專利名稱：用于納米顆粒介導(dǎo)的癌細(xì)胞靶向遞送的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)納米顆粒將活性劑選擇性遞送至癌細(xì)胞的組合物和方法。
背景技術(shù)：
抗癌癥治療的效力取決于降低或消除癌細(xì)胞而不破壞健康組織的能力。因此，優(yōu)先靶向癌細(xì)胞的策略對(duì)于癌癥治療的成功是基本的?，F(xiàn)已研究了基于納米顆粒的系統(tǒng)以增強(qiáng)治療劑向癌細(xì)胞的遞送。雖然新的進(jìn)展改進(jìn)了藥物遞送效率，但對(duì)于獲得癌細(xì)胞特異性遞送 仍是很大的挑戰(zhàn)。有一種癌細(xì)胞現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)，該現(xiàn)象確定癌細(xì)胞的一種被充分表征的趨勢(shì)，即，癌細(xì)胞極其需要將葡萄糖輸送入細(xì)胞以為惡性腫瘤特征性的逃避代謝活性(run-away metabolic activity)提供燃料。Warburg效應(yīng)最熟悉的用途在于正電子發(fā)射斷層照相術(shù)(PET)，借此，放射性核素連接于葡萄糖分子并給予患者。惡性細(xì)胞攝入大量葡萄糖-放射性核素中間體，后者被內(nèi)在化進(jìn)入細(xì)胞，或者至少附著于腫瘤細(xì)胞。放射性核素發(fā)出的輻射導(dǎo)致腫瘤位置處光子的釋放，這進(jìn)而由PET(光子)檢測(cè)儀器檢測(cè)到。因此，PET掃描是檢測(cè)癌癥的非常精確和特異性的方法。本發(fā)明利用Warburg效應(yīng)以經(jīng)由納米顆粒將活性劑直接地和選擇性地祀向癌細(xì)胞、遞送治療劑(例如，藥物、核酸、蛋白質(zhì)/多肽)和/或放置可檢測(cè)標(biāo)記物以供診斷，從而克服了本領(lǐng)域的已有缺陷。在其它方面，腫瘤抑制劑p53是一種轉(zhuǎn)錄因子，它作為四聚體主要結(jié)合宿主基因啟動(dòng)子內(nèi)的P53反應(yīng)元件，其產(chǎn)物參與控制對(duì)維持基因組穩(wěn)定性和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的生長(zhǎng)停滯、凋亡、衰老、分化和DNA修復(fù)等細(xì)胞事件[1、2]。p53被各種應(yīng)激信號(hào)激活，包括原癌基因激活和DNA破壞，現(xiàn)已證明翻譯后修飾是p53激活的主要機(jī)制，其導(dǎo)致p53蛋白豐度和轉(zhuǎn)錄活性增加[I、2]。由于其生長(zhǎng)抑制活性，在正常生理?xiàng)l件下，野生型p53的水平通常保持較低，這主要通過(guò)調(diào)控P53蛋白穩(wěn)定性來(lái)介導(dǎo)。雖然有報(bào)道說(shuō)涉及許多調(diào)節(jié)劑，但MDM2對(duì)于控制p53更新起主要作用。MDM2是靶向p53以進(jìn)行遍在蛋白化和隨后降解的E3遍在蛋白連接酶，但同時(shí)也是P53的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，從而產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)環(huán)路。各種應(yīng)激信號(hào)均影響該調(diào)控環(huán)路，從而影響P53活性[1、2]。與野生型p53相反，突變型p53蛋白通常在癌細(xì)胞中以高水平累積，這歸因于突變體P53不能誘導(dǎo)MDM2表達(dá)。實(shí)際上，利用突變型p53敲入小鼠的遺傳學(xué)研究證明突變型P53蛋白水平主要由MDM2調(diào)節(jié)[3]。p53通過(guò)直接影響基因座的突變或通過(guò)偏離其正常調(diào)控而經(jīng)由在癌細(xì)胞中的普遍滅活來(lái)支持其作為腫瘤抑制劑的關(guān)鍵作用[1，2]。幾乎在所有類型的人癌癥中鑒定到各種頻率的突變，從約10% (例如，造血惡性腫瘤[4])到50-70% (例如，卵巢癌[5]、結(jié)腸直腸癌[6]和頭脖癌[7])。大量證據(jù)表明，雖然野生型p53使得癌細(xì)胞對(duì)化療和放療敏感，但癌細(xì)胞中的突變型P53導(dǎo)致治療耐受性和預(yù)后不良。突變型p53的表達(dá)和癌癥治療耐受性之間的相關(guān)性已經(jīng)廣泛報(bào)道。例如，已在卵巢癌患者中觀察到對(duì)順鉬的耐受性。有突變型p53存在下，結(jié)腸直腸癌也被證明化學(xué)敏感性較低[9]。類似地，p53滅活使得血液惡性腫瘤耐受抗腫瘤藥物[10]。突變是獨(dú)特的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)改變是導(dǎo)致合成全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的錯(cuò)義突變[11]。雖然，大多數(shù)突變?cè)诤薉NA-結(jié)合域(DBD)內(nèi)發(fā)現(xiàn)，從而導(dǎo)致序列特異性DNA結(jié)合活性喪失，但仍有高度的結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)和生物學(xué)不統(tǒng)一性。按照對(duì)P53蛋白的熱力學(xué)穩(wěn)定性的影響，大多數(shù)PM突變可分成兩個(gè)主要的類[12]，通常稱為“DNA-接觸”突變和“構(gòu)象”突 變。DNA-接觸類包括直接參與DNA結(jié)合的殘基的突變，例如R248Q和R273H。構(gòu)象單克隆抗體探測(cè)到該類具有野生型構(gòu)象，且不結(jié)合分子伴侶hsp70 [13，14]。構(gòu)象類包含導(dǎo)致局部(例如，R249S和G245S)或整體(例如，R175H和R282W)構(gòu)象變形的突變，所述變形導(dǎo)致蛋白質(zhì)集中結(jié)合到hsp70。與DNA接觸突變相比，構(gòu)象突變涉及更嚴(yán)重的體外表型[13]。P53突變的不統(tǒng)一性還體現(xiàn)在所得殘基的性質(zhì)上。突變型R273H具有野生型構(gòu)象，而突變型R273P是變性的[13]。除喪失腫瘤抑制功能外，與野生型P53相比，突變型p53通過(guò)突變型和野生型p53之間的異源-寡聚獲得負(fù)顯性活性(dominant-negative activity),這是p53滅活的非常有效的機(jī)制，因?yàn)樗木垠w中只有I分子的突變型P53能顯著損害DNA結(jié)合[1，2]。此外，研究顯示突變型P53可獲得獨(dú)立于野生型p53的新致癌活性[15，17]。雖然p53的功能獲得特性的統(tǒng)一機(jī)理尚未闡明，但人們提出了許多模型。突變型P53已顯示通過(guò)它們的DNA結(jié)合域與P63和p73相互作用。該相互作用導(dǎo)致p73和p63功能的滅活[18-21]。表達(dá)普通P53突變體(R248W和R273H)的敲入小鼠的遺傳學(xué)研究顯示，這些突變體通過(guò)ATM (對(duì)于DNA損傷反應(yīng)至關(guān)重要的蛋白激酶)的滅活獲得致癌特性[22]。整體上，可獲得的信息表明突變型P53通過(guò)功能喪失、負(fù)顯性活性和功能獲得活性的組合導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和治療耐受性。人們已做出許多努力來(lái)開(kāi)發(fā)能再激活突變型P53的小分子。然而，由癌細(xì)胞中超過(guò)2000種不同類型的突變型p53蛋白反映出突變型p53的結(jié)構(gòu)不統(tǒng)一性[23]，給開(kāi)發(fā)通用的P53-再激活劑提出嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。一種替代的方法是通過(guò)基因治療將野生型p53重新導(dǎo)回腫瘤細(xì)胞?；趶?fù)制缺陷型病毒的載體已在頭脖癌中顯示一些治療作用；然而，腫瘤細(xì)胞中高水平的突變型P53蛋白是恢復(fù)功能p53的主要障礙。本發(fā)明通過(guò)提供P53衍生物來(lái)克服本領(lǐng)域的已有缺陷，所述P53衍生物不結(jié)合到突變型p53，因此能在高水平p53突變體存在下有效恢復(fù)P53功能。發(fā)明概述
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供選自下組的納米顆粒
A)包含以下成分的納米顆粒
a)聚陽(yáng)離子/聚亞烷基二醇/葡萄糖偶聯(lián)物；和
b)活性劑；
B)包含以下成分的納米顆粒
a)包含活性劑的核心；和
b)圍繞(a)的核心的葡萄糖/聚亞烷基二醇偶聯(lián)物；C)包含以下成分的納米顆粒
a)包含聚陽(yáng)離子和活性劑的核心；和
b)圍繞(a)的核心的葡萄糖/聚亞烷基二醇偶聯(lián)物；
D)包含以下成分的納米顆粒
a)聚陽(yáng)離子/藻酸鹽/葡萄糖偶聯(lián)物；和
b)活性劑；
E)包含以下成分的納米顆粒
a)包含活性劑的核心；和 b)圍繞(a)的核心的葡萄糖/藻酸鹽偶聯(lián)物；
F)包含以下成分的納米顆粒
a)包含聚陽(yáng)離子和活性劑的核心；和
b)圍繞(a)的核心的葡萄糖/藻酸鹽偶聯(lián)物；和
G)以上(A)-(F)的納米顆粒的任何組合。在本發(fā)明的納米顆粒中，所述活性劑可以是多核苷酸、寡核苷酸、干擾RNA、蛋白質(zhì)、多肽、化療藥物、細(xì)胞毒劑、放射性核素、可檢測(cè)標(biāo)記物、顯像劑、和它們的任何組合。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，提供納米顆粒，所述納米顆粒包含a)包含聚乙烯亞胺(PEI)和編碼p53的多核苷酸的核心；和幻圍繞(a)的核心的葡萄糖/聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供納米顆粒，所述納米顆粒包含a)包含聚乙烯亞胺(PEI)和多核苷酸的核心，所述多核苷酸編碼包含P730D的p53嵌合體(例如，p53/P730D);和幻圍繞(a)的核心的葡萄糖/聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)物。此外，本文提供在藥學(xué)上可接受的載體中包含P53嵌合體的組合物，所述嵌合體包含p730D。而且，本發(fā)明提供將納米顆粒遞送至細(xì)胞的方法，包括在一定條件下使細(xì)胞與本發(fā)明的納米顆粒接觸，借此，納米顆粒結(jié)合到細(xì)胞表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucosetransporter)并由細(xì)胞內(nèi)在化，所述細(xì)胞可以是在體內(nèi)或在體外。此外，本文提供將活性劑遞送至對(duì)象(例如，有需要的對(duì)象)中腫瘤細(xì)胞的方法，包括將本發(fā)明的納米顆粒遞送至所述對(duì)象，借此，所述納米顆粒結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并由腫瘤細(xì)胞內(nèi)在化，從而將活性劑遞送至腫瘤細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供減小對(duì)象(例如，有需要的對(duì)象)中腫瘤大小的方法，包括將有效量的本發(fā)明的納米顆粒遞送至對(duì)象，借此，納米顆粒結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并由細(xì)胞內(nèi)在化，從而減小對(duì)象中腫瘤的大小。本發(fā)明還提供治療對(duì)象(例如，有需要的對(duì)象)中癌癥的方法，包括將有效量的本發(fā)明的納米顆粒遞送至對(duì)象，從而治療所述對(duì)象中的癌癥。而且，本發(fā)明提供將包含p730D的p53嵌合體遞送至細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)的方法，包括在一定條件下使細(xì)胞與本發(fā)明的P53嵌合體接觸，借此，p53嵌合體由細(xì)胞內(nèi)在化，所述細(xì)胞可以是在體內(nèi)或在體外。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供減小對(duì)象(例如，有需要的對(duì)象)中腫瘤大小的方法，包括將有效量的本發(fā)明的P53嵌合體遞送至對(duì)象，借此，嵌合體由腫瘤的細(xì)胞內(nèi)在化，從而減小所述對(duì)象中腫瘤的大小。
