專利名稱：通過抑制rna酶h1的天然反義轉(zhuǎn)錄物而治療rna酶h1相關(guān)疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請要求2010年I月25日提交的美國臨時專利申請No. 61/297878的優(yōu)先權(quán)，其通過引用整體并入本文。本發(fā)明的實施方案包括調(diào)節(jié)RNA酶Hl和相關(guān)分子的表達和/或功能的寡核苷酸。背景DNA-RNA和RNA-RNA雜交對于核酸功能的許多方面是重要的，包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。雜交對于檢測特定核酸或改變其表達的多種技術(shù)也是關(guān)鍵的。反義核苷酸，例如通過與靶RNA雜交從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制來破壞基因表達。反義DNA具有額 外的特性，即DNA-RNA雜交物作被核糖核酸酶H消化的底物，這是在大多數(shù)細胞類型中存在的活性。反義分子可被遞送到細胞中，如寡脫氧核苷酸(ODN)的情形，或反義分子可從內(nèi)源基因表達為RNA分子。FDA最近批準(zhǔn)了一種反義藥物VITRAVENE (用于治療巨細胞病毒視網(wǎng)膜炎)，反映了反義藥物具有治療效用。概述提供本概述以展示本發(fā)明的概述，以簡要地指出本發(fā)明的性質(zhì)和實質(zhì)。提交本概述應(yīng)理解的是，其不會用來解釋或限制權(quán)利要求書的范圍或含義。在一個實施方案中，本發(fā)明提供通過利用靶向天然反義轉(zhuǎn)錄物任何區(qū)域的反義寡核苷酸而導(dǎo)致相應(yīng)有義基因的上調(diào)來抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物作用的方法。本文還預(yù)期，天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制可由siRNA、核酶和小分子實現(xiàn)，認(rèn)為這些在本發(fā)明的范圍中。一個實施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達的方法，包括將所述細胞或組織與長度為5至30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與包括SEQ ID NO:2的核苷酸I至437或SEQ ID NO:3的核苷酸I至278或SEQ ID NO:4的核苷酸I至436或SEQ ID NO:5的核苷酸I至1140中的5至30個連續(xù)核苷酸的多核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列同一性，從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達。在實施方案中，寡核苷酸靶向RNA酶Hl多核苷酸的天然反義序列，例如，SEQ IDN0:2至5所列的核苷酸及其任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO:6至13所列。另一實施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達的方法，包括將所述細胞或組織與長度為5至30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與RNA酶Hl多核苷酸的反義的反向互補序列具有至少50%序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達。另一實施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達的方法，包括將所述細胞或組織與長度為5至30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與RNA酶Hl反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達。
在實施方案中，組合物包括一種或多種結(jié)合有義和/或反義RNA酶Hl多核苷酸的反義寡核苷酸。在實施方案中，寡核苷酸包括一種或多種修飾或取代的核苷酸。在實施方案中，寡核苷酸包括一種或多種修飾的鍵。在又一實施方案中，修飾的核苷酸包括包含硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、2’ -0-甲基、氟-或碳、亞甲基或其它鎖核酸(LNA)分子的修飾的堿基。優(yōu)選地，修飾的核苷酸是鎖核酸分子，包括a-L-LNA。在實施方案中，將寡核苷酸皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用給患者。在實施方案中，寡核苷酸以藥物組合物施用。治療方案包括向患者施用反義化合物至少一次；然而，可修改該治療以包括經(jīng)一段時間的多個劑量。該治療可與一種或多種其它類型的治療聯(lián)合。 在實施方案中，將寡核苷酸封裝在脂質(zhì)體中或連接于載體分子(例如，膽固醇、TAT 肽)。其它方面在以下描述。附圖
簡述圖I是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理HepG2細胞后與對照相比RNA酶HlmRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)為⑶R-0665、CUR-0666、CUR-0669、CUR-0670、CUR-0667、CUR-0668、CUR-0671 和 CUR-0672 的條柱分別對應(yīng)用SEQ ID NO:6至13處理的樣品。序列表描述-SEQ ID NO: I :智人核糖核酸酶Hl (RNA酶HI)、mRNA(NCBI登記號NM_002936) ；SEQ ID NO:2 :天然 RNA 酶 Hl 反義序列(Hs. 502765) ；SEQ ID N0:3:天然 RNA酶 Hl 反義序列(Hs. 610890) ；SEQ ID NO: 4 :天然 RNA 酶 Hl 反義序列(Hs. 700975) ；SEQ IDNO: 5 :天然RNA酶Hl反義序列(Hs. 606550) SEQ ID NO: 6至13 :反義寡核苷酸。*指示硫代磷酸酯鍵。詳述下面參考用于示例的實例應(yīng)用來描述本發(fā)明的多個方面。應(yīng)理解的是，列出許多具體細節(jié)、關(guān)聯(lián)和方法以提供對本發(fā)明的完全理解。然而，相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識到，可沒有一種或多種具體細節(jié)地實踐本發(fā)明或以其它方法實踐本發(fā)明。本發(fā)明不限于行為或事件的順序，因為一些行為可以不同順序進行和/或與其它行為或事件同時進行。而且，并非所有列舉的行為或事件都是實施根據(jù)本發(fā)明的方法所需的。本文公開的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物預(yù)期對應(yīng)來自本文公開的組合物和方法可適用的任何物種的同系物。因此，這些術(shù)語包括但不限于來自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。應(yīng)理解的是，當(dāng)公開來自具體物種的基因或基因產(chǎn)物時，這一公開僅旨在示例，不應(yīng)解釋為限制，除非在其存在的上下文清楚地指明。因此，例如，對于本文公開的基因，其在一些實施方案中涉及哺乳動物核酸和氨基酸序列，預(yù)期涵蓋來自其它動物的同源和/或直系同源基因和基因產(chǎn)物，所述其它動物包括但不限于其它哺乳動物、魚、兩棲類、爬行動物和鳥類。在實施方案中，基因或核酸序列是人的。定義本文所用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方案的目的，并不旨在限制本發(fā)明。除非上下文另外清楚地指明，否則本文所用的單數(shù)形式〃一個/ 一種(a)〃、〃一個/ 一種(an)〃和〃該(the)"預(yù)期包括復(fù)數(shù)形式。而且，就詳述和/或權(quán)利要求書中使用術(shù)語〃包括(including) 〃、〃 包括(includes) 〃、〃 具有(having) 〃、〃 具有(has) 〃、〃 帶有(with) 〃 或其變化形式來說，這些術(shù)語預(yù)期以類似于術(shù)語〃包含(comprising) 〃的方式被包括。術(shù)語〃約〃或〃大約〃是指在由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的特定數(shù)值的可接受誤差范圍內(nèi)，其將部分地取決于如何測量或確定該數(shù)值，即，測量系統(tǒng)的限度。例如，按照本領(lǐng)域中的實踐，〃約〃可表示在I個或多于I個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)?？蛇x地，〃約〃可表示給定數(shù)值的達20%、優(yōu)選地達10%、更優(yōu)選地達5%、仍更優(yōu)選地達1%的范圍?？蛇x地，尤其是有關(guān)生物系統(tǒng)或方法，術(shù)語可表示在數(shù)值的數(shù)量級內(nèi)，優(yōu)選地在5倍內(nèi)，更優(yōu)選地在2倍內(nèi)。當(dāng)在本申請和權(quán)利要求書中描述特定數(shù)值時，除非另外指明，否則應(yīng)假設(shè)術(shù)語"約"表示在特定數(shù)值可接受的誤差范圍內(nèi)。本文所用的術(shù)語〃mRNA〃是指靶基因的目前已知的mRNA轉(zhuǎn)錄物和可能說明的任何進一步的轉(zhuǎn)錄物。 〃反義寡核苷酸〃或〃反義化合物〃是指結(jié)合另一 RNA或DNA (靶RNA、DNA)的RNA或DNA分子。例如，如果其是RNA寡核苷酸，其借助于RNA-RNA相互作用結(jié)合另一 RNA靶并且改變靶RNA的活性。反義寡核苷酸可上調(diào)或下調(diào)特定多核苷酸的表達和/或功能。該定義意為包括從治療、診斷或其它觀點來說有用的任何外來RNA或DNA分子。這種分子包括，例如，反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶促RNA、治療性編輯RNA和激動劑與拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可選剪接體、引物、探針以及與靶核酸的至少一部分雜交的其它寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的范疇中，術(shù)語"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚物或聚合物。術(shù)語"寡核苷酸"還包括天然和/或修飾的單體或鍵合的線性或環(huán)狀寡聚物，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代形式和其a -異頭形式、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯、膦酸甲酯和類似物。寡核苷酸能夠經(jīng)由規(guī)則方式的單體與單體間的相互作用，例如Watson-Crick型堿基配對、Ho6gsteen或逆Ho6gsteen型堿基配對或類似物特異性結(jié)合靶多核苷酸。寡核苷酸可以是〃嵌合的"，即，包括不同區(qū)域。在本發(fā)明的范疇中，"嵌合〃化合物是寡核苷酸，其包含兩個或更多個化學(xué)區(qū)域，例如，DNA區(qū)域、RNA區(qū)域、PNA區(qū)域等等。每個化學(xué)區(qū)域由至少一個單體單位構(gòu)成，在寡核苷酸化合物的情形中所述單體單位即為核苷酸。這些寡核苷酸通常包括至少一個區(qū)域，其中寡核苷酸經(jīng)修飾以表現(xiàn)一種或多種期望特性。寡核苷酸的期望特性包括但不限于，例如，對核酸酶降解增加的耐受性、增加的細胞攝取和/或?qū)Π泻怂嵩黾拥慕Y(jié)合親和力。因此，寡核苷酸的不同區(qū)域可具有不同特性。如上所述，本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多種寡核苷酸的混合結(jié)構(gòu)、修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸類似物。寡核苷酸可由可被〃成行〃地連接(即當(dāng)單體被連續(xù)地連接時，如在天然DNA中)的區(qū)域或經(jīng)由間隔物連接的區(qū)域構(gòu)成。預(yù)期間隔物構(gòu)成區(qū)域之間的共價"橋"，在優(yōu)選情形中具有不超過約100個碳原子的長度。間隔物可攜帶不同功能性，例如，具有正電荷或負電荷，攜帶特殊的核酸結(jié)合特性(嵌入劑、槽溝結(jié)合物、毒素、熒光團等等)，為親脂性的，誘導(dǎo)特殊的二級結(jié)構(gòu)，如例如，誘導(dǎo)a -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的"RNA酶Hl"和"RNA酶Hl"包括所有家族成員、突變體、等位基因、片段、種類(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等等。本文所用的詞語核糖核酸酶H1、RNA酶HKmasehlvRNA酶Hl、H1RNA、核糖核酸酶H1、核糖核酸酶H II型、RNA酶HURNHl被認(rèn)為在文獻中是相同的，且在本申請中可交換地使用。本文所用的術(shù)語〃對…有特異性的寡核苷酸〃或〃靶向…的寡核苷酸〃是指具有(i)能夠與靶基因的一部分形成穩(wěn)定復(fù)合體，或(ii)能夠與靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體的序列的寡核苷酸。復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過理論計算和/或體外測定來確定。用于確定雜交復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性測定在以下實施例中描述。本文所用的術(shù)語〃靶核酸〃涵蓋DNA、從這種DNA轉(zhuǎn)錄的RNA (包括前體mRNA和 mRNA)、還有從這種RNA衍生的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾核酸的正常功能。特異性地與靶核酸雜交的化合物對靶核酸功能的這一調(diào)節(jié)通常稱為〃反義〃。待干擾的DNA功能包括，例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能包括所有重要功能，例如，RNA向蛋白翻譯位置的移位，從RNA翻譯為蛋白，剪接RNA以產(chǎn)生一種或多種mRNA種類以及可能由RNA參與或促進的催化活性。這種干擾靶核酸功能的總效果是調(diào)節(jié)編碼的產(chǎn)物或寡核苷酸的表達。RNA干擾"RNAi "由對其〃靶〃核酸序列具有序列特異性的同源性的雙鏈RNA(dsRNA)分子介導(dǎo)。在本發(fā)明的某些實施方案中，介導(dǎo)物是5-25個核苷酸的〃小干擾"RNA雙鏈體(siRNA)。siRNA來源于稱為Dicer的RNA酶對dsRNA的加工。siRNA雙鏈體產(chǎn)物被募集到稱為RISC (RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的多蛋白siRNA復(fù)合體中。不希望受任何特定理論束縛，認(rèn)為隨后RISC被引導(dǎo)至靶核酸(適當(dāng)?shù)貫閙RNA)，在那里siRNA雙鏈體以序列特異性方式相互作用來以催化方式介導(dǎo)裂解。根據(jù)本發(fā)明可使用的小干擾RNA可根據(jù)本領(lǐng)域公知并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的方案合成和使用。用于本發(fā)明方法的小干擾RNA適當(dāng)?shù)匕sI至約50個核苷酸(nt)。在非限制性實施方案的實例中，siRNA可包括約5至約40nt、約5至約30nt、約10至約30nt、約15至約25nt或約20-25個核苷酸。通過利用自動比對核酸序列并指明同一性或同源性的區(qū)域的計算機程序來便于選擇適當(dāng)?shù)墓押塑账帷＿@種程序用來比較獲得的核酸序列，例如通過搜尋數(shù)據(jù)庫例如GenBank或通過對PCR產(chǎn)物測序。比較來自一系列物種的核酸序列允許選擇在物種之間展示適當(dāng)?shù)耐恍猿潭鹊暮怂嵝蛄?。在未被測序的基因的情形中，進行DNA印跡以允許確定靶物種與其它物種的基因之間的同一性程度。如本領(lǐng)域所熟知的，通過以不同的嚴(yán)格性程度進行DNA印跡，可能獲得近似的同一性測量。這些方案允許選擇展現(xiàn)與待控制的受治療者中的靶核酸序列的高程度互補性和與其它物種中的相應(yīng)核酸序列的較低程度互補性的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，在選擇用于本發(fā)明的基因的適當(dāng)區(qū)域方面存在相當(dāng)大的自由。〃 酶促 RNA"是指具有酶促活性的 RNA 分子(Cech, (1988) J American. Med.Assoc. 260，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通過首先結(jié)合靶RNA來作用。這種結(jié)合經(jīng)由被保持在鄰近用于裂解靶RNA的分子的酶促部分處的酶促核酸的靶結(jié)合部分來進行。因此，酶促核酸首先識別靶RNA然后經(jīng)由堿基配對結(jié)合靶RNA，結(jié)合到正確位置時，酶促地作用以切割靶RNA?！ㄕT餌RNA〃是指模擬配體的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RNA分子。因此，誘餌RNA與天然結(jié)合靶競爭結(jié)合特定配體。例如，已經(jīng)顯示HIV反式激活響應(yīng)(TAR)RNA的過表達可作為〃誘餌〃起作用并有效地結(jié)合HIV tat蛋白，從而阻止其結(jié)合HIV RNA中編碼的TAR序列。這表示一個特定的實例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，這僅是一個實例，利用本領(lǐng)域通常已知的技術(shù)可容易地產(chǎn)生其它實施方案。本文所用的術(shù)語〃單體〃通常是指由磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小從數(shù)個單體單位例如約3-4個至約數(shù)百個單體單位范圍的寡核苷酸的單體。磷酸二酯鍵合的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯和類似物，如以下更充分地描述。術(shù)語“核苷酸”涵蓋天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，此前被認(rèn)為是"非天然存在的"各種核苷酸后來已在自然界中發(fā)現(xiàn)。因此，"核苷酸"不僅包括已知的含嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，還包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。 其它類型的核苷酸的示例性實例是含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶、N6, N6-橋亞乙基-2，6- 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷的分子以及Benner等，美國專利No. 5，432，272中描述的〃非天然存在的〃核苷酸。