專利名稱：一種受體介導(dǎo)量子點(diǎn)示蹤靶向給藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥品領(lǐng)域，具體涉及一種受體介導(dǎo)量子點(diǎn)示蹤靶向給藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康和生命最主要的疾病之一。目前對(duì)惡性腫瘤多采用手術(shù)與化療相結(jié)合的綜合治療為主，其中化療是必須使用的治療手段，因其藥力強(qiáng)大、可快速殺傷或殺死腫瘤細(xì)胞，在臨床治療中發(fā)揮著重要作用。但化療藥物普遍存在細(xì)胞選擇性差、毒副作用大、不良反應(yīng)嚴(yán)重、易產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)和多藥耐藥(Multi-drugresistance，MDR)，致使化療效果不理想。因此，如何提高藥物的組織或細(xì)胞選擇性，將藥物 準(zhǔn)確輸送到腫瘤組織或細(xì)胞并在靶部位定向釋放發(fā)揮治療作用，已成為腫瘤治療亟待解決的關(guān)鍵問題之一。隨著醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)新的研究成果不斷涌現(xiàn)，藥物制劑理論與實(shí)踐獲得了迅速發(fā)展，為提高腫瘤的治療效果、降低毒副作用、逆轉(zhuǎn)MDR等發(fā)揮了重要作用。尤其是“靶向給藥”理論與實(shí)踐研究的成果，將化療藥物選擇性導(dǎo)向特定腫瘤細(xì)胞、解決化療藥物制劑普遍存在的選擇性差等共性問題提供了新的思路，化療藥物的靶向給藥有望成為治療惡性腫瘤的新途徑。革巴向給藥系統(tǒng)(Targeting Drug Delivery System, TDDS)能將藥物準(zhǔn)確送到病灶部位，提高病灶部位的藥物濃度，從而提高藥物治療效果，避免或減輕藥物毒副作用。靶向性分為主動(dòng)靶向性和被動(dòng)靶向性。主動(dòng)靶向性是指該系統(tǒng)具有主動(dòng)識(shí)別靶細(xì)胞并進(jìn)入靶細(xì)胞的能力，如受體靶向給藥系統(tǒng)等。被動(dòng)靶向能力與系統(tǒng)的尺寸大小有關(guān)，100納米以下的顆粒易透過腫瘤組織的血管，使藥物或基因等效應(yīng)分子濃集于腫瘤細(xì)胞周圍并產(chǎn)生作用。0)44是一種跨膜受體糖蛋白，能與透明質(zhì)酸(Hyaluronan acid, HA)等多種配體結(jié)合，最近的研究表明，HA與其特異性受體CD44之間的相互作用可以作為HA靶向治療惡性瘤的研究基礎(chǔ)，CD44在多種惡性瘤細(xì)胞表面都有過表達(dá)，所以利用HA作為載體，將小分子藥物搭載其上，可以在增強(qiáng)藥物選擇性的同時(shí)降低藥物對(duì)于正常細(xì)胞的殺傷作用，并且，與HA連接后藥物的溶解性和穩(wěn)定性會(huì)大大提高。因此利用HA作為藥物的靶向基團(tuán)連接到藥物或其載體表面，可以通過受體介導(dǎo)作用將藥物導(dǎo)入細(xì)胞中殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞，達(dá)到靶向治療的目的。但HA易溶于水，易被吸收，在組織中停留時(shí)間短，降解速度快，這就限制了他在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。聚乙二醇(PEG)為低毒性線性分子，無抗原性，具有水溶性、免疫學(xué)惰性，其生物相容性已得到美國(guó)食品和藥物管理局FDA認(rèn)證。PEG末端的羥基是化學(xué)反應(yīng)的功能基團(tuán)，但化學(xué)性質(zhì)不活潑，須在較激烈的條件下才能與其它基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，為使HA能在較溫和條件下以較高速率與PEG鍵合，只有通過特定的活化劑與PEG反應(yīng)使之活化，用活化的PEG羧基與HA乙?；幚淼陌被l(fā)生反應(yīng)形成酯鏈或醚鏈連接的二元共軛物。在作為藥物傳輸用途時(shí)，酯鏈型連接在體內(nèi)適宜條件下，能被逐漸水解打開。透明質(zhì)酸(Hyaluronan acid, HA)是由重復(fù)二糖結(jié)構(gòu)單元0-D-葡萄糖醒酸和N-乙酰氨基葡萄糖相互交替連接構(gòu)成的線性黏多糖，具有低免疫原性、生物可降解性，是一種理想的生物醫(yī)用高分子材料。有文獻(xiàn)報(bào)道，以HA作為藥物載體的前藥具有良好的主動(dòng)及被動(dòng)靶向性，將抗腫瘤藥物與HA偶合能提高藥物的溶解性、穩(wěn)定性、控釋性；并使藥物的毒性降低，達(dá)到靶向治療腫瘤的目的。