本發(fā)明還提供治療對(duì)象(例如，有需要的對(duì)象)中癌癥的方法，包括將有效量的本發(fā)明的P53嵌合體遞送至所述對(duì)象，從而治療所述對(duì)象中的癌癥。本發(fā)明的其它實(shí)施方式包括在有需要的對(duì)象中誘導(dǎo)腫瘤消退的方法，包括將有效量的本發(fā)明的P53嵌合體遞送至對(duì)象，從而誘導(dǎo)對(duì)象中的腫瘤消退。本文所述的方法還可包括以下步驟給予對(duì)象蛋白激酶抑制劑、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑、甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和它們的任何組合。上述方法還可包括以下步驟給予對(duì)象化療劑、抗-血管生成劑、放療、外科治療或它們的任何組合。該其它步驟可在將納米顆粒和/或P53嵌合體遞送至所述對(duì)象的之前、之后和/或同時(shí)進(jìn)行。本發(fā)明的其它方面包括在藥學(xué)上可接受的載體中包含本發(fā)明的納米顆粒的組合物，以及包含本發(fā)明的納米顆粒和/或本發(fā)明的組合物的試劑盒。
本文還提供診斷對(duì)象中癌癥的體外方法，包括a)使本發(fā)明的納米顆粒與對(duì)象的細(xì)胞接觸，其中所述納米顆粒包含可檢測(cè)標(biāo)記物；b)檢測(cè)納米顆粒內(nèi)在化進(jìn)入對(duì)象的細(xì)胞的速度和/或量和/或特異性；和c)比較納米顆粒內(nèi)在化進(jìn)入對(duì)象的細(xì)胞的速度和/或量和/或特異性與納米顆粒內(nèi)在化進(jìn)入對(duì)照對(duì)象的細(xì)胞和/或被診斷對(duì)象的對(duì)照細(xì)胞的速度和/或量和/或特異性，與對(duì)照對(duì)象的細(xì)胞和/或?qū)φ占?xì)胞相比，根據(jù)納米顆粒內(nèi)在化進(jìn)入對(duì)象的細(xì)胞的量和/或速度和/或特異性的提高或改變來(lái)診斷所述對(duì)象中的癌癥。而且，本發(fā)明提供診斷對(duì)象中癌癥的體內(nèi)方法，包括a)將權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的納米顆粒遞送至對(duì)象，其中所述納米顆粒包含顯像劑；b)檢測(cè)所述對(duì)象中來(lái)自顯像劑的信號(hào)；和c)比較對(duì)象中來(lái)自顯像劑的信號(hào)與對(duì)照對(duì)象中和/或來(lái)自被診斷對(duì)象的對(duì)照組織/細(xì)胞中來(lái)自同一顯像劑的信號(hào)，與來(lái)自對(duì)照對(duì)象和/或?qū)φ战M織/細(xì)胞的信號(hào)相比，根據(jù)來(lái)自所述對(duì)象的信號(hào)的改變來(lái)診斷所述對(duì)象中的癌癥。附圖簡(jiǎn)述
圖I. GLU-PEG-PEI質(zhì)粒復(fù)合物的合成。圖2A-C. A.編碼綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒在兩種細(xì)胞系，乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231)和非轉(zhuǎn)化人乳腺上皮細(xì)胞系(MCF-10A)中的差異表達(dá)。B.與非轉(zhuǎn)化前列腺上皮細(xì)胞系(RWPE)相比，納米顆粒在前列腺癌細(xì)胞系(PC3)中的優(yōu)先靶向。C.編碼@半乳糖苷酶(P_gal)的質(zhì)粒在兩種癌細(xì)胞系和兩種未轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中的差異表達(dá)。圖3A-B. A.證明GLU-PEG-PEI-介導(dǎo)的核酸遞送是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依賴性的競(jìng)爭(zhēng)分析。B.納米顆粒-核酸復(fù)合物通過(guò)內(nèi)吞作用介導(dǎo)的內(nèi)在化進(jìn)入細(xì)胞。圖4A-B. A.攜帶腫瘤的小鼠(腫瘤體積約100 mm3)靜脈內(nèi)注射與納米顆粒形成復(fù)合物的腫瘤抑制基因(PTEN, 20或40 ii g)質(zhì)粒(50 U I總體積)。14天后處死小鼠，收集腫瘤。B.用Ki-67(—種增殖標(biāo)記物)使腫瘤組織切片染色。顯示了 Ki-67染色的代表性圖像和腫瘤體積。PTEN磷酸酶和張力蛋白(tensin)同源物的序列提供于GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)NM_000314. 4. (Li等人.“PTEN-—種在人腦癌、乳腺癌和前列腺癌中突變的推定蛋白酪氨酸憐酸酶基因”(PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutatedin human brain, breast, and prostate cancer) Science 275(5308):1943-1947(1997))。圖5A-B. P53/730D而非野生型p53抑制突變型p53表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)。用編碼對(duì)照載體的 PCNDA3 載體(1.0 yg)、野生型 p53 (1.0 y g)、p53/p730D (0. 5 y g)或p53(R175H)/p730D (1.0 U g)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞。用嘌呤霉素選擇后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行集落形成試驗(yàn)。數(shù)據(jù)是來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土 SE (A)0用選擇后48小時(shí)時(shí)收集的細(xì)胞進(jìn)行Western分析，利用所示抗體進(jìn)行探測(cè)(B)?？?Myc印跡顯示外源性p53的水平，抗_p53印跡反映出內(nèi)源性突變型p53和外源性p53的組合的水平。圖6. MCF-10A細(xì)胞對(duì)中等水平的p53/p730D表達(dá)的敏感性較低。以MDA-MB-231細(xì)胞為對(duì)照，用所示載體(0.5 Ug)轉(zhuǎn)染MCF-10A細(xì)胞，并如圖5所示進(jìn)行集落形式試驗(yàn)。平行進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡來(lái)測(cè)定p53/p730D表達(dá)水平。圖7A-C. p53/p730D表達(dá)導(dǎo)致在MDA-MB-231細(xì)胞中的差異應(yīng)答。A.使用所示抗體對(duì)如圖6中的細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。表達(dá)P53/p730D的MDA-MB-231或MCF-10A細(xì)胞或者是模擬的或用4 Gy照射。照射后6小時(shí)收集細(xì)胞以供蛋白質(zhì)印跡分析(B)或在24小時(shí)時(shí)收集以供FACS分析(C)。結(jié)果是來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土 SE。圖8A-C. GIu-PEG-PEI納米顆粒特異性靶向惡性細(xì)胞以便遞送基因。將MCF-10A/ MDA-MB-231 (a)或 RWPE/PC3 (B)細(xì)胞與 Glu-PEG-PEI/lacZ DNA 復(fù)合物溫育。細(xì)胞固定24小時(shí)，用X-gal 試劑染色。C.培養(yǎng)基中包含50 mM葡萄糖以便與GLU_PEG-PEI_P-gal攝取競(jìng)爭(zhēng)。顯示的是代表性圖像。圖9. GLU-ALG降低PEI的細(xì)胞毒性。使用圖5所述方法，通過(guò)集落存活試驗(yàn)評(píng)估PEI 升高的濃度(0、0. 05,0. 1,0. 25,0. 5、I. 0,2. 5 或 5. 0 u g/ml)對(duì) MDA-MB-231 細(xì)胞成活力的影響。通過(guò)混合 I U g/ml 的 PEI 與 0. 05、0. 1、0. 25、0. 5、1. 0、2. 5 或 5. 0 y g/ml 的GLU-ALG來(lái)檢測(cè)GLU-ALG的作用。

圖10. GLU-ALG-PEI介導(dǎo)的LacZ表達(dá)質(zhì)粒的腫瘤特異性遞送。將乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 (5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)移植入裸鼠(4_6周齡)的肋部，讓腫瘤發(fā)展兩周。一旦腫瘤體積達(dá)到約200 mm,使小鼠饑餓過(guò)夜。第二天上午，將LacZ表達(dá)質(zhì)粒與PEI混合、隨后和葡萄糖-藻酸混合并通過(guò)靜脈內(nèi)注射。注射后48小時(shí)處死小鼠。收集不同組織樣品，包括心臟、肺、脾臟、肝臟、腎臟和腫瘤樣品。制備組織切片并用P-Gal染色。顯示了各組織的代表性圖像。圖11.通過(guò)表達(dá)p53/p730D在MDA-MB-231細(xì)胞中誘導(dǎo)Pgl3-GFp。穩(wěn)定表達(dá)Pgl3-GFp 的 MDA-MB-231 細(xì)胞與 GLU-PEG-PEI/WTp53 或 p53/p730D [利用低水平的質(zhì)粒(0.2 Ug DNA/60-mm碟)以避免p53_介導(dǎo)的細(xì)胞死亡]溫育。24小時(shí)后使用2%福爾馬林固定細(xì)胞，用DAPI染料染色。上面的圖顯示GFP表達(dá)。下面的圖顯示由DAPI染色檢測(cè)到的細(xì)胞核。圖12. p53、p730和p53嵌合體的示意圖。p53嵌合體包含p730的寡聚結(jié)構(gòu)域(OD)，其中p53蛋白的393氨基酸序列在氨基酸318到364處被p73 P蛋白的氨基酸346-390取代。TAD :反式激活域；PRD :脯氨酸富集域；DBD :DNA結(jié)合域；01igo :寡聚結(jié)構(gòu)域。
發(fā)明詳述
本說(shuō)明書并非意欲詳細(xì)列舉可實(shí)施本發(fā)明的所有不同方式，或者可加入本發(fā)明的所有特征。例如，關(guān)于一個(gè)實(shí)施方式所示的特征可并入其它實(shí)施方式，關(guān)于具體實(shí)施方式
所示的特征可從該實(shí)施方式中刪除。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒于本公開(kāi)可明了本文提示的對(duì)各種實(shí)施方式的許多改變和增加，它們不脫離本發(fā)明。因此，以下描述想要說(shuō)明本發(fā)明的某些具體實(shí)施方式
，而非窮盡性指出它們的所有排列、組合和改變。除非另有限定，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意義。本發(fā)明說(shuō)明書中所用的術(shù)語(yǔ)僅是出于描述具體實(shí)施方式
的目的，而非限制本發(fā)明。本文述及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)通過(guò)引用全文納入本文。如本文中所用的，“一個(gè)”、“一種”或“該”可表示一個(gè)或更多個(gè)。例如，“一個(gè)”細(xì)胞可表示單個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞。如本文中所用的，“和/或”指代和包括一個(gè)或更多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任何和全部可能的組合，以及用“或”解讀時(shí)表示不存在組合。此外，如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“約”當(dāng)指代可檢測(cè)值，例如本發(fā)明的生物分子或試劑 的含量、劑量、時(shí)間、溫度等時(shí)，表不包括所指量的土 20%、土 10%、土 5%、土 1%、土 0.5%
