專利名稱：一種克服腫瘤耐藥性的載藥脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種克服腫瘤耐藥性的載藥脂質(zhì)體，該載藥脂質(zhì)體的制備方法，及其該載藥脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物和腫瘤治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、腫瘤耐藥性目前，在許多腫瘤的治療中·，常規(guī)化療效果差和預(yù)后不良是困擾臨床的重要難題，而腫瘤多藥耐藥性(MDR)則是腫瘤化療失敗的關(guān)鍵因素。經(jīng)治療后.殘存的腫瘤干細(xì)胞耐藥性形成，常導(dǎo)致對(duì)某些藥物治療敏感性降低，并引起腫瘤復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移。人惡性腫瘤對(duì)化療的耐藥性可分為先天性耐藥(nature resistance)和獲得性耐藥(acquiredresistance);根據(jù)耐藥譜又分為原藥耐藥(primary drug resistance, PDR)和多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)。PDR只對(duì)誘導(dǎo)的原藥產(chǎn)生耐藥,面對(duì)其它藥物不產(chǎn)生產(chǎn)交叉耐藥；MDR是由一種藥物誘發(fā)，但同時(shí)又對(duì)其它多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制迥異的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥。耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制有多種，如:DNA修復(fù)能力的增強(qiáng):化療藥致使DNA損傷，當(dāng)二氫葉酸還原酶(DHFR)和DNA損傷修復(fù)相關(guān)酶活性增強(qiáng)(MGMT)可增加其對(duì)化療藥的耐藥程度。P-糖蛋白表達(dá):P-糖蛋白是一種能量依賴性藥物排出泵，可以與一些抗腫瘤藥物結(jié)合，也有ATP結(jié)合位點(diǎn)。P-糖蛋白一旦與抗腫瘤藥物結(jié)合，通過(guò)ATP提供能量，就可將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外，使藥物在細(xì)胞內(nèi)濃度不斷下降，并使其細(xì)胞毒作用減弱直至散失，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。P-糖蛋白在正常膽管、腎、小腸、腎上腺、造血干細(xì)胞等均有表達(dá)，負(fù)責(zé)激素運(yùn)輸及排泌毒物等生理功能。P-糖蛋白高表達(dá)的腫瘤病人常伴預(yù)后不良，如低緩解率、高復(fù)發(fā)率、生存期短，可作為預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶:谷胱甘肽是一種含半胱氨酸的三肽，為細(xì)胞內(nèi)主要的非蛋白巰基。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶能夠催化機(jī)體內(nèi)親電性化合物與GSH結(jié)合，使有毒化合物增加水溶性、減少毒性，最終排出細(xì)胞外。2、紫杉醇紫杉醇屬有絲分裂抑制劑或紡錘體毒素，是從太平洋紫杉樹皮中提取的二萜類化合物，是一種天然來(lái)源抗腫瘤藥，能夠誘導(dǎo)和促進(jìn)微管的裝配，具有聚合和穩(wěn)定微管的作用，致使快速分裂的腫瘤細(xì)胞在有絲分裂階段被牢牢固定，使癌細(xì)胞復(fù)制受阻斷而死亡，1992年美國(guó)FDA批準(zhǔn)使用，是目前臨床上非常重要的用于卵巢癌和乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌等癌癥的一線和二線治療用藥。也可用于頭頸癌、食管癌，精原細(xì)胞瘤，復(fù)發(fā)非何金氏淋巴瘤等的治療。其不良反應(yīng)包括:過(guò)敏反應(yīng)；骨髓抑制；神經(jīng)毒性；心血管毒性；脫發(fā)以及炎癥等局部反應(yīng)。由于紫杉醇難溶于水，制劑由50%乙醇與50%的表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油衍生物配制而成，以增加紫杉醇的水溶性。該溶劑也存在毒副反應(yīng)，如變態(tài)反應(yīng)、中毒性腎損傷、神經(jīng)毒性、心臟血管毒性等。