CD44是細(xì)胞表面最重要的HA受體，其N端與HA非共價(jià)結(jié)合，結(jié)合部位可以延伸至HA的數(shù)個(gè)重復(fù)二糖單位，且其在惡性腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)，因而HA適合用作惡性腫瘤靶向給藥系統(tǒng)的主動(dòng)靶向因子。量子點(diǎn)(quantum dots, QDs,又稱為半導(dǎo)體納米晶)作為一種具有獨(dú)特光學(xué)和化學(xué)性質(zhì)的新型熒光探針，在細(xì)胞、活體的熒光成像以及生物活性物質(zhì)的定性、定量方面都有較好的應(yīng)用前景，與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光原料相比，具有不可比擬的優(yōu)點(diǎn)激發(fā)光譜寬，可用單一激發(fā)波長(zhǎng)同時(shí)激發(fā)不同顏色的量子點(diǎn)；發(fā)射光譜窄而對(duì)稱，可減少檢測(cè)中的光譜重疊，提高檢測(cè)的靈敏度；熒光發(fā)射波長(zhǎng)可由量子點(diǎn)大小和組成元素調(diào)控；發(fā)光強(qiáng)度比傳統(tǒng)熒光物質(zhì)強(qiáng)10倍以上，熒光壽命強(qiáng)。雖然組成量子點(diǎn)的化學(xué)成分Cd和Se等元素對(duì) 細(xì)胞和組織是有毒害的，但經(jīng)親水性和功能化處理的量子點(diǎn)則表現(xiàn)出良好的生物相容性(biocompatibility)。對(duì)標(biāo)記了量子點(diǎn)的培養(yǎng)細(xì)胞和注射了量子點(diǎn)的活體動(dòng)物的長(zhǎng)期跟蹤觀察表明，量子點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動(dòng)物體未造成生理損害并能夠保持量子點(diǎn)理化性質(zhì)。迄今為止，已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者將不同材料的QDs與生物分子偶聯(lián)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機(jī)熒光染料分子，廣泛用于生物活性分子檢測(cè)，腫瘤細(xì)胞檢測(cè)與腫瘤影像以及生物活體成像等方面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種受體介導(dǎo)量子點(diǎn)示蹤靶向給藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用。該給藥系統(tǒng)用于淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、精原細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤和甲狀腺癌化療具有明顯的優(yōu)勢(shì)，特別在殺傷高表達(dá)CD44受體的乳腺癌，卵巢癌，宮頸癌腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常組織的毒性較低，且該靶向給藥系統(tǒng)在活體內(nèi)實(shí)時(shí)閱讀藥物與細(xì)胞以及細(xì)胞的多生物分子相互作用的信息，可研究藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)過程及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)藥物多靶點(diǎn)過程。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案一種受體介導(dǎo)量子點(diǎn)示蹤美法侖靶向給藥系統(tǒng)，它是聚乙二醇-透明質(zhì)酸-量子點(diǎn)-美法侖復(fù)合物，簡(jiǎn)寫為PEG-HA-QDs-MEL，由PEG與HA酰胺脫水縮合連接，并且在HA接入水溶性CdTe/CdS量子點(diǎn)，最后與藥物MEL酰胺脫水縮合制備得到，其中，PEG-HA-QDs-MEL的組分含量按重量份數(shù)計(jì)如下，每一重量份為I毫克美法侖(MEL)30-100 份，聚乙二醇(PEG) 600-1500 份，透明質(zhì)酸(HA) 200-500 份，CdTe/CdS量子點(diǎn)5-50份，N，N’ 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)20_50份，4- 二甲氨基吡啶(DMAP)1-10份，丁二酸酐100-500份，N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS) 20-50份，1_ (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC) 20-50份，亞硫酸氫鈉10-100份，苯甲醇(BA) 50-200份。