第21天。將最長長度(β)和與最長長度垂直的長度如用于公式V =1A3 (幻2中，來獲得腫瘤體積(mm3)。在21天時(shí)，處死所有動(dòng)物，移走引流淋巴結(jié)、脾和經(jīng)處理及未經(jīng)處理的腫瘤二者，用于pDC群和細(xì)胞死亡(TUNEL)的IHC和FACS分 析。第21天時(shí)記錄單個(gè)腫瘤的重量并用作腫瘤控制的量度。將未經(jīng)處理的腫瘤用作評估黑素瘤-特異性的CTL應(yīng)答是否能夠表現(xiàn)出對遠(yuǎn)端位點(diǎn)腫瘤的抗腫瘤活性的工具。數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)
可使用廣義線性模型來分析納米-CpG的腫瘤內(nèi)駐留及其在pDC中的攝取。雖然在擬合數(shù)據(jù)之前不能確定這些模型的最終形式，但我們注意到所提出的設(shè)計(jì)在檢測每一成對比較的20%差異時(shí)具有>85%的功效。對于抗腫瘤作用研究，將腫瘤接種后每3天測量的腫瘤大小用作主要的終點(diǎn)。我們開始使用5-6只小鼠/組來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和確定方差及統(tǒng)計(jì)功效。加入另外的動(dòng)物(多達(dá)總共10只小鼠/組)來獲得統(tǒng)計(jì)顯著性。如果我們保守估計(jì)每一組的變異系數(shù)約為O. 25，并假設(shè)腫瘤大小有兩倍的降低，則對每組10只小鼠在t_檢驗(yàn)O. 005水平時(shí)，我們具有>85%的功效來檢測組間差異(假設(shè)每一組方差相等)。用Microsoft Windows的SAS軟件8. O版(SAS Institute)用單向ANOVA來進(jìn)行組間比較。將顯著性水平設(shè)為O. 05。預(yù)期結(jié)果、缺陷和解決方法
我們期望鑒定對與CpG結(jié)合的PG納米構(gòu)建物的有效抗腫瘤活性而言重要的PG聚合物的理化特性。具體地，有相對高M(jìn)W的帶負(fù)電荷PG可誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫刺激應(yīng)答，因?yàn)檫@些聚合物可在腫瘤中駐留更久并以持續(xù)方式釋放CpG。比起其較小尺寸的對應(yīng)物，較大尺寸的聚合物亦可更易于被APC吞噬，并與黑素瘤中的帶正電荷蛋白質(zhì)的相互作用更強(qiáng)。將Tyr和Ala引入到L-PG中，由于共聚物疏水性的增加，不僅影響聚合物的降解性，而且還影響APC對其的攝取及其與堿性蛋白質(zhì)的相互作用。不太可能但潛在的缺陷是PG聚合物可直接與其內(nèi)體受體(TLR9)相互作用，而不需要從聚合物中釋放CpG。在那種情況下，我們將在進(jìn)一步的研究中鑒定具有最強(qiáng)抗癌功效的聚合物_CpG。初始L-PG1-CpG和在體內(nèi)抗腫瘤功效研究中表現(xiàn)出最好功效的與CpG結(jié)合的PG納米構(gòu)建物(稱為PG2-CpG)，可被改進(jìn)至目標(biāo)2以設(shè)計(jì)和開發(fā)靶向黑素瘤受體和黑素瘤-特異性的酶的與CpG結(jié)合的PG納米構(gòu)建物。預(yù)示性實(shí)施例1I
開發(fā)并確認(rèn)通過受體-介導(dǎo)的攝取和酪氨酸酶-介導(dǎo)的CpG釋放二者主動(dòng)靶向黑素瘤細(xì)胞的PG-CpG納米構(gòu)建物
主動(dòng)靶向黑素瘤細(xì)胞并僅在黑素瘤-特異性的酪氨酸酶作用下釋放CpG的PG-CpG納米構(gòu)建物，進(jìn)一步增強(qiáng)CpG的免疫刺激和抗腫瘤活性，而不誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的非特異性激活。
基本原理和總體策略