多烯紫杉醇注射液(艾素，多西他賽，Docetaxel Injection)是由歐洲紅豆杉葉中提取物經(jīng)合成而來(lái)的半合成紫杉醇類似物，作用機(jī)制是加強(qiáng)微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，導(dǎo)致形成穩(wěn)定的非功能性微管束，因而破壞腫瘤細(xì)胞的有絲分裂。它在細(xì)胞內(nèi)濃度比紫杉醇高3倍，并在細(xì)胞內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)，這是它在體外試驗(yàn)中比紫杉醇抗腫瘤活性大的重要原因。在體內(nèi)試驗(yàn)中，對(duì)小鼠的結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢腫瘤移植物等有效。副作用與紫杉醇類似，其骨髓抑制毒性更大。多烯紫杉醇一般由聚山梨醇80配制而成。
脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇組成的具有類似生物膜的雙分子層結(jié)構(gòu)。1971年Rymen等人開始將其作為藥物載體。相比于其他載體，脂質(zhì)體具有以下優(yōu)點(diǎn):細(xì)胞親合性和靶向性；緩釋性；降低藥物毒性，提高藥物穩(wěn)定性。注射用紫杉醇脂質(zhì)體(力撲素)是江蘇省藥物研究所、南京思科藥業(yè)有限公司、江蘇省脂質(zhì)體藥物工程技術(shù)研究中心研制的新型藥物，于2004年上市推廣。是我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的第一個(gè)脂質(zhì)體藥物，也是國(guó)際首次上市的注射用紫杉醇脂質(zhì)體藥物。
力撲素是將難溶于水的紫杉醇包封在新型藥物載體-脂質(zhì)體磷脂雙分子層中，解決了紫杉醇的溶解性問(wèn)題；與普通紫杉醇藥物相比，力撲素具有的優(yōu)勢(shì)有:
(I)解除了由溶媒引發(fā)的超 過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)
紫杉醇脂質(zhì)體從根本上革除了普通紫杉醇注射液必需使用的聚氧乙基代蓖麻油與無(wú)水乙醇混合溶媒，革除了超過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。并可不作預(yù)處理，這為臨床用藥提供了方便，使患者免除了大劑量使用激素產(chǎn)生的不良影響。
(2)紫杉醇脂質(zhì)體的毒副反應(yīng)較紫杉醇注射液明顯減輕
由于脂質(zhì)體藥物獨(dú)特的藥代動(dòng)力學(xué)特性，在體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)、血藥濃度波動(dòng)小等因素，與紫杉醇注射液相比，紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)血液系統(tǒng)、血壓和肝功能的影響更小，藥物毒副反應(yīng)更低。此外，紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)血壓的影響明顯低于紫杉醇注射液，且外周血液和肝臟毒性反應(yīng)明顯減弱。
(3)明顯提高機(jī)體對(duì)紫杉醇的耐受性
急性毒性試驗(yàn)顯示:紫杉醇脂質(zhì)體的LD5tl比紫杉醇注射液大一倍，表明其耐受性明顯提聞，為臨床用藥加大劑量、提聞療效提供了空間。
(4)半衰期延長(zhǎng)、突顯緩釋功效
臨床前藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)表明:紫杉醇脂質(zhì)體的半衰期較紫杉醇注射液明顯延長(zhǎng)一倍以上。
(5)具有靶向給藥的特性
紫杉醇脂質(zhì)體在肝臟、肺、淋巴組織等組織器官濃度明顯增高。跟蹤檢測(cè)不增加該器官毒性，有利于局部病變的治療。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)室研究及臨床觀察發(fā)現(xiàn)，紫杉醇脂質(zhì)體解決了紫杉醇的溶解性問(wèn)題；提高了紫杉醇在溶液中的穩(wěn)定性；避免過(guò)敏反應(yīng)而不影響抗腫瘤活性；另外，紫杉醇脂質(zhì)體還具有腹腔、胸腔給藥的可能性。因此紫杉醇脂質(zhì)體與紫杉醇相比具有一定的優(yōu)勢(shì)。
但是隨著腫瘤化療藥物在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，腫瘤的耐藥性問(wèn)題越來(lái)越突出，已成為腫瘤有效治療的主要障礙之一。而上述各種形式的紫杉醇藥物對(duì)耐藥性腫瘤療效都較差。