術(shù)語"核苷酸"預(yù)期涵蓋這些實例的每一種和所有以及其類似物和互變異構(gòu)體。尤其關(guān)注的核苷酸是包含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的那些，它們被認(rèn)為是與在人的治療和診斷應(yīng)用有關(guān)的天然存在的核苷酸。核苷酸包括天然2’ -脫氧糖和2’ -羥基糖，例如在 Kornberg 和 Baker, DNA Replication,第2版.(Freeman, San Francisco, 1992)中描述的，以及它們的類似物。提及核苷酸的"類似物"包括具有修飾的堿基部分和/或修飾的糖部分的合成的核苷酸(參見例如，通常描述于Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980 ；Freier & Altmann, (1997) NucI. Acid. Res. , 25 (22), 4429-4443, Toulme, J. J. , (2001)Nature Biotechnologyl9:17-18 ；Manoharan M. , (1999)Biochemica et BiophysicaActal489:117-139 ；Freier S. M., (1997)Nucleic Acid Research, 25:4429-4443，Uhlman, E. , (2000)Drug Discovery & Development, 3:203-213, Herdewin P., (2000)Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.，10:297-310) ;2’-0，3'-C-連接的[3.2.0] 二環(huán)阿拉伯糖核苷。這種類似物包括經(jīng)設(shè)計以增強結(jié)合特性，例如，雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性或類似特性的合成的核苷酸。本文所用的〃雜交〃是指寡聚化合物的大致互補鏈的配對。配對的一種機制包括寡聚化合物的鏈的互補核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵合，其可以是Watson-Crick、Ho6gsteen或逆HoGgsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是經(jīng)由氫鍵形成而配對的互補核苷酸。雜交可在不同情況下發(fā)生。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以導(dǎo)致功能和/或活性的調(diào)節(jié)時，該化合物是"可特異性雜交的"，且在期望特異性結(jié)合的條件下(即，在體內(nèi)測定或治療性治療的情形中的生理條件下和在體外測定的情形中進行測定的條件下)存在足夠程度的互補性以避免反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。本文所用的短語"嚴(yán)格雜交條件"或"嚴(yán)格條件"是指本發(fā)明化合物將與其靶序列雜交，但與最小數(shù)目的其它序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的且在不同情況中將是不同的，并且在本發(fā)明范疇中，寡聚化合物與靶序列雜交的"嚴(yán)格條件"由寡聚化合物的性質(zhì)和組成以及研究它們的測定決定。通常，嚴(yán)格雜交條件包括低濃度(〈O. 15M)的帶有無機陽離子例如Na++或K++的鹽(即，低離子強度)、高于20°C _25°C低于寡聚化合物靶序列復(fù)合體的Tm的溫度、和存在變性劑例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亞砜或去垢劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，對于每種1%甲酰胺，雜交率降低I. 1%。高嚴(yán)格雜交條件的實例是在60°C下0. I X氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC) /0. l%(w/v) SDS進行30分鐘。
本文所用的〃互補〃是指一條或兩條寡聚鏈上的兩個核苷酸之間準(zhǔn)確配對的能力。例如，如果在反義化合物某一位置的核堿基能夠與在靶核酸某一位置的核堿基氫鍵結(jié)合，所述靶核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，則認(rèn)為寡核苷酸與靶核酸之間的氫鍵結(jié)合位置是互補位置。當(dāng)每個分子的足夠數(shù)目的互補位置由可彼此成氫鍵的核苷酸占據(jù)時，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子是彼此互補的。因此，〃可特異性雜交〃和〃互補"是用來表示經(jīng)足夠數(shù)目的核苷酸足夠程度的準(zhǔn)確配對或互補性，從而在寡聚化合物和靶核酸之間發(fā)生穩(wěn)定和特異性結(jié)合的術(shù)語。本領(lǐng)域應(yīng)理解的是，寡聚化合物的序列不必與待可特異性雜交的其靶核酸的序列100%互補。而且，寡核苷酸可經(jīng)一個或多個區(qū)段雜交，從而其間的或相鄰區(qū)段不牽涉在雜交事件中(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物包括與其所靶向的靶核酸序列中靶區(qū)域具有至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%序列互補性。例如，其中反義化合物的20個核苷酸中的18個與靶區(qū)域互補從而將特異性雜交的反義化合物將表示90%互補性。在這一實例中，其余非互補核苷酸可成串或散布于互補核苷酸，不必彼此連續(xù)或與互補核苷酸連續(xù)。因此，具有側(cè)翼為與靶核酸具有完全互補性的兩個區(qū)域的4(四)個非互補核苷酸的長度為18個核苷酸的反義化合物將與靶核酸具有77. 8%總互補性，因此屬于本發(fā)明的范圍中。反義化合物與靶核酸的區(qū)域的互補性百分比可常規(guī)地利用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基本局部比對搜索工具)和PowerBLAST程序來確定。同源性、序列同一性或互補性的百分比可通過例如使用Smith 和 Waterman 的算法(Adv. Appl. Math. , (1981) 2, 482-489)的 Gap 程序(Wisconsin序列分析軟件包，用于 Unix 的版本 8，Genetics Computer Group, University ResearchPark, Madison ffis.)確定，并使用默認(rèn)設(shè)置。本文所用的術(shù)語"熱熔點(Tm)"是指在指定的離子強度、pH和核酸濃度下，與靶序列互補的寡核苷酸的50%平衡地與靶序列雜交的溫度。通常，嚴(yán)格條件將是其中鹽濃度為至少約0. 01至I. OM Na離子濃度(或其它鹽)、pH 7. 0至8. 3，且對于短寡核苷酸(例如，10至50個核苷酸)溫度為至少約30°C的條件。嚴(yán)格條件還可通過加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實現(xiàn)。本文所用的〃調(diào)節(jié)〃是指基因表達的增加(刺激)或減少(抑制)。術(shù)語〃變體〃當(dāng)在多核苷酸序列的上下文中使用時，可涵蓋與野生型基因相關(guān)的多核苷酸序列。這一定義還可包括，例如，〃等位〃、〃剪接〃、〃物種〃或〃多態(tài)〃變體。剪接變體可與參考分子具有顯著的同一性，但由于在mRNA加工期間外顯子的可選剪接通常將具有更大數(shù)目或更小數(shù)目的多核苷酸。相應(yīng)的多肽可具有另外的功能結(jié)構(gòu)域或缺少結(jié)構(gòu)域。物種變體是在物種之間不同的多核苷酸序列。本發(fā)明中特別有用的是野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可來源于核酸序列中至少一種突變，并可產(chǎn)生改變的mRNA或產(chǎn)生結(jié)構(gòu)或功能可能改變或可能不改變的多肽。任何給定的天然或重組基因可具有O種、一種或多種等位基因形式。產(chǎn)生變體的常見突變改變通常歸因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。在給定序列中，這些類型改變的每一種可單獨發(fā)生，或組合其它類型改變發(fā)生一次或多次。所得的多肽通常將具有相對于彼此顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體是給定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態(tài)變體還可涵蓋"單核苷酸多態(tài)性"(SNP)或其中多核苷酸序列差異為一個堿基的單堿基突變。SNP的存在可指示，例如，具有疾病狀態(tài)的傾向的某一群體，所述傾向相比于耐受性為易感性。 衍生的多核苷酸包括經(jīng)受化學(xué)修飾(例如以烷基、?；虬被鏆?的核酸。衍生物例如，衍生物寡核苷酸，可包括非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵合。其中示例的有硫代磷酸酯和本領(lǐng)域已知的其它含硫物質(zhì)。衍生的核酸還可包含標(biāo)記，包括放射性核苷酸、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性粒子和類似物?！ㄑ苌铩ǘ嚯幕螂氖抢缤ㄟ^糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、還原/烷基化、?；?、化學(xué)偶合或適度福爾馬林處理修飾的多肽或肽。還可修飾衍生物以直接或間接包含可檢測的標(biāo)記，包括但不限于，放射性同位素、熒光和酶標(biāo)記。本文所用的術(shù)語〃動物〃或〃患者〃意為包括，例如人、綿羊、麋鹿、鹿、長耳鹿、貂、哺乳動物、猴、馬、牛、豬、山羊、犬、貓、大鼠、小鼠、鳥類、雞、爬行動物、魚、昆蟲和蛛形綱動物?！ú溉閯游铩êw通常處于醫(yī)療護理下的溫血哺乳動物(例如，人和馴養(yǎng)的動物)。實例包括貓科動物、犬科動物、馬科動物、?？苿游锖腿?，以及僅僅人?！ㄖ委?Treating) 〃或〃治療(treatment) 〃涵蓋治療哺乳動物的疾病狀態(tài),并包括(a)防止疾病狀態(tài)在哺乳動物中發(fā)生，尤其是當(dāng)所述哺乳動物傾向于疾病狀態(tài)但還未被診斷為患有其的時候；(b)抑制疾病狀態(tài)，例如阻止其發(fā)展；和/或(C)緩解疾病狀態(tài)，例如導(dǎo)致疾病狀態(tài)消退，直到達到期望端點。治療還包括疾病癥狀的改善(例如，減輕疼痛或不適)，其中所述改善可或不可直接影響疾病(例如起因、傳染、表達等等)。本文所用的〃癌癥〃是指在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的所有類型的癌癥或贅生物或惡性腫瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌癥本身表現(xiàn)為〃腫瘤〃或包括癌癥惡性細胞的組織。腫瘤的實例包括肉瘤和癌，例如但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、月旨肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、腎母細胞瘤、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細胞瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤?？捎酶鶕?jù)本發(fā)明公開的組合物治療的其它癌癥包括但不限于，例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性巨球蛋白血癥、小細胞肺腫瘤、原發(fā)性腦瘤、胃癌、結(jié)腸癌、惡性胰島腫瘤、惡性類癌瘤、膀胱癌、胃癌、惡變前皮膚損傷、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血癥、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌和前列腺癌。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子靶在一個實施方案中，靶包括RNA酶Hl的核酸序列，包括但不限于RNA酶Hl相關(guān)的有義和/或反義的非編碼和/或編碼序列。RNA酶H水解RNA-DNA雜合體中的RNA。RNA酶H活性看似在真核生物和細菌中是普遍存在的。盡管已提出很多機理用于靶RNA的寡核苷酸介導(dǎo)的脫穩(wěn)定化，但是據(jù)信反義寡核苷酸引起靶RNA水平的減少的主要機理是通過這種RNA酶H作用。盡管RNA酶H構(gòu)成不同分子量的蛋白的家族，但是核溶解活性和底物需求看似對各種同種型是類似的。例如，迄今為止所有RNA酶H的研究作為表現(xiàn)出有限的序列特異性和需要二價陽離子的內(nèi)切核酸酶起作用(例如，Mg. sup. 2+、Mn. sup. 2+)以產(chǎn)生在〃核酸酶〃中具有5’磷酸和3’羥基末 端的切割產(chǎn)物。在實施方案中，反義寡核苷酸用來預(yù)防或治療RNA酶Hl家族成員相關(guān)的疾病或病癥?？捎脧睦梅戳x化合物獲得的干細胞再生的細胞/組織治療的示例性RNA酶Hl介導(dǎo)的疾病和病癥包括利什曼病、肝疾病或病癥、與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病或病癥、癌癥、細胞凋亡疾病、Aicardi-Goutieres綜合征和逆轉(zhuǎn)錄病毒疾病或病癥(例如AIDS)。在另一實施方案中，可進一步與其它反義寡核苷酸結(jié)合使用RNA酶Hl寡核苷酸以增加其活性。在實施方案中，將一種或多種反義寡核苷酸對RNA酶Hl的調(diào)節(jié)向需要其的患者施用，用于增強體格和健身。在實施方案中，將一種或多種反義寡核苷酸對RNA酶Hl的調(diào)節(jié)向需要其的患者施用以預(yù)防或治療與正常對照相比的RNA酶Hl異常表達、功能、活性相關(guān)的任何疾病或病癥。在實施方案中，寡核苷酸是對RNA酶Hl多核苷酸有特異性，該多核苷酸包括但不限于非編碼區(qū)。RNA酶Hl靶包括RNA酶Hl的變體；RNA酶Hl的突變體，包括SNP ；RNA酶Hl的非編碼序列；等位基因、片段和類似物。優(yōu)選地寡核苷酸是反義RNA分子。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，靶核酸分子不限于僅RNA酶Hl多核苷酸，還延伸到RNA酶Hl的任何同種型、受體、同系物、非編碼區(qū)和類似物。在實施方案中，寡核苷酸靶向RNA酶Hl靶的天然反義序列(與編碼區(qū)和非編碼區(qū)天然反義)，包括但不限于，其變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。優(yōu)選地寡核苷酸是反義RNA或DNA分子。在實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括變體，其中在化合物中一個或多個核苷酸位置存在不同堿基。例如，如果第一個核苷酸是腺嘌呤，可產(chǎn)生在這一位置包含胸苷、鳥苷、胞苷或其它天然或非天然核苷酸的變體。這可在反義化合物的任何位置進行。隨后利用本文所述的方法測定這些化合物以確定它們抑制靶核酸表達的能力。在一些實施方案中，反義化合物與靶之間的同源性、序列同一性或互補性是從約50%至約60%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約60%至約70%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約70%至約80%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約80%至約90%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以導(dǎo)致活性的喪失時，該化合物是可特異性雜交的，且在期望特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補性以避免反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。這種條件包括，即，在體內(nèi)測定或治療性治療的情形中的生理條件以及在體外測定的情形中進行測定的條件。當(dāng)反義化合物(無論是DNA、RNA、嵌合、取代的等等)與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能以導(dǎo)致效用的喪失時，該化合物是可特異性雜交的，且在期望特異性結(jié)合的條件下(即，在體內(nèi)測定或治療性治療的情形中的生理條件下以及在體外測定的情形中進行測定的條件下)存在足夠程度的互補性以避免反義化合物與非靶序列的非特異性結(jié)合。在實施方案中，RNA酶Hl的靶向包括但不限于，利用例如PCR、雜交等鑒定和擴展的反義序列、一種或多種如SEQ ID NO: 2至5所列的序列和調(diào)節(jié)RNA酶Hl表達或功能的類似物。在一個實施方案中，與對照相比表達或功能被上調(diào)。在實施方案中，與對照相比表達 或功能被下調(diào)。在實施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID N0:6至13所列的核酸序列，包括利用例如PCR、雜交等鑒定和擴展的反義序列。這些寡核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸、更短或更長的片段、修飾的鍵和類似物。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或類似物。在實施方案中，核苷酸包括磷衍生物?？筛郊佑诒景l(fā)明的修飾的寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾的磷酸酯基團)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷烴酯、硫代磷酸酯和類似物。上述磷酸酯類似物的制備和將其向核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸的并入本身是已知的，不必在此描述。反義的特異性和靈敏性還由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用以用于治療用途。反義寡核苷酸已在動物和人的疾病狀態(tài)的治療中用作治療部分。反義寡核苷酸已經(jīng)安全且有效地施用于人，目前正在進行許多臨床試驗。因此已經(jīng)確定，寡核苷酸可以是有用的治療形態(tài)，可被配置以用于治療細胞、組織和動物(尤其是人)的治療方案。在本發(fā)明的實施方案中，寡聚反義化合物，尤其是寡核苷酸，結(jié)合靶核酸分子并調(diào)節(jié)靶基因編碼的分子的表達和/或功能。待干擾的DNA的功能包括，例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能包括所有重要功能，例如RNA向蛋白翻譯位置的移位，從RNA翻譯為蛋白，剪接RNA以產(chǎn)生一種或多種mRNA種類以及可由RNA參與或促進的催化活性。取決于期望的功能，功能可被上調(diào)或抑制。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可選剪接體、引物、探針以及與靶核酸的至少一部分雜交的其它寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明范疇中，將反義化合物靶向特定核酸分子可以是多步驟的過程。