或者甚至土 0.1%的差異。在一個(gè)方面，本發(fā)明通過(guò)給予對(duì)象(例如，患癌癥的對(duì)象)本發(fā)明的納米顆粒來(lái)提供治療癌癥的新策略，所述納米顆粒設(shè)計(jì)成選擇性和直接地靶向?qū)ο笾械哪[瘤細(xì)胞。納米顆粒將活性劑遞送至腫瘤細(xì)胞來(lái)殺死細(xì)胞和/或?qū)⒖蓹z測(cè)標(biāo)記物沉積以便鑒定細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含以下成分、基本上由以下成分構(gòu)成或由以下成分構(gòu)成的納米顆粒a)聚陽(yáng)離子/聚亞烷基二醇/葡萄糖偶聯(lián)物；和b)活性劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含以下成分、基本上由以下成分構(gòu)成或由以下成分構(gòu)成的納米顆粒a)包含活性劑的核心；和b)圍繞a)的核心的葡萄糖/聚亞烷基二醇偶聯(lián)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含以下成分、基本上由以下成分構(gòu)成或由以下成分構(gòu)成的納米顆粒a)包含活性劑的核心；b)圍繞a)的核心的葡萄糖/聚亞烷基二醇偶聯(lián)物；和(3)聚陽(yáng)離子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含葡萄糖/活性劑復(fù)合物、基本上由葡萄糖/活性劑復(fù)合物構(gòu)成或由葡萄糖/活性劑復(fù)合物構(gòu)成的納米顆粒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含以下成分、基本上由以下成分構(gòu)成或由以下成分構(gòu)成的納米顆粒a)聚陽(yáng)離子/藻酸鹽/葡萄糖偶聯(lián)物；和b)活性劑；以及包含以下成分、基本上由以下成分構(gòu)成或由以下成分構(gòu)成的納米顆粒a)包含活性劑的核心；和b)圍繞a)的核心的葡萄糖/藻酸鹽偶聯(lián)物。此外，本文提供包含以下成分、基本上由以下成分構(gòu)成或由以下成分構(gòu)成的納米顆粒a)包含活性劑的核心；b)圍繞a)的核心的葡萄糖/藻酸鹽偶聯(lián)物；和c)聚陽(yáng)離子。本發(fā)明的納米顆?？勺鳛榧{米顆粒的群存在，因此，本發(fā)明提供在運(yùn)載體中包含納米顆粒的群的組合物。所述群的納米顆?？梢跃峭活愋突蛩黾{米顆粒的群可以由兩種或更多種不同類型的本文中所述納米顆粒以任何組合和任何比例構(gòu)成。本發(fā)明的納米顆粒的大小可以是約20 nm到約500 nm。因此，所述納米顆?？梢允?20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、110 nm、120 nm、130 nm、140 nm、150 nm、160 nm、170 nm、180 nm、190 nm、200 nm、225 nm、250 nm、275 nm、300 nm、325 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm等或它們的任何組合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該知道，在包含本發(fā)明的納米顆粒的組合物中，組合物中的納米顆粒的大小可以不同，但通常落在本文所述的大小范圍內(nèi)。在本發(fā)明的納米顆粒中，偶聯(lián)物的葡萄糖部分可以作為葡萄糖、F-18-氟脫氧葡萄糖(FDG)、放射性標(biāo)記葡萄糖(例如，[11C]葡萄糖、[14C]葡萄糖)、葡萄糖衍生物或它們的任何組合存在。術(shù)語(yǔ)“葡萄糖衍生物”包括具有修飾的葡萄糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的葡萄糖分子，該葡萄糖分子是生物相容性的并且可被身體進(jìn)行生物化學(xué)處理(例如，被葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合)。葡萄糖衍生物的例子包括但不限于右旋葡萄糖(D-葡萄糖)和2-脫氧葡萄糖(2-DG)。“聚亞烷基二醇”表示直鏈或支鏈聚亞烷基二醇聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和聚丁二醇(PBG)以及PEG、PPG和PBG的任何組合的共聚物，“聚亞烷基二醇”包括聚亞烷基二醇的單烷基醚(monoalkylether)。因此，在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，本發(fā)明納米顆粒中的聚亞烷基二醇可以是但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇和它們的任何組合。 在某些實(shí)施方式中，所述納米顆粒的聚亞烷基二醇是聚乙二醇或“PEG”。術(shù)語(yǔ)“PEG亞單元”指單個(gè)聚乙二醇單元，S卩，一(CH2CH2O)—。在一些實(shí)施方式中，所述聚亞烷基二醇(例如，PEG)可以是非多分散的、單分散的、基本上單分散的、純單分散的或基本上純單分散的。“單分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中約100%的化合物具有相同的分子量。“基本上單分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中至少約95%的化合物具有相同的分子量。“純單分散的”用于描述化合物的混合物,其中所述混合物中約100%的化合物具有相同的分子量且具有相同的分子結(jié)構(gòu)。因此，純單分散的混合物是單分散的混合物，但單分散的混合物不一定是純單分散的混合物。“基本上純單分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中至少約95%的化合物具有相同的分子量且具有相同的分子結(jié)構(gòu)。因此，基本上純單分散的混合物是基本上單分散的混合物，但基本上單分散的混合物不一定是基本上純單分散的混合物。在實(shí)施方式中，其中所述納米顆粒包含以下成分、基本上由以下成分構(gòu)成或由以下成分構(gòu)成a)聚陽(yáng)離子/藻酸鹽/葡萄糖偶聯(lián)物；和b)活性劑，所述聚陽(yáng)離子、葡萄糖和藻酸鹽可通過(guò)共價(jià)相互作用在偶聯(lián)物中彼此相連。此外，聚陽(yáng)離子/藻酸鹽/葡萄糖偶聯(lián)物可通過(guò)靜電力與活性劑相連。在實(shí)施方式中，其中所述納米顆粒包含以下成分、基本上由以下成分構(gòu)成或由以下成分構(gòu)成a)包含活性劑的核心；和b)圍繞a)的核心的葡萄糖/藻酸鹽偶聯(lián)物，所述葡萄糖和藻酸鹽可通過(guò)共價(jià)相互作用彼此相連。此外，所述葡萄糖/藻酸鹽偶聯(lián)物可通過(guò)共價(jià)相互作用與所述活性劑相連。在本發(fā)明納米顆粒的一些實(shí)施方式中，葡萄糖/PAG偶聯(lián)物(例如，葡萄糖/PEG偶聯(lián)物)可以圍繞包含活性劑的核心存在。在該葡萄糖/PAG偶聯(lián)物中，葡萄糖和PAG可相連，例如通過(guò)化學(xué)共價(jià)鍵(例如，共價(jià)相互作用)。葡萄糖/PAG偶聯(lián)物的PAG部分可通過(guò)共價(jià)相互作用連接于核心的活性劑。此外，在本發(fā)明的納米顆粒的一些實(shí)施方式中，聚陽(yáng)離子/PAG/葡萄糖偶聯(lián)物可連同活性劑一起存在。在該偶聯(lián)物中，葡萄糖或PAG可如上所述彼此相連，聚陽(yáng)離子(例如，PEI)可例如通過(guò)化學(xué)共價(jià)鍵連接于葡萄糖/PAG偶聯(lián)物的PAG(例如，PEG)。該偶聯(lián)物的聚陽(yáng)離子可通過(guò)靜電力連接于活性劑。在本發(fā)明的納米顆粒中，其中存在包含聚陽(yáng)離子和活性劑的核心與圍繞所述核心的葡萄糖/PAG偶聯(lián)物一起存在，所述聚陽(yáng)離子可通過(guò)靜電力連接于活性劑，所述葡萄糖/PAG偶聯(lián)物可通過(guò)共價(jià)鍵連接于所述核心的聚陽(yáng)離子。此外，在本發(fā)明的納米顆粒中，其中，包含聚陽(yáng)離子和活性劑的核心與圍繞所述核心的葡萄糖/藻酸鹽偶聯(lián)物一起存在，所述聚陽(yáng)離子可通過(guò)靜電力連接于活性劑，所述葡萄糖/藻酸鹽偶聯(lián)物可通過(guò)共價(jià)鍵連接于所述核心的聚陽(yáng)離子。
在聚陽(yáng)離子存在于納米顆粒中的本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述聚陽(yáng)離子可以是但不限于聚乙烯亞胺、聚氮丙啶、聚(烯丙基負(fù)離子鹽酸鹽；PAH)、腐胺、尸胺、聚賴氨酸、聚精氨酸、聚(三亞甲基亞胺)、聚(四亞甲基亞胺)、聚亞丙基亞胺(polypropylenimine)、氨基糖苷-聚胺、二脫氧-二氨基-b_環(huán)糊精、精胺、亞精胺、尸胺、聚(2-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(組氨酸)、陽(yáng)離子化明膠、枝狀聚合物(dendrimer)、殼聚糖和它們的任何組合。在本發(fā)明納米顆粒的某些實(shí)施方式中，所述聚陽(yáng)離子是聚乙烯亞胺(PEI)。在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，聚陽(yáng)離子(例如，PEI)可以與本發(fā)明的活性劑(例如，多核苷酸、寡核苷酸、陰離子蛋白質(zhì)、陰離子藥物、共價(jià)結(jié)合于多肽或蛋白質(zhì)的多核苷酸或寡核苷酸、以及它們的任何組合)通過(guò)物理靜電力(例如，其中活性劑中的負(fù)電荷與聚陽(yáng)離子中的正電荷結(jié)合)復(fù)合?；钚詣┛梢栽诰坳?yáng)離子偶聯(lián)于GLU-PAG或GLU-藻酸鹽之前和/或之后與聚陽(yáng)離子復(fù)合。還期望，本發(fā)明的納米顆粒的各種成分可通過(guò)交聯(lián)彼此相連，例如利用交聯(lián)劑和/或催化劑[例如，任何組合的I-乙基-(3-3-二甲基氨基丙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC);N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) ；N, N’ - 二異丙基碳二亞胺(DIC)、京尼平(genipin)和本領(lǐng)域已知的任何其它交聯(lián)劑和/或催化劑]。在一些實(shí)施方式中，可采用化學(xué)交聯(lián)，例如光交聯(lián)，其中具有光可固化基團(tuán)的成分可以與納米顆粒的光可固化成分共-交聯(lián)。在其它實(shí)施方式中，納米顆粒的成分可經(jīng)連接分子相連。本發(fā)明的連接分子的例子包括但不限于肝素和硫酸肝素。在將肝素用作連接分子的實(shí)施方式中，可使用通過(guò)靜電力或特異性結(jié)合與肝素結(jié)合的活性劑。例如，肝素與本領(lǐng)域熟知的TGF-^ I、IL-10、HGF、FGF和其它，具有特異性結(jié)合。此外，肝素帶負(fù)電荷，可通過(guò)靜電力結(jié)合帶正電荷的聚陽(yáng)離子。本發(fā)明的其它連接分子包括肝素類似物和改性的多糖，例如Frank等人ij. Biol. Chem.278(44): 43229-43235 (2003))中所述的。本發(fā)明納米顆粒中存在的活性劑可以是但不限于多核苷酸、多核苷酸的片段、寡核苷酸、反義序列、核酶、編碼核酶的核苷酸序列、干擾RNA (siRNA ; shRNA、dsRNA)、微小RNA (miRNA)、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的生物活性片段、多肽、化療藥物或試劑、細(xì)胞毒劑、放射性核素、可檢測(cè)標(biāo)記物、顯像劑、和它們的任何組合。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多核苷酸可以是編碼賦予療效的功能蛋白或其它產(chǎn)物的質(zhì)?；蚝怂峤Y(jié)構(gòu)物。本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)物編碼的蛋白質(zhì)的非限制性例子包括本領(lǐng)域已知或以后被鑒定的p53、p53/p730D嵌合體、白介素-2(IL-2)、白介素-4 (IL-4)、白介素-6 (IL-6)、白介素-7 (IL-7)、白介素-12 (IL-12)、白介素-15 (IL-15)、白介素-18 (IL-18)、白介素-21 (IL-21)、白介素-27 (IL-27)、cesalin、CPT-Il、干擾素可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)-10 (IP-10)、干擾素Y誘導(dǎo)的單核因子(Mig;CXCL9)、腫瘤壞死因子 a (TNF-a)、Fas 配體、PTEN、ARF (pl4)、Fas、CDK 抑制蛋白(CIP) pl5、CIPp27、CIP p21、￠-聯(lián)蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2 (msFlkl)、胸苷激酶、抗-血管生成因子、凋亡誘導(dǎo)因子(例如，BIK、BNIP、NOXA PUMA、BAD、BAX、EGL-1、CED13)等等。在納米顆粒包含含有活性劑的核心的實(shí)施方式中，所述核心可包含以下成分、基本上由以下成分構(gòu)成或由以下成分構(gòu)成作為活性劑的多核苷酸/聚陽(yáng)離子(例如，PEI)復(fù)合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述多核苷酸是編碼p53的質(zhì)粒或核酸結(jié)構(gòu)物。在該實(shí)施方式中，本發(fā)明的納米顆粒將編碼P53的質(zhì)粒選擇性且直接地遞送至腫瘤細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生P53蛋白，其中p53蛋白表現(xiàn)出其抗腫瘤作用。