對于治療致命的轉(zhuǎn)移性黑素瘤，強(qiáng)烈希望CpG到達(dá)整個(gè)身體的每一個(gè)病灶而不觸發(fā)全身性免疫應(yīng)答和由此引起的對在腫瘤位點(diǎn)需要的效應(yīng)T細(xì)胞的消耗。Sharma等最近使用靶向Her2/neU-陽性腫瘤細(xì)胞的抗體-CpG綴合物的研究和我們自己的關(guān)于靶向黑素瘤細(xì)胞的L-PG-CpG的初步數(shù)據(jù)，表明間接地將CpG靶向黑素瘤細(xì)胞是用于免疫治療黑素瘤的可行的策略。我們提出使用兩種方法來將CpG靶向黑素瘤細(xì)胞。在第一種方法中，我們將通過黑皮質(zhì)素I型受體(MClR)-介導(dǎo)的攝取，用α -促黑色素細(xì)胞激素作為尋靶配體，直接將與CpG結(jié)合的PG納米構(gòu)建物定向至黑素瘤細(xì)胞。將納米顆粒靶向腫瘤相關(guān)受體，雖然有吸引力，但不能完全避免肝和脾對納米顆粒的攝取。在理想情況下，與CpG結(jié)合的納米顆粒，或更特別地與CpG結(jié)合的PG，在腫瘤特異性的酶的作用下可在腫瘤位點(diǎn)單獨(dú)釋放CpG。以這種方式，在非腫瘤的位點(diǎn)，CpG-誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活將大幅降低，即使一些注射納米顆粒分布在這些次級淋巴器官中亦如此。
因此，在第二種方法中，我們將制備僅在高度黑素瘤特異性的-酶酪氨酸酶的酶激活時(shí)才釋放CpG的“智能的”納米構(gòu)建物。一旦獲得了所提出的納米結(jié)構(gòu)，我們將研究在腫瘤內(nèi)和靜脈內(nèi)注射后，CpG至B16腫瘤的體內(nèi)選擇性遞送的效率。然后我們將再次用腫瘤內(nèi)和靜脈內(nèi)兩種給藥途徑，來評估靶向的PG-PG納米構(gòu)建物對黑素瘤和全身性免疫系統(tǒng)的免疫刺激活性。在沒有非特異性激活免疫應(yīng)答的情況下，全身性抗腫瘤活性的成功論證，可使黑素瘤以及其它轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤的免疫治療領(lǐng)域發(fā)生變革。研究設(shè)計(jì)
靶向MClR的CpG的合成和表征
我們已成功地證明用 a -MSH 類似物 NDP-MSH (Cys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-1/-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2)作為尋祀配體將中空納米金球祀向遞送至B16黑素瘤中的MC1R，其中通過聚乙二醇(PEG)接頭讓NDP-MSH與納米金球表面連接。此處我們將使用類似的策略，通過PEG接頭讓NDP-MSH與L-PG鏈連接以增加MClR對NDP-MSH肽的可及性，其如圖13所示。簡言之，通過用三氟乙酰胺-PEG-胺作為引發(fā)劑的L-Glu(0Bzl)-NCA的開環(huán)聚合化作用，來制備嵌段共聚物PEG-PBLG (聚合物I)。隨后在NaOH水溶液中脫保護(hù)并用N-琥珀酰亞胺基-3-馬來酰亞胺基丙酸酯活化末端胺，可得聚合物3。然后用6.1. 3. a章節(jié)中所述的相同程序?qū)H2-DTPA或NH2-染料與NH2-CpG與聚合物3綴合，接著引入SH-NDP-MSH，得到所提出的聚合物(圖13)。如6.1. 3. a章節(jié)中所述來表征所得聚合物5?？墒褂妙愃频姆椒ǎ砸陨项A(yù)示性實(shí)施例1中所鑒定的PG2-CpG合成靶向MClR的納米構(gòu)建物。細(xì)胞攝取和運(yùn)輸
按照我們報(bào)道的方法來研究聚合物5和相應(yīng)的Gd (111In)或染料-標(biāo)記的NDP-MSH-PEG-PG2-CpG在B16/F10細(xì)胞中的細(xì)胞攝取。Lu ff, Xiong C，Zhang TargetedPho to thermal Abla tion of Murine Melanomas wi th MelanocyteSt imula ting HormoneAnalog-Conjugated Hollow Gold Nanospheres (綴合促黑素細(xì)胞激素類似物的中空納米金球?qū)κ蠛谒亓龅陌邢蚬鉄崆谐?