該過程通常開始于鑒定待調(diào)節(jié)其功能的靶核酸。這一靶核酸可以是，例如，其表達與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細胞基因(或從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)或來自感染物的核酸分子。在本發(fā)明中，靶核酸編碼性激素集合球蛋白RNA酶Hl。靶向過程通常還包括確定靶核酸中發(fā)生反義相互作用從而產(chǎn)生期望作用例如調(diào)節(jié)表達的至少一個靶區(qū)域、區(qū)段或位置。在本發(fā)明范疇中，術(shù)語〃區(qū)域〃定義為具有至少一種可鑒定結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸區(qū)域中是區(qū)段。"區(qū)段"定義為靶核酸中較小區(qū)域或區(qū)域的亞部分。本發(fā)明中使用的"位置"定義為靶核酸中的位置。在實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合RNA酶Hl的天然反義序列并調(diào)節(jié)RNA酶Hl (SEQID NO: I)的表達和/或功能。反義序列的實例包括SEQ ID N0:2至13。在實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合RNA酶Hl多核苷酸的一個或多個區(qū)并調(diào)節(jié)RNA酶Hl的表達和/或功能。區(qū)段包括RNA酶Hl的有義或反義多核苷酸的至少五個連續(xù)核苷酸。在實施方案中，反義寡核苷酸是對RNA酶Hl的天然反義序列有特異性，其中寡核苷酸對RNA酶Hl的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)RNA酶Hl的表達和/或功能。在實施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID N0:6至13所列的序列、利用例如PCR、雜交等鑒定和擴展的反義序列。這些寡核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸、更短 或更長的片段、修飾的鍵和類似物。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或類似物。在實施方案中，核苷酸包括磷衍生物?？筛郊佑诒景l(fā)明的修飾的寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾的磷酸酯基團)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷烴酯、硫代磷酸酯和類似物。上述磷酸酯類似物的制備和將其向核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸的并入本身是已知的，不必在此描述。如本領(lǐng)域已知的，因為翻譯起始密碼子通常是5’ -AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；在相應(yīng)DNA分子中是5’ -ATG)，翻譯起始密碼子也稱為"AUG密碼子〃、〃起始密碼子〃或"AUG起始密碼子"。少數(shù)基因具有具有RNA序列5’ -GUG、5’ -UUG或5’ -CUG的翻譯起始密碼子；且5’ -AUA、5’ -ACG和5’ -CUG已顯示在體內(nèi)起作用。因此，術(shù)語〃翻譯起始密碼子〃和〃起始密碼子"可涵蓋許多密碼子序列，盡管每種情形中的起始氨基酸通常是甲硫氨酸(真核細胞中)或甲酰甲硫氨酸(原核細胞中)。真核基因和原核基因可具有兩個或更多個替代性起始密碼子，其中的任何一個可在特定細胞類型或組織中或在特定條件設(shè)置下優(yōu)先地用于翻譯起始。在本發(fā)明范疇中，"起始密碼子"和"翻譯起始密碼子"是指體內(nèi)用于起始從編碼RNA酶Hl的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯的一種或多種密碼子，而不論這種密碼子的序列。基因的翻譯終止密碼子(或〃終止密碼子〃)可具有三種序列即5’ -UAA、5’ -UAG和5’ -UGA之一(相應(yīng)的DNA序列分別是5’ -TAA、5’ -TAG和5’ -TGA)。術(shù)語〃起始密碼子區(qū)〃和〃翻譯起始密碼子區(qū)〃是指這種mRNA或基因的一部分，涵蓋以任一方向(即，5’或3’)從翻譯起始密碼子的約25至約50個連續(xù)核苷酸。類似地，術(shù)語〃終止密碼子區(qū)〃和〃翻譯終止密碼子區(qū)〃是指這種mRNA或基因的一部分，涵蓋以任一方向(即，5’或3’)從翻譯終止密碼子的約25至約50個連續(xù)核苷酸。因此，〃起始密碼子區(qū)〃(或"翻譯起始密碼子區(qū)〃)和"終止密碼子區(qū)〃(或"翻譯終止密碼子區(qū)〃)都是可用本發(fā)明的反義化合物有效地靶向的區(qū)域。本領(lǐng)域已知開放讀碼框(ORF)或〃編碼區(qū)〃是指翻譯起始密碼子與翻譯終止密碼子之間的區(qū)域，也是可被有效地靶向的區(qū)域。在本發(fā)明范疇中，靶向的區(qū)域是涵蓋基因開放讀碼框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)域。另一靶區(qū)域包括5'非翻譯區(qū)(5’ UTR)，本領(lǐng)域已知是指mRNA以5’方向從翻譯起始密碼子的部分，因此包括mRNA的5’帽位置與翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上相應(yīng)的核苷酸)。又一靶區(qū)域包括3'非翻譯區(qū)(3’UTR)，本領(lǐng)域已知是指mRNA以3’方向從翻譯終止密碼子的部分，因此包括mRNA的翻譯終止密碼子與3’端之間的核苷酸(或基因上相應(yīng)的核苷酸)。mRNA的5’帽位置包括經(jīng)由5’ -5’三磷酸酯鍵合與mRNA的最5’殘基連接的N7-甲基化鳥苷殘基。認(rèn)為mRNA的5’帽區(qū)域包括5’帽結(jié)構(gòu)本身以及與帽位置相鄰的前50個核苷酸。本發(fā)明的另一靶區(qū)域是5’帽區(qū)域。盡管一些真核mRNA轉(zhuǎn)錄物被直接翻譯，但是許多包含一個或多個稱為〃內(nèi)含子〃的區(qū)域，在翻譯前從轉(zhuǎn)錄物切除。其余(因此被翻譯的)區(qū)域稱為"外顯子"，被剪接在一起以形成連續(xù)的mRNA序列。在一個實施方案中，靶向剪接位置，即，內(nèi)含子-外顯子結(jié)點或外顯子-內(nèi)含子結(jié)點在其中疾病中牽涉異常剪接的情形或其中疾病中牽涉特定剪接產(chǎn)物的過度產(chǎn)生的情形尤其有用。由于重排或缺失的異常融合結(jié)點是靶位置的另一形式。由剪接來自不同基因來源的兩個(或更多個)mRNA的過程產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄物稱為"融合轉(zhuǎn)錄物"。利用靶向例如DNA或前體mRNA的反義化合物可有效地靶向內(nèi)含子。在實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合靶多核苷酸的編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)并調(diào)節(jié)靶 分子的表達和/或功能。在實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合天然反義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達和/或功能。在實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合有義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達和/或功倉泛?？蓮腄NA的相同基因組區(qū)域產(chǎn)生可選RNA轉(zhuǎn)錄物。這些可選轉(zhuǎn)錄物通常稱為〃變體"。更具體地，〃前體mRNA變體〃是從相同基因組DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物，在其起始或終止位置與從相同基因組DNA產(chǎn)生的其它轉(zhuǎn)錄物不同，并包含內(nèi)含子序列和外顯子序列兩者。在剪接期間切除一個或多個外顯子或內(nèi)含子區(qū)域或其部分后，前體mRNA變體產(chǎn)生更小的"mRNA變體〃。因此，mRNA變體是加工的前體mRNA變體，且每個獨特的前體mRNA變體必定因為剪接而產(chǎn)生獨特的mRNA變體。這些mRNA變體還稱為〃可選剪接變體〃。如果不進行前體mRNA變體的剪接，則前體mRNA變體與mRNA變體相同。變體可經(jīng)由使用可選信號產(chǎn)生以起始或終止轉(zhuǎn)錄。前體mRNA和mRNA可具有多于一個起始密碼子或終止密碼子。來源于使用可選起始密碼子的前體mRNA或mRNA的變體稱為該前體mRNA或mRNA的"可選起始變體"。使用可選終止密碼子的那些轉(zhuǎn)錄物稱為該前體mRNA或mRNA的〃可選終止變體"。一種特定類型的可選終止變體是〃聚腺苷酸變體"，其中產(chǎn)生的多個轉(zhuǎn)錄物由"聚腺苷酸終止信號"之一被轉(zhuǎn)錄機制可選選擇所致，從而產(chǎn)生在獨特聚腺苷酸位點終止的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明范疇中，本文所述的變體類型也是靶核酸的實施方案。靶核酸上與反義化合物雜交的位置定義為活性反義化合物靶向的靶區(qū)域的至少5-核苷酸長的部分。盡管本文列出了某些示例性靶區(qū)段的具體序列，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些用于闡釋和描述于本發(fā)明范圍中的具體實施方案。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員考慮到本公開內(nèi)容可容易地鑒定另外的靶區(qū)段。認(rèn)為包括選自示例性優(yōu)選的靶區(qū)段中的至少五(5)個連續(xù)核苷酸的段的長度為5-100個核苷酸的靶區(qū)段也適合于靶向。靶區(qū)段可包括包括從示例性優(yōu)選的靶區(qū)段之一的5’ -末端的至少5個連續(xù)核苷酸的DNA或RNA序列(其余核苷酸為從靶區(qū)段5’ -末端的緊鄰上游開始的相同DNA或RNA的連續(xù)段并延伸直到DNA或RNA包含約5至約100個核苷酸)。類似地優(yōu)選的靶區(qū)段由包括從示例性優(yōu)選的靶區(qū)段之一的3’ -末端的至少5個連續(xù)核苷酸的DNA或RNA序列代表(其余核苷酸為從靶區(qū)段3’ -末端的緊鄰下游開始的相同DNA或RNA的連續(xù)段并延伸直到DNA或RNA包含約5至約100個核苷酸)。借助本文所示例的靶區(qū)段的本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定另外的優(yōu)選的靶區(qū)段而不需過度試驗。已經(jīng)鑒定出一種或多種靶區(qū)域、區(qū)段或位置后，選擇與靶足夠地互補，S卩，充分良好并以足夠特異性雜交的反義化合物以獲得期望作用。在本發(fā)明的實施方案中，寡核苷酸結(jié)合特定靶的反義鏈。寡核苷酸長度為至少5個核苷酸并可合成以使每個寡核苷酸靶向重疊序列，從而寡核苷酸被合成以覆蓋靶多核苷酸的整個長度。靶還包括編碼區(qū)以及非編碼區(qū)。在一個實施方案中，將反義寡核苷酸靶向特定核酸是優(yōu)選的。將反義化合物靶向特定核酸是多步驟的過程。該過程通常開始于鑒定待調(diào)節(jié)其功能的核酸序列。這一核酸序 列可以是，例如，其表達與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細胞基因(或從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)、或非編碼多核苷酸，例如非編碼RNA(ncRNA)。RNA可分為(I)信使RNA(mRNA)，其被翻譯為蛋白，和(2)非蛋白編碼RNA(ncRNA)。ncRNA包括微RNA、反義轉(zhuǎn)錄物和包含高密度終止密碼子和缺少任何廣泛的〃開放讀碼框〃的其它轉(zhuǎn)錄單位(TU)。許多ncRNA表現(xiàn)為從蛋白-編碼基因座的3'非翻譯區(qū)(3’UTR)中的起始位點開始。ncRNA通常是罕見的，已被FANTOM財團測序的ncRNA的至少一半似乎不是多腺苷酸化的。出于明顯的原因，大多數(shù)研究者集中于被加工并輸出到細胞質(zhì)的多腺苷酸化mRNA。最近，顯示非多腺苷酸化的核RNA的組可能是非常大的，且許多這樣的轉(zhuǎn)錄物來源于所謂的基因間區(qū)。ncRNA可調(diào)節(jié)基因表達的機制是通過與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對。通過堿基配對起作用的RNA可分為(I)順式編碼的RNA，其在它們所作用的RNA的相同遺傳位置但在相對鏈上被編碼，因此與其靶展示極佳的互補性，和(2)反式編碼的RNA，其在不同于它們所作用的RNA的染色體位置被編碼，通常不與其靶展示極佳的堿基-配對可能。不希望受限于理論，反義多核苷酸被本文所述的反義寡核苷酸的擾動可改變相應(yīng)有義信使RNA的表達。然而，這一調(diào)節(jié)可以是不一致的(反義敲低導(dǎo)致信使RNA升高)或一致的(反義敲低導(dǎo)致相伴的信使RNA減少)。在這些情形中，反義寡核苷酸可靶向于反義轉(zhuǎn)錄物的重疊或非重疊部分，導(dǎo)致其敲低或隔離。編碼以及非編碼反義可以相同方式靶向，任一種類能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)的有義轉(zhuǎn)錄物-以一致的或不一致的方式。鑒定針對靶使用的新寡核苷酸中采用的策略可基于反義RNA轉(zhuǎn)錄物被反義寡核苷酸的敲低或調(diào)節(jié)期望靶的任何其它手段。策略I :在不一致調(diào)節(jié)的情形下，敲低反義轉(zhuǎn)錄物升高常規(guī)(有義)基因的表達。如果后者基因編碼已知或推測的藥物靶，則其反義對應(yīng)物的敲低能夠可設(shè)想地模擬受體激動劑或酶刺激劑的作用。策略2 :在一致調(diào)節(jié)的情形下，人們可以協(xié)同地敲低反義轉(zhuǎn)錄物和有義轉(zhuǎn)錄物兩者，從而實現(xiàn)常規(guī)(有義)基因表達的協(xié)同減少。例如，如果反義寡核苷酸用來實現(xiàn)敲低，則這一策略可用來施加靶向有義轉(zhuǎn)錄物的一種反義寡核苷酸和靶向相應(yīng)反義轉(zhuǎn)錄物的另一反義寡核苷酸，或同時靶向重疊的有義轉(zhuǎn)錄物和反義轉(zhuǎn)錄物的單個有力地對稱的反義寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物以及雜交于靶核酸的至少一部分并調(diào)節(jié)其功能的其它寡聚化合物。因此，它們可以是DNA、RNA、DNA-樣、RNA-樣或其混合物，或可以是一種或多種這些的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物，并可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部凸出或末端凸出、錯配或環(huán)。常規(guī)線性地制備反義化合物，但可被連接或以其它方式制備為環(huán)狀和/或分支的。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如，兩條鏈雜交以形成完全或部分雙鏈的化合物或者具有足夠自互補性的單鏈以允許雜交和形成完全或部分雙鏈的化合物。兩條鏈可在內(nèi)部被連接，留下游離的3’或5’末端，或可被連接以形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可包含在5’或3’末端的突出，產(chǎn)生單鏈特征的延伸段。雙鏈化合物任選地可包括在末端的突出。進一步的修飾可包括附加于末端之一、所選的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵合之一的綴合物基團?？蛇x地，兩條鏈可經(jīng)由非核酸部分或接頭基團連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時，dsRNA可采取自互補發(fā)夾型分子的形式，其與自身對折以形成雙鏈體。因此，dsRNA可以是完全或部分雙鏈的?；虮磉_的特異性調(diào)節(jié)可通過在轉(zhuǎn)基因細胞系中穩(wěn)定表達dsRNA發(fā)夾來實現(xiàn),然而,在一些實施方案中，基因表達或功能被上調(diào)。當(dāng)由兩條鏈或采取與自身對折以形成雙鏈體的自互補發(fā)夾型分子形式的單鏈形成時，兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))是以Watson-Crick方式堿基配對的互補RNA鏈。被引入系統(tǒng)中后，本發(fā)明的化合物可引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實現(xiàn)靶核酸的裂解或其它修飾，或可經(jīng)由基于占位性的機制作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可描述為"DNA-樣〃(S卩，通常具有一個或多個2’ -脫氧糖，且通常具有T而不是U堿基)或〃RNA-樣〃(即，通常具有一個或多個2’ -羥基或2’ -修飾的糖，且通常具有U而不是T堿基)。核酸螺旋可采用多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最通常是A-和B-形式。通常認(rèn)為，具有B-形式-樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是"DNA-樣〃，且具有A-形式樣結(jié)構(gòu)的是"RNA-樣〃。在一些(嵌合)實施方案中，反義化合物可包含A-形式區(qū)域和B-形式區(qū)域兩者。在實施方案中，期望寡核苷酸或反義化合物包括以下至少一種反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包括修飾的鍵合的反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA (siRNA)、微干擾 RNA (miRNA)、時序調(diào)節(jié)小 RNA (stRNA)或短發(fā)夾 RNA (shRNA)、小 RNA-誘導(dǎo)的基因活化(RNAa)、小活化RNA(saRNA)或其組合。 dsRNA還可活化基因表達，這是已被稱為"小RNA-誘導(dǎo)的基因活化〃或RNAa的機制。dsRNA靶向基因啟動子誘導(dǎo)相關(guān)基因的有效的轉(zhuǎn)錄活化。RNAa在人細胞中利用合成的dsRNA證實，稱為"小活化RNA" (saRNA)。目前未知RNAa在其它生物體中是否是保守的。已發(fā)現(xiàn)小雙鏈RNA (dsRNA)，例如小干擾RNA (siRNA)和微RNA (miRNA)是稱為RNA干擾(RNAi)的進化保守機制的觸發(fā)物。RNAi不變性經(jīng)由重建染色質(zhì)導(dǎo)致基因沉默，從而阻遏轉(zhuǎn)錄、降解互補mRNA或阻斷蛋白翻譯。然而在以下實施例部分詳細描述的情況中，寡核苷酸顯示增加RNA酶Hl多核苷酸和其編碼的產(chǎn)物的表達和/或功能。dsRNA還可作為小活化RNA(saRNA)作用。不希望受理論束縛，通過靶向基因啟動子中的序列，saRNA將以稱為dsRNA-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化(RNAa)的現(xiàn)象誘導(dǎo)靶基因表達。