3、白藜蘆醇20世紀(jì)80年代，世界衛(wèi)生組織調(diào)查發(fā)現(xiàn)，盡管法國(guó)人偏愛奶酪等高脂肪食物，但冠心病發(fā)病率和死亡率低于其他西方國(guó)家，其原因可能是與法國(guó)人常飲含白藜蘆醇的葡萄酒有關(guān)。此后，白藜蘆醇備受關(guān)注。到目前為止至少已在21科、31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇。白藜蘆醇主要來(lái)源于寥科Polygonaceae植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖和根,葡萄科植物葡萄Vitis vinifera果實(shí)的皮和籽,豆科Fabaceae植物花生Arachis hypogaea的種子等。白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝結(jié)和血管舒張，保持血液暢通，可預(yù)防癌癥的發(fā)生及發(fā)展，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病，缺血性心臟病，高血脂的防治作用。此外，白藜蘆醇還具有保護(hù)心血管、抗氧化、抗自由基、抗炎、抗菌等作用，而且還有很多的臨床使用實(shí)例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中各種形式的化療藥物對(duì)耐藥性腫瘤療效均較差的缺陷，提供一種對(duì)耐藥性腫瘤療效較好的載藥脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供一種載藥脂質(zhì)體，其特征在于，該載藥脂質(zhì)體包括長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體和包裹于其中的藥物活性組分，所述長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體為脂質(zhì)體表面被二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000修飾的脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。本發(fā)明還提供一種載藥脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，該方法包括，利用薄膜-超聲法，將脂質(zhì)體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述載藥脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。以及提供由上述方法制得的載藥脂質(zhì)體。
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此外，本發(fā)明還提供上述載藥脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用和在腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的載藥脂質(zhì)體含有紫杉醇和白藜蘆醇，除了對(duì)藥物敏感腫瘤的發(fā)展具有抑制活性外，其還可有效地抑制化療藥物耐藥性腫瘤的發(fā)展，因此，具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。


附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書的一部分，與下面的具體實(shí)施方式
一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中:圖1a和圖1b是本發(fā)明一種實(shí)施方式的載藥脂質(zhì)體的透射電鏡圖；圖2a顯示出本發(fā)明一種實(shí)施方式的載藥脂質(zhì)體處理MCF-7敏感細(xì)胞24小時(shí)后的結(jié)果，圖2b顯示出該載藥脂質(zhì)體處理MCF-7抗性細(xì)胞24小時(shí)后的結(jié)果；圖3a顯示出本發(fā)明一種實(shí)施方式的載藥脂質(zhì)體處理MCF-7敏感細(xì)胞48小時(shí)后的結(jié)果，圖3b顯示出該載藥脂質(zhì)體處理MCF-7抗性細(xì)胞48小時(shí)后的結(jié)果；圖4a顯示出本發(fā)明一種實(shí)施方式的載藥脂質(zhì)體處理MCF-7敏感細(xì)胞72小時(shí)后的結(jié)果，圖4b顯示出該載藥脂質(zhì)體處理MCF-7抗性細(xì)胞72小時(shí)后的結(jié)果；
圖5顯示出本發(fā)明一種實(shí)施方式的載藥脂質(zhì)體處理耐藥乳腺癌荷瘤裸鼠后腫瘤的變化結(jié)果。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供一種載藥脂質(zhì)體，其特征在于，該載藥脂質(zhì)體包括長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體和包裹于其中的藥物活性組分，所述長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體為脂質(zhì)體表面被二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000 (DSPE-mPEG2000)修飾的脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。