如本文所用的，“核酸”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”包括RNA和DNA，包括cDNA、基因組DNA、mRNA、合成的(例如，化學(xué)合成的)DNA或RNA以及RNA和DNA的嵌合體。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核苷酸序列”指核苷酸鏈，而無(wú)論該鏈的長(zhǎng)度。核酸可以是雙鏈或單鏈的。如果是單鏈的，核酸可以是有義鏈或反義鏈?？衫霉押塑账犷愃莆锘蜓苌?例如，肌苷或硫代磷酸酯核苷酸)來(lái)合成核酸。此類寡核苷酸可用于，例如制備已改變堿基配對(duì)能力或?qū)怂崦傅哪褪苄栽黾拥暮怂?。本發(fā)明還提供本發(fā)明核酸或核苷酸序列的互補(bǔ)核酸(其可以是完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ))?！胺蛛x的多核苷酸”是這樣一種核苷酸序列(例如，DNA或RNA)，其不與核苷酸序列直接鄰接，在獲得它的有機(jī)物的天然存在的基因組中，其與所述核苷酸序列直接鄰接(一條在5’端，一條在3’端)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，分離的核酸包含與編碼序列直接鄰接的一部分或全部5’-非編碼(例如，啟動(dòng)子)序列。因此，該術(shù)語(yǔ)包括，例如并入載體、自復(fù)制質(zhì)?；虿《?、或原核或真核生物的基因組DNA的重組蛋白，或者獨(dú)立于其它序列的作為獨(dú)立分子存在(例如，通過(guò)PCR或限制性核酸內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)的重組DNA。其還包括是編碼額外多肽或多肽序列的雜交核酸的一部分的重組DNA。包含基因的分離的多核苷酸不是包含此基因的染色體的片段，而是包含與該基因相關(guān)的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)，但沒(méi)有該染色體上天然存在的其它基因。術(shù)語(yǔ)“分離的”可指基本上不含細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)和/或培養(yǎng)基(當(dāng)通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時(shí))或化學(xué)前體或其它化學(xué)試劑(當(dāng)化學(xué)合成時(shí))的核酸、核苷酸序列或多肽。而且，“分離的片段”是天然不作為片段天然存在并且未以天然狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的核酸、核苷酸序列或多肽的片段?！胺蛛x的”不表示該制品在技術(shù)上是純的(均質(zhì)的)，而是足夠純，從而能提供處于可用于所需目的的形式的多肽或核酸。分離的細(xì)胞指與天然狀態(tài)下與其通常相關(guān)的其它成分分離的細(xì)胞。例如，分離的細(xì)胞可以是培養(yǎng)基中的細(xì)胞(例如，體外)和/或在本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體中的細(xì)胞。因此，可將分離的細(xì)胞遞送至和/或引入對(duì)象。在一些實(shí)施方式中，分離的細(xì)胞可以是從對(duì)象中取出，離體操作后再送回該對(duì)象的細(xì)胞。當(dāng)用于多核苷酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”應(yīng)理解為表示相對(duì)于參考核酸或核苷酸序列長(zhǎng)度減小的核苷酸序列，并且包含、基本上由以下核苷酸序列構(gòu)成或由以下核苷酸序列構(gòu)成，與參考核酸或核苷酸序列相同或幾乎相同(例如，90%、92%、95%、98%、99%相同)的鄰接的核苷酸的核苷酸序列。如果合適，本發(fā)明的此類核酸片段可以包括在較大的多核苷酸中，本發(fā)明的此類核酸片段作為較大的多核苷酸的成分。在一些實(shí)施方式中，此類片段可包含以下寡核苷酸、基本上由所述寡核苷酸組成或由所述寡核苷酸組成所述寡核苷酸具有本發(fā)明的核酸或核苷酸序列的至少約 8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200 或更多個(gè)連續(xù)的核苷酸的長(zhǎng)度。當(dāng)用于多肽的時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”應(yīng)理解為表示相對(duì)于參考多肽或氨基酸序列長(zhǎng)度減小的氨基酸序列，且包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列構(gòu)成或由以下氨基酸序列構(gòu)成，與參考多肽或氨基酸序列相同或幾乎相同(例如，90%、92%、95%、98%、99%相同)的鄰接氨基酸的氨基酸序列，。如果合適，本發(fā)明的此類多肽片段可以包括在較大的多肽中，本發(fā)明的多肽片段作為較大的多肽的成分。在一些實(shí)施方式中，此類片段可包含以下多肽、基本上由以下多肽構(gòu)成或由以下多肽組成所述多肽具有本發(fā)明的多肽或氨基酸序列的至少約 4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200 或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸的長(zhǎng)度。
如本文所用的，“功能”多肽或“功能蛋白”或多肽的“功能片段”或“生物學(xué)活性片段”基本上保留了與該多肽通常相關(guān)的至少一種生物學(xué)活性(例如，抗腫瘤活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、配體或受體結(jié)合)。在具體的實(shí)施方式中，“功能”多肽或蛋白質(zhì)或“功能片段”基本上保留了未修飾的蛋白質(zhì)具有的所有活性。“基本上保留”生物學(xué)活性，表示所述多肽或蛋白質(zhì)或片段保留了天然多肽的至少約20%、30%、40%、50%、60%、75%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或更多的生物學(xué)活性(甚至可以比天然多肽具有更高水平的活性)。“非-功能”多肽表現(xiàn)出很少或基本上沒(méi)有與該多肽通常相關(guān)的可檢測(cè)生物活性(例如，最多僅是非顯著的量，例如小于約10%或甚至5%)?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟知和本文描述的試驗(yàn)來(lái)測(cè)定生物學(xué)活性，例如蛋白質(zhì)結(jié)合和抗腫瘤活性。關(guān)于包含編碼序列的核酸，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)(express、expressing或expression) ”表示該核酸經(jīng)轉(zhuǎn)錄和任選翻譯。按照本發(fā)明，本發(fā)明編碼序列的表達(dá)通常導(dǎo)致本發(fā)明的多肽或其它產(chǎn)物的產(chǎn)生。完全表達(dá)的多肽或片段或其它產(chǎn)物還可在完整細(xì)胞中起作用而無(wú)需純化。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，活性劑可以是反義核苷酸序列或反義寡核苷酸。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“反義核苷酸序列”或“反義寡核苷酸”指與指定的目標(biāo)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列?？砂凑粘Ｒ?guī)技術(shù)制備表達(dá)相同的反義寡核苷酸和核酸。參見(jiàn)，例如授予Tullis的美國(guó)專利第5，023，243號(hào)；授予Pederson等人的美國(guó)專利第5，149，797號(hào)。所述反義核苷酸序列可以與整個(gè)目標(biāo)核苷酸序列或至少10、20、40、50、75、100、150、200、300或500個(gè)鄰接的堿基的其一部分互補(bǔ)，并且降低由該目標(biāo)核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)或產(chǎn)物的產(chǎn)生的水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，反義核苷酸序列不必與目標(biāo)核苷酸序列完全互補(bǔ)，只要序列相似程度足以使得反義核苷酸序列與其目標(biāo)雜交并降低所編碼的多肽或產(chǎn)物的產(chǎn)量。本領(lǐng)域已知的是，短反義核苷酸序列通常需要較高的序列相似程度，而較長(zhǎng)反義核苷酸序列允許更大程度的錯(cuò)配堿基。例如，就反義核苷酸序列的目標(biāo)核苷酸序列而言，可在降低的嚴(yán)格性、中等嚴(yán)格性或者甚至高嚴(yán)格性的條件下進(jìn)行此類反義核苷酸序列的雜交(例如，分別是由35-40%甲酰胺與5 XDenhardt溶液、0. 5% SDS和I X SSPE，于37°C的洗滌嚴(yán)格性代表的條件；由40-45%甲酰胺與5XDenhardt溶液、0. 5% SDS和1XSSPE，42°C的洗滌嚴(yán)格性代表的條件；和/或50%甲酰胺與5XDenhardt溶液、0. 5% SDS和I X SSPE，42°C的洗滌嚴(yán)格性所代表的條件)。參見(jiàn),例如Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning: ALaboratory Manual)第2版.(冷泉港，紐約，1989)。因此,在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的反義核苷酸序列與目標(biāo)編碼序列的互補(bǔ)序列有至少約70%、80%、90%、95%、97%、98%或更高的序列相似性且降低多肽產(chǎn)生的水平。反義核苷酸序列的長(zhǎng)度(即，其中核苷酸的數(shù)量)不是至關(guān)重要的，只要其選擇性地結(jié)合至預(yù)期的位置并降低靶序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，該長(zhǎng)度可按照常規(guī)程序來(lái)確定。反義核苷酸序列的長(zhǎng)度通常約是8、10或12個(gè)核苷酸，最多約20、30、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法，采用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)構(gòu)建反義核苷酸序列。例如，可利用天然存在的核苷酸或?yàn)樵黾臃肿拥纳飳W(xué)穩(wěn)定性或增加反義和有義核苷酸序列之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性而設(shè)計(jì)的各種修飾的核苷酸來(lái)化學(xué)合成反義核苷酸序列，例如可利用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于產(chǎn)生反義核苷酸序列的修飾的 核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、^ -D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6_異戊烯基腺嘌呤、I-甲基鳥嘌呤、I-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、P-D-甘露糖基Q核苷、5’ -甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿喃唳、2-甲基硫代-N6-異戍烯基腺嘌呤、尿卩密唳-5-氧代乙酸(V)、wybutoxosine、假尿喃啶(pseudouracil)、Q核苷、2_硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧代乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧代乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(&叩3) 和2，6-二氨基嘌呤。或者，可利用表達(dá)載體來(lái)產(chǎn)生反義核苷酸序列，在所述表達(dá)載體中以反義方向克隆了核酸(即，從插入的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA是感興趣的目標(biāo)核酸的反義方向)。本發(fā)明的反義核苷酸序列還包含這樣的核苷酸序列，其中至少一個(gè)或全部的核苷酸間橋連磷酸殘基是修飾的磷酸酯，例如膦酸甲酯、硫代膦酸甲酯、偶磷嗎啉酸(phosphoromorpholidates)、偶憐哌嗪酸(phosphoropiperazidates)和氨基憐酸酯。例如，每隔一個(gè)核苷酸間橋連磷酸殘基可如所述地進(jìn)行修飾。在另一非限制性例子中，反義核苷酸序列是這樣的核苷酸序列，其中一個(gè)或全部的核苷酸含有2’低級(jí)烷基部分(例如，C1-C4、直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烷基，例如甲基、乙基、乙烯基、丙基、I-丙烯基、2-丙烯基和異丙基)。