在進一步的實施方案中，本文鑒定的〃優(yōu)選的靶區(qū)段〃可用于篩選調(diào)節(jié)RNA酶Hl多核苷酸表達的另外的化合物?！ㄕ{(diào)節(jié)劑〃是減少或增加編碼RNA酶Hl的核酸分子表達的那些化合物，且包括與優(yōu)選的靶區(qū)段互補的至少5-核苷酸部分。篩選方法包括以下步驟將編碼RNA酶Hl的有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的優(yōu)選的靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，并選擇減少或增加編碼RNA酶Hl多核苷酸的核酸分子(例如SEQ ID NO:6至13)的表達的一種或多種候選調(diào)節(jié)劑。顯示一種或多種候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如，減少或增加)編碼RNA酶Hl多核苷酸的核酸分子的表達后，隨后調(diào)節(jié)劑可用于RNA酶Hl多核苷酸功能的進一步研究性研究，或用作根據(jù)本發(fā)明的研究劑、診斷劑或治療劑。靶向天然反義序列優(yōu)選地調(diào)節(jié)靶基因的功能。例如，RNA酶Hl基因(例如，登錄號NM_002936)。在實施方案中，靶是RNA酶Hl基因的反義多核苷酸。在實施方案中，反義寡核苷酸靶向RNA酶Hl多核苷酸(例如，登錄號NM_002936)的有義和/或天然反義序列、變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。優(yōu)選地寡核苷酸是反義分子且靶包括反義和/或有義RNA酶Hl多核苷酸的編碼區(qū)和非編碼區(qū)。本發(fā)明優(yōu)選的靶區(qū)段還可與本發(fā)明的其各自的互補反義化合物組合以形成穩(wěn)定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。 在本領(lǐng)域中，這種雙鏈寡核苷酸部分已顯示經(jīng)由反義機制調(diào)節(jié)靶表達和調(diào)節(jié)翻譯以及RNA加工。而且，可對雙鏈部分進行化學(xué)修飾。例如，這種雙鏈部分已經(jīng)顯示通過雙鏈體的反義鏈與靶經(jīng)典雜交，從而觸發(fā)靶的酶促降解來抑制靶。在實施方案中，反義寡核苷酸靶向RNA酶Hl多核苷酸(例如，登錄號NM_002936)、變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。優(yōu)選地寡核苷酸是反義分子。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，靶核酸分子不限于僅RNA酶H1，還延伸到RNA酶Hl分子的同種型、受體、同系物和類似物的任一種。在實施方案中，寡核苷酸靶向RNA酶Hl多核苷酸的天然反義序列，例如，如SEQ IDN0:2至5所列的多核苷酸，和任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。反義寡核苷酸的實例列在SEQ ID N0:6至13。在一個實施方案中，寡核苷酸與RNA酶Hl反義的核酸序列互補或結(jié)合，包括但不限于RNA酶Hl多核苷酸相關(guān)的非編碼有義和/或反義序列，并調(diào)節(jié)RNA酶Hl分子的表達和/或功能。在實施方案中，寡核苷酸與如SEQ ID N0:2至5所列的RNA酶Hl天然反義的核酸序列互補或結(jié)合，并調(diào)節(jié)RNA酶Hl分子的表達和/或功能。在實施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID N0:6至13的至少5個連續(xù)核苷酸的序列，并調(diào)節(jié)RNA酶Hl分子的表達和/或功能。多核苷酸靶包括RNA酶Hl，包括其家族成員、RNA酶Hl的變體；RNA酶Hl的突變體，包括SNP ;RNA酶Hl的非編碼序列；RNA酶Hl的等位基因；物種變體、片段和類似物。優(yōu)選地寡核苷酸是反義分子。在實施方案中，靶向RNA酶Hl多核苷酸的寡核苷酸包括反義RNA、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA);微干擾RNA (miRNA);時序調(diào)節(jié)小RNA (stRNA);或短發(fā)夾RNA(shRNA);小RNA誘導(dǎo)的基因活化(RNAa);或小活化RNA(saRNA)。在實施方案中，靶向RNA酶Hl多核苷酸(例如SEQ ID N0:2至5)調(diào)節(jié)這些靶的表達或功能。在一個實施方案中，與對照相比表達或功能被上調(diào)。在實施方案中，與對照相比表達或功能被下調(diào)。在實施方案中，反義化合物包括如SEQ ID N0:6至13所列的序列。這些寡核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸、更短或更長片段、修飾的鍵和類似物。在實施方案中，SEQ ID NO:6至13包括一種或多種LNA核苷酸。期望靶核酸的調(diào)節(jié)可以本領(lǐng)域已知的多種方式進行。例如，反義寡核苷酸、siRNA等。酶促核酸分子(例如，核酶)是能夠催化多種反應(yīng)的一種或多種的核酸分子，包括以核苷酸堿基序列特異性方式重復(fù)地裂解其它單獨核酸分子的能力。這種酶促核酸分子可用于例如靶向幾乎任何RNA轉(zhuǎn)錄物。由于其序列特異性，反式裂解酶促核酸分子顯示用作人疾病的治療劑的希望?？稍O(shè)計酶促核酸分子以裂解細胞RNA背景中的特定RNA靶。這種裂解事件使得mRNA無功能 并消除從該RNA的蛋白表達。以這種方式，可選擇性地抑制疾病狀態(tài)相關(guān)的蛋白的合成。通常，具有RNA裂解活性的酶促核酸通過首先結(jié)合靶RNA來作用。這種結(jié)合經(jīng)由被保持在鄰近用于裂解靶RNA的分子的酶促部分的酶促核酸的靶結(jié)合部分來進行。因此，酶促核酸首先識別靶RNA然后經(jīng)由互補堿基配對結(jié)合靶RNA，結(jié)合到正確位置時，酶促地作用以切割靶RNA。對這種靶RNA的關(guān)鍵裂解將破壞其指導(dǎo)編碼蛋白合成的能力。在酶促核酸已結(jié)合和裂解其RNA靶后，其從該RNA釋放以搜尋另一靶并可重復(fù)地結(jié)合和裂解新的靶。多種方法例如體外選擇(進化)策略(OrgeI, (1979) Proc. R. Soc. London, B205，435)已經(jīng)用于進化能夠催化多種反應(yīng)(例如磷酸二酯鍵合和酰胺鍵合的裂解和連接)的新核酸催化劑。催化活性最佳的核酶的開發(fā)將顯著有助于為了調(diào)節(jié)基因表達的目的采用RNA-裂解核酶的任何策略。例如，錘頭狀核酶在飽和(IOmM)濃度的Mg2+輔因子存在下以約ImirT1的催化速率(kcat)作用。人工的"RNA連接酶〃核酶已經(jīng)顯示以約IOOmirT1的速率催化相應(yīng)的自修飾反應(yīng)。此外，已知具有DNA制成的底物結(jié)合臂的某些修飾的錘頭狀核酶以接近IOOmin-1的多倍周轉(zhuǎn)率催化RNA裂解。最后，用某些核苷酸類似物代替錘頭的催化核心中的特定殘基獲得顯示催化速率改進多達10倍的修飾的核酶。這些發(fā)現(xiàn)證明，核酶可促進化學(xué)轉(zhuǎn)化，伴隨催化速率顯著大于大多數(shù)天然自裂解核酶體外展示的催化速率。那么可能可優(yōu)化某些自裂解核酶的結(jié)構(gòu)以獲得最大催化活性，或可能可制備對于RNA磷酸二酯裂解展示顯著更快速率的完全新的RNA基序。符合〃錘頭〃模型的RNA催化劑對RNA底物的分子間裂解首次在1987年顯示(Uhlenbeck, 0. C. (1987)Nature, 328:596-600)。回收 RNA 催化劑并與多種 RNA 分子反應(yīng)，證實其真正是催化性的。通過在催化性RNA中進行適當(dāng)?shù)膲A基改變以保持與靶序列必需的堿基配對，基于〃錘頭〃基序設(shè)計的催化性RNA已用于裂解特定靶序列。這已經(jīng)允許使用催化性RNA來裂解特定靶序列并指示，按照"錘頭"模型設(shè)計的催化性RNA可能可體內(nèi)裂解特定底物RNA。RNA干擾(RNAi)已經(jīng)變成在哺乳動物和哺乳動物細胞中調(diào)節(jié)基因表達的強有力工具。這一方法要求利用表達質(zhì)?；虿《竞捅患庸閟iRNA的小發(fā)夾RNA的編碼序列遞送作為RNA本身或作為DNA的小干擾RNA(siRNA)。這一系統(tǒng)使得能夠有效地運輸前體siRNA到細胞質(zhì)，在那里它們是活性的，并允許使用用于基因表達的受控型啟動子和組織特異性啟動子。在實施方案中，寡核苷酸或反義化合物包括核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物或其模擬物、嵌合體、類似物或同系物。這一術(shù)語包括包括天然存在的核苷酸、糖和共價核苷間(主鏈)鍵的寡核苷酸以及具有類似地起作用的非天然存在的部分的寡核苷酸。因為期望的特性，例如對增加的細胞攝取、對靶核酸增加的親和力和在核酸酶存在下增加的穩(wěn)定性，這種修飾的或取代的寡核苷酸通常相比于天然形式是期望的。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸或〃反義化合物〃包括反義寡核苷酸(例如，RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類似物或同系物)、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA和與靶核酸的至少一部分雜交并調(diào)節(jié)其功能的其它寡聚化合物。因此，它們可以是DNA、RNA、DNA-樣、RNA-樣或其混合物，或可以是一種或多種這些的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化 合物，并可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部凸出或末端凸出、錯配或環(huán)。常規(guī)線性地制備反義化合物，但可被連接或以其它方式制備為環(huán)狀和/或分支的。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如，兩條鏈雜交以形成完全或部分雙鏈的化合物，或具有足夠自互補性的單鏈以允許雜交和形成完全或部分雙鏈的化合物。兩條鏈可在內(nèi)部被連接，留下游離的3’或5’末端，或可被連接以形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可包含在5’或3’末端的突出，產(chǎn)生單鏈特征的延伸段。雙鏈化合物任選地可包括在末端的突出。進一步的修飾可包括附加于末端之一、所選的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵合之一的綴合物基團?？蛇x地，兩條鏈可經(jīng)由非核酸部分或接頭基團連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時，dsRNA可采取自互補發(fā)夾型分子的形式，其與自身對折以形成雙鏈體。因此，dsRNA可以是完全或部分雙鏈的。基因表達的特異性調(diào)節(jié)可通過在轉(zhuǎn)基因細胞系中穩(wěn)定表達dsRNA發(fā)夾來實現(xiàn)。當(dāng)由兩條鏈或采取與自身對折以形成雙鏈體的自互補發(fā)夾型分子形式的單鏈形成時，兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))是以Watson-Crick方式喊基配對的互補RNA鏈。被引入系統(tǒng)中后，本發(fā)明的化合物可引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實現(xiàn)靶核酸的裂解或其它修飾，或可經(jīng)由基于占位性的機制作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可描述為"DNA-樣〃(S卩，通常具有一個或多個2’ -脫氧糖，且通常具有T而不是U堿基)或〃RNA-樣〃(即，通常具有一個或多個2’ -羥基或2’ -修飾的糖，且通常具有U而不是T堿基)。核酸螺旋可采用多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最通常是A-和B-形式。通常認(rèn)為，具有B-形式-樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是"DNA-樣〃，且具有A-形式樣結(jié)構(gòu)的是"RNA-樣〃。在一些(嵌合)實施方案中，反義化合物可包含A-形式區(qū)域和B-形式區(qū)域兩者。根據(jù)本發(fā)明的反義化合物可包括長度為從約5至約80個核苷酸(即，從約5至約80個連接的核苷)的反義部分。這是指反義化合物的反義鏈或部分的長度。換言之，本發(fā)明的單鏈反義化合物包括從5至約80個核苷酸，且本發(fā)明的雙鏈反義化合物(例如dsRNA)包括長度為5至約80個核苷酸的有義和反義鏈或部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，這包括長度為 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個核苷酸或其中的任何范圍的反義部分。
在一個實施方案中，本發(fā)明的反義化合物具有長度為10至50個核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，這包括具有長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸或其中的任何范圍的反義部分的寡核苷酸。在一些實施方案中，寡核苷酸長度為15個核苷酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的反義或寡核苷酸化合物具有長度為12或13至30個核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，這包括具有長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸或其中的任何范圍的反義部分的反義化合物。在實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括變體，其中在化合物中一個或多個核苷酸位置存在不同堿基。例如，如果第一個核苷酸是腺嘌呤，可產(chǎn)生在這一位置包含胸苷、鳥苷或胞苷的變體。這可在反義或dsRNA化合物的任何位置進行。隨后利用本文所述的方法測定這些化合物以確定它們抑制靶核酸表達的能力。 在一些實施方案中，反義化合物與靶之間的同源性、序列同一性或互補性是從約40%至約60%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約60%至約70%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約70%至約80%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約80%至約90%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。在實施方案中，反義寡核苷酸，例如SEQ ID N0:2至13所列的核酸分子，包括一種或多種取代或修飾。在一個實施方案中，核苷酸是用鎖核酸(LNA)取代的。在實施方案中，寡核苷酸靶向與RNA酶Hl和如SEQ ID NO: I至5所列的序列相關(guān)的編碼和/或非編碼序列的有義和/或反義的核酸分子的一個或多個區(qū)域。寡核苷酸還靶向于SEQ ID NO: I至5的重疊區(qū)域。本發(fā)明某些優(yōu)選的寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本發(fā)明范疇中，"嵌合寡核苷酸"或"嵌合體"是包含兩個或更多個化學(xué)不同區(qū)域的寡核苷酸，每個區(qū)域由至少一個核苷酸組成。這些寡核苷酸通常包含賦予一種或多種有益特性(例如，增加的核酸酶耐受性、增加的攝取入細胞、增加的對靶的結(jié)合親和力)的修飾的核苷酸的至少一個區(qū)域和為能夠裂解RNA: DNA或RNA: RNA雜交物的酶的底物的區(qū)域。例如，RNA酶H是裂解RNA: DNA雙鏈體的RNA鏈的細胞核酸內(nèi)切酶。因此，RNA酶H的活化導(dǎo)致RNA靶的裂解，從而大大增強基因表達的反義調(diào)節(jié)的效力。因此，與雜交于相同靶區(qū)域的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，當(dāng)使用嵌合寡核苷酸時以較短寡核苷酸通?？色@得可比較的結(jié)果。RNA靶的裂解可常規(guī)地通過凝膠電泳來檢測，如果需要，通過本領(lǐng)域已知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)來檢測。在一個實施方案中，嵌合寡核苷酸包括經(jīng)修飾以增加靶結(jié)合親和性的至少一個區(qū)域和通常作為RNA酶H底物作用的區(qū)域。寡核苷酸對其靶(在這一情形中是編碼ras的核酸)的親和性常規(guī)地通過測量寡核苷酸/靶配對的Tm來確定，Tm是寡核苷酸與靶解離的溫度；分光光度地檢測解離。Tm越高，寡核苷酸對靶的親和性越大。本發(fā)明的嵌合反義化合物可形成為兩種或更多種寡核苷酸、如上所述的修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的復(fù)合結(jié)構(gòu)。這種化合物在本領(lǐng)域中也已稱為雜交物或間隙體(gapmer)。教導(dǎo)這種雜交物結(jié)構(gòu)的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利 No. 5，013，830,5, 149，797,5, 220，007,5, 256，775,5, 366，878,5, 403，711,5, 491，133、5，565，350,5, 623，065,5, 652，355,5, 652，356 和 5，700，922，其每一個通過引用并入本文。在實施方案中，經(jīng)修飾的寡核苷酸的區(qū)域包括在糖的2’位置修飾的至少一個核苷酸，最優(yōu)選地2’ -0烷基、2’ -0-烷基-0-烷基或2’ -氟-修飾的核苷酸。在其它實施方案中，RNA修飾包括在RNA 3’端的嘧啶、脫堿基殘基或反向堿基的核糖上的2’ -氟、2’ -氨基和2’ 0-甲基修飾。這種修飾常規(guī)地并入寡核苷酸，且這些寡核苷酸已經(jīng)顯示對給定靶具有比2’ -脫氧寡核苷酸更高的Tm(即，更高的靶結(jié)合親和性)。這種增加的親和性的作用是大大增強基因表達的RNAi寡核苷酸抑制。RNA酶H是裂解RNA = DNA雙鏈體的RNA鏈的細胞核酸內(nèi)切酶；因此該酶的活化導(dǎo)致RNA靶的裂解，從而可大大增強RNAi抑制的效力。RNA靶的裂解可常規(guī)地通過凝膠電泳來證實。在實施方案中，還修飾嵌合寡核苷酸以增強核酸酶的耐受性。細胞包含多種可降解核酸的核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。多種核苷酸和核苷修飾已經(jīng)顯示使得它們并入的寡核苷酸比天然寡脫氧核苷酸對核酸酶消化更耐 受。核酸酶耐受性常規(guī)地通過如下測量培養(yǎng)寡核苷酸與細胞提取物或分離的核酸酶溶液，并隨著時間測量剩余的完整寡核苷酸的程度，通常通過凝膠電泳測量。經(jīng)修飾以增強其核酸酶耐受性的寡核苷酸比未修飾的寡核苷酸保持完整更長時間。多種寡核苷酸修飾已證實增強或賦予核酸酶耐受性。包含至少一種硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸目前是更優(yōu)選的。