本發(fā)明中，所述長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體與藥物活性組分的摩爾比可以與現(xiàn)有技術(shù)中脂質(zhì)體載體與藥物活性組分的比例相同，優(yōu)選地，所述長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體與藥物活性組分的摩爾比為I: 0.001-0.5，進(jìn)一步優(yōu)選為 I: 0.01-0.3，最優(yōu)選為 I: 0.02-0.1。
根據(jù)本發(fā)明，所述藥物活性組分中，紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比可以在較寬的范圍內(nèi)變化，例如，所述紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比可以為1: 0.01-100;本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著白藜蘆醇量的增加，其與紫杉醇的協(xié)同作用也越來(lái)越顯著，優(yōu)選地，所述紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比為1: 1-80，進(jìn)一步優(yōu)選為1: 3-40，綜合考慮白藜蘆醇的協(xié)同作用和紫杉醇的細(xì)胞毒性，最優(yōu)選為1: 5-20。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用上述優(yōu)選比例范圍內(nèi)的紫杉醇和白藜蘆醇能夠獲得具有更高的治療效果的載藥脂質(zhì)體。
根據(jù)本發(fā)明，所述長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體可以與現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體相同，其中，脂質(zhì)體源與二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000的摩爾比可以在很寬的范圍內(nèi)變化，例如可以為1: 0.01-1，優(yōu)選為1: 0.02-0.2，進(jìn)一步優(yōu)選為1: 0.05-0.1。
本發(fā)明提供一種載藥脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，該方法包括，利用薄膜-超聲法，將脂質(zhì)體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述載藥脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。
其中，所述脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分的摩爾 比為可以為常規(guī)的脂質(zhì)體載體與藥物活性組分的比例，優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分的摩爾比為 1: 0.01-1: 0.001-0.5，進(jìn)一步優(yōu)選為 1: 0.02-0.2: 0.01-0.3，最優(yōu)選為I: 0.05-0.1: 0.02-0.1。
根據(jù)本發(fā)明的方法，所述藥物活性組分中，紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)，優(yōu)選地，所述紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比為1: 0.01-100，進(jìn)一步優(yōu)選為I: 1-80，再優(yōu)選為1: 3-40，最優(yōu)選為1: 5-20。
根據(jù)本發(fā)明，所述脂質(zhì)體源可以為本領(lǐng)域任何常規(guī)的能夠制得脂質(zhì)體載體的物質(zhì)，包括但不限于大豆卵磷脂、氫化大豆磷脂、蛋黃卵磷脂中的至少一種，優(yōu)選為大豆卵磷脂。
所述脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000、紫杉醇和白藜蘆醇均可以通過(guò)商購(gòu)獲得。
本發(fā)明中，所述薄膜-超聲法的具體步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，即，將各種原料溶解后去除溶劑制成薄膜，然后通過(guò)超聲破碎制得顆粒。