，Clin Cancer Res 15:876-86, 2009。簡言之，讓細(xì)胞與每種AleXFluor647-標(biāo)記的受試化合物在37°C下孵育I小時(shí)，接著用4%的低聚甲醛固定。對于抑制研究，在加入每種化合物之前，讓細(xì)胞與游離NDP-MSH (200 Pg/mL)孵育30分鐘。洗滌和固定后，用DAPI對細(xì)胞核染色。為評估β_抑制蛋白的激活和募集，可用AleXFluor647-標(biāo)記的5或6處理細(xì)胞15分鐘，然后用山羊抗-β -抑制蛋白_2多克隆抗體和驢抗-山羊IgG異硫氰酸四甲基羅丹明綴合物對β -抑制蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用Zeiss Axio Observer. Zl熒光顯微鏡檢測細(xì)胞的熒光。用不含尋靶配體的AlexFluor647-標(biāo)記的 L-PG-CpG 或 PG2_CpG 作為對照。酪氨酸酶可激活的結(jié)合CpG的納米構(gòu)建物的合成和表征
酪氨酸是酪氨酸酶的天然底物，且發(fā)生氧化后得到相應(yīng)的L-DOPA和鄰醌(圖14A)。先前的研究已表明可將酪氨酸酶用于介導(dǎo)細(xì)胞毒性劑經(jīng)由藥物環(huán)化釋放機(jī)理從氨基甲酸酯和尿素前藥中的釋放。設(shè)想可通過尿素接頭讓Tyr-CpG中間體6與馬來酰亞胺封端的PEG-PG共聚物3連接，來形成靶向MClR的聚合的CpG前藥7，接著通過邁克爾加成反應(yīng)引Λ SH-DNP-MSH (圖14Β)。在酪氨酸酶-介導(dǎo)的氧化7后，發(fā)生迅速的分子內(nèi)環(huán)化以引發(fā)游離CpG的切除和釋放(圖14Β)?；衔?可經(jīng)由NH2-CpG與異氰酸酯8反應(yīng)合成，其可通過用三光氣處理Tyr (Bn)-NH-(CH2)2-NH-tBoc來合成。然后去除9中的保護(hù)基團(tuán)來獲得6 (圖14C)。我們亦基于不可降解的D-PG聚合物來合成7，以降低非特異性的CpG釋放。另夕卜，亦合成通過來自PEG-D-PG的Tyr連接的相應(yīng)非靶向CpG綴合物作為對照。我們將用LC-MS來評估酪氨酸酶-介導(dǎo)的CpG釋放的生存力。將聚合物7和非靶向綴合物溶解在PBS中，用酪氨酸酶進(jìn)行處理，通過液相色譜-質(zhì)譜來分析溶液以證明藥物釋放。為確保藥物釋放真正依賴于酪氨酸酶，將檢測每種納米構(gòu)建物在PBS和牛血清中的穩(wěn)定性。靶向的CpG和酪氨酸酶可激活的CpG納米構(gòu)建物的體外和體內(nèi)免疫刺激活性的評估
接下來，我們將評估酪氨酸酶-激活的納米構(gòu)建物的免疫刺激活性。用每種聚合物處理B16細(xì)胞。二十四小時(shí)后，收集培養(yǎng)物上清液，用于用分離的pDC來測定pDC激活。體外細(xì)胞的攝取和運(yùn)輸
按照我們發(fā)表的實(shí)驗(yàn)方案從C57BL/6小鼠的骨髓產(chǎn)生巨噬細(xì)胞。為研究聚合物-CpG的內(nèi)化作用，用熒光標(biāo)記的聚合物脈沖巨噬細(xì)胞I小時(shí)，固定，用針對EEA (早期內(nèi)體標(biāo)記)、甘露糖-6磷酸受體(晚期內(nèi)體受體)和LAMPl (溶酶體標(biāo)記)的單克隆抗體來染色。所有的抗體都來自Abeam (Cambridge, MA)。通過共焦顯微術(shù)來研究聚合物的共區(qū)域化和不同內(nèi)吞溶酶體標(biāo)記。體內(nèi)細(xì)胞的攝取
