專利名稱：樹突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞在肺癌治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥和免疫學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及樹突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞在肺癌治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其中，非小細(xì)胞肺癌的死亡率占據(jù)首位。在診斷時(shí)，多數(shù)患者已經(jīng)晚期(IIIB-IV期)，無法進(jìn)行手術(shù)治療。IIIB-IV期的非小細(xì)胞肺癌患者只能接受化療為主的治療方式。化療的毒副反應(yīng)包括骨髓抑制，胃腸道反應(yīng)和感染性疾病。鑒于化療的局限性，需要發(fā)展一種新穎的治療模式。在不同的治療模式中，免疫治療因?yàn)槠溽槍?duì)性地殺傷腫瘤細(xì)胞，具有高效和低毒的作用，而日益受到廣泛關(guān)注。臨床前期研究提示，免疫治療聯(lián)合化療能提供明顯的益處。然而，至今沒有數(shù)據(jù)顯示化療聯(lián)合免疫治療在晚期非細(xì)胞肺癌患者中的作用。因此，本領(lǐng)域非常有必要進(jìn)一步研究DC聯(lián)合CIK的免疫治療聯(lián)合化療在晚期肺癌患者中的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供樹突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞在肺癌治療中的應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種用于緩解或治療肺癌的細(xì)胞組合，包括(a)致敏的DC細(xì)胞；該細(xì)胞如下制備獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞(較佳地，為黏附細(xì)胞)，在含有GM-CSF和IL-4的條件下培養(yǎng)，用SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的肽刺激，獲得致敏的DC細(xì)胞；和(b) CIK細(xì)胞；該細(xì)胞如下制備獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞(較佳地，為非黏附細(xì)胞)，在含有IFN- γ的條件下培養(yǎng)，之后加入抗人⑶3抗體和IL-2，獲得CIK細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選例中，(a)中，獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞后，所述的單個(gè)核細(xì)胞如下處理將肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞置于容器中，靜置使之形成兩部分細(xì)胞，一部分黏附在容器壁上，一部分為懸浮細(xì)胞；分離其中的黏附細(xì)胞；和/或(b)中，獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞后，所述的單個(gè)核細(xì)胞如下處理將肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞置于容器中，靜置使之形成兩部分細(xì)胞，一部分黏附在容器壁上，一部分為懸浮細(xì)胞；分離其中的非黏附細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，(a)中，單個(gè)核細(xì)胞在含有1000士200單位/mL GM-CSF, 500 士 100單位/mL IL-4的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，單個(gè)核細(xì)胞在含有1000 士 100單位/mL GM-CSF，500 士 50單位/ mL IL-4的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，(a)中，細(xì)胞在含有GM-CSF和IL_4的條件下培養(yǎng)6_10天(較佳地8天)后，與SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的肽共孵育12士2小時(shí)(較佳地，12士 1小時(shí))。在另一優(yōu)選例中，共孵育時(shí)，肽的濃度是10 士 2ug/ml。在另一優(yōu)選例中，(b)中，單個(gè)核細(xì)胞在含有1000士 100單位/mL IFN-γ的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)24士5小時(shí)(較佳地對(duì)士3小時(shí))，之后加入50士 10ng/mL(較佳地50士5ng/ mL)的抗⑶3抗體，細(xì)胞每3 士 1天換液，換液時(shí)補(bǔ)充1000 士 200單位/mL IL-2，培養(yǎng)9 士 2 天(較佳地9 士1天)。在另一優(yōu)選例中，單個(gè)核細(xì)胞在含有IFN-Y的培養(yǎng)介質(zhì)中的細(xì)胞濃度是 (1-10) X IO6個(gè)細(xì)胞/ml ；較佳地，為3X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備致敏的DC細(xì)胞的方法，該方法包括獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞(較佳地，為黏附細(xì)胞)，在含有GM-CSF和IL-4的條件下培養(yǎng)，用 SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的肽刺激，獲得致敏的DC細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備CIK細(xì)胞的方法，該方法包括獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞(較佳地，為非黏附細(xì)胞)，在含有IFN-γ的條件下培養(yǎng)，之后加入抗CD3 抗體和IL-2，獲得CIK細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的細(xì)胞組合的用途，用于制備緩解或治療肺癌的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的肺癌是非小細(xì)胞肺癌。