優(yōu)選地，所述薄膜-超聲法中的超聲條件包括，頻率為200-800W，優(yōu)選為300-500W ;超聲時(shí)間為5-30S，優(yōu)選為10-20S ;間隔時(shí)間為2-20S，優(yōu)選為5-10S ;循環(huán)次數(shù)為5-30次，優(yōu)選為10-20次。具體地，所述薄膜-超聲法可包括以下步驟，(I)將脂質(zhì)體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、紫杉醇、白藜蘆醇和第一有機(jī)溶劑混合，得到第一混合溶液，(2)蒸發(fā)去除第一混合溶液中的第一有機(jī)溶劑，形成薄膜，(3)將所述薄膜與純水或生理鹽水混合得到第二混合溶液，超聲得到所述載藥脂質(zhì)體。其中，所述第一有機(jī)溶劑可以為能夠溶解各種原料的溶劑，優(yōu)選為無(wú)水乙醇、氯仿和甲醇中的至少一種，最優(yōu)選為無(wú)水乙醇。本發(fā)明中，所述蒸發(fā)的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，只要能夠?qū)⑵渲械牡谝挥袡C(jī)溶劑去除即可，例如可以在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，所述第一有機(jī)溶劑的加入量可以為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，優(yōu)選地，在第一混合溶液中，所述紫杉醇的濃度為IX 10_4mOl/L-10mOl/L。所述純水或生理鹽水的加入量也可以為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，優(yōu)選地，在第二混合溶液中，所述紫杉醇的濃度為IX 10_5mol/L-10mol/L，進(jìn)一步優(yōu)選為I X 10_3mol/L-lmol/L，最優(yōu)選為 5 X 10 2mol/L-0.5mol/L。本發(fā)明對(duì)于所述脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000、紫杉醇、白藜蘆醇和第一有機(jī)溶 劑的混合方式?jīng)]有特別的限定，優(yōu)選地，先將脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000和第一有機(jī)溶劑混合，再加入紫杉醇和白藜蘆醇。其中，對(duì)于脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000和第一有機(jī)溶劑三者的加入順序沒有特別的限定,對(duì)于再加入的紫杉醇和白藜蘆醇的加入順序也沒有特別的限定。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)上述優(yōu)選的方法，能夠得到治療效果更好的載藥脂質(zhì)體。本發(fā)明提供由上述方法制得的載藥脂質(zhì)體。本發(fā)明還提供上述載藥脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的所述載藥脂質(zhì)體特別適合于制備抗耐藥性腫瘤的藥物。本發(fā)明還提供上述載藥脂質(zhì)體在腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的所述載藥脂質(zhì)體特別適合于治療耐藥性腫瘤。所述腫瘤和耐藥性腫瘤包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞癌、頭頸癌、食管癌、精原細(xì)胞瘤、肝癌、肺腺細(xì)胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤，以及它們的耐藥性腫瘤中的至少一種。通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。本發(fā)明的實(shí)施例中，所用大豆卵磷脂購(gòu)自上海滬宇生化試劑有限公司，商品號(hào)為L(zhǎng)E030A，CAS號(hào)為8002-43-5 ;所用蛋黃卵磷脂購(gòu)自上海滬宇生化試劑有限公司，商品號(hào)為P0051 ;所用二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000購(gòu)自genzyme公司，商品號(hào)為L(zhǎng)P-R4-039，CAS號(hào)為147867-65-0 ;所用紫杉醇(PTX)購(gòu)自北京諾瑞醫(yī)藥技術(shù)有限公司，CAS號(hào)為33069-62-4 ;所用白藜蘆醇(Res)購(gòu)自湖北興銀河化工有限公司，CAS號(hào)為501-36-0。實(shí)施例1
本實(shí)施例用于制備載藥脂質(zhì)體:PTX+Res脂質(zhì)體-1。