為評價(jià)結(jié)合CpG的PG納米構(gòu)建物在不同免疫細(xì)胞群中的攝取，可用AlexaFluor647 標(biāo)記三種靶向的納米-CpG (NDP-MSH-PEG-L-PG-CpG、PEG-D-PG-Tyr-CpG 和DNP-MSH-PEG-D-PG-Tyr-CpG)中的每一種,經(jīng)腫瘤內(nèi)或靜脈內(nèi)注射至B16腫瘤中(η = 10)。用鹽水、CpG、非靶向的L-PG-CpG和非靶向的D-PG-CpG作為對照。在1、3和7天之后，通過流式細(xì)胞術(shù)測量腫瘤、引流淋巴結(jié)和脾中⑶IIc+ DC和⑶llb+F480+巨噬細(xì)胞對CpG的攝取。另外，可將在單核細(xì)胞譜系細(xì)胞中表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠(在鼠c-fms啟動(dòng)子的控制下)用作腫瘤移植受者，這允許我們在活體動(dòng)物中用非侵襲性成像活體成像來研究聚合物和單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的共區(qū)域化?？扇缟纤鰧?shí)施局部細(xì)胞因子產(chǎn)生、遞送至B16黑素瘤中的APC、激活pDC、腫瘤中黑素瘤-特異性的⑶8+ T-細(xì)胞應(yīng)答和全身性應(yīng)答。腫瘤內(nèi)和靜脈內(nèi)注射后的抗腫瘤活性
在預(yù)示性實(shí)施例1的抗腫瘤活性確認(rèn)中所述的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在此適用于研究靶向的PG-CpG綴合物的抗腫瘤活性。簡言之，在C57BL/6小鼠雙腿上皮下接種穩(wěn)定敲除了酪氨酸酶基因的B16F10細(xì)胞或B16F10黑素瘤細(xì)胞(平均直徑4-6 mm)。將小鼠分配到8個(gè)組中(10只小鼠/組)，用如下方式進(jìn)行腫瘤內(nèi)處理第I組，靶向MClR的NDP-MSH-PEG-L-PG-CpG ；第2組，靶向MClR的酪氨酸酶可激活的DNP-MSH-PEG-D-PG-Tyr-CpG ;第3組，在處理酪氨酸酶-敲除的腫瘤中靶向MCIR的酪氨酸酶可激活的DNP-MSH-PEG-D-PG-Tyr-CpG ；第4組，未處理；第5組，非靶向的PEG-L-PG-CpG ;第6組，酪氨酸酶可激活的但非靶向的PEG-D-PG-Tyr-CpG ;第7組，在處理酪氨酸酶-敲除的腫瘤中酪氨酸酶可激活的但非靶向的PEG-D-PG-Tyr-CpG ;第8組，不可降解的非靶向的納米構(gòu)建物PEG-D-PG-CpG。第4-8組作為對照。除第3組和第7組外的所有組將使用B16F10細(xì)胞。對于第3組和第7組，使用通過RNA干擾而穩(wěn)定敲除了酪氨酸酶基因的B16F10細(xì)胞。通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染市購自Invitrogen (Carlsberg, CA)的質(zhì)粒來實(shí)施酪氨酸酶基因的穩(wěn)定敲除。在1、7和10天時(shí)每組中的小鼠將接受每種藥劑的瘤內(nèi)注射，劑量為50 μ g當(dāng)量CpG/注射(100 μ I)。第21天時(shí)測量腫瘤大小，將動(dòng)物處死，移出引流淋巴結(jié)、脾和經(jīng)處理及未處理的腫瘤二者用于PDC群和細(xì)胞死亡(TUNEL)的IHC和FACS分析。第21天時(shí)記錄單個(gè)腫瘤的重量并用作腫瘤控制的量度。在分開的研究中，將荷瘤小鼠分成8組，每組由10只小鼠組成。用與上述相同的藥劑靜脈內(nèi)注射每組中的小鼠，并如上所述測定抗腫瘤活性?？扇鐚?shí)施例1的數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)中所述來實(shí)施統(tǒng)計(jì)分析。預(yù)期結(jié)果、缺陷和解決方法