在一些情形中，增強靶結(jié)合親和性的寡核苷酸修飾也獨立地能夠增強核酸酶耐受性。本發(fā)明預(yù)期的一些優(yōu)選的寡核苷酸的具體實例包括包括修飾的主鏈的那些，例如，硫代磷酸酯、磷酸三酯、膦酸甲基酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵合或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間鍵合。更優(yōu)選的是具有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸和具有雜原子主鏈的那些，尤其是CH2—NH—0—CH2、CH、—N (CH3) —0—CH2 [稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI主鏈]、CH2--0—N(CH3)—CH2、CH2-N(CH3)—N(CH3)—CH2 和 0—N (CH3)—CH2—CH2 主鏈，其中天然磷酸二酯主鏈表示為0—P—0—CH。由De Mesmaeker等(1995)Acc. Chem.Res. 28:366-374公開的酰胺主鏈也是優(yōu)選的。還優(yōu)選的是具有嗎啉代主鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(Summerton和Weller,美國專利No. 5，034, 506)。在其它實施方案中，例如肽核酸(PNA)主鏈，寡核苷酸的磷酸二酯主鏈被聚酰胺主鏈代替，核苷酸被直接或間接地結(jié)合于聚酰胺主鏈的氮雜氮原子。寡核苷酸還可包括一種或多種取代的糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸在2’位置包括以下之一 0H、SH、SCH3、F、OCN、0CH30CH3、0CH30(CH2)n CH3、0(CH2)n NH2 或 0(CH2)n CH3，其中n是I至約10 ；C1至ClO低級烷基、烷氧基烷氧基、取代的低級烷基、烷芳基或芳烷基；C1 ；Br ；CN ；CF3 ；0CF3 ;0—、S—或 N-烷基；0—、S—或 N-烯基；S0CH3 ；S02CH3 ；0N02 ；N02 ；N3 ；NH2 ;雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA裂解基團；報告基團；嵌入劑；用于改善寡核苷酸藥代動力學(xué)特性的基團；或用于改善寡核苷酸藥效學(xué)特性的基團和具有類似特性的其它取代基。優(yōu)選的修飾包括2’-甲氧基乙氧基[2’ -0-CH2CH20CH3，還稱為’ -0-(2-甲氧基乙基)]。其它優(yōu)選的修飾包括2’ -甲氧基(2’ -0—CH3)、2’ -丙氧基(2’ -0CH2CH2CH3)和2’ -氟(2’ -F)。還可在寡核苷酸上的其它位置進行類似修飾，尤其是3’末端核苷酸上糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸還可具有糖模擬物例如環(huán)丁基來代替戊呋喃糖基。另外或可選地，寡核苷酸還可包括核堿基(本領(lǐng)域中通常簡稱為〃堿基〃)修飾或取代。本文所用的"未修飾"或"天然"核苷酸包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核苷酸包括天然核酸中僅僅罕見或短暫出現(xiàn)的核苷酸，例如，次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶、尤其是5-甲基胞嘧啶(也稱為5-甲基-2’脫氧胞嘧啶，本領(lǐng)域中通常稱為5-Me-C)、5_羥基甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龍膽二糖基HMC以及合成的核苷酸，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它雜取代的烷基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基甲基尿嘧啶、8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N6 (6-氨基己基)腺嘌呤和2，6- 二氨基嘌呤?？砂ū绢I(lǐng)域中已知的〃通用〃堿基，例如肌苷。5-Me-C取代已顯示增加核酸雙鏈體的穩(wěn)定性0. 6-1. 2°C，是目前優(yōu)選的堿基取代。本發(fā)明寡核苷酸的另一修飾包括與該寡核苷酸化學(xué)連接增強寡核苷 酸的活性或細胞攝取的一個或多個部分或綴合物。這種部分包括但不限于脂質(zhì)部分例如膽固醇部分、膽固醇基部分、脂肪族鏈如十二烷二醇或十一烷基殘基、聚胺或聚乙二醇鏈或金剛烷乙酸。包括親脂部分的寡核苷酸和制備這種寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的，例如，美國專利No. 5，138，045,5, 218，105 和 5，459，255。給定的寡核苷酸中的所有位置不必一致地被修飾，事實上多于一個上述修飾可并入單個寡核苷酸中或甚至在寡核苷酸中的單個核苷中。本發(fā)明還包括為上文定義的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。在另一實施方案中，本發(fā)明的核酸分子綴合于另一部分，該另一部分包括但不限于脫堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或聚烴化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，這些分子可在糖、堿基或磷酸酯基團上的多個位置連接于一種或多種任何核苷酸(包括核酸分子)。根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸可方便和常規(guī)地通過公知的固相合成技術(shù)制備。用于這種合成的設(shè)備由包括Applied Biosystems的多個供應(yīng)商出售。還可采用用于這種合成的任何其它手段；寡核苷酸的實際合成完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的才能范圍內(nèi)。還公知的是使用類似技術(shù)來制備其它寡核苷酸例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。還公知的是使用類似技術(shù)和市售可獲得的修飾的亞酰胺化物(amidite)和可控孔度玻璃(CPG)產(chǎn)物例如生物素、突光素、卩丫唳或補骨脂素-修飾的亞酰胺化物和/或CPG(可從Glen Research, SterlingVA獲得)來合成熒光標(biāo)記的、生物素化的或其它修飾的寡核苷酸，例如膽固醇-修飾的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，使用修飾例如使用LNA單體來增強包括本發(fā)明化學(xué)性質(zhì)例如M0E、ANA、FANA、PS等的寡核苷酸的效力、特異性和作用持續(xù)時間并增寬所述寡核苷酸施用途徑。這可通過以LNA單體取代本發(fā)明寡核苷酸中的一些單體來實現(xiàn)。LNA修飾的寡核苷酸可具有與親本化合物相似的大小或可更大或優(yōu)選地更小。優(yōu)選地，這種LNA-修飾的寡核苷酸包含少于約70%、更優(yōu)選地少于約60%、最優(yōu)選地少于約50%的LNA單體，且其大小為約5至25個核苷酸，更優(yōu)選地約12至20個核苷酸。優(yōu)選的修飾的寡核苷酸主鏈包括但不限于，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、膦酸甲基酯和其它膦酸烷基酯(包括膦酸3’亞烷基酯和手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’ -氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰磷酸烷基酯、硫羰烷基磷酸三酯和具有正常3’ -5’鍵合的硼磷酸酯、這些的2’-5’連接的類似物和具有倒轉(zhuǎn)極性的那些，其中相鄰的核苷單元對是3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2'連接的。還包括多種鹽、混合鹽和游離酸形式。教導(dǎo)以上含磷鍵合的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利No. 3，687，808,4, 469，863,4, 476，301,5, 023，243,5, 177，196,5, 188，897,5, 264，423、5，276，019、5，278，302、5，286，717、5，321，131、5，399，676、5，405, 939、5，453，496、5，455，233,5, 466，677,5, 476，925,5, 519，126,5, 536，821,5, 541，306,5, 550, 111、5，563，253,5, 571，799,5, 587，361 和 5，625，050，其每一個通過引用并入本文。其中不包含磷原子的優(yōu)選的修飾的寡核苷酸主鏈具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合或者一種或多種短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合形成的主鏈。這些包括具有嗎啉代鍵合(部分地從核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲?；?formacetyl)和硫代甲?；麈?；亞甲基甲?；土虼姿峄麈?；含鏈稀的主鏈；氣基橫酸酷主鏈；亞甲基亞胺基和亞甲基餅基主鏈；橫 酸酯和磺胺主鏈；酰胺主鏈；和具有混合的N、O、S和CH2組成部分的其它主鏈。教導(dǎo)以上寡核苷的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利No. 5，034，506,5, 166，315,5, 185，444,5, 214，134,5, 216，141,5, 235，033,5, 264，562、5，264，564,5,405，938,5,434，257,5, 466，677,5, 470，967,5, 489，677,5, 541，307、5，561，225,5, 596，086,5, 602, 240,5, 610, 289,5, 602, 240,5, 608, 046,5, 610, 289、5，618，704,5, 623，070,5, 663，312,5, 633，360,5, 677，437 和 5，677，439，其每一個通過引用并入本文。在其它優(yōu)選的寡核苷酸模擬物中，核苷酸單元的糖和核苷間鍵合兩者即主鏈被新的基團代替。堿基單元被保留用于與適當(dāng)?shù)暮怂岚谢衔镫s交。一種這樣的寡聚化合物，即已顯示具有極佳的雜交特性的寡核苷酸模擬物稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-主鏈被包含酰胺的主鏈，特別是氨基乙基甘氨酸主鏈代替。核堿基被保留，并直接或間接與主鏈的酰胺部分的氮雜氮原子結(jié)合。教導(dǎo)PNA化合物的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利No. 5，539，082,5, 714，331和5，719，262，其每一個通過引用并入本文。PNA化合物的進一步教導(dǎo)可見于Nielsen等(1991) Science 254,1497-1500。在本發(fā)明的實施方案中，具有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸和具有雜原子主鏈的寡核苷，尤其是-CH2-NH-0-CH2、稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI主鏈的_CH2_N(CH3)-O-CH2-、-CH2-0-N(CH3) -CH2、_CH2N(CH3) _N(CH3) CH2 和 _0_N(CH3) -CH2-CH2，其中天然磷酸二酯主鏈表示為以上引用的美國專利No. 5，489，677的-0-P-0-CH2-和以上引用的美國專利No. 5，602, 240的酰胺主鏈。還優(yōu)選的是具有以上引用的美國專利No. 5，034, 506的嗎啉代主鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。修飾的寡核苷酸還可包含一種或多種取代的糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸在2’位置包括以下之一 0H ；F ;0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或0烷基-0-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C至CO烷基或C2至CO烯基和炔基。尤其優(yōu)選的是 0(CH2)n 0mCH3、0(CH2)n、0CH3、0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、0 (CH2)n0NH2和0(CH2n0N(CH2)nCH3)2，其中n和m可以為I至約10。其它優(yōu)選的寡核苷酸包括在2’位置包括以下之一 C至CO低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或0-芳烷基、SH、SCH3、0CN、Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02CH3、0N02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)燒芳基、氣基燒基氣基、聚燒基氣基、取代的甲娃燒基、RNA裂解基團、報告基團、嵌入劑、用于改善寡核苷酸藥代動力學(xué)特性的基團或用于改善寡核苷酸藥效學(xué)特性的基團和具有類似特性的其它取代基。優(yōu)選的修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2’-0-CH2CH20CH3，還稱為2’-0-(2-甲氧基乙基)或2’-M0E)即，烷氧基烷氧基基團。另外優(yōu)選的修飾包括如在本文以下實施例中描述的2’ - 二甲基氨基氧基乙氧基，即0 (CH2) 20N (CH3) 2基團，還稱為2’-DMAOEdP 2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域還稱為2’-0-二甲基氨基乙氧基乙基或 2’-DMAE0E)，SP，2’-0-CH2-0-CH2-N(CH2)2。其它優(yōu)選的修飾包括2’ -甲氧基(2’ -0—CH3)、2’ -氨基丙氧基(2’ -0CH2 CH2CH3)和2’-氟(2’-F)。還可在寡核苷酸上的其它位置進行類似修飾，尤其是3’末端核苷酸或2’_5’連接的寡核苷酸上糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸還可具有糖模擬物例如環(huán)丁基部分來代替戊呋喃糖基糖。教導(dǎo)這種修飾的糖結(jié)構(gòu)的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利 No. 4，981，957,5, 118，800,5, 319，080,5, 359，044,5, 393，878、5，446，137、5，466，786、5，514，785、5，519，134、5，567，811,5, 576，427、5，591，722、5，597，909,5, 610，300,5, 627，053,5, 639，873,5, 646，265,5, 658，873,5, 670，633 和5，700, 920，其每一個通過引用并入本文。 寡核苷酸還可包括核堿基(本領(lǐng)域中通常簡稱為〃堿基〃)修飾或取代。本文所用的"未修飾"或"天然"核苷酸包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)、和嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核苷酸包括其它合成的和天然核苷酸例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5_羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假-尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫氫基、8-硫烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代尤其是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤和3-脫氮雜鳥嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。此外，核苷酸包括美國專利No. 3，687，808中公開的那些、’ TheConciseEncyclopedia of Polymer Science And Engineering’,第 858-859 頁,Kroschwitz, J.I 編著.John Wiley & Sons, 1990 中公開的那些、Englisch 等，’AngewandleChemie, International Edition’, 1991, 30,第 613 頁中公開的那些以及 Sanghvi, Y.S.，第 15 章，’Antisense Research and Applications’，第 289-302 頁,Crooke, S.T.和Lebleu，B.編著，CRCPress，1993中公開的那些。這些核苷酸的某些尤其有用于增加本發(fā)明寡聚化合物的結(jié)合親和性。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶、N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示增加核酸雙鏈體穩(wěn)定性0. 6-1. 2 V (Sanghvi, Y. S.，Crooke, S.T.和 Lebleu, B.編著，’Antisense Research and Applications’，CRC Press,BocaRaton, 1993，pp. 276-278)，并且是目前優(yōu)選的堿基取代，甚至更尤其是當(dāng)與2’ -0甲氧基乙基糖修飾組合時。教導(dǎo)上述修飾的核苷酸以及其它修飾的核苷酸的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利 No. 3，687，808 以及 4，845，205,5, 130，302,5, 134，066,5, 175，273、5，367，066、5，432，272、5，457，187、5，459，255、5，484，908、5，502，177、5，525，711、5，552，540,5, 587，469,5, 596，091,5, 614，617,5, 750，692 和 5，681，941，其每一個通過引