(I)將4X 10_2mol大豆卵磷脂、2X 10_3mol 二硬脂?；字Ｒ掖及穇甲氧基聚乙二醇2000與150ml的無(wú)水乙醇混合，溶解后加入3 X ΙΟΛιοΙ紫杉醇和1.2 X IO^mol白藜蘆醇，得到第一混合溶液，
(2)蒸發(fā)去除第一混合溶液中的無(wú)水乙醇，形成薄膜，
(3)將所述薄膜與5ml生理鹽水混合，超聲得到載藥脂質(zhì)體，即PTX+Res脂質(zhì)體_1。
所述超聲的條件包括:頻率為350W，超聲18s，間隔8s，超聲15次。
實(shí)施例2
本實(shí)施例用于制備載藥脂質(zhì)體:PTX+Res脂質(zhì)體_2。
(I)將4X 10_2mol大豆卵磷脂、2X 10_3mol 二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000與200ml的無(wú)水乙醇混合，溶解后加入3 X ΙΟΛιοΙ紫杉醇和3.6Χ 10_3mOl白藜蘆醇，得到第一混合溶液，
(2)蒸發(fā)去除第一混合溶液中的無(wú)水乙醇，形成薄膜，
(3)將所述薄膜與4ml生理鹽水混合，超聲得到載藥脂質(zhì)體，即PTX+Res脂質(zhì)體_2。
所述超聲的條件包括:頻率為400W，超聲15s，間隔5s，超聲10次。
對(duì)比例I
根據(jù)實(shí)施例2的方法制備紫杉醇載藥脂質(zhì)體(PTX脂質(zhì)體)，不同的是，不加入白藜蘆醇。
對(duì)比例2
根據(jù)實(shí)施例2的方法制備白藜蘆醇載藥脂質(zhì)體(Res脂質(zhì)體)，不同的是，不加入紫杉醇。
對(duì)比例3
根據(jù)實(shí)施例2的方法，將4X l(T2mol大豆卵磷脂和2X l(T3mol 二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000與200ml的無(wú)水乙醇混合，制得長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體。
實(shí)施例3
本實(shí)施例用于制備載藥脂質(zhì)體:PTX+Res脂質(zhì)體_3。
(I)將8X10_2mol的大豆卵磷脂、2X 10_3mol的二硬脂?；字Ｒ掖及穇甲氧基聚乙二醇2000與IOOml的氯仿混合，溶解后加入3X 10_4mol紫杉醇和6X 10_3mol白藜蘆醇，得到第一混合溶液，
(2)蒸發(fā)去除第一混合溶液中的氯仿，形成薄膜，
(3)將所述薄膜與3ml純水混合，超聲得到載藥脂質(zhì)體，即PTX+Res脂質(zhì)體_3。
所述超聲的條件包括:頻率為300W，超聲20s，間隔10s，超聲20次。
實(shí)施例4
本實(shí)施例用于制備載藥脂質(zhì)體:PTX+Res脂質(zhì)體_4。
(I)將0.4mol蛋黃卵磷脂、2X 10_2mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000與IOOml的無(wú)水乙醇混合，溶解后加入3X 10_4mol紫杉醇和1.2 XlO^moI白藜蘆醇，得到第一混合溶液，
(2)蒸發(fā)去除第一混合溶液中的無(wú)水乙醇，形成薄膜，(3)將所述薄膜與2ml生理鹽水混合，超聲得到載藥脂質(zhì)體，即PTX+Res脂質(zhì)體-4。所述超聲的條件包括:頻率為500W，超聲10s，間隔5s，超聲12次。測(cè)試?yán)齀用透射電鏡(型號(hào)為Tecnai G2 F20 U-TWIN)對(duì)PTX+Res脂質(zhì)體_3進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1a和圖1b所示，由圖1a和圖1b可以看出，載藥脂質(zhì)體形成了較為均一的直徑為70-1OOnm的顆粒。測(cè)試?yán)?本測(cè)試?yán)糜谠诩?xì)胞水平上檢測(cè)本發(fā)明的載藥脂質(zhì)體的活性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1:在96孔板中接種MCF-7敏感細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞)，接種量為5000個(gè)細(xì)胞/孔，細(xì)胞貼壁后加藥，根據(jù)藥物的不同分為4組，分別是:(I)生理鹽水組；(2)脂質(zhì)體組(單獨(dú)加入對(duì)比例3制得的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體);(3)紫杉醇脂質(zhì)體組(加入對(duì)比例I制得的PTX脂質(zhì)體)，其中，紫杉醇的在培養(yǎng)基中的終濃度為Syg/ml ；(4)同時(shí)包裹紫杉醇和白藜蘆醇的脂質(zhì)體組(PTX+Res脂質(zhì)體)，其中，包括4個(gè)小組，分別加入實(shí)施例1-4制得的PTX+Res脂質(zhì)體-1、PTX+Res脂質(zhì)體-2、PTX+Res脂質(zhì)體-3和PTX+Res脂質(zhì)體_4，其中，各組中紫杉醇在培養(yǎng)基中的終濃度均為5 μ g/ml，而白藜蘆醇的終濃度分別是5，15，25，50 μ g/ml，每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)孔；其中，(2)和(4)中加入PTX+Res脂質(zhì)體-2的組中的脂質(zhì)體加入量均相同。