我們期望靶向MCRl的納米構(gòu)建物和酪氨酸酶可激活的納米構(gòu)建物二者都高度選擇性地激活腫瘤-特異性的免疫應(yīng)答。但是，因?yàn)槔野彼崦笇τ诤谒亓龅莫?dú)特性，預(yù)期酪氨酸酶可激活的納米構(gòu)建物比靶向的納米構(gòu)建物可誘導(dǎo)更加特異的應(yīng)答。在酪氨酸酶-介導(dǎo)的自納米構(gòu)建物的CpG釋放不成功的不太可能的事件中，我們用L-DOPA替代酪氨酸作為酪氨酸酶的底物?；蛘?，可使用氨基甲酸酯來替代尿素接頭。期望這些方法可有效介導(dǎo)CpG的釋放。本預(yù)示性實(shí)施例的主要缺陷是即使在我們加倍努力之后，靶向MClR的和酪氨酸酶-介導(dǎo)的CpG釋放仍不能夠避免全身刺激免疫細(xì)胞。失去激活黑素瘤-特異性的免疫應(yīng)答這一“焦點(diǎn)”將不利地影響CpG治療的有效性。如果發(fā)生這種情況，我們將尋求兩種備選方法。第一，我們嘗試將L-PG-CpG靶向其它的黑素瘤-特異性的生物標(biāo)記。我們將使用黑素瘤細(xì)胞特異性的單克隆抗體例如抗-GD2抗體和抗-GM3抗體作為尋祀配體。這些抗體對細(xì)胞表面受體具有高親和力(Kd=IO ηΜ),并且可改進(jìn)納米-CpG與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。第二，我們將使用長環(huán)狀核-交聯(lián)聚合的微團(tuán)作為CpG的載體。我們先前已證明這些納米材料可有效逃避單核吞噬系統(tǒng)的細(xì)胞。通過防止單核吞噬系統(tǒng)對納米-CpG的攝取，我們期望降低全身性攝取和腫瘤外納米-CpG的釋放。預(yù)示性實(shí)施例1II
單獨(dú)使用L-PG-Cpg納米構(gòu)建物及與T調(diào)控細(xì)胞消耗聯(lián)合使用對抗腫瘤免疫的作用 瘤內(nèi)注射納米-CpG (來自實(shí)施例1的最好的)或靜脈內(nèi)注射靶向的納米-CpG (來自實(shí)施例1I的最好的)與靶向協(xié)同刺激途徑的治療聯(lián)合，將通過激活多種先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞來導(dǎo)致強(qiáng)烈的抗腫瘤活性。另外，這些治療計(jì)劃可進(jìn)一步包括使用諸如IL-2和IFN-α等細(xì)胞因子，其在臨床領(lǐng)域顯示出一些前景，但仍有改進(jìn)的空間。基本原理和總體策略
普遍認(rèn)為，癌癥的有效免疫治療依賴于對免疫刺激的多個(gè)檢查點(diǎn)起作用。聯(lián)合使用通過不同機(jī)制協(xié)同作用的免疫治療劑已成為研究中的關(guān)鍵領(lǐng)域。免疫的完全激活需要刺激正協(xié)同刺激信號和抑制負(fù)免疫調(diào)控信號。成功的免疫治療將涉及合理聯(lián)合藥劑以激活在發(fā)展強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答中所涉及的關(guān)鍵步驟。因此，在B16黑素瘤鼠模型中確定了最有效的抗腫瘤納米-CpG之后，我們將讓這些TLR激動(dòng)劑與全身性免疫調(diào)節(jié)聯(lián)合，所述全身性免疫調(diào)節(jié)使用正免疫刺激劑或負(fù)協(xié)同刺激分子，所述正免疫刺激劑例如針對0X40、CD40和4-1BB的激動(dòng)劑抗體，所述負(fù)協(xié)同刺激分 子例如針對B7家族的分子B7S1和B7H3的抗體和抗-CTLA-4抗體?？紤]到這些細(xì)胞因子在先前臨床上的中等成功，故一旦鑒定出最佳的聯(lián)合，便可將其用于與IL-2和IFN- α建立細(xì)胞因子療法。聯(lián)合針對TAA的疫苗，評價(jià)了這些針對協(xié)同刺激分子的激動(dòng)劑抗體中的每一種。將這些抗體與替代疫苗的TLR激動(dòng)劑聯(lián)合，具有接種患者來抵抗多種腫瘤特異性抗原的潛力，適合針對單個(gè)患者的腫瘤。最后，將IL-2和IFN-α給予黑素瘤患者而觀察到的中等臨床成功仍留有改進(jìn)的空間，所述改進(jìn)可能通過加入TLR-激動(dòng)劑抗體組合來實(shí)現(xiàn)。研究計(jì)劃