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于緩解或治療肺癌的藥盒，其中包括容器1，其中包括有效量的致敏的DC細(xì)胞，以及與所述細(xì)胞相容的載體；所述的致敏的DC細(xì)胞如下制備獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞(較佳地，為黏附細(xì)胞)，在含有 GM-CSF和IL-4的條件下培養(yǎng)，用SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的肽刺激，獲得致敏的DC細(xì)胞；和/或容器2，其中包括有效量的CIK細(xì)胞，以及與所述細(xì)胞相容的載體；所述的CIK細(xì)胞如下制備獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞(較佳地，為非黏附細(xì)胞)，在含有IFN-γ的條件下培養(yǎng)，之后加入抗⑶3抗體和IL-2，獲得CIK細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的藥盒中還包括癌癥化療藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥化療藥物選自長(zhǎng)春瑞濱和/或順鉬。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、與化療組相比，免疫化療組的生存期有顯著延長(zhǎng)。在免疫化療組，中位無病生存期為 6. 9 個(gè)月(95% CI 5. 0-8. 8) (p = 0. 03)，化療組為 5. 2 個(gè)月(95% CI 3. 3-6. 0)。圖2、免疫化療組患者的1、2、5年生存率分別為64. 3%,49. 8%和21. 0%。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，開辟了一種利用樹突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞來緩解或治療肺癌的方法，所述方法可有效延長(zhǎng)癌癥患者的生存時(shí)間，且毒副作用低。
細(xì)胞如本文所用，所述的“單個(gè)核細(xì)胞”是指獲自癌癥患者外周血、或癌癥患者的癌癥組織、惡性腹水或惡性胸水中的一類具有免疫效應(yīng)的細(xì)胞，其可通過例如非連續(xù)密度梯度離心法分離獲得。該類具有免疫效應(yīng)的細(xì)胞主要包括樹突狀細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等。DC細(xì)胞亦可從骨髓中的造血干細(xì)胞中獲得。本發(fā)明中，利用樹突狀細(xì)胞(DC)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的細(xì)胞免疫。樹突狀細(xì)胞是強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，能有效地刺激抗腫瘤的細(xì)胞免疫。應(yīng)用腫瘤相關(guān)抗原(TAA)致敏DC能誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫反應(yīng)。一些證據(jù)顯示，TAA致敏DC能誘導(dǎo)殺傷性的T細(xì)胞(CTL)的產(chǎn)生。CEA 是18道爾頓的糖蛋白，在肺癌患者中高表達(dá)。在本發(fā)明中，本發(fā)明人經(jīng)過廣泛研究后發(fā)現(xiàn)， 應(yīng)用CEA蛋白氨基酸序列第605-613的9肽(HLA-A2限制性的)來致敏DC，獲得的致敏DC 細(xì)胞能夠高效地誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的致敏DC細(xì)胞如下制備獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)，在貼壁細(xì)胞中加入細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4使之成為DC ；在含有GM-CSF 和IL-4的條件下培養(yǎng)，用SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的肽刺激，獲得致敏的DC細(xì)胞。利用GM-CSF和IL-4來進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，可以促進(jìn)細(xì)胞的樹指狀突起，避免形成巨噬細(xì)胞；并可以為細(xì)胞提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)是體外應(yīng)用抗CD3單抗刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的。CIK 比之于淋巴細(xì)胞激活的殺傷細(xì)胞(LAK)具有更強(qiáng)的抗腫瘤作用。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的CIK細(xì)胞如下制備獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞，單個(gè)核細(xì)胞鋪成在培養(yǎng)皿上，靜置使之形成兩部分細(xì)胞，一部分為黏附在培養(yǎng)皿的，一部分為懸浮細(xì)胞)，懸浮的細(xì)胞在含有IFN- γ的條件下培養(yǎng)，之后加入抗⑶3抗體和IL-2， 獲得CIK細(xì)胞。IFN- γ和IL-2的應(yīng)用有利于獲得CIK細(xì)胞。CIK細(xì)胞可以在體外通過流式細(xì)胞儀鑒定其表型，⑶3+⑶56+雙陽性的CIK超過50%才被認(rèn)為具有殺傷活性。CIK細(xì)胞兼具T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的殺瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性。DC和CIK聯(lián)合能互相改變彼此的細(xì)胞表面分子，導(dǎo)致IL-12的分泌，提高殺傷作用。這樣，DC聯(lián)合CIK在免疫治療中具有理論依據(jù)。DC聯(lián)合CIK是一種天然免疫結(jié)合獲得性免疫的新穎免疫治療方式。本發(fā)明還提供了 DC和CIK的用途，兩者聯(lián)合應(yīng)用于緩