在加藥24h，48h，72h后用MTS試劑盒檢測(cè)OD值。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)2:根據(jù)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)I相同的方法進(jìn)行檢測(cè)，不同的是，接種MCF-7紫杉醇抗性細(xì)胞。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)2的結(jié)果如圖2a-2b、3a-3b和4a_4b所示。圖2a和圖2b為處理24小時(shí)后的結(jié)果，其中，縱軸表示測(cè)得的OD值，其反映出存活細(xì)胞的數(shù)量，各組柱狀圖反映出生理鹽水組、脂質(zhì)體組、紫杉醇脂質(zhì)體組，以及PTX+Res脂質(zhì)體-1至PTX+Res脂質(zhì)體-4中的一組的測(cè)試結(jié)果(橫軸表示白藜蘆醇在培養(yǎng)基中的終濃度，從左至右依次為PTX+Res脂質(zhì)體-1至PTX+Res脂質(zhì)體-4的測(cè)試結(jié)果)。圖2a為對(duì)MCF-7敏感細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果，圖2b為對(duì)紫杉醇耐藥性乳腺癌細(xì)胞(MCF-7抗性細(xì)胞)的檢測(cè)結(jié)果。圖2a中，加入不同濃度的白藜蘆醇的PTX+Res脂質(zhì)體_1至PTX+Res脂質(zhì)體_4對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制活性與單獨(dú)使用紫杉醇的抑制活性接近，甚至在加入低濃度的白藜蘆醇時(shí)，PTX+Res脂質(zhì)體-1至PTX+Res脂質(zhì)體_4的抑制活性還差于單獨(dú)使用紫杉醇的效果。但是從圖2b中可以看出，紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)于紫杉醇耐藥性腫瘤細(xì)胞幾乎不再具有抑制活性，而根據(jù)本發(fā)明的載藥脂質(zhì)體PTX+Res脂質(zhì)體-1至PTX+Res脂質(zhì)體_4均具有明顯的癌細(xì)胞抑制活性。并且，隨著白藜蘆醇濃度的增加，其抑制活性越來(lái)越顯著。圖3a和圖3b為處理 48小時(shí)后的結(jié)果，其中，圖3a為對(duì)MCF-7敏感細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果，圖3b為對(duì)MCF-7抗性細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果。圖3a和圖3b與圖2a和圖2b的結(jié)果類似，力口入不同濃度的白藜蘆醇的PTX+Res脂質(zhì)體-1至PTX+Res脂質(zhì)體-4對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制活性與單獨(dú)使用紫杉醇的抑制活性接近，但是，紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)于紫杉醇耐藥性腫瘤細(xì)胞幾乎不再具有抑制活性，而根據(jù)本發(fā)明的PTX+Res脂質(zhì)體-1至PTX+Res脂質(zhì)體_4均具有明顯的癌細(xì)胞抑制活性。
圖4a和圖4b為處理72小時(shí)后的結(jié)果，其中，圖4a為對(duì)MCF-7敏感細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果，圖4b為對(duì)MCF-7抗性細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果。圖4a和圖4b與上述兩組圖的結(jié)果也類似，相比于圖3a和圖3b,圖4a和圖4b中的存活細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)一步下降。
由上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明的載藥脂質(zhì)體特別適合于抑制紫杉醇抗性腫瘤細(xì)胞的發(fā)展和繁殖，并且具有明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性，在處理72小時(shí)后，仍有明顯的抗腫瘤活性，說(shuō)明本發(fā)明的載藥脂質(zhì)體的抗腫瘤活性持久。
測(cè)試?yán)?