評估有效納米-CpG與針對協(xié)同刺激分子的激動(dòng)劑抗體或B7負(fù)協(xié)同刺激分子的治療將B16黑素瘤植入到小鼠中。一周后，在建立起實(shí)體瘤之后，用兩種TLR激動(dòng)劑(來自以上實(shí)施例1和2中的最佳候選物)中任一種加上針對0X40、⑶40或4-1BB的激動(dòng)劑抗體，或針對B7負(fù)協(xié)同刺激分子的拮抗劑抗體(抗-B7S1和抗-B7H3抗體)和抗-CTLA-4開始治療，所有抗體均為腹膜內(nèi)給予。TLR激動(dòng)劑的給藥途徑將視經(jīng)確定為最有效的激動(dòng)劑而定?？稍谧⑸浼{米-CpG 5天之后，以預(yù)定劑量給予抗體。我們的初步數(shù)據(jù)表明腫瘤-特異性的CD8 T細(xì)胞應(yīng)答在瘤內(nèi)注射L-PG-CpG后5天達(dá)到頂峰(圖5)。終點(diǎn)是腫瘤大小減小和小鼠存活。亦研究最佳協(xié)同作用組合的機(jī)理，特別是關(guān)于腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞變化、抗原-特異性的T細(xì)胞的發(fā)育和CTL活性，基于這些發(fā)現(xiàn)將研究進(jìn)一步改良。我們期望TLR激動(dòng)劑與抗體-介導(dǎo)的刺激途徑的參與的聯(lián)合將進(jìn)一步提聞抗腫瘤應(yīng)答。評估有效納米-CpG和針對協(xié)同刺激途徑的激動(dòng)劑抗體或B7負(fù)協(xié)同刺激分子與細(xì)胞因子聯(lián)合的方案
將B16黑素瘤植入到小鼠中，I周后開始治療。已鑒定出TLR激動(dòng)劑加上刺激性抗體或B7負(fù)協(xié)同刺激分子的最佳聯(lián)合，將IL-2和IFN-α加入到這一方案中。IL_2或IFN-α將與抗體一起腹膜內(nèi)給予。監(jiān)測聯(lián)合療法的治療應(yīng)答 治療方案
對于自預(yù)示性實(shí)施例1鑒定的最佳納米_CpG，研究以下組
與針對負(fù)協(xié)同刺激途徑的拮抗劑抗體的聯(lián)合 第I組，納米-CpG ;第2組，納米-CpG+抗-CTLA-4 ;第 3 組，抗-B7S1+ 納米-CpG ’第 4 組，抗-B7H3 + 納米-CpG0與針對正刺激途徑的激動(dòng)劑抗體的聯(lián)合第5組，納米-CpG +抗-0X40 ;第6組，納米-CpG + 抗-CD40 ;第 7 組，納米-CpG + 抗-4-1-1BBL。與細(xì)胞因子的聯(lián)合第8組，納米-CpG + IL-2 + —種協(xié)同刺激途徑試劑；第9組，納米-CpG +IFN- α +—種協(xié)同刺激途徑試劑。對于在以上預(yù)示性實(shí)施例1I中鑒定的最佳納米_CpG，制定相同的治療方案。數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)可如實(shí)施例1的數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)中所述來實(shí)施統(tǒng)計(jì)分析。如上所述來實(shí)施局部細(xì)胞因子的產(chǎn)生、至B16黑素瘤中APC的遞送、pDC的激活、腫瘤中黑素 瘤-特異性的CD8+ T-細(xì)胞應(yīng)答和全身性應(yīng)答。預(yù)期結(jié)果、缺陷和解決方法
我們期望通過聯(lián)合使用協(xié)同刺激試劑和細(xì)胞因子觀察到抗腫瘤應(yīng)答增強(qiáng)。我們尤其期望看到由于協(xié)同刺激試劑導(dǎo)致的CD8 T細(xì)胞的腫瘤殺傷活性增強(qiáng)，對遠(yuǎn)端腫瘤治療的效果大巾畐提聞。如對于IFN- α和IL_2所觀察到的免疫調(diào)節(jié)劑的毒性可妨礙其與納米-CpG的聯(lián)合使用。因?yàn)榧{米-CpG經(jīng)設(shè)計(jì)以避免全身性激活免疫系統(tǒng)，所以納米-CpG不太可能增加協(xié)同刺激試劑和細(xì)胞因子的已知毒性。作為備選方法，我們有兩個(gè)計(jì)劃1)我們將降低在初步研究中我們所使用的單一試劑的劑量，檢測納米-CpG是否可降低此特定試劑所需的有效劑量；和/或2)我們將嘗試低劑量的多種協(xié)同刺激試劑來檢測這些試劑之間的協(xié)同作用是否可降低每一種單獨(dú)試劑的所需劑量。預(yù)示性實(shí)施例1V 體內(nèi)分析