例如，每隔一個(gè)核苷酸可如所述地進(jìn)行修飾。還可參見(jiàn)Furdon等人.，Nucleic Acids Res. 17:9193 (1989) ;Agrawal 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:1401 (1990) ;Baker 等人 ，Nucleic Acids Res. 18:3537 (1990) ;Sproat 等人 ，Nucleic Acids Res. 17:3373 (1989) ;Walder 和 Walder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5011 (1988)，這些文獻(xiàn)中關(guān)于制備反義分子的方法的教導(dǎo)，包括含有修飾的核苷酸堿基的那些的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本文。在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，活性劑可以是干擾RNA，例如小干擾RNA (siRNA)，短發(fā)夾RNA (shRNA)，雙鏈RNA (dsRNA)或微小RNA (miRNA)。這些干擾RNA可以直接針對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的靶核苷酸序列，從而調(diào)控核苷酸序列的表達(dá)，隨后調(diào)控該靶核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)或產(chǎn)物的產(chǎn)量。使用干擾RNA方法被靶向的腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞內(nèi)的核苷酸序列的非限制性例子包括 Bcl-2、Bcl-XL, Akt、HIF_a、MMP, Ras 和 MDM2。siRNA是轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機(jī)制，其中將對(duì)應(yīng)于靶編碼序列的雙鏈RNA (dsRNA)引入細(xì)胞或有機(jī)物，從而導(dǎo)致相應(yīng)的mRNA的降解。以下文獻(xiàn)總結(jié)了 siRNA實(shí)現(xiàn)基因沉默的機(jī)制Sharp 等人，Genes Dev. 15:485 (2001);和 Hammond 等人 ，Nature Rev. Gen. 2:110 (2001)。siRNA效應(yīng)持續(xù)多輪細(xì)胞分裂，然后基因重獲表達(dá)。已在人細(xì)胞(包括人胚胎腎臟和HeLa細(xì)胞)中證實(shí)siRNA是成功的(參見(jiàn)，例如Elbashir等人 ，Nature 411: 494(2001))。在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過(guò)強(qiáng)迫RNA發(fā)夾(shRNA)的內(nèi)源性表達(dá)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)沉默(參見(jiàn) Paddison 等人 ，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 1443 (2002))。在另一個(gè)實(shí)施方式中，小(21-23 nt) dsRNA的轉(zhuǎn)染特異性抑制核酸表達(dá)(Caplen, TrendsBiotechnol. 20:49 (2002)中進(jìn)行了綜述)。
siRNA技術(shù)采用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法制備對(duì)應(yīng)于待滅活的全部或部分靶編碼序列的dsRNA，例如用17 RNA聚合酶同時(shí)轉(zhuǎn)錄模板DNA (對(duì)應(yīng)于靶序列)的兩條鏈。用于siRNA的制備dsRNA的試劑盒可市售購(gòu)得，例如購(gòu)自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(New England Biolabs, Inc)。轉(zhuǎn)染dsRNA或設(shè)計(jì)成制備dsRNA的質(zhì)粒的方法是本領(lǐng)域的慣常方法。微小RNA (miRNA)是長(zhǎng)約21_23個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子，其可以類似于siRNA的方式用于調(diào)控基因表達(dá)(參見(jiàn)美國(guó)專利第7，217，807號(hào))。已在轉(zhuǎn)染了 mRNA-cDNA雜交結(jié)構(gòu)物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中報(bào)道了類似于siRNA所產(chǎn)生的那些效應(yīng)的沉默效應(yīng)(Lin等人 ，Biochem. Biophys. Res. Commun. 281:639(2001))，從而為使感興趣的編碼序列沉默提供另一策略。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的活性劑還可以是核酶以及編碼核酶的核酸。核酶是以位點(diǎn)特異性方式切割核酸的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。核酶具有特異性催化結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域具有內(nèi)切核酸酶活性(Kim 等人，Proc. Natl. Acad, Sci. USA 84:8788 (1987)；Gerlach 等人 ，Nature 328:802 (1987) ;Forster 和 Symons, Cell 49:211 (1987))。例如，許多核酶高度特異性地加速磷酸酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)，常只切割寡核苷酸底物中幾個(gè)磷酸酯之一(Michel和Westhof, J Mol. Biol. 216:585 (1990) ;ReinhoId-Hurek和Shub, Nature357: 173 (1992))。該特異性歸已因于在化學(xué)反應(yīng)之前底物需要通過(guò)特異性堿基配對(duì)相互作用結(jié)合于核酶的內(nèi)部指導(dǎo)序列(“IGS”)。觀察到核酶催化主要作為涉及核酸的序列特異性切割/連接反應(yīng)的一部分(Joyce, Nature 338:211 (1989))。例如，美國(guó)專利第5，354，855號(hào)描述了某些核酶可用作序列特異性高于已知核糖核酸酶、接近DNA限制酶的內(nèi)切核酸酶。因此,序列特異性核酶-介導(dǎo)的基因表達(dá)的抑制特別適用于治療應(yīng)用(Scanlon等人.，Proc. Natl. Acad.Sci USA 88:10591 (1991) ;Sarver 等人，Science 247:1222 (1990) ;Sioud 等人 ，J.Mol Biol. 223:831 (1992))。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的活性劑可以是化療藥物或試劑?；熕幬锘蛟噭┑姆窍拗菩岳影↖)長(zhǎng)春花屬生物堿(例如，長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿)；2)表鬼白毒素(例如，依托泊苷和替尼泊苷)；3)抗生素(例如，更生霉素(放線菌素D)、柔紅霉素(道諾霉素；紅比霉素)、阿霉素、博萊霉素、普卡霉素(光輝霉素)和絲裂霉素(絲裂霉素C);4)酶(例如，L-天冬酰胺酶)；5)生物反應(yīng)修飾劑(例如，干擾素-a) ；6)鉬配位復(fù)合物(例如，順鉬和卡鉬)；7)蒽二酮類(例如，米托蒽醌)；8)取代的脲(例如，羥基脲)；9)甲基肼衍生物(例如，丙卡巴肼(N-甲基肼;MIH)) ; 10)腎上腺皮質(zhì)抑制劑(例如，米托坦(o，p’_DDD)和氨魯米特)；11)腎上腺皮質(zhì)類固醇類(例如，潑尼松)；12)孕酮(例如，己酸羥孕酮、醋酸甲羥孕酮和醋酸甲地孕酮)；13)雌激素類(例如，己烯雌酚和乙炔雌二醇)；14)抗雌激素類(例如，他莫昔芬)；15)雄激素類(例如，丙酸睪酮和氟甲睪酮)；16)抗雄激素類(例如，氟他胺) ；和17)促性腺激素-釋放激素類似物(例如，亮丙瑞林)。本發(fā)明化療劑的其它例子包括氨甲蝶呤、表柔比星、氟尿嘧啶、維拉帕米、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、氨基喋呤、博來(lái)霉素、秋水仙胺(democolcine)、依托泊苷、光輝霉素、瘤可寧、美法侖、道諾紅霉素、阿霉素、他莫昔芬、紫杉醇、喜樹堿、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑(例如，馬立馬司他(Marimastat)、托卡特(Trocade)、強(qiáng)力霉素、米諾環(huán)素和通過(guò)引用納入的美國(guó)專利第5，872，152號(hào)中所述的)和阿糖胞苷。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，活性劑可以是放射性核素。如本文中所述的，“放射性核素”可以是適合將治療劑量的輔射遞送至腫瘤或癌細(xì)胞的任何放射性核素，包括但不限于227Ac,211At,131Ba,77Br,109Cd,51Cr,67Cu,165Dy,155Eu,153Gd,198Au,166Ho,113mIn,115mIn,123I,1251 , 131 1 , 189Ir, 191Ir, 192Ir, 194Ir,52Fe,55Fe,59Fe, 177Lu, 109Pd,32P, 226Ra, 186Re, 188Re, 153Sm,46Sc,47Sc,72Se,75Se, 105Ag,89Sr,35S,177Ta, 117mSn,121Sn, 166Yb, 169Yb,90Y,212Bi,119Sb, 197Hg,97Ru,100Pd,lolmRh 和 212Pb。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，活性劑可以是或可包含可檢測(cè)標(biāo)記物或標(biāo)記?？蓹z測(cè)標(biāo)記物或標(biāo)記的非限制性例子包括本領(lǐng)域熟知的放射性核素(35S、125I、131I、99Te、64CU，等等)、酶、熒光試劑、化學(xué)發(fā)光試劑和生色劑以及底物、輔因子、抑制劑、磁粉等。本發(fā)明的活性劑還可以是細(xì)胞毒劑。如本文所用的，“細(xì)胞毒劑”包括但不限蓖麻蛋白(例如，蓖麻蛋白A鏈)、阿克拉霉素、白喉毒素、莫能星、疣孢菌素A、相思豆毒蛋白、長(zhǎng)春花屬生物堿、單端孢霉烯族化合物(tricothecenes)和假單胞菌外毒素A。此外，本發(fā)明的活性劑可以是顯像劑。例如，異硫氰酸熒光素(FITC)可以是用于熒光成像的顯像劑，超順磁性鐵氧化物可以是用于磁共振成像(MRI)的顯像劑且/或放射性核素可以是用于放射線照相成像的顯像劑。應(yīng)該理解，本發(fā)明納米顆粒的任何元素可存在于上述本發(fā)明納米顆粒的各種實(shí)施方式中，本發(fā)明納米顆粒中也可不包含任何此類元素或?qū)⑵鋸闹信懦?，這些元素的此類排除或缺失可定義為本發(fā)明的負(fù)限制(例如，通過(guò)負(fù)限定附帶從所述實(shí)施方式中排除)。作為另一個(gè)方面，本發(fā)明提供藥物制劑和給予所述藥物制劑以便獲得療效和/或以供診斷的方法，如本文中所述的。所述藥物制劑可在藥學(xué)上可接受的載體中包含本文所述的任何納米顆粒?！八帉W(xué)上可接受的載體”是組合物的組分，例如鹽、載體、賦形劑或稀釋劑，該組分