本發(fā)明的受體介導(dǎo)量子點(diǎn)示蹤美法侖靶向給藥系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟，下述每一重量份為I毫克I)端羧基聚乙二醇的合成及純化將600-1500重量份聚乙二醇(PEG)置于帶有冷凝管、攪拌器和溫度計(jì)的三口燒瓶中，加入氯仿溶解，待溶解完畢后加入100-500重量份丁二酸酐，加熱溶解，同時(shí)加入干燥的吡啶，攪拌下回流反應(yīng)2-10小時(shí)，停止反應(yīng)后冷卻至室溫，反應(yīng)所得混合物減壓蒸發(fā)至呈粘稠狀，再加入無水乙醚沉淀得到白色產(chǎn)物，抽濾，再用二氯甲烷溶解產(chǎn)物，濾去不溶物，加入無水乙醚沉淀得到白色產(chǎn)物，重復(fù)2次以上，抽濾后真空干燥至恒重，得到純化的端羧
基聚乙二醇；2) PEG-HA 的制備將步驟I)得到的端羧基 聚乙二醇溶解于200 - 500重量份透明質(zhì)酸的水解液中，倒入裝有分餾柱和攪拌器的三口燒瓶，加入催化劑I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺10-50重量份和4-二甲氨基吡啶0. 5-5重量份，在60-140°C下反應(yīng)2-10小時(shí)后，收集100°C餾分，反應(yīng)結(jié)束后冷卻；加入無水乙醇至無沉淀生成，過濾收集沉淀，洗滌沉淀，干燥沉淀物即得 PEG-HA ；3)水溶性CdTe/CdS量子點(diǎn)的制備將5-20重量份碲粉和2-10重量份硼氫化鈉加入水中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，常溫下磁力攪拌2-5h，得到暗紅色含Te的NaHTe前驅(qū)液；稱取2_10重量份CdCl2溶于蒸餾水中，加入2-10重量份巰基丙酸，用濃度lm0l/L-2m0l/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值到8_10 ；把溶液加入三頸瓶中，把新制備的NaHTe加入到氮?dú)獗Ｗo(hù)下的CdCl2溶液中，溶液的顏色變成透明橙黃色，室溫?cái)嚢?，然后轉(zhuǎn)入到90°C的恒溫水浴中反應(yīng)0.5-2h后，以0. lml/min速度滴入濃度I U mol/L-20 u mol/L Na2S的溶液lml_15ml，得到CdTe/CdS核殼量子點(diǎn)；全部反應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下完成，反應(yīng)終止后，加入乙醇，在5000r/min下離心分離10_15min，棄去上層清液，加水使沉淀重新懸浮，重復(fù)此過程2次，得到的固體在室溫下自然晾干，研磨得到CdTe/CdS量子點(diǎn)固體粉末，簡(jiǎn)寫為QDs ；4) PEG-HA-QDs 的制備稱取5-50重量份QDs溶于水中，室溫避光磁力攪拌至QDs全部溶解，加入5_50重量份N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)與5-50重量份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)。在室溫避光磁力攪拌Ih后將步驟2)制備的0. I g/ml-I g/ml的PEG-HA的水溶液20ml，加入上述混合液中，室溫避光磁力攪拌12h，所得產(chǎn)物混合液在pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液以透析袋透析，冷凍干燥得PEG-HA-QDs復(fù)合物；5)美法倫芐酯(BA-MEL)的制備在裝有溫度計(jì)、分水器的三頸燒瓶中加入美法侖30-100重量份，亞硫酸氫鈉10-100重量份和過量苯甲醇在磁力攪拌下進(jìn)行反應(yīng)，將反應(yīng)后所得的混合液依次用蒸餾水、飽和碳酸氫鈉和蒸餾水洗滌，得到油狀物，將洗滌后的油狀物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)，除去未反應(yīng)苯甲醇，設(shè)定旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為30-60°C，蒸發(fā)直到無餾出物為止，蒸發(fā)得到的物質(zhì)用乙醇-乙醚進(jìn)行重結(jié)晶，其乙醇與乙醚體積比為1:2，得到乳白色的固體BA-MEL ；6) PEG-HA-QDs-MEL 的制備將步驟4)得到的100-500重量份PEG-HA-QDs復(fù)合物、10-50重量份N，N’ 二環(huán)己基碳二亞胺和0. 