這些實(shí)驗(yàn)中將使用C57BL/6純系株雌性小鼠(約600只/年)和GFP-轉(zhuǎn)基因小鼠。對小鼠實(shí)施的主要程序包括以下
因?yàn)轶w內(nèi)腫瘤消除和體內(nèi)免疫應(yīng)答是了解待開發(fā)的納米載體-CpG候選物的抗癌功效的關(guān)鍵，所以僅可在動(dòng)物內(nèi)測試所提出的研究。對于所產(chǎn)生數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，我們將重復(fù)測定至少一次，每一測試每組使用10只小鼠。動(dòng)物將于M. D. Anderson供養(yǎng)在用于小動(dòng)物的無病原容納設(shè)施中，其以12小時(shí)為周期變換光照和黑暗，按照美國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理認(rèn)定協(xié)會(huì)(AAALAC)批準(zhǔn)的條件來控制溫度和濕度。所有程序都將由受過訓(xùn)練的工作人員來執(zhí)行，并經(jīng)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理及使用委員會(huì)批準(zhǔn)。將使用等同于10mg/mL氯胺酮和lmg/mL賽拉嗪(xylazine)的氯胺酮/賽拉嗪混合物經(jīng)腹腔內(nèi)注射(1. P)遞送來麻醉小鼠。使用的麻醉劑是標(biāo)準(zhǔn)的、安全的，并經(jīng)批準(zhǔn)可用于小鼠。麻醉下的免疫期間，將觀察小鼠的任何問題，在整個(gè)期間將保持小鼠溫暖。通過在小鼠的左和/或右側(cè)注射3xl05個(gè)B16黑素瘤細(xì)胞來進(jìn)行腫瘤接種。在腫瘤接種7天后瘤內(nèi)注射納米-CpG和對照。通過腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系所接種動(dòng)物的操作在動(dòng)物設(shè)施中的BSL-2條件下進(jìn)行，且BSL-2規(guī)范用于實(shí)施實(shí)驗(yàn)的個(gè)人。每周測量2-3次小鼠腫瘤的生長。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到直徑為1. 2 cm時(shí)(約接種3xl05個(gè)B16細(xì)胞后21天)，將小鼠處死。研究這21天期間納米-CpG的抗癌作用。每天檢查動(dòng)物以確保健康，在研究過程中任何瀕死的動(dòng)物將實(shí)施安樂死?；趧?dòng)物身體外觀、活性水平、食欲和呼吸速率來測定發(fā)病率。在麻醉的動(dòng)物中抽取血樣樣品。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物，收獲各種組織(脾、淋巴結(jié)和腫瘤)進(jìn)行T細(xì)胞測定，收獲血清進(jìn)行細(xì)胞因子測定。在所有這些程序中預(yù)期無毒性事件，因?yàn)榧{米-CpG和CpG不是毒性的，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)B16黑素瘤細(xì)胞的重組病毒是復(fù)制缺陷型的。使用的所有劑量都低于公開的研究中已知有毒的劑量。處死任何表現(xiàn)出嗜睡、皮毛起皺或痛苦的動(dòng)物以避免更長的痛苦。如果在腫瘤中觀察到潰瘍，則應(yīng)迅速處死該小鼠。安樂死將涉及CO2暴露。一旦動(dòng)物熟睡并對外界刺激無反應(yīng)，將通過頸部脫臼法將其處死。這一過程與AVMA安樂死專家組的推薦一致。收獲組織之后，在生物-危險(xiǎn)性的動(dòng)物廢物中處理動(dòng)物軀體。以下表格包括以上提出的不同實(shí)驗(yàn)(預(yù)示性實(shí)施例1、11和III)中所使用的各組小鼠和時(shí)間線。 對于預(yù)示性實(shí)施例1
共計(jì):620只C57BL/6小鼠，120只轉(zhuǎn)基因小鼠 表2