(i)與組合物中的其它成分相容，從而使其能與本發(fā)明的組合物混合(combine)而不使得該組合物不適于所需目的，和(ii)適用于本文提供的對(duì)象而沒(méi)有過(guò)度的不利的副作用(例如毒性、刺激性和過(guò)敏反應(yīng))。當(dāng)副作用的風(fēng)險(xiǎn)超出組合物提供的益處，則副作用是“過(guò)度的”。藥學(xué)上可接受的組分的非限制性例子包括但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，例如磷酸緩沖鹽水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、微乳液和各類潤(rùn)濕劑。具體地，期望藥學(xué)上可接受的載體是經(jīng)配制以給予或遞送入本發(fā)明的對(duì)象的無(wú)菌載體。此外，藥學(xué)上可接受的載體是聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在美國(guó)藥典或其它公認(rèn)的用于動(dòng)物(更具體地人)的藥典中列出的任何載體分子。此類載體可采取溶液、混懸液、乳液、片劑、丸劑、小粒、膠囊、含液體的膠囊、散劑、緩釋制劑、栓劑、乳液、氣溶膠、噴霧劑、混懸液的形式或適用的任何其它形式。本領(lǐng)域技術(shù)人熟知合適的藥物載體的例子(參見(jiàn)，例如《雷明頓藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐》(Remington: The Science and Practice of Pharmacy),第 21 版(2005),Lffff 公司(Lippincott Williams & Wilkins),費(fèi)城，賓夕法尼亞州)。而且，在制備包含與配制組合物所需組分相混合的一種或更多種活性成分的此類藥物組合物中，可摻入其它常規(guī)藥學(xué)上可接受的添加劑，包括例如賦形劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、著色劑、調(diào)味劑、等滲劑、緩沖劑、抗氧化劑等。作為添加劑，可提到的是例如淀粉、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖醇、沉淀碳酸 鈣、結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素、糊精、明膠、阿拉伯膠、EDTA、硬脂酸鎂、滑石、羥丙基甲基纖維素、焦亞硫酸鈉等。本發(fā)明的制劑可任選地包含醫(yī)學(xué)試劑、藥學(xué)試劑、載體、佐劑、分散劑、稀釋劑等。可根據(jù)已知技術(shù)在藥物載體中配制本發(fā)明的納米顆粒以供給藥。參見(jiàn)例如《雷明頓藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐》，第21版(2005) ,Lffff公司，費(fèi)城，賓夕法尼亞州。在制備本發(fā)明的藥物制劑中，化合物(包括其生理學(xué)上可接受的鹽)通常與尤其是可接受的載體混合。所述載體可以是固體或液體或二者兼具，優(yōu)選地將載體與化合物配制成單位劑量制劑(例如片劑)，其可以含有0. 01或0. 5重量％到95重量％或99重量％的化合物?？蓪⒁环N或更多種化合物摻入本發(fā)明的制劑，其可通過(guò)藥學(xué)上熟知的技術(shù)來(lái)制備。本發(fā)明的另一方面是體內(nèi)治療對(duì)象的方法，包括給予對(duì)象在藥學(xué)上可接受的載體中包含本發(fā)明的納米顆粒的藥物組合物，其中以治療有效量給予所述藥物組合物。本發(fā)明的組合物給予有此需要的人類對(duì)象或動(dòng)物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的用于給予此類組合物的任何方式進(jìn)行。本發(fā)明的制劑包括適合于以下給藥方式的那些口服、直腸、局部、口腔含化(例如，舌下)、陰道、胃腸外(例如，皮下、肌肉內(nèi)(包括骨骼肌、心肌、隔膜肌和平滑肌)、真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi))、局部(即，皮膚和粘膜表面，包括氣道表面)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、內(nèi)臟內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、經(jīng)皮的、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)和吸入給藥，通過(guò)門靜脈內(nèi)遞送(intraportal delivery)給藥至肝臟以及直接器官注射(例如，注射入肝臟、注射入大腦以遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)、注射入胰臟、注射入腫瘤或圍繞腫瘤的組織)。在任何給出的情況中，最合適的途徑取決于所治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度以及所用具體化合物的性質(zhì)。對(duì)于注射，載體通常是液體，例如無(wú)菌無(wú)熱原水、無(wú)熱原磷酸鹽緩沖鹽水溶液、抑菌水或Cremophor EL[R](新澤西州帕斯帕尼的巴斯夫公司(BASF, Parsippany, N.J.))。對(duì)于其它給藥方法，載體可以是固體或液體。對(duì)于口服給藥，可以固體劑型給予組合物，例如膠囊、片劑和散劑，或以液體劑型給予，例如酏劑、糖漿劑和混懸劑?？蓪⒔M合物與無(wú)活性成分和粉末化的載體，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、淀粉、纖維素或纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸、糖精鈉、滑石粉、碳酸鎂等一起包封在明膠膠囊中?？杉尤胍蕴峁┧桀伾⑽兜?、穩(wěn)定性、緩沖能力、分散性或其它已知所需特征的附加的無(wú)活性成分的例子是氧化鐵紅、硅膠、月桂基硫酸鈉、二氧化鈦、可食用白色墨水(edible white ink)等。可使用類似的稀釋劑制備壓縮片劑。片劑和膠囊均可制成緩釋產(chǎn)品以便在數(shù)小時(shí)期間持續(xù)釋放藥物。壓縮片劑可以是糖包衣或薄膜包衣以遮蔽任何不愉快的味道并保護(hù)片劑以隔離大氣，或是腸包衣以便在胃腸道中選擇性崩解。口服的液體劑型可含有著色劑和調(diào)味劑以增加患者接受度。適合口腔含化(舌下)給藥的制劑包括在調(diào)味基料(base)中包含組合物的錠劑，所述調(diào)味基料通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠；和在惰性基料中包含組合物的軟錠劑，所述惰性基料是例如明膠和固有或蔗糖和阿拉伯膠。 適合胃腸外給藥的本發(fā)明制劑包括組合物的無(wú)菌水性和非水性注射溶液，該制品優(yōu)選與預(yù)定的接受者的血液是等滲的。這些制品可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得制劑與預(yù)定的接受者的血液等滲的溶質(zhì)。水性和非水性無(wú)菌混懸劑可包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可提供于單位劑量或多劑量容器中，例如密封安瓿和管形瓶，可儲(chǔ)存在冷凍干燥(凍干)條件下，只需在使用前直接加入無(wú)菌液體載體例如鹽水或注射用水?？蓮纳鲜鲱愋偷臒o(wú)菌散劑、顆粒和片劑制備臨時(shí)的注射溶液和混懸液。例如，本發(fā)明一個(gè)方面提供包含本發(fā)明的納米顆粒的可注射、穩(wěn)定無(wú)菌組合物，該組合物為處于密封容器中的單位劑型。組合物以凍干物(Iyophilizate)的形式提供,所述凍干物能用合適的藥學(xué)上可接受的載體重建以形成適合將其注射入對(duì)象的液體組合物。當(dāng)所述組合物基本上是水不溶性的時(shí)，可以足夠的量采用足夠量的藥學(xué)上可接受的乳化劑以便在水性載體中乳化該組合物。一種此類有用的乳化劑是磷脂酰膽堿。適合直腸給藥的制劑優(yōu)選地作為單位劑量栓劑來(lái)提供。可將組合物與一種或更多種常規(guī)固體載體(例如可可脂混合)、然后使得到的混合物成形來(lái)制備這些栓劑。適合局部施用于皮膚的制劑優(yōu)選采取軟膏、乳膏、洗液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油的形式?？衫玫妮d體包括石油膏、羊毛脂、聚乙二醇、醇類、經(jīng)皮增強(qiáng)劑和它們中兩種或更多種的組合。適合經(jīng)皮給藥的制劑可以作為適于與接受者的表皮保持長(zhǎng)期密切接觸的離散的貼劑來(lái)提供。適合透皮給藥的制劑還可通過(guò)離子電滲療法來(lái)遞送(參見(jiàn)，例如Tyle，Pharm. Res. 3:318 (1986))，且通常采取任選地含緩沖劑的組合物的水溶液的形式。合適的制劑包含檸檬酸鹽或bis/tris緩沖劑(pH 6)或乙醇/水?；蛘?，可將化合物配制成用于通過(guò)任何合適的方式鼻部給藥或以其它方式給予對(duì)象的肺，例如通過(guò)包含納米顆粒的可呼吸顆粒的氣溶膠混懸液來(lái)給藥，該氣溶膠混懸液被對(duì)象吸入?？珊粑w?？梢允且后w或固體。術(shù)語(yǔ)“氣溶膠”包括能吸入支氣管或鼻通道的任何運(yùn)載氣體的懸浮相。具體地，氣溶膠包括運(yùn)載氣體的液滴混懸液，其可在計(jì)量劑量的吸入器或霧化器或噴霧器中產(chǎn)生。氣溶膠還包括懸浮在空氣或其它載氣中的干粉料組合物，例如，其可通過(guò)可從吸入器裝置吹入來(lái)遞送。參見(jiàn)，Ganderton和Jones,《向呼吸道進(jìn)行藥物遞送》Wrug Deli very to the Respiratory Tract), Ellis Horwood (1987)；Gonda (1990) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313 ;和Raeburn 等人，J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 27:143 (1992)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方式產(chǎn)生包含納米顆粒的液體顆粒的氣溶膠，例如壓力驅(qū)動(dòng)的氣溶膠霧化器或超聲波霧化器。參見(jiàn)例如美國(guó)專利第4，501，729號(hào)?？赏ㄟ^(guò)藥學(xué)領(lǐng)域已知的技術(shù)，利用任何固體顆粒藥物氣溶膠發(fā)生器來(lái)類似地產(chǎn)生包含納米顆粒的固體顆粒的氣溶膠。或者，可局部給予(例如，直接給予到腫瘤內(nèi)和/或腫瘤附近)本發(fā)明的納米顆粒而非全身性給予，例如以貯存庫(kù)(depot)或緩釋制劑的形式?？扇芜x地與其它治療劑和/或療法組合遞送本發(fā)明的納米顆粒。額外的治療劑和/或療法可以在本發(fā)明納米顆粒之前、之后和/或同步遞送。如本文所用的，單詞“同步”表示時(shí)間上足夠接近，從而產(chǎn)生組合效應(yīng)(即，同步可以是同時(shí)，或者可以是在彼此前后的短時(shí)間內(nèi)發(fā)生的兩個(gè)或更多個(gè)事件)。在一個(gè)實(shí)施方式中，可與以下試劑組合給予本發(fā)明的納米顆?？拱┰噭?例如，本文所述的化療藥物或試劑)和/或抗血管生成試劑(其非限制性的例子包括VEGF的抗體(例如，貝伐單抗(AVASTIN)、蘭尼單抗(LUCENTIS))和血管生成的其它促進(jìn)劑(例如，bFGF、促血管生成素-I))、a-v/0-3血管整聯(lián)蛋白的抗體(例如， VITAXIN)、血管他丁、內(nèi)皮他丁、達(dá)肝素(dalt印arin)、ABT-510、CNGRC多肽TNFa偶聯(lián)物、環(huán)磷酰胺、康普瑞汀A4磷酸酯、二甲基咕噸酮乙酸(dimethylxanthenone acetic acid)、多西他賽、來(lái)那度胺、恩扎啕林、紫杉醇、紫杉醇白蛋白穩(wěn)定的納米顆粒制劑(Abraxane)、大豆異黃酮(三羥異黃酮)、檸檬酸他莫昔芬、沙利度胺、ADH-I (EXHERIN)、AG-013736、AMG-706、AZD2171、甲苯磺酸索拉菲尼(sorafenib tosylate)、BMS-582664、CHIR-265、帕唑帕尼(pazopanib)、PI-88、伐他拉尼、依維莫司、蘇拉明、蘋果酸舒尼替尼(sunitinibmalate)、XL184、ZD6474、ATN-161、西侖吉肽和塞來(lái)考昔。此外，如本領(lǐng)域已知的，本發(fā)明的對(duì)象可接受與遞送納米顆粒組合的輻射治療和/或外科治療，還可接受化療藥物、細(xì)胞因子、激素和/或抗-血管生成試劑。在具體的實(shí)施方式中，將治療有效量的納米顆粒給予對(duì)象，該術(shù)語(yǔ)如本文限定的。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法決定藥學(xué)活性化合物的劑量，參見(jiàn)例如《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences,馬克出版公司(Maack Publishing Co.),伊斯頓，賓夕法尼亞州)。任何特定納米顆粒組合物的治療有效劑量在一定程度上視具體的組合物和對(duì)象而有所不同，取決于對(duì)象的病癥、特定納米顆粒的組成和/或遞送途徑和/或頻率。為給予/遞送包含核酸的納米顆粒，可采用為約IO9到約IO12個(gè)納米顆粒/cm2 (例如，Iovcm2UO1Vcm2UO1Vcm2, IO1Vcm2納米顆粒)的劑量范圍。通過(guò)分光光度法分析或通過(guò)本領(lǐng)域已知的用于定量測(cè)定顆粒的任何其它方法來(lái)確定給定體積的載體或運(yùn)載體(例如，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS);水凝膠等)中的納米顆粒的數(shù)量。為給予/遞送包含治療藥物的納米顆粒，劑量范圍可為約5 mg/m2到約200 mg/m2的納米顆粒，或更具體地，約10 mg/m2到約100 mg/m2的納米顆粒(例如，5 mg/m2、6 mg/m2、7 mg/m2、8 mg/m2、9 mg/m2、10 mg/m2、11 mg/m2、12 mg/m2、13 mg/m2、14 mg/m2、15 mg/m2、16 mg/m2、17 mg/m2、18 mg/m2、5 mg/m2、19 mg/m2、20 mg/m2、25 mg/m2、30 mg/m2、35 mg/m2、40 mg/m2、45 mg/m2、50 mg/m2、55 mg/m2、60 mg/m2、65 mg/m2、70 mg/m2、75 mg/m2、80 mg/m2、85 mg/m2、90 mg/m2、95 mg/m2、100 mg/m2> 125 mg/m2> 150 mg/m2> 175 mg/m2、200 mg/m2 的納米顆粒)，這取決于所用的藥物并可通過(guò)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定。用于給予/遞送納米顆粒的示范性劑量范圍(使用mg/kg計(jì))包括約2 mg/kg到約20 mg/kg的納米顆粒，以及約5 mg/kg到約10 mg/kg的納米顆粒的范圍(例如,2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg、18 mg/kg、19 mg/kg、20 mg/kg的納米顆粒)。為給予/遞送本發(fā)明的p53嵌合體(例如，p53/p730D),示范性的劑量范圍可以是約 1.0 mg DNA/kg 到約 10. 0 mg DNA/kg (例如，I. O、I. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. O、