5-5重量份4- 二甲氨基吡啶溶于無水二甲基亞砜中，室溫避光磁力攪拌至PEG-HA-QDs全部溶解，加入步驟5)所得的pH4. 7的10-50重量份BA-MEL水溶液，室溫避光磁力攪拌12h,將其在叔丁醇中通過碳載鈕0. 5wt%一15wt%催化劑氫化脫除苯甲醇,然后用pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液透析24-72h，再用雙蒸水透析24_72h，冷凍干燥得反應(yīng)物粉末，即PEG-HA-QDs-MEL 產(chǎn)物。本發(fā)明的的制備工藝如下
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PEMA-Qft-MEL本靶向給藥系統(tǒng)，應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明的有益效果在于I)本系統(tǒng)有優(yōu)良的主動(dòng)靶向性和較好的逆轉(zhuǎn)耐藥作用CD44是一種高效內(nèi)吞HA受體，該系統(tǒng)中的HA可特異識(shí)別受體并與之結(jié)合，使藥物高效主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞；同時(shí)通過控制粒子的粒徑，可實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的被動(dòng)靶向性，有效提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，具有較好的逆轉(zhuǎn)耐藥作用。2)本系統(tǒng)有優(yōu)良的血液穩(wěn)定性。HA在體內(nèi)主要被透明質(zhì)酸酶降解，透明質(zhì)酸酶為一種￠-1-4內(nèi)切葡糖胺酸酶，其活性受環(huán)境酸堿度影響較大，人血清、尿、肝臟及腫瘤組織中的透明質(zhì)酸酶為酸性型透明質(zhì)酸酶，其最適PH值為3. 5-4. O。在血液中，較高的pH值(7. 35-7. 45)使得酸性型透明質(zhì)酸酶失活，HA不被降解，MEL、PEG與HA相連接的化學(xué)鍵均穩(wěn)定，可保障給藥系統(tǒng)在血液循環(huán)過程中藥物不被釋放。3)有良好的隱形性、釋藥性和控釋性能。該系統(tǒng)偶聯(lián)了 PEG可避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬而具有較好的隱形性。酸性型透明質(zhì)酸酶僅在腫瘤組織中或其周圍有活性。該系統(tǒng)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，在透明質(zhì)酸酶作用下，HA被降解，同時(shí)，較低的PH值也使PEG-HA酯鍵被水解斷開，引發(fā)藥物釋放。4)有良好的體內(nèi)示蹤功能。量子點(diǎn)具有腫瘤成像功能,能動(dòng)態(tài)觀察藥物載體是否達(dá)到腫瘤細(xì)胞和發(fā)揮療效。該給藥系統(tǒng)有望解決氨基芳基氮芥類藥物制劑在治療腫瘤方面存在的細(xì)胞選擇性差、不良反應(yīng)嚴(yán)重、有效治療濃度低和耐藥等問題。5)本系統(tǒng)的廣泛適用性本發(fā)明的靶向給藥系統(tǒng)通過HA活性基團(tuán)連接含-NH2或-COOH反應(yīng)基團(tuán)的不同活性物質(zhì)，如抗腫瘤單抗、抗腫瘤化療藥和吸附基因等，從而進(jìn)一步擴(kuò)大其運(yùn)用范圍，具有廣泛適用性。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。下述實(shí)施例中每一重量份為I毫克。實(shí)施例II. PEG-HA-QDs-MEL 組分的制備( I)端羧基聚乙二醇的合成及純化將IOg (5mmol)PEG-1500置于250mL帶有冷凝管、攪拌器和溫度計(jì)的三口燒瓶中，加入IOOmL氯仿(CaH2存在下蒸出)溶解，待溶解完畢后加入2. 