用并入本文。本發(fā)明寡核苷酸的另一修飾包括將寡核苷酸化學(xué)連接于增強寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取的一個或多個部分或綴合物。這種部分包括但不限于，脂質(zhì)部分例如膽固醇部分、膽酸、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫膽固醇、脂肪族鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基、磷脂例如二 -十六烷基-rac-甘油或1，2- 二 -0-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸三乙基銨、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚?；糠帧⒒蚴税坊蚣夯被?羰基_t羥膽固醇部分。教導(dǎo)這種寡核苷酸綴合物的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利No. 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、5，578，717、5，580, 731、5，580, 731、5，591，584、5，109, 124、5，118，802、5，138，045、5，414，077,5,486，603,5,512，439,5, 578，718,5, 608，046,4, 587，044,4, 605，735、 4，667，025,4, 762，779,4, 789，737,4, 824，941,4, 835，263,4, 876，335,4, 904，582、4，958，013、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，245，022,5, 254，469,5, 258，506,5, 262，536,5, 272，250,5, 292，873,5, 317，098、5，371，241、5，391，723、5，416，203、5，451，463、5，510，475、5，512，667、5，514，785、5，565，552,5, 567，810,5, 574，142,5, 585，481,5, 587，371,5, 595，726,5, 597，696、5，599，923,5, 599，928和5，688，941，其每一個通過引用并入本文。藥物發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物還可應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)和靶確認(rèn)的領(lǐng)域。本發(fā)明涵蓋本文鑒定的化合物和優(yōu)選的靶區(qū)段在藥物發(fā)現(xiàn)嘗試中使用以闡明RNA酶Hl多核苷酸與疾病狀態(tài)、表型或疾患之間存在的關(guān)聯(lián)。這些方法包括檢測或調(diào)節(jié)RNA酶Hl多核苷酸，包括將樣品、組織、細胞或生物體與本發(fā)明化合物接觸，在處理后某一時間測量RNA酶Hl多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相關(guān)的表型或化學(xué)端點，和任選地將測量值與未處理樣品或用本發(fā)明另外化合物處理的樣品比較。這些方法還可與其它試驗平行或組合進行，以為靶確認(rèn)方法確定未知基因的功能，或確定特定基因產(chǎn)物作為治療或預(yù)防特定疾病、疾患或表型的靶的有效性。評價基因表達的上調(diào)或抑制外源核酸向宿主細胞或生物體中的轉(zhuǎn)移可通過直接檢測細胞或生物體中該核酸的存在來評價。這種檢測可通過本領(lǐng)域公知的多種方法來實現(xiàn)。例如，外源核酸的存在可通過DNA印跡或利用特異性地擴增與該核酸相關(guān)的核苷酸序列的引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)來檢測。外源核酸的表達還可利用包括基因表達分析的常規(guī)方法測量。例如，從外源核酸產(chǎn)生的mRNA可利用RNA印跡和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)來檢測和定量。RNA從外源核酸的表達還可通過測量酶促活性或報告蛋白活性來檢測。例如，反義調(diào)節(jié)活性可間接地作為靶核酸表達的減少或增加來測量，靶核酸表達的減少或增加作為外源核酸在產(chǎn)生效應(yīng)RNA的指示。基于序列保守性，可設(shè)計引物并用于擴增靶基因的編碼區(qū)域。最初，來自每個基因的最高度表達的編碼區(qū)域可用于構(gòu)建模式對照基因，盡管可使用任何編碼或非編碼區(qū)域。通過在報告基因編碼區(qū)域和其poly (A)信號之間插入每個編碼區(qū)域來組裝每個對照基因。這些質(zhì)粒將產(chǎn)生報告基因在基因的上游部分且可能的RNAi靶在3'非編碼區(qū)域的mRNA。單獨反義寡核苷酸的效果將通過報告基因的調(diào)節(jié)來測定?？捎糜诒景l(fā)明方法的報告基因包括乙酰羥酸合酶(AHAS)、堿性磷酸酶(AP)、P半乳糖苷酶(LacZ)、3葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)、辣根過氧化物酶(HRP)、熒光素酶(Luc)、胭脂堿合酶(NOS)、章魚堿合酶(OCS)及其衍生物。賦予對氨芐西林、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦、嘌呤霉素和四環(huán)素抗性的多種選擇標(biāo)記是可得的。確定報告基因的調(diào)節(jié)的方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，熒光方法(例如，熒光光譜學(xué)、熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)、熒光顯微鏡檢術(shù))、抗生素抗性確定。RNA酶Hl蛋白和mRNA表達可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和在本文別處描述的方法來測定。例如，免疫測定例如ELISA可用于測量蛋白水平。RNA酶HlELISA測定試劑盒是市售可獲得的，如，從 R&D Systems (Minneapolis, MN)。在實施方案中，利用本發(fā)明反義寡核苷酸處理的樣品(例如，體內(nèi)或體外的細胞或組織)中的RNA酶Hl表達(例如，mRNA或蛋白)通過與對照樣品中的RNA酶Hl表達比較來評價。例如，蛋白或核酸的表達可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法與模擬處理或未處理樣品中的比較?？蛇x地，取決于期望的信息，可與以對照反義寡核苷酸(例如，具有改變 的或不同序列的反義寡核苷酸)處理的樣品進行比較。在另一實施方案中，處理樣品與未處理樣品中RNA酶Hl蛋白或核酸的表達差異可與處理樣品與未處理樣品中不同核酸(包括研究者認(rèn)為適當(dāng)?shù)娜魏螛?biāo)準(zhǔn)，例如，看家基因)的表達差異比較。觀察到的差異可如期望地表示，例如，以比率或分?jǐn)?shù)的形式，用于與對照比較。在實施方案中，以本發(fā)明反義寡核苷酸處理的樣品中RNA酶Hl mRNA或蛋白的水平相對于未處理樣品或以對照核酸處理的樣品增加或減少約I. 25倍至約10倍或更多。在實施方案中，RNA酶Hl mRNA或蛋白的水平增加或減少至少約I. 25倍、至少約I. 3倍、至少約I. 4倍、至少約I. 5倍、至少約I. 6倍、至少約I. 7倍、至少約I. 8倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少約3倍、至少約3. 5倍、至少約4倍、至少約4. 5倍、至少約5倍、至少約5. 5倍、至少約6倍、至少約6. 5倍、至少約7倍、至少約7. 5倍、至少約8倍、至少約8. 5倍、至少約9倍、至少約9. 5倍、或至少約10倍或更多。試劑盒、研宄試劑、診斷和治療本發(fā)明的化合物可用于診斷、治療和預(yù)防，及作為研究試劑和試劑盒的成分。而且，能夠以強烈特異性抑制基因表達的反義寡核苷酸通常被本領(lǐng)域技術(shù)人員用來闡明特定基因的功能或區(qū)分生物途徑的不同成員的功能。對于在試劑盒和診斷和不同生物系統(tǒng)中使用，本發(fā)明的化合物，單獨地或與其它化合物或治療組合地用作差異和/或組合分析中的工具來闡明細胞和組織中表達的基因的一部分或完全互補序列的表達模式。本文所用的術(shù)語〃生物系統(tǒng)〃或〃系統(tǒng)〃定義為表達或使成為感受態(tài)以表達RNA酶Hl基因產(chǎn)物的任何生物體、細胞、細胞培養(yǎng)物或組織。這些包括但不限于，人、轉(zhuǎn)基因動物、細胞、細胞培養(yǎng)物、組織、異種移植物、移植物及其組合。作為一個非限制性實例，將以一種或多種反義化合物處理的細胞或組織中的表達模式與未被反義化合物處理的對照細胞或組織比較，并按照其屬于所檢查的基因的例如疾病關(guān)聯(lián)、信號傳導(dǎo)途徑、細胞定位、表達水平、大小、結(jié)構(gòu)或功能分析所產(chǎn)生的模式的基因表達差異水平。這些分析可對刺激或未刺激的細胞進行，并在影響表達模式的其它化合物存在或不存在下。本領(lǐng)域已知的基因表達分析方法的實例包括DNA陣列或微陣列、SAGE(基因表達系列分析)、READS(消化的cDNA的限制性酶擴增)、T0GA(總基因表達分析)、蛋白陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)、表達的序列標(biāo)簽(EST)測序、消減RNA指紋技術(shù)(SuRF)、消減克隆、差異展示(DD)、比較基因組雜交、FISH (熒光原位雜交)技術(shù)和質(zhì)譜方法。本發(fā)明的化合物可用于研究和診斷，因為這些化合物雜交于編碼RNA酶Hl的核酸。例如，在本文公開的這種條件下以這種效力雜交的為有效的RNA酶Hl調(diào)節(jié)劑的寡核苷酸，在有利基因擴增或檢測的條件下分別是有效的引物或探針。這些引物和探針可用于需要特異性檢測編碼RNA酶Hl的核酸分子的方法和可用于擴增用于檢測或用于進一步研究RNA酶Hl的所述核酸分子。本發(fā)明的反義寡核苷酸，尤其是引物和探針與編碼RNA酶Hl的核酸的雜交可通過本領(lǐng)域已知的手段檢測。這種手段可包括將酶綴合于寡核苷酸、放射性標(biāo)記寡核苷酸或任何其它適當(dāng)?shù)臋z測手段。還可制備利用這種檢測手段來檢測樣品中RNA酶Hl水平的試劑盒。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還利用反義的特異性和靈敏性用于治療用途。反義化合物已經(jīng)在動物(包括人)的疾病狀態(tài)的治療中用作治療部分。反義寡核苷酸藥物已經(jīng)安全且有效地施用于人，目前正在進行許多臨床試驗。因此已經(jīng)確定，反義化合物可以是有用的治療形態(tài)，可被配置以用于治療細胞、組織和動物(尤其是人)的治療方案。對于治療，通過施用根據(jù)本發(fā)明的反義化合物來治療懷疑患有可通過調(diào)節(jié)RNA酶Hl多核苷酸的表達來治療的疾病或病癥的動物，優(yōu)選地人。例如，在一個非限制性實施方案中，方法包括向需要治療的動物施用治療有效量的RNA酶Hl調(diào)節(jié)劑的步驟。本發(fā)明的RNA酶Hl調(diào)節(jié)劑有效地調(diào)節(jié)RNA酶Hl的活性或調(diào)節(jié)RNA酶Hl蛋白的表達。在一個實施方案中，與對照相比，動物中RNA酶Hl的活性或表達被抑制約10%。優(yōu)選地，動物中RNA酶Hl的活性或表達被抑制約30%。更優(yōu)選地，動物中RNA酶Hl的活性或表達被抑制50%或更多。因此，與對照相比，寡聚化合物調(diào)節(jié)RNA酶HlmRNA的表達至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少 98%、至少 99% 或 100%。在一個實施方案中，與對照相比，動物中RNA酶Hl的活性或表達增加約10%。優(yōu)選地，動物中RNA酶Hl的活性或表達增加約30%。更優(yōu)選地，動物中RNA酶Hl的活性或表達增加50%或更多。因此，與對照相比，寡聚化合物調(diào)節(jié)RNA酶HlmRNA的表達至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。例如，可測量動物的血清、血液、脂肪組織、肝臟或任何其它體液、組織或器官中RNA酶Hl表達的減少。優(yōu)選地，待分析的所述體液、組織或器官中包含的細胞包含編碼RNA酶Hl肽和/或RNA酶Hl蛋白本身的核酸分子。本發(fā)明的化合物可用于藥物組合物，通過向適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的稀釋劑或載體加入有效量的本發(fā)明化合物。本發(fā)明的化合物和方法的用途還可以是預(yù)防上有用的。綴合物本發(fā)明寡核苷酸的另一修飾包括將該寡核苷酸化學(xué)連接至增強寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取的一個或多個部分或綴合物。這些部分或綴合物可包括共價結(jié)合官能團例如伯羥基或仲羥基基團的綴合物基團。本發(fā)明的綴合物基團包括嵌入劑、報告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強寡聚物藥代動力學(xué)特性的基團、增強寡聚物藥效學(xué)特性的基團。典型綴合物基團包括膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素和染料。在本發(fā)明范疇中，增強藥效學(xué)特性的基團包括改進攝取、增強對降解的耐受性和/或加強與靶核酸序列特異性雜交的基團。在本發(fā)明范疇中，增強藥代動力學(xué)特性的基團包括改進本發(fā)明化合物的攝取、分布、代謝或排泄的基團。代表性綴合物基團公開在1992年10月23日提交的國際專利申請NO.PCT/US92/09196和美國專利No. 6，287，860中，其通過引用并入本文。綴合物部分包括但不限于，脂質(zhì)部分例如膽固醇部分、膽酸、硫醚例如己基-5-三苯甲基硫醇、硫膽固醇、脂肪族鏈例如十二烷二醇或i^一烷基殘基、磷脂例如二 -十六烷基-rac-甘油或1，2- 二 -O-十六烷基-rac-甘油-3-H膦酸三乙基銨、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚酰基部分或十八胺或己基氨基-羰基-羥膽固醇部分。本發(fā)明的寡核苷酸還可綴合于活性藥物物質(zhì)，例如，阿斯匹林、華法林、苯基丁氮酮、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)_(+)_普拉洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟滅酸、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜環(huán)庚三烯、吲哚美辛、巴比妥酸鹽、頭孢菌素、磺胺藥物、抗糖尿病藥、抗菌藥或抗生素。
教導(dǎo)這種寡核苷酸綴合物的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利No. 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、5，578，717,5, 580，731,5, 580，731,5, 591，584,5, 109，124,5, 118，802,5, 138，045、5，414，077,5, 486，603,5, 512，439,5, 578，718,5, 608，046,4, 587，044,4, 605，735、4，667，025,4,762，779,4,789，737,4,824，941,4, 835，263,4, 876，335,4, 904，582、4，958，013、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，245，022,5, 254，469,5, 258，506,5, 262，536,5, 272，250,5, 292，873,5, 317，098、5，371，241、5，391，723、5，416，203、5，451，463、5，510，475、5，512，667、5，514，785、5，565，552、5，567，810、5，574，142、5，585，481 ,5, 587，371,5, 595，726、5，597，696、5，599，923,5, 599，928 和 5，688，941。制劑為了輔助攝取、分布和/或吸收，本發(fā)明的化合物還可與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物混合、包封、綴合或以其它方式關(guān)聯(lián)，例如脂質(zhì)體、受體靶向分子、口服、直腸、局部或其它制劑。教導(dǎo)這種攝取、分布和/或吸收輔助制劑的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利 No. 5，108，921,5, 354，844,5, 416，016,5, 459，127,5, 521，291、5，543，165、5，547，932、5，583，020、5，591, 721,4, 426，330,4, 534，899、5，013，556、5，108，921,5, 213，804,5, 227，170,5, 264，221,5, 356，633,5, 395，619,5, 416，016、5，417，978、5，462，854、5，469，854、5，512，295、5，527，528、5，534，259、5，543，152、5，556，948,5, 580，575和5，595，756，其每一個通過引用并入本文。盡管反義寡核苷酸不必以載體的背景施用以便調(diào)節(jié)靶表達和/或功能，但是本發(fā)明的實施方案涉及用于表達反義寡核苷酸的表達載體構(gòu)建體，包括啟動子、雜合體啟動子基因序列，并具備強的組成型啟動子活性或在期望情形中可被誘導(dǎo)的啟動子活性。在實施方案中，發(fā)明實踐包括以適當(dāng)?shù)暮怂徇f送系統(tǒng)施用至少一種上述反義寡核苷酸。在一個實施方案中，該系統(tǒng)包括可操作地連接于多核苷酸的非病毒載體。這種非病毒載體的實例包括單獨寡核苷酸(例如，SEQ ID N0:6至13的任何一種或多種)或寡核苷酸與適當(dāng)?shù)牡鞍住⒍嗵腔蛑|(zhì)制劑的組合。另外適當(dāng)?shù)暮怂徇f送系統(tǒng)包括病毒載體，通常序列來自以下的至少一種腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)、輔助病毒依賴型腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或日本血凝病毒-脂質(zhì)體(HVJ)復(fù)合體。優(yōu)選地，病毒載體包括可操作地連接于多核苷酸的強的真核啟動子，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子。另外優(yōu)選的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學(xué)綴合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼氏鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一種優(yōu)選的基于HIV的病毒載體包括至少兩種載體，其中g(shù)ag和pol基因來自HIV基因組且env基因來自另一病毒。DNA病毒載體是優(yōu)選的。這些載體包括痘病毒載體例如正痘病毒或禽痘病毒載體、皰疹病毒載體例如I型單純皰疫病毒(HSV)載體、腺病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。本發(fā)明的反義化合物涵蓋任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯或這種酯的鹽、或當(dāng)施用于動物(包括人)時能夠提供(直接或間接)生物活性代謝物的任何其它化合物或其殘留物。 術(shù)語〃藥學(xué)上可接受的鹽〃是指本發(fā)明化合物的生理上和藥學(xué)上可接受的鹽SP，保留親本化合物的期望生物活性且不對其賦予不期望的毒物學(xué)作用的鹽。對于寡核苷酸，藥學(xué)上可接受的鹽及其用途的優(yōu)選的實例進一步描述于美國專利No. 6，287，860，其通過引用并入本文。