5.5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、9. 5 或 10. 0 mg DNA/kg)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，在各種時(shí)間間隔中可采用(例如，每小時(shí)、每天、每周、每月、每年等等)多于一次給藥(例如，兩次、三次、四次或更多次給藥)以實(shí)現(xiàn)療效和/或用于診斷目的。因此，在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供利用本發(fā)明納米顆粒的各種方法。具體地，本文提供將納米顆粒遞送至細(xì)胞的方法，包括在一定條件下使所述細(xì)胞與本發(fā)明納米顆粒接觸，借此，納米顆粒結(jié)合到細(xì)胞表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并被細(xì)胞內(nèi)在化。細(xì)胞可以是在體內(nèi)(即，在對(duì)象內(nèi)的細(xì)胞)，或者細(xì)胞可以在體外或離體。此外，本發(fā)明的細(xì)胞可以是癌細(xì)胞、癌前期細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。 本文還提供將活性劑遞送至有此需要的對(duì)象中的腫瘤細(xì)胞的方法，包括將本發(fā)明的納米顆粒遞送至所述對(duì)象，借此，所述納米顆粒結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并被該腫瘤細(xì)胞內(nèi)在化，從而將活性劑遞送至腫瘤細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供減小有此需要的對(duì)象中腫瘤的大小的方法，包括將有效量的本發(fā)明的納米顆粒遞送至所述對(duì)象，從而減小所述對(duì)象中腫瘤的大小。本文中還提供在有此需要的對(duì)象中誘導(dǎo)腫瘤消退的方法，包括將有效量的本發(fā)明的納米顆粒遞送至所述對(duì)象，從而誘導(dǎo)所述對(duì)象中的腫瘤消退。腫瘤消退可例如在非實(shí)體瘤癌癥的癌癥(例如白血病)和本領(lǐng)域熟知的其它“液體癌癥”中測(cè)定。本發(fā)明還提供治療對(duì)象(例如，有此需要的對(duì)象)中癌癥的方法，包括將有效量的本發(fā)明的納米顆粒遞送至所述對(duì)象，從而治療所述對(duì)象中的癌癥。本發(fā)明還提供治療對(duì)象(例如，有此需要的對(duì)象)中過(guò)度增生性疾病(例如，其中過(guò)度增生性細(xì)胞在細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的方法，包括將有效量的本發(fā)明的納米顆粒遞送至所述對(duì)象，從而治療所述對(duì)象中的過(guò)度增生性疾病。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“癌癥”指細(xì)胞的任何良性或惡性異常生長(zhǎng)。本發(fā)明的癌癥可以是原發(fā)性癌癥和/或轉(zhuǎn)移性癌癥。例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、惡性黑色素瘤、卵巢癌、腦癌(brain cancer)、原發(fā)性腦癌、頭脖癌(brain-neck cancer)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、頭或頸癌、乳粟、卵巢癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、維爾姆斯氏瘤、宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、泌尿生殖癌、甲狀腺癌、食道癌、骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤、腎上腺癌、腎細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌、惡性胰胰島素瘤、惡性類癌瘤、惡性合胞體瘤、蕈樣肉芽腫病、惡性高鈣血癥、宮頸增生、白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、毛細(xì)胞白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、卡波西肉瘤、真性紅細(xì)胞增多、原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocytosis)、霍奇金病、非-霍奇金淋巴瘤、軟組織肉瘤、成骨肉瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。本文還提供本領(lǐng)域已知的與突變型P53表型相關(guān)的任何癌癥。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”包括其中可實(shí)施本發(fā)明方法的任何對(duì)象?？砂凑毡景l(fā)明的方法向其遞送本發(fā)明的納米顆粒的對(duì)象包括出于醫(yī)學(xué)目的(例如，治療和/或診斷)的人對(duì)象和用于獸醫(yī)學(xué)和藥物篩選及開(kāi)發(fā)目的的動(dòng)物對(duì)象。在一些實(shí)施方式中，所述對(duì)象可以是禽類對(duì)象或哺乳動(dòng)物對(duì)象(例如，狗、貓、馬、牛、綿羊、山羊、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、大鼠、小鼠、兔形動(dòng)物、兔子、豚鼠、倉(cāng)鼠等)，在具體的實(shí)施方式中，所述對(duì)象是人對(duì)象(包括男性和女性對(duì)象，還包括新生兒、嬰兒、少年、青少年、成人和老年人，還包括懷孕對(duì)象)。在其它實(shí)施方式中，所述對(duì)象是癌癥、腫瘤生長(zhǎng)和/或其它過(guò)度增生性疾病的動(dòng)物模型?！坝写诵枰钡膶?duì)象包括但不限于診斷有癌癥或其它增生性疾病的對(duì)象，懷疑有癌癥的對(duì)象、具有腫瘤的對(duì)象、懷疑有腫瘤的對(duì)象、患癌癥或其它增生性疾病風(fēng)險(xiǎn)升高的對(duì) 象、可能患癌癥的對(duì)象、可能具有腫瘤的對(duì)象等等。因此，此類對(duì)象是出于治療和/或診斷的目的而需要和/或會(huì)受益于和/或希望對(duì)其給予或遞送本發(fā)明的納米顆粒的對(duì)象。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”或“有效量”指賦予受某種狀況(例如，失調(diào)、疾病、綜合征、病癥、損傷、創(chuàng)傷性和/或外科性傷口)折磨的對(duì)象調(diào)控作用的本發(fā)明的納米顆粒和/或包含本發(fā)明的納米顆粒的組合物的量，所述調(diào)控作用可以是例如有益作用，包括對(duì)象的狀況(例如，一種或多種癥狀)的改善、該狀況的進(jìn)展的延遲或減慢、該狀況的發(fā)作的防止或延遲、和/或某疾病或病癥的臨床參數(shù)、狀態(tài)或分類的改變等等，如本領(lǐng)域熟知的。例如，治療有效量或有效量可以指將對(duì)象中某狀況改善(例如，治療癌癥和/或減小腫瘤大小和/或誘導(dǎo)腫瘤消退)至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%的本發(fā)明的納米顆粒或組合物的量?！爸委?Treat, treating, treatment) ”或“治愈”指賦予受某種狀況(例如，失調(diào)、疾病、綜合征、病癥、創(chuàng)傷性和/或外科性傷口等)折磨的對(duì)象調(diào)控作用的任何類型的作用，所述調(diào)控作用可以是例如有益作用。術(shù)語(yǔ)“治療(Treat，treating) ”、“治愈”或“…的治療”(或語(yǔ)法上等價(jià)的術(shù)語(yǔ))還表示對(duì)象狀況的嚴(yán)重程度降低或至少部分改善或轉(zhuǎn)好、和/或達(dá)到在至少一種臨床癥狀的一定程度的減輕、緩和/或降低、和/或狀況的進(jìn)展的延遲、和/或疾病或病癥的發(fā)作的延遲?！邦A(yù)防(prevent、preventing或prevention) ”表示避免或消除對(duì)象的病理性狀態(tài)和/或疾病狀況或狀態(tài)的發(fā)生和/或表現(xiàn)。在減小腫瘤大小的本發(fā)明的方法中，與未用本發(fā)明的納米顆粒和/或組合物治療的腫瘤大小相比，腫瘤大小可減小(例如，減小了 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%)。還可通過(guò)與未用本發(fā)明的納米顆粒和/或組合物治療的腫瘤生長(zhǎng)速度相比，監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)速度的降低或腫瘤消退的誘導(dǎo)(例如，生長(zhǎng)速度降低或誘導(dǎo)消退達(dá)到約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%)來(lái)測(cè)定治療的效力。可被測(cè)定測(cè)來(lái)確定療效的其它參數(shù)是在對(duì)本發(fā)明納米顆粒和/或組合物的治療的響應(yīng)中腫瘤細(xì)胞的凋亡和/或衰老的速度/程度。可通過(guò)各種方法將本發(fā)明的納米顆粒遞送至對(duì)象，所述方法包括但不限口服遞送、靜脈內(nèi)遞送、皮下遞送、注射、手術(shù)植入、遞送入體腔、局部施用和它們的任何組合。本發(fā)明還提供診斷對(duì)象中癌癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了診斷對(duì)象中癌癥的體外方法，包括a)使本發(fā)明納米顆粒與來(lái)自對(duì)象的細(xì)胞接觸；b)測(cè)定納米顆粒內(nèi)在化進(jìn)入對(duì)象的細(xì)胞中的速度和/或數(shù)量和/或選擇性；和c)比較納米顆粒內(nèi)在化進(jìn)入對(duì)象的細(xì)胞中的速度和/或數(shù)量和/或選擇性與該納米顆粒內(nèi)在化進(jìn)入對(duì)照對(duì)象的細(xì)胞和/或被診斷的對(duì)象的對(duì)照細(xì)胞中的速度和/或數(shù)量和/或選擇性，借此，與對(duì)照對(duì)象的細(xì)胞和/或測(cè)試對(duì)象的對(duì)照細(xì)胞相比，根據(jù)該納米顆粒進(jìn)入對(duì)象的細(xì)胞中的數(shù)量和/或內(nèi)在化速度和/或顯示的選擇性的增加來(lái)診斷該對(duì)象中的癌癥。測(cè)定本發(fā)明的納米顆粒內(nèi)在化進(jìn)入的細(xì)胞中的速度和/或數(shù)量和/或選擇性的方法如本文所列實(shí)施例所述，也是本領(lǐng)域熟知的。非限制性例子包括檢測(cè)標(biāo)記物(例如，GFP)和測(cè)定納米顆粒所攜核苷酸序列產(chǎn)生產(chǎn) 物(例如，P半乳糖苷酶)的表達(dá)。