5g (25mmol) 丁二酸酐，加熱溶解，同時(shí)加入2mL干燥吡唆，攪拌下回流反應(yīng)6小時(shí)，停止反應(yīng)后冷卻至室溫，反應(yīng)所得混合物減壓蒸發(fā)至呈粘稠狀，殘余物加入大量無水乙醚，析出白色沉淀產(chǎn)物，抽濾得濾餅，濾餅用30mL 二氯甲烷溶解產(chǎn)物，濾去不溶物，再加入無水乙醚沉淀，析出白色沉淀產(chǎn)物，抽濾得濾餅，再用二氯甲烷溶解產(chǎn)物，重復(fù)上述操作3次，抽濾后真空干燥至恒重，得端羧基聚乙二醇(PEG-SA-NHS)，稱重；(2) PEG-HA 的制備取3. Og透明質(zhì)酸與15mL濃度20wt%的NaOH水溶液在常溫下機(jī)械攪拌反應(yīng)12小時(shí)，脫去乙?；?；溶液在蒸餾水中透析2天，冷凍干燥得到脫乙?；耐该髻|(zhì)酸凍干粉末；將步驟(I)得到的0. 500g端羧基聚乙二醇溶解于透明質(zhì)酸水解液中，倒入裝有分餾柱和攪拌器的IOOmL三口燒瓶中，加入EDC催化劑0. 250g、DMAPO. 020g, 100°C水浴下反應(yīng)6小時(shí)，收集100°C餾分，反應(yīng)結(jié)束，溶液呈棕色，冷卻，加入無水乙醇至無沉淀生成；過濾收集沉淀，洗滌，干燥即得PEG-HA ；(3)水溶性CdTe/CdS量子點(diǎn)的制備水溶性CdTe/CdS核殼型納米量子點(diǎn)的合成主要分為兩個(gè)步驟首先合成CdTe核納米溶膠；然后再在CdTe外包覆CdS殼層。將0. 1200g碲粉和0. 0700g硼氫化鈉加入5mL的水溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，常溫下磁力攪拌3h，得到暗紅色的含Te的前驅(qū)液。稱取CdCl2O. 040g,溶于15mL蒸餾水中，加入50 y L巰基丙酸，用濃度lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值到8-10 ;將溶液加入IOOmL三頸瓶中，通氮?dú)?0min后，把新制備的NaHTe加入到氮?dú)獗Ｗo(hù)下的CdCl2溶液中，溶液的顏色變成透明橙黃色，室溫?cái)嚢?0min，然后轉(zhuǎn)入到90°C的恒溫水浴中，反應(yīng)0. 5h后，以0. lmL/min的速度滴入5 u mol/L的Na2S溶液1ml，得到CdTe/CdS核殼量子點(diǎn)；全部反應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下完成，反應(yīng)終止后，加入IOmL的乙醇，在5000r/min下離心分離IOmin,棄去上層清液，加IOmL水使沉淀重新懸浮，重復(fù)此過程2次，得到的固體在室溫下自然晾干，并用坩堝研磨得到CdTe/CdS量子點(diǎn)(QDs)固體粉末；(4) PEG-HA-QDs 的制備稱取0. IOOg QDs溶于水中，室溫避光磁力攪拌至QDs全部溶解，加入0. 25g NHS與0. 15gEDC，在室溫避光磁力攪拌Ih后將步驟2)所制備的0. I g/ml的PEG-HA的水溶液20ml，室溫避光磁力攪拌12h，所得產(chǎn)物混合液在pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液以透析袋透析，冷凍干燥得PEG-HA-QDs復(fù)合物； (5) BA-MEL 的制備在裝有溫度計(jì)、分水器的三頸燒瓶中加入美法侖0.600g，苯甲醇10ml，亞硫酸氫鈉0. 394g在磁力攪拌下進(jìn)行反應(yīng)；將反應(yīng)后的混合液依次用蒸餾水、飽和碳酸氫鈉、蒸餾水洗滌，得到油狀物；將洗滌后的油狀物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)，除去混合物中未反應(yīng)的苯甲醇，設(shè)定旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為60°C，蒸發(fā)直到無餾出物為止，得到的物質(zhì)用乙醇-乙醚進(jìn)行重結(jié)晶，其乙醇與乙醚體積比為1:2，得到乳白色的固體BA-MEL ；(6) PEG-HA-QDs-MEL 的制備將步驟(2)得到的PEG-HA-QDs300mg，取 260mg DCC，0. 05mmol4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于15mL無水二甲基亞砜中，室溫避光磁力攪拌至PEG-HA-QDs全部溶解(約I小時(shí))，加入5mg/mL的BA-MEL水溶液(pH4. 7) 30mL，室溫避光磁力攪拌12h，將其于叔丁醇中通過碳載鈀5wt%氫催化劑脫除苯甲醇，pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液透析3天，再用雙蒸水透析3天。冷凍干燥得反應(yīng)物粉末，即得產(chǎn)物PEG-HA-QDs-MEL。2.