......S...................麗.....................................................「麗................1......萬 麗
......1....................1..... .麗-...........................1..........].....JJlf1........................................1
2-12 11 S-CpG I 科I 扣I。
13 I Vink Cpo fWErTl 1-2 ψ ；預(yù)示性實(shí)施例1的抗腫瘤活性確認(rèn)
腫瘤駐留10只小鼠/組X 13組=130只小鼠
預(yù)示性實(shí)施例1，瘤內(nèi)注射后通過CpG和基于PG的納米構(gòu)建物誘導(dǎo)的先天性和獲得性免疫的評估。pDC的體內(nèi)攝取。10只小鼠/組X 12組(除鹽水之外)x 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)=360只小鼠
GFP轉(zhuǎn)基因小鼠。10只小鼠/組X 12組=120只轉(zhuǎn)基因小鼠 表3
對于預(yù)示性實(shí)施例1I，共計(jì)300只C57BL/6小鼠，140只轉(zhuǎn)基因小鼠
權(quán)利要求
1.一種用于治療黑素瘤的納米構(gòu)建物，所述納米構(gòu)建物包含多聚(L-谷氨酸)-CpG綴合物，其中所述納米構(gòu)建物在體內(nèi)提供將CpG靶向遞送至黑素瘤，增強(qiáng)黑素瘤抗腫瘤活性，同時(shí)降低或消除PDC的全身性激活。
2.一種用于將免疫調(diào)節(jié)劑給予腫瘤位點(diǎn)的遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)包含納米構(gòu)建物，其中納米聚合物與免疫調(diào)節(jié)劑綴合，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑為CpG或CpG與其它腫瘤結(jié)合配體及抗體的組合。
3.權(quán)利要求2的遞送系統(tǒng)，其中所述納米聚合物為多聚(L-谷氨酸)，并且所述其它腫瘤配體為針對黑皮質(zhì)素I型受體(MClR)、適配體或抗體的MSH衍生的配體。
4.一種治療需要治療的受試者的黑素瘤的方法，所述方法包括將治療量的納米構(gòu)建物給予所述受試者，所述納米構(gòu)建物具有與親巨噬細(xì)胞的聚合物綴合的CpG。
5.一種治療需要治療的受試者的黑素瘤的方法，所述方法包括將治療量的綴合納米聚合物的免疫藥物給予所述受試者。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述綴合納米聚合物的免疫藥物為多聚(L-谷氨酸)-CpG綴合物(〃L-PG-Cp-G〃)。
7.權(quán)利要求5的方法，其中將正協(xié)同刺激信號激動(dòng)劑和負(fù)免疫調(diào)控信號抑制劑共同給予所述受試者。
全文摘要
闡述了具有以下三種組分的納米構(gòu)建物及使用所述納米構(gòu)建物的方法(1)生物可降解的納米聚合物和納米顆粒；(2)免疫藥物，例如CpG；和(3)腫瘤結(jié)合裝置，其通過受體-介導(dǎo)的攝取主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞，例如黑素瘤細(xì)胞。通過將PG-CpG納米構(gòu)建物與正協(xié)同刺激信號激動(dòng)劑和負(fù)免疫調(diào)控信號抑制劑聯(lián)合，進(jìn)一步增強(qiáng)了抗腫瘤免疫。
文檔編號A61K39/395GK103002919SQ201180017094
公開日2013年3月27日 申請日期2011年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月4日
發(fā)明者周大鵬, 李春, P.吳 申請人:得克薩斯系統(tǒng)大學(xué)評議會(huì)