本文還提供診斷對(duì)象中癌癥的體內(nèi)方法，包括a)將本發(fā)明的納米顆粒遞送至對(duì)象，其中所述納米顆粒包含顯像劑；b)檢測(cè)該對(duì)象中顯像劑的信號(hào)；和c)比較該對(duì)象中來(lái)自顯像劑的信號(hào)與在對(duì)照對(duì)象或來(lái)自被診斷的對(duì)象的對(duì)照組織中來(lái)自同一顯像劑的信號(hào)，借此，與來(lái)自對(duì)照對(duì)象或?qū)φ战M織的信號(hào)相比，來(lái)自該對(duì)象的信號(hào)的改變(例如，在具體器官、細(xì)胞類型、位置中信號(hào)的累積，等等)診斷該對(duì)象中的癌癥。在所述顯像劑存在于對(duì)象中時(shí)檢測(cè)來(lái)自本發(fā)明顯像劑的信號(hào)的方法是本領(lǐng)域熟知的。還考慮，本發(fā)明的方法可用于監(jiān)測(cè)腫瘤動(dòng)態(tài)特性(例如，將本發(fā)明納米顆粒遞送至對(duì)象后，一定時(shí)間內(nèi)腫瘤大小隨的減小)和鑒定有效的治療。本發(fā)明的納米顆粒可設(shè)計(jì)成以同時(shí)賦予療效和為此類監(jiān)測(cè)方法提供可檢測(cè)信號(hào)。本發(fā)明的實(shí)施方式還包括試劑盒，其包含一種或更多種本文所述的納米顆粒和/或組合物和任選的用于使用和/或給藥的使用說(shuō)明書。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很好理解，本發(fā)明的試劑盒可包含一個(gè)或更多個(gè)容器和/或接受器以便容納試劑盒的試劑以及合適的試劑和使用該試劑盒的說(shuō)明，這是本領(lǐng)域熟知的。所述試劑盒的各組分可組合在同一容器中和/或在單獨(dú)的容器中提供。在其它方面，本發(fā)明提供p53的衍生物，其是包含p73 OD的p53嵌合體。本文還提供在藥學(xué)上可接受的載體中的包含P53嵌合體、基本上由所述嵌合體構(gòu)成或由所述嵌合體構(gòu)成的組合物，所述P53嵌合體含有p73 OD。包含p73寡聚結(jié)構(gòu)域(OD)的p53嵌合體(也稱為p53/p730D)是具有393個(gè)氨基酸的人P53蛋白，其中氨基酸318-364被p73(寡聚結(jié)構(gòu)域)的氨基酸346-390代替[28]。野生型p53 (例如，PubMed中的Gene ID 7157)、野生型p73 (例如，PubMed中的Gene ID7161)和嵌合體p53/p730D各自的氨基酸序列如下所示，其中被取代的序列以粗體字顯示。這些野生型和嵌合體的示意圖(在圖中描述為p53(73Paa346-390))示于圖12中，其中標(biāo)出了各結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易理解，可對(duì)P53嵌合體的氨基酸序列作出各種取代而不改變本發(fā)明的P53嵌合體的功能。此類變體氨基酸序列的產(chǎn)生和測(cè)試所得變體P53嵌合體的功能的試驗(yàn)是普通技術(shù)人員熟知的。因此，本文提供p53嵌合體序列的此類變體包括在本發(fā)明內(nèi)。
p73 (499個(gè)氨基酸；GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)CAA72219)。氨基酸346-390顯示為
粗體字。
權(quán)利要求
1.一種選自下組的納米顆粒 A)包含以下成分的納米顆粒 a)聚陽(yáng)離子/聚亞烷基二醇/葡萄糖偶聯(lián)物；和 b)活性劑； B)包含以下成分的納米顆粒 a)包含活性劑的核心；和 b)圍繞(a)所述核心的葡萄糖/聚亞烷基二醇偶聯(lián)物； C)包含以下成分的納米顆粒 a)包含聚陽(yáng)離子和活性劑的核心；和 b)圍繞(a)所述核心的葡萄糖/聚亞烷基二醇偶聯(lián)物； D)包含以下成分的納米顆粒 a)聚陽(yáng)離子/藻酸鹽/葡萄糖偶聯(lián)物；和 b)活性劑； E)包含以下成分的納米顆粒 a)包含活性劑的核心；和 b)圍繞(a)所述核心的葡萄糖/藻酸鹽偶聯(lián)物； F)包含以下成分的納米顆粒 a)包含聚陽(yáng)離子和活性劑的核心；和 b)圍繞(a)所述核心的葡萄糖/藻酸鹽偶聯(lián)物；和 G)以上(A)-(F)的任何組合。
2.如權(quán)利要求I所述的納米顆粒，其中，所述聚亞烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的納米顆粒，其中，所述聚陽(yáng)離子是聚乙烯亞胺(PEI)。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，其中，所述活性劑選自多核苷酸、寡核苷酸、干擾RNA、蛋白質(zhì)、肽、化療藥物、細(xì)胞毒劑、放射性核素、可檢測(cè)標(biāo)記物、顯像劑和它們的任何組合。
5.如權(quán)利要求4所述的納米顆粒，其中，所述多核苷酸是編碼包含p73OD的p53嵌合體的質(zhì)粒。
6.—種納米顆粒,其包含 a)包含PEI和編碼p53的多核苷酸的核心；和 b)圍繞(a)所述核心的葡萄糖/PEG偶聯(lián)物。
7.—種納米顆粒,其包含 a)包含PEI和編碼p53嵌合體的多核苷酸的核心，所述p53嵌合體包含p73OD ;和 b)圍繞(a)所述核心的葡萄糖/PEG偶聯(lián)物。
8.一種將納米顆粒遞送至細(xì)胞的方法，所述方法包括在一定條件下使所述細(xì)胞與權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的納米顆粒接觸，借此，所述納米顆粒結(jié)合到所述細(xì)胞表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并由所述細(xì)胞內(nèi)在化。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述細(xì)胞在體內(nèi)。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述細(xì)胞在體外。
11.一種將活性劑遞送至有需要的對(duì)象中的腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的納米顆粒遞送至所述對(duì)象，借此所述納米顆粒結(jié)合到所述腫瘤細(xì)胞表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并由所述腫瘤細(xì)胞內(nèi)在化，從而將所述活性劑遞送至所述腫瘤細(xì)胞。
12.—種減小有需要的對(duì)象中腫瘤大小的方法，所述方法包括將有效量的權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的納米顆粒遞送至所述對(duì)象，借此所述納米顆粒結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并被內(nèi)在化，從而減小所述對(duì)象中所述腫瘤的大小。
13.一種治療有需要的對(duì)象中癌癥的方法，所述方法包括將有效量的權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的納米顆粒遞送至所述對(duì)象，從而治療所述對(duì)象中的癌癥。
14.如權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的方法，還包括以下步驟給予所述對(duì)象化療劑、抗-血管生成劑、細(xì)胞因子、激素、放療、外科治療或它們的任何組合。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述還包括的步驟在將所述納米顆粒遞送至所述對(duì)象的之前、之后和/或同時(shí)進(jìn)行。
16.一種組合物，所述組合物在藥學(xué)上可接受的載體中包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的納米顆粒。
17.—種試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的納米顆粒或權(quán)利要求16所述的組合物。
18.—種診斷對(duì)象中癌癥的體外方法，所述方法包括 a)將權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的納米顆粒與來(lái)自所述對(duì)象的細(xì)胞接觸，其中，所述納米顆粒包含可檢測(cè)標(biāo)記物； b)測(cè)定所述納米顆粒內(nèi)在化進(jìn)入所述對(duì)象的細(xì)胞的速度和/或量和/或特異性；和 c)比較所述納米顆粒內(nèi)在化進(jìn)入所述對(duì)象的細(xì)胞的速度和/或量和/或特異性與所述納米顆粒內(nèi)在化進(jìn)入對(duì)照對(duì)象的細(xì)胞和/或來(lái)自被診斷對(duì)象的對(duì)照細(xì)胞的速度和/或量和/或特異性，與所述對(duì)照對(duì)象的細(xì)胞和/或所述對(duì)照細(xì)胞相比，根據(jù)所述納米顆粒內(nèi)在化進(jìn)入所述對(duì)象的細(xì)胞的量和/或速度和/或特異性的提高來(lái)診斷所述對(duì)象中的癌癥。
19.一種診斷對(duì)象中癌癥的體內(nèi)方法，所述方法包括 a)將權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的納米顆粒遞送至所述對(duì)象，其中所述納米顆粒包含顯像劑； b)檢測(cè)所述對(duì)象中來(lái)自所述顯像劑的信號(hào)；和 c)比較所述對(duì)象中來(lái)自所述顯像劑的信號(hào)與對(duì)照對(duì)象中和/或被診斷對(duì)象的對(duì)照組織/細(xì)胞中來(lái)自同一顯像劑的信號(hào)，與來(lái)自所述對(duì)照對(duì)象和/或?qū)φ战M織/細(xì)胞的信號(hào)相t匕，根據(jù)來(lái)自所述對(duì)象的信號(hào)的改變來(lái)診斷所述對(duì)象中的癌癥。
20.一種組合物,所述組合物在藥學(xué)上可接受的載體中包含p53嵌合體,所述p53嵌合體含有P73寡聚結(jié)構(gòu)域(OD)。
21.一種將包含p73 OD的p53嵌合體遞送至細(xì)胞的方法，所述方法包括在一定條件下使所述細(xì)胞與所述p53嵌合體接觸,借此,所述p53嵌合體被所述細(xì)胞內(nèi)在化。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述細(xì)胞在體內(nèi)。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述細(xì)胞在體外。
24.一種減小有需要的對(duì)象中腫瘤的大小的方法，所述方法包括將有效量的包含p73OD的p53嵌合體引入所述對(duì)象的腫瘤細(xì)胞，從而減小所述對(duì)象中所述腫瘤的大小。
25.一種治療有需要的對(duì)象中癌癥的方法，所述方法包括將有效量的包含p73 OD的P53嵌合體遞送至所述對(duì)象，從而治療所述對(duì)象中的癌癥。
26.一種誘導(dǎo)有需要的對(duì)象中腫瘤消退的方法，所述方法包括將有效量的包含p73 OD的P53嵌合體遞送至所述對(duì)象，從而誘導(dǎo)所述對(duì)象中的腫瘤消退。
27.如權(quán)利要求21-26中任一項(xiàng)所述的方法，還包括以下步驟給予所述對(duì)象蛋白激酶抑制劑、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑、甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、和它們的任何組合。
28.如權(quán)利要求21-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，還包括以下步驟給予所述對(duì)象化療劑、抗-血管生成劑、細(xì)胞因子、激素、放療、外科治療或它們的任何組合。
29.如權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，所述還包括的步驟在將所述p53嵌合體遞送至所述對(duì)象的之前、之后和/或同時(shí)進(jìn)行。
30.一種試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求20所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供方法和組合物以便將攜帶活性劑的納米顆粒選擇性地并直接地遞送至腫瘤細(xì)胞。所述活性劑被腫瘤細(xì)胞內(nèi)在化，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用以供治療應(yīng)用和/或沉積可檢測(cè)標(biāo)記物以供診斷應(yīng)用。本發(fā)明還提供避免突變型p53的負(fù)顯性活性的p53嵌合體作為治療癌癥或減小腫瘤尺寸中的治療劑。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102811746SQ201180014585
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月18日
發(fā)明者袁志民, 徐錫鎮(zhèn) 申請(qǐng)人:得克薩斯系統(tǒng)大學(xué)評(píng)議會(huì)