受體介導(dǎo)量子點(diǎn)示蹤靶向給藥系統(tǒng)的MTT實(shí)驗(yàn)(卵巢癌SKOV3細(xì)胞)(I)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后配制成為濃度為2-10X104個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過準(zhǔn)確細(xì)胞技術(shù)后按500個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔加100 ill。(2)將平板置37°C、含體積濃度5%C02及飽和濕度條件下24小時(shí)后，加入各個(gè)細(xì)胞樣品對(duì)應(yīng)的藥物血清、生理鹽水血清、以及已稀釋好的藥物，每個(gè)樣品濃度設(shè)平行的三個(gè)孔，對(duì)照組加不含樣品的培養(yǎng)液100 yl，再放入培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)。(3)每孔加入按5mg/ml新配制的MTT溶液50 iil，溫育4小時(shí)，使MTT還原為甲瓚，當(dāng)在倒置顯微鏡下看到孔板內(nèi)的細(xì)胞周圍出現(xiàn)絲狀紫色結(jié)晶體時(shí)倒掉上清液，每孔加二甲基亞砜220 iil，用平板搖床搖勻后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值(OD)(檢測(cè)波長(zhǎng)570nm)，以溶劑對(duì)照處理細(xì)胞為對(duì)照組，按公式計(jì)算化合物對(duì)細(xì)胞的抑制率。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.受體介導(dǎo)量子點(diǎn)示蹤美法侖靶向給藥系統(tǒng)，其特征在于，它是聚乙二醇-透明質(zhì)酸-量子點(diǎn)-美法侖復(fù)合物，簡(jiǎn)寫為PEG-HA-QDs-MEL，由PEG與HA酰胺脫水縮合連接，并且在HA接入水溶性CdTe/CdS量子點(diǎn)，最后與藥物MEL酰胺脫水縮合制備得到，其中，PEG-HA-QDs-MEL的組分含量按重量份數(shù)計(jì)如下，每一重量份為I暈克 美法侖 30-100 份，PEG 600-1500 份，HA 200-500 份，CdTe/CdS 量子點(diǎn) 5-50 份，N，N，二環(huán)己基碳二亞胺20-50份，4- 二甲氨基吡啶1-10份，丁二酸酐100-500份，N-羥基硫代琥珀酰亞胺20-50份，I- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺20-50份，亞硫酸氫鈉10-100份。
2.如權(quán)利要求I所述的受體介導(dǎo)量子點(diǎn)示蹤美法侖靶向給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟，下述每一重量份為I毫克 1)端羧基聚乙二醇的合成及純化 將600-1500重量份聚乙二醇置于帶有冷凝管、攪拌器和溫度計(jì)的三口燒瓶中，加入氯仿溶解，待溶解完畢后加入100-500重量份丁二酸酐，加熱溶解，同時(shí)加入干燥的吡啶，攪拌下回流反應(yīng)2-10小時(shí)，停止反應(yīng)后冷卻至室溫，反應(yīng)所得混合物減壓蒸發(fā)至呈粘稠狀，再加入無水乙醚沉淀得到白色產(chǎn)物，抽濾得濾餅，再用二氯甲烷溶解濾餅，濾去不溶物，力口入無水乙醚沉淀得到白色產(chǎn)物，重復(fù)上述操作2次以上，抽濾后濾餅真空干燥至恒重，得到純化的端羧基聚乙二醇； 2)PEG-HA的制備 將步驟I)得到的端羧基聚乙二醇溶解于200 - 500重量份透明質(zhì)酸的水解液中，倒入裝有分餾柱和攪拌器的三口燒瓶，加入催化劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺10-50重量份和4-二甲氨基吡啶0. 5-5重量份，在60-140°C下反應(yīng)2_10小時(shí)后，收集100°C餾分，反應(yīng)結(jié)束后冷卻；加入無水乙醇至無沉淀生成，過濾收集沉淀，洗滌沉淀，干燥沉淀物即得 PEG-HA ； 3)水溶性CdTe/CdS量子點(diǎn)的制備 將5-20重量份碲粉和2-10重量份硼氫化鈉加入水中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，常溫下磁力攪拌2-5h，得到暗紅色含Te的NaHTe前驅(qū)液；稱取2_10重量份CdCl2溶于蒸餾水中，加入2-10重量份巰基丙酸，用濃度lmol/L-2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值到8-10 ；把溶液加入三頸瓶中，把新制備的NaHTe加入到氮?dú)獗Ｗo(hù)下的CdCl2溶液中，溶液的顏色變成透明橙黃色，室溫?cái)嚢?