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明反義化合物的藥物組合物和制劑。取決于期望局部還是系統(tǒng)治療和待治療的區(qū)域，本發(fā)明的藥物組合物可以多種方式施用。施用可以是局部的(包括眼睛和向粘膜，包括陰道和直腸遞送)、肺部，例如通過吸入或噴入粉末或氣霧劑，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和經(jīng)皮)、口服或腸胃外。腸胃外施用包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)的施用。對于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的組織，施用可通過例如注射或輸注到腦脊液中來進行。反義RNA向腦脊液的施用描述于例如美國專利申請公布No. 2007/0117772 “Methodsfor slowing familial ALS disease progression” 中，通過引用整體并入本文。當(dāng)預(yù)期本發(fā)明的反義寡核苷酸被施用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞時，可以能夠促進本發(fā)明反義寡核苷酸跨越血腦屏障的滲透的一種或多種試劑施用。注射可在例如內(nèi)嗅皮質(zhì)或海馬中進行。通過向肌肉組織中的運動神經(jīng)元施用腺病毒載體來遞送神經(jīng)營養(yǎng)因子描述于例如美國專利 No. 6，632，427 “Adenoviral-vector-mediated gene transfer intomedullary motor neurons”中，通過引用并入本文。向腦例如紋狀體、丘腦、海馬或黑質(zhì)直接遞送載體是本領(lǐng)域已知的，描述于例如美國專利No. 6, 756, 523 “Adenovirus vectorsfor the transfer of foreign genes into cells of the central nervous systemparticularly in brain”中，通過引用并入本文。施用可以是快速的,如通過注射,或經(jīng)一段時間進行，如通過緩慢輸注或施用緩釋制劑。本發(fā)明反義寡核苷酸可還連接或綴合于提供期望的藥物或藥效學(xué)特性的試劑。例如，反義寡核苷酸可偶聯(lián)于本領(lǐng)域已知的促進跨血腦屏障滲透或運輸?shù)娜魏挝镔|(zhì)，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體，并通過靜脈內(nèi)注射施用。反義化合物可連接于病毒載體，例如，使得反義化合物更有效和/或增加反義化合物跨血腦屏障的運輸?shù)牟《据d體。滲透血腦屏障破壞還可通過例如輸注以下物質(zhì)來實現(xiàn)糖包括但不限于，赤蘚糖醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D㈠阿拉伯糖、纖維二糖、D⑴麥芽糖、D⑴棉子糖、L(+)鼠李糖、D⑴蜜二糖、D㈠核糖、側(cè)金盞花醇、D (+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)巖藻糖、L(-)巖藻糖、D(-)來蘇糖、L(+)來蘇糖和L(-)來蘇糖，或氨基酸包括但不限于，谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸和?；撬?。用于增強血腦屏障滲透的方法和材料描述于，例如，美國專利 No. 4，866，042 “Method for the delivery of genetic material acrossthe blood brain barrier，，,美國專利No. 6，294，520“Material for passage through theblood-brain barrier”和美國專利 No. 6，936，589 “Parenteral delivery systems”，都通過引用整體并入本文。為了幫助攝取、分布和/或吸收，本發(fā)明反義化合物可與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物混合物，例如，脂質(zhì)體、受體靶向分子、口服、直腸、局部或其它制劑混合、包封、綴合或以其它方式關(guān)聯(lián)。例如，陽離子脂質(zhì)可被包括在制劑中以促進寡核苷酸攝取。顯示促進攝取的一種這樣的組合物是LIP0FECTIN(可從GIBCO-BRL，Bethesda, MD獲得)。 認(rèn)為具有至少一種2’-0_甲氧基乙基修飾的寡核苷酸尤其可用于口服施用。用于局部施用的藥物組合物和制劑可包括經(jīng)皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧齊U、液體和粉末。常規(guī)藥物載體、水性、粉狀或油性基質(zhì)、增稠劑和類似物可以是必需或期望的。涂覆的避孕套、手套和類似物也是可用的?？煞奖愕匾詥挝粍┬统尸F(xiàn)的本發(fā)明的藥物制劑可按照制藥工業(yè)中公知的常規(guī)技術(shù)制備。這種技術(shù)包括將活性成分與藥物載體或賦形劑關(guān)聯(lián)的步驟。通常，制劑通過以下制備均勻且密切地將活性成分與液態(tài)載體或磨碎的固態(tài)載體或兩者關(guān)聯(lián)，然后，如果需要，將產(chǎn)品成型。本發(fā)明的組合物可配制為任何的許多可能劑型，例如但不限于，片劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿劑、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可配制為在含水、不含水或混合介質(zhì)中的懸浮劑。含水懸浮劑可進一步包含增加懸浮劑粘度的物質(zhì)，包括例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。懸浮劑還可包含穩(wěn)定劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于，溶液、乳液、泡沫劑和含脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明的藥物組合物和制劑可包括一種或多種滲透促進劑、載體、賦形劑或其它活性或無活性配料。乳劑通常是一種液體以直徑通常超過0. I y m的液滴形式分散在另一液體中的異質(zhì)系統(tǒng)。除了分散相和可作為以水相、油相或本身作為單獨相的溶液存在的活性藥物以外，乳劑可包含另外的成分。包括微乳劑作為本發(fā)明的實施方案。乳劑及其用途是本領(lǐng)域公知的，進一步描述于美國專利No. 6，287，860。本發(fā)明的制劑包括脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明所用的術(shù)語〃脂質(zhì)體〃是指包括以一個或多個球形雙層排列的兩親性脂質(zhì)的囊泡。脂質(zhì)體是單層或多層囊泡，具有從親脂性材料形成的膜和包含待遞送的組合物的含水內(nèi)部。陽離子脂質(zhì)體是帶正電荷的脂質(zhì)體，認(rèn)為其與帶負電荷的DNA分子相互作用形成穩(wěn)定復(fù)合體。認(rèn)為pH-敏感或帶負電荷的脂質(zhì)體捕獲DNA而不是與其復(fù)合。陽離子和非陽離子脂質(zhì)體兩者已經(jīng)用于向細胞遞送DNA。脂質(zhì)體還包括〃空間上穩(wěn)定的〃脂質(zhì)體，本文所用的該術(shù)語是指包括一種或多種特化的脂質(zhì)的脂質(zhì)體。當(dāng)被并入脂質(zhì)體時，這些特化的脂質(zhì)產(chǎn)生相對于松散這種特化脂質(zhì)的脂質(zhì)體具有增強的循環(huán)生命周期的脂質(zhì)體?？臻g上穩(wěn)定的脂質(zhì)體的實例是其中脂質(zhì)體的形成囊泡的脂質(zhì)部分的部分包括一種或多種糖脂或以一種或多種親水性聚合物例如聚乙二醇(PEG)部分衍生化的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體及其用途進一步描述于美國專利No. 6，287，860中。本發(fā)明的藥物制劑和組合物還可包括表面活性劑。表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑和乳劑中的使用是本領(lǐng)域公知的。表面活性劑及其用途進一步描述于美國專利No. 6，287，860中，其通過引用并入本文。在一個實施方案中，本發(fā)明采用多種滲透促進劑來實現(xiàn)核酸尤其是寡核苷酸的有效遞送。除了幫助非親脂性藥物跨細胞膜的擴散，滲透促進劑還增強親脂性藥物的滲透性。滲透促進劑可分為屬于五個大類之一，即，表面活性劑、脂肪酸、膽酸、螯合劑和非螯合非表面活性劑。滲透促進劑及其用途進一步描述于美國專利No. 6，287，860中，其通過引用并入本文。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，制劑常規(guī)地根據(jù)其預(yù)期用途即施用途徑來設(shè)計。用于局部施用的優(yōu)選的制劑包括其中本發(fā)明的寡核苷酸與局部遞送劑例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑混合的制劑。優(yōu)選的脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性(例如，二油?；?磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿DMPC、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、陰性(例如，二肉豆蘧酰磷脂酰甘油DMPG)和陽離子(例如，二油?；募谆被鵇OTAP和二油酰基-磷脂酰乙醇胺D0TMA)。對于局部或其它施用，可將本發(fā)明的寡核苷酸封裝于脂質(zhì)體中或可與其形成復(fù)合體，尤其是陽離子脂質(zhì)體?？蛇x地，寡核苷酸可與脂質(zhì)，尤其是陽離子脂質(zhì)復(fù)合。優(yōu)選的脂肪酸和酯、其藥學(xué)上可接受的鹽及其用途進一步描述于美國專利No. 6，287，860中。用于口服施用的組合物和制劑包括粉末劑或顆粒劑、微顆粒、納米顆粒、水或非水介質(zhì)中的懸浮劑或溶液、膠囊、凝膠膠囊、囊劑、片劑或小片劑。增稠劑、芳香劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可以是期望的。優(yōu)選的口服制劑是其中本發(fā)明的寡核苷酸連同一種或多種滲透促進劑、表面活性劑和螯合劑一起施用的那些。優(yōu)選的表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽酸和/或其鹽。優(yōu)選的膽酸/鹽和脂肪酸及其用途進一步描述于美國專利No. 6，287, 860中，其通過引用并入本文。還優(yōu)選的是滲透促進劑的組合，例如，脂肪酸/鹽與膽酸/鹽的組合。尤其優(yōu)選的組合是月桂酸、癸酸和UDCA的鈉鹽。進一步的滲透促進劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚。本發(fā)明的寡核苷酸可口服遞送，以包括噴霧干燥顆粒的粒狀形式或復(fù)合以形成微顆粒或納米顆粒。寡核苷酸絡(luò)合劑及其用途進一步描述于美國專利No. 6，287，860中，其通過引用并入本文。用于腸胃外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用的組合物和制劑可包括還可包含緩沖劑、稀釋劑和其它適當(dāng)?shù)奶砑觿?例如但不限于滲透促進劑、載體化合物和其它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑)的無菌水溶液。本發(fā)明的某些實施方案提供包含一種或多種寡聚化合物和通過非反義機制起作用的一種或多種其它化療劑的藥物組合物。這種化療劑的實例包括但不限于，癌癥化療藥物例如柔紅霉素、道諾霉素、放線菌素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、雙氯乙亞硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光神霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、他莫昔芬、達卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己亞硝基脲、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧柯福霉素、4-羥基過氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙堿、泰素、長春新堿、長春堿、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、順鉬和己烯雌酚(DES) 0當(dāng)與本發(fā)明的化合物一起使用時，這種化療劑可單獨地使用(例如，5-FU和寡核苷酸)，順序地使用(例如，5-FU和寡核苷酸持續(xù)一段時間，隨后是MTX和寡核苷酸)或與一種或多種其它這種化療劑組合使用(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放療和寡核苷酸)。包括但不限于非類固醇抗炎藥物和皮質(zhì)激素的抗炎藥物及包括但不限于利巴韋林、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷和更昔洛韋的抗病毒藥物也可組合在本發(fā)明的組合物中。反義化合物與其它非反義藥物的組合也在本發(fā)明的范圍中。兩種或更多種組合的化合物可一起或順序地使用。在另一相關(guān)實施方案中，本發(fā)明的組合物可包含靶向第一核酸的一種或多種反義化合物，尤其是寡核苷酸，和靶向第二核酸靶的一種或多種另外的反義化合物。例如，第一靶可以是RNA酶Hl的特定反義序列，第二靶可以是來自另一核苷酸序列的區(qū)域?？蛇x地， 本發(fā)明的組合物可包含靶向同一RNA酶Hl核酸靶的不同區(qū)域的兩種或更多種反義化合物。本文闡述了反義化合物的許多實例，其它的可選自本領(lǐng)域已知的適當(dāng)?shù)幕衔?。兩種或更多種組合的化合物可一起或順序地使用。給藥認(rèn)為治療性組合物的配制及其隨后的施用(給藥)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。給藥依賴于待治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重度和響應(yīng)性，治療的時期持續(xù)數(shù)天到數(shù)月，或直到實現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減輕。最佳給藥計劃可從患者體內(nèi)藥物積累的測量來計算。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)率。最佳劑量可根據(jù)單獨寡核苷酸的相對效力而變化，通常可基于在有效的體外和體內(nèi)動物模型中有效的EC50來估算。通常，劑量是每kg體重從0. 01 ii g至IOOg,可每天、每周、每月或每年一次或多次,或甚至每2至20年一次地提供。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可基于測量的藥物在體液或組織中的停留時間和濃度容易地估算重復(fù)率。在成功治療之后，可能期望對患者進行維持療法以阻止疾病狀態(tài)復(fù)發(fā)，其中寡核苷酸以維持劑量施用，范圍從每kg體重0. 01 u g至100g，每天一次或多次，至每20年一次。在實施方案中，患者以至少約I、至少約2、至少約3、至少約4、至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90或至少約100mg/kg體重的藥物劑量治療。反義寡核苷酸的某些注射劑量描述于，例如，美國專利No. 7, 563, 884 “Antisense modulation of PTPlB expression”,通過引用整體并入本文。盡管以上已經(jīng)描述了本發(fā)明多種實施方案，應(yīng)理解的是，它們僅以示例而非限制的方式呈現(xiàn)。可根據(jù)本公開內(nèi)容對公開的實施方案進行多種改變而不偏離本發(fā)明的主旨或范圍。因此，本發(fā)明的寬度和范圍不應(yīng)限于任何上述的實施方案。本文提及的所有文件通過引用并入本文。本申請中提及的所有出版物和專利文件為了所有目的通過引用并入本文，其程度如同每個單獨出版物或?qū)＠募粏为毜靥峒啊Ｍㄟ^在本文件中提及多個參考文獻，申請人不承認(rèn)任何特定參考文獻是本發(fā)明的"現(xiàn)有技術(shù)"。本發(fā)明組合物和方法的實施方案在以下實施例中闡述。
實施例以下非限制性實施例用于闡述本發(fā)明的選定實施方案。應(yīng)理解的是，所示組分的成分的比例和其它選擇方面的改變對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，并且在本發(fā)明實施方案范圍中。實施例I :對與RNA酶Hl反義的核酸分子和/或RNA酶Hl多核苷酸的有義鏈有特異性的反義寡核苷酸的設(shè)計如上所述，術(shù)語〃對…有特異性的寡核苷酸〃或〃寡核苷酸靶〃是指具有⑴能夠與祀向基因的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體，或(ii)能夠與祀基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體的序列的寡核苷酸。