本測(cè)試?yán)糜谠趧?dòng)物水平上檢測(cè)本發(fā)明的載藥脂質(zhì)體對(duì)紫杉醇耐藥的乳腺癌的抑制活性。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn):通過(guò)皮下注射將MCF-7抗性細(xì)胞接種至16g Balb/c的裸鼠中，IO7個(gè)細(xì)胞/只，當(dāng)腫瘤長(zhǎng)至3mm時(shí)打藥，共5組，分別是:
(I)生理鹽水組，
(2)脂質(zhì)體組(注射對(duì)比例3制得的脂質(zhì)體)，
(3)紫杉醇脂質(zhì)體組(注射對(duì)比例I制得的PTX脂質(zhì)體，注射量為8mg/kg體重)，
(4)白藜蘆醇脂質(zhì)體組(注射對(duì)比例2制得的Res脂質(zhì)體，注射量為20mg/kg體重)，
(5)同時(shí)包裹紫杉醇和白藜蘆醇的脂質(zhì)體組(注射實(shí)施例2制得的PTX+Res脂質(zhì)體)，每天腹腔注射，紫杉醇注射量為8mg/kg體重，白藜蘆醇注射量為20mg/kg體重。
其中，(2)組中的脂質(zhì)體注射量與(5)組相同。注射2周后取出腫瘤照相，結(jié)果如圖5所示(每組三個(gè)平行實(shí)驗(yàn))。
由圖5可以看出，與生理鹽水組相比，單獨(dú)使用紫杉醇脂質(zhì)體和單獨(dú)使用白藜蘆醇脂質(zhì)體已經(jīng)無(wú)法對(duì)紫杉醇耐藥的乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，但是，使用本發(fā)明的PTX+Res脂質(zhì)體-2，即組合使用白藜蘆醇和紫杉醇的載藥脂質(zhì)體對(duì)紫杉醇耐藥的乳腺腫瘤產(chǎn)生明顯的抑制。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了本發(fā)明的載藥脂質(zhì)體對(duì)耐藥性腫瘤具有強(qiáng)的抑制活性。
此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.一種載藥脂質(zhì)體，其特征在于，該載藥脂質(zhì)體包括長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體和包裹于其中的藥物活性組分，所述長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體為脂質(zhì)體表面被二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000修飾的脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載藥脂質(zhì)體，其中，所述長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體與藥物活性組分的摩爾比為 1: 0.001-0.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載藥脂質(zhì)體，其中，所述藥物活性組分中，紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比為I: 0.01-100。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的載藥脂質(zhì)體，其中，所述長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體與二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000的摩爾比為1: 0.01-1。
5.一種載藥脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，該方法包括，利用薄膜-超聲法，將脂質(zhì)體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述載藥脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述脂質(zhì)體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分的摩爾比為I: 0.01-1: 0.001-0.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述藥物活性組分中，紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比為 I: 0.01-100。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述脂質(zhì)體源為大豆卵磷脂、氫化大豆磷脂、蛋黃卵磷脂中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述薄膜-超聲法中的超聲條件包括，頻率為200-800W，超聲時(shí)間為5-30S，間隔時(shí)間為2-20S，循環(huán)次數(shù)為5-30次。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述薄膜-超聲法包括以下步驟， (1)將脂質(zhì)體源、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000、紫杉醇、白藜蘆醇和第一有機(jī)溶劑混合，得到第一混合溶液， (2)蒸發(fā)去除第一混合溶液中的第一有機(jī)溶劑，形成薄膜， (3)將所述薄膜與純水或生理鹽水混合得到第二混合溶液，超聲得到所述載藥脂質(zhì)體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述第一有機(jī)溶劑為無(wú)水乙醇、氯仿和甲醇中的至少一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求10 所述的方法，其中，在第二混合溶液中，所述紫杉醇的濃度為I X105mol/L_10mol/L。
13.由權(quán)利要求5-12中任意一項(xiàng)所述的方法制得的載藥脂質(zhì)體。
14.權(quán)利要求1-4和13中任意一項(xiàng)所述的載藥脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中，所述腫瘤為耐藥性腫瘤。
16.權(quán)利要求1-4和13中任意一項(xiàng)所述的載藥脂質(zhì)體在腫瘤治療中的應(yīng)用。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述腫瘤為耐藥性腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供一種載藥脂質(zhì)體，該載藥脂質(zhì)體包括長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體和包裹于其中的藥物活性組分，所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。本發(fā)明還提供一種載藥脂質(zhì)體的制備方法，該方法包括，利用薄膜-超聲法，將脂質(zhì)體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述載藥脂質(zhì)體，所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。以及提供由上述方法制得的載藥脂質(zhì)體。此外，本發(fā)明還提供上述脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用和在腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的載藥脂質(zhì)體含有紫杉醇和白藜蘆醇，除了具有抑制藥物敏感腫瘤發(fā)展的活性外，其還可有效地抑制化療藥物耐藥性腫瘤的發(fā)展，具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K9/127GK103142481SQ20111040211
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者楊先達(dá), 孟潔, 王琛 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心