，然后轉(zhuǎn)入到90°C的恒溫水浴中反應(yīng)0. 5-2 h后，以0. Iml/min速度滴入濃度I V- mol/L-20 u mol/L Na2S的溶液I ml-15 ml,得到CdTe/CdS核殼量子點(diǎn)；全部反應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下完成，反應(yīng)終止后，加入乙醇，在5 000 r/min下離心分離10-15 min,棄去上層清液，加水使沉淀重新懸浮，重復(fù)此過程2次，得到的固體在室溫下自然晾干，研磨得到CdTe/CdS量子點(diǎn)固體粉末，簡(jiǎn)寫為QDs ; 4)PEG-HA-QDs 的制備 稱取5-50重量份QDs溶于水中，室溫避光磁力攪拌至QDs全部溶解，加入5_50重量份N-羥基硫代琥珀酰亞胺與5-50重量份I- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺，Ih后加入步驟2)制備的0. I g/ml-I g/ml的PEG-HA的水溶液20ml，室溫避光磁力攪拌12 h，所得產(chǎn)物混合液在pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液以透析袋透析，冷凍干燥得PEG-HA-QDs復(fù)合物； 5)美法倫芐酯的制備在裝有溫度計(jì)、分水器的三頸燒瓶中加入美法侖30-100重量份，亞硫酸氫鈉10-100重量份和過量苯甲醇在磁力攪拌下進(jìn)行反應(yīng)，將反應(yīng)后所得的混合液依次用蒸餾水、飽和碳酸氫鈉和蒸餾水洗滌，得到油狀物，將洗滌后的油狀物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)，除去未反應(yīng)苯甲醇，設(shè)定旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為30-60°C，蒸發(fā)直到無餾出物為止，蒸發(fā)得到的物質(zhì)用乙醇-乙醚進(jìn)行重結(jié)晶，其乙醇與乙醚體積比為1:2，得到乳白色的固體美法倫芐酯，簡(jiǎn)寫為BA-MEL ； 6)PEG-HA-QDs-MEL 的制備 將步驟4)得到的100-500重量份PEG-HA-QDs復(fù)合物、10-50重量份N，N’ 二環(huán)己基碳二亞胺和0. 5-5重量份4- 二甲氨基吡啶溶于無水二甲基亞砜中，室溫避光磁力攪拌至PEG-HA-QDs全部溶解，加入步驟5)所得的pH4. 7的10-50重量份BA-MEL水溶液，室溫避光磁力攪拌12 h,將其在叔丁醇中通過碳載鈕0. 5wt% — 15wt%催化劑氫化脫除苯甲醇,然后用pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液透析24-72h，再用雙蒸水透析24_72h，冷凍干燥得反應(yīng)物粉末，即 PEG-HA-QDs-MEL 產(chǎn)物。·
3.如權(quán)利要求I所述的受體介導(dǎo)量子點(diǎn)示蹤美法侖靶向給藥系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。
全文摘要
一種受體介導(dǎo)量子點(diǎn)示蹤靶向給藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用。其靶向給藥系統(tǒng)是聚乙二醇-透明質(zhì)酸-量子點(diǎn)-美法侖復(fù)合物，簡(jiǎn)寫為PEG-HA-QDs-MEL，由PEG與HA酰胺脫水縮合連接，并在HA上接入水溶性CdTe/CdS量子點(diǎn)，最后與藥物MEL制備得到，其中，PEG-HA-QDs-MEL的組分含量按重量份數(shù)計(jì)為美法侖30-100份，PEG600-1500份，HA200-500份，CdTe/CdS量子點(diǎn)5-50份，DCC20-50份，DMAP1-10份，丁二酸酐100-500份，NHS20-50份,EDC20-50份，亞硫酸氫鈉10-100份。本靶向給藥系統(tǒng)，應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號(hào)A61K31/196GK102743762SQ20121025020
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者劉慧 , 張喻, 徐海星, 徐金巧, 李映萱, 楊昭, 王玉, 王玲, 許沛虎, 黃志軍 申請(qǐng)人:武漢理工大學(xué)