通過利用自動比對核酸序列并指明同一性或同源性的區(qū)域的計算機程序來便于選擇適當(dāng)?shù)墓押塑账?。這種程序用來比較獲得的核酸序列，例如通過搜尋數(shù)據(jù)庫例如GenBank或通過對PCR產(chǎn)物測序。比較來自一定范圍物種的核酸序列允許選擇在物種之間展示適當(dāng)?shù)耐恍猿潭鹊暮怂嵝蛄?。在未被測序的基因的情形中，進行DNA印跡以允許確定靶物種與其它物種的基因之間的同一性程度。如本領(lǐng)域已知的，通過以不同的嚴(yán)格性程度進行DNA印跡，可能獲得近似的同一性測量。這些方案允許選擇展現(xiàn)與待控制的受治療者中的靶核酸序列的高程度互補性和與其它物種中的相應(yīng)核酸序列的較低程度互補性的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，在選擇用于本發(fā)明的基因的適當(dāng)區(qū)域方面存在相當(dāng)大的自由。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以導(dǎo)致功能和/或活性的調(diào)節(jié)時，該化合物是"可特異性雜交的"，且在期望特異性結(jié)合的條件下(即，在體內(nèi)測定或治療性治療的情形中的生理條件下，和在體外測定的情形中進行測定的條件下)存在足夠程度的互補性以避免反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。本文所述寡核苷酸的雜交特性可通過本領(lǐng)域已知的一種或多種體外測定來確定。例如，本文所述寡核苷酸的特性可利用解鏈曲線測定確定靶天然反義與可能的藥物分子之間的結(jié)合強度來獲得。靶天然反義與可能的藥物分子(分子)之間的結(jié)合強度可利用測量分子間相互作用強度的任何已建立的方法例如解鏈曲線測定來估算。對于天然反義/分子復(fù)合體，解鏈曲線測定確定雙鏈向單鏈構(gòu)象的快速轉(zhuǎn)變發(fā)生時的溫度。這一溫度被廣泛接受作為兩種分子之間相互作用強度的可靠量度。解鏈曲線測定可利用對應(yīng)分子結(jié)合位置的實際天然反義RNA分子或合成的DNA或RNA核苷酸的cDNA拷貝進行。多種包含所有進行這一測定所必需的試劑的試劑盒是可獲得的(例如，Applied Biosystems Inc. MeltDoctor試劑盒)。這些試劑盒包括包含雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合染料之一(例如ABI HRM染料、SYBR Green、SYTO等等)的適當(dāng)?shù)木彌_溶液。dsDNA染料的特性是使得它們在游離形式幾乎不發(fā)出熒光，但當(dāng)結(jié)合dsDNA時是高度熒光的。為了進行測定，將cDNA或相應(yīng)的寡核苷酸與由具體制造商的方案規(guī)定的濃度的分子混合。將混合物加熱到95°C以使所有預(yù)形成的dsDNA復(fù)合體解離，然后緩慢冷卻到室溫或試劑盒制造商規(guī)定的其它較低溫度以允許DNA分子退火。然后將新形成的復(fù)合體緩慢加熱到95°C，同時連續(xù)收集反應(yīng)產(chǎn)生的熒光的量的數(shù)據(jù)。熒光強度與反應(yīng)中存在的dsDNA的量成反比。數(shù)據(jù)可利用與試劑盒相容的實時PCR儀器(例如ABI’ s StepOne Plus實時PCR 系統(tǒng)或 IightTyper instrument, Roche Diagnostics, Lewes, UK)來收集。利用適當(dāng)?shù)能浖?例如IightTyper (Roche)或 SDS Dissociation Curve, ABI)將熒光相對于溫度的負導(dǎo)函數(shù)(y軸上的-d(熒光)/dT))對溫度(X軸)繪圖來構(gòu)建熔融峰。分析數(shù)據(jù)以鑒定dsDNA復(fù)合體向單鏈分子快速轉(zhuǎn)變的溫度。這一溫度稱為Tm，與兩種分子之間相互作用的強度成正比。通常，Tm將超過40°C。實施例2 =RNA酶Hl多核苷酸的調(diào)節(jié)以反義寡核苷酸處理HEPG2細胞在37°C和5%C02下將來自ATCC的H印G2細胞(cat# HB-8065)生長在生長培養(yǎng)基(MEM/EBSS(Hyclone cat #SH30024 或 Mediatech cat#MT-10-010-CV)+10%FBS(Mediatechcat# MT35-011-CV) +青霉素/鏈霉素(Mediatech cat# MT30-002-CI))中。實驗前一天，將細胞以I. 5X 105/ml的密度重新鋪板到6孔板中并且在37°C和5%C02下孵育。在實驗當(dāng)天將6孔板中培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸稀釋到20 u M的濃度。將此溶液的 I 與 400ii I Opti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco cat# 31985-070)和 4 y I Lipofectamine2000 (Invitrogen cat# 11668019)在室溫一起孵育20min，施加到帶有HEPG2細胞的6孔板的每個孔。代替寡核苷酸溶液的包括2 Ul水的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對照。在37°C和5%C02培養(yǎng)3-18h后，將培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。加入反義寡核苷酸48h后，去除培養(yǎng)基且利用來自Promega的SV總RNA分離系統(tǒng)(cat#Z3105)或來自Qiagen的RNeasy總RNA分離試劑盒(cat#74181)按照制造商的說明書從細胞提取RNA。將600ng RNA加入到利用來自 Thermo Scientific^tJVerso cDNA 試劑盒(cat#AB1453B)或高容量 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(cat#4368813)如制造商的方案所述地進行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。來自這一逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的 cDNA 用于利用 ABI Taqman 基因表達混合物(cat#4369510)和由 ABI (Applied BiosystemsTaqman 基因表達測定Hs00268000_ml,由 Applied Biosystems Inc. , Foster City CA)設(shè)計的引物/探針通過實時PCR監(jiān)測基因表達。利用Mx4000thermal cycler (Stratagene)使用以下PCR循環(huán)50°C持續(xù)2min、95°C持續(xù)10min、40個循環(huán)的(95°C持續(xù)15秒、60°C持續(xù)Imin)。以反義寡核苷酸處理后的基因表達倍數(shù)變化基于處理樣品和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dC^t值的差異來計算。結(jié)果實時PCR結(jié)果顯示，用針對RNA酶Hl反義Hs. 700975設(shè)計的寡核苷酸之一處理后48h，HepG2細胞中RNA酶HlmRNA的水平顯著增加(圖I)。盡管已經(jīng)參照一種或多種實現(xiàn)來說明和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀和理解說明書和附圖后將進行等價的改變和修飾。此外，盡管僅關(guān)于多種實現(xiàn)之一公開了本發(fā)明的特定特征，這種特征可如所需地與其它實現(xiàn)的一種或多種其它特征組合，如對于任何給定或特定應(yīng)用可能是期望和有利的。盡管已經(jīng)參照一種或多種實現(xiàn)來說明和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀和理解說明書和附圖后將進行等價的改變和修飾。此外，盡管僅關(guān)于多種實現(xiàn)之一公開了本發(fā)明的特定特征，這種特征可如所需地與其它實現(xiàn)的一種或多種其它特征組合，如對于任何給定或特定應(yīng)用可能是期望和有利的。本公開內(nèi)容的摘要將允許閱讀者快速地確定技術(shù)公開內(nèi)容的性質(zhì)。應(yīng)理解的是， 提交其并不用于解釋或限制所附權(quán)利要求書的范圍或含義。
權(quán)利要求
1.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述細胞或組織與長度為5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與包括SEQ ID NO: 2的核苷酸I至437或SEQ ID NO: 3的核苷酸I至278或SEQ ID NO:4的核苷酸I至436或SEQ ID NO:5的核苷酸I至1140中的5至30個連續(xù)核苷酸的多核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列同一丨丨生；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達。
2.—種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述細胞或組織與長度為5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與RNA酶Hl多核苷酸的天然反義的反向互補序列具有至少50%序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達。
3.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述細胞或組織與長度為5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸 接觸，其中所述寡核苷酸與RNA酶Hl多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達。
4.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述細胞或組織與靶向RNA酶Hl多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)域的至少一種反義寡核苷酸接觸；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中RNA酶Hl多核苷酸的功能和/或表達。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中RNA酶Hl的功能和/或表達相對于對照體內(nèi)或體外增加。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向RNA酶Hl多核苷酸的天然反義序列。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向包括RNA酶Hl多核苷酸的編碼核酸序列和/或非編碼核酸序列的核酸序列。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向RNA酶Hl多核苷酸的重疊序列和/或非重疊序列。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸包括選自以下的一種或多種修飾至少一種修飾的糖部分、至少一種修飾的核苷間鍵合、至少一種修飾的核苷酸及其組合。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾的糖部分2’ -O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖 部分、二環(huán)的糖部分及其組合。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾的核苷間鍵合硫代磷酸酯、2’ -0甲氧基乙基(MOE)、2’ -氟、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其組口 o
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾的核苷酸肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、阿拉伯糖-核酸(FANA)、類似物、衍生物及其組合。
13.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述至少一種寡核苷酸包括如SEQID N0:6至13所列的至少一種寡核苷酸序列。
14.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中RNA酶Hl基因的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述細胞或組織與長度為5至30個核苷酸的至少一種短干擾RNA(siRNA)寡核苷酸接觸，所述至少一種siRNA寡核苷酸對RNA酶Hl多核苷酸的反義多核苷酸有特異性，其中所述至少一種siRNA寡核苷酸與RNA酶Hl多核苷酸的反義核酸分子和/或有義核酸分子的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少50%序列同一性；以及體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中RNA酶Hl的功能和/或表達。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述寡核苷酸與RNA酶Hl多核苷酸的反義核酸分 子和/或有義核酸分子互補的至少約五個連續(xù)核酸的序列具有至少80%序列同一性。
16.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中RNA酶Hl的功能和/或表達的方法，所述方法包括將所述細胞或組織與長度為約5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，所述至少一種反義寡核苷酸對RNA酶Hl多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼序列和/或編碼序列有特異性，其中所述至少一種反義寡核苷酸與如SEQ ID NO:l至5所列的至少一種核酸序列具有至少50%序列同一性；以及體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中RNA酶Hl的功能和/或表達。
17.一種合成的、修飾的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括至少一種修飾，其中所述至少一種修飾選自至少一種修飾的糖部分；至少一種修飾的核苷酸間鍵合；至少一種修飾的核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸是與RNA酶Hl基因雜交并與正常對照相比體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)其功能和/或表達的反義化合物。
18.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自以下組成的組的核苷酸間鍵合硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其組合。
19.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一種硫代磷酸酯核苷酸間鍵合。
20.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸間鍵合的主鏈。
21.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包括至少一種修飾的核苷酸，所述修飾的核苷酸選自肽核酸、鎖核酸(LNA)、類似物、衍生物及其組合。
22.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾的核苷酸硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其組合。
23.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾的核苷酸肽核酸、鎖核酸(LNA)、類似物、衍生物及其組合。
24.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括選自以下的至少一種修飾的糖部分2’ -O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖部分、二環(huán)的糖部分及其組合。
25.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾的糖部分2’ -O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖部分、二環(huán)的糖部分及其組合。
26.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長度為至少約5至30個核苷酸并與RNA酶Hl多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與RNA酶Hl多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少約20%序列同一‘丨生。
27.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與RNA酶Hl多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少約80%序列同一,I"生。
28.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸與至少一種RNA酶Hl多核苷酸雜交并與正常對照相比體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)其表達和/或功能。
29.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO: 6至13所列 的序列。
30.一種組合物，所述組合物包括對一種或多種RNA酶Hl多核苷酸有特異性的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補序列、等位基因、同系物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。
31.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述寡核苷酸與如SEQID N0:6至13所列的任一種核苷酸序列相比具有至少約40%序列同一性。
32.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述寡核苷酸包括如SEQID N0:6至13所列的核苷酸序列。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中如SEQID N0:6至13所列的寡核苷酸包括一種或多種修飾或取代。
34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述一種或多種修飾選自硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、鎖核酸(LNA)分子及其組合。
35.一種預(yù)防或治療至少一種RNA酶Hl多核苷酸和/或至少一種其編碼的產(chǎn)物相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括向患者施用治療有效劑量的結(jié)合所述至少一種RNA酶Hl多核苷酸的天然反義序列并調(diào)節(jié)所述至少一種RNA酶Hl多核苷酸的表達的至少一種反義寡核苷酸；從而預(yù)防或治療至少一種RNA酶Hl多核苷酸和/或至少一種其編碼的產(chǎn)物相關(guān)的疾病。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中至少一種RNA酶Hl多核苷酸相關(guān)的疾病是利什曼病、肝疾病或病癥、與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病或病癥、癌癥、細胞凋亡疾病、Aicardi - Goutieres綜合征和逆轉(zhuǎn)錄病毒疾病或病癥(例如AIDS)。
37.一種鑒定和選擇用于體內(nèi)施用的至少一種寡核苷酸的方法，所述方法包括選擇與疾病狀態(tài)相關(guān)的靶多核苷酸；鑒定包括與所選靶多核苷酸或與所選靶多核苷酸的反義多核苷酸互補的至少五個連續(xù)核苷酸的至少一種寡核苷酸；測量反義寡核苷酸和所述靶多核苷酸或與所選靶多核苷酸反義的多核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下的雜合體的熱熔點；和基于所獲得的信息選擇用于體內(nèi)施用的至少一種寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)RNA酶H1的表達和/或功能的反義寡核苷酸，尤其是通過靶向RNA酶H1的天然反義多核苷酸。本發(fā)明還涉及這些反義寡核苷酸的鑒定和它們在治療RNA酶H1表達相關(guān)的疾病和病癥中的用途。
文檔編號A61K48/00GK102782135SQ201180006257
公開日2012年11月14日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月25日
發(fā)明者J·克拉德, O·霍克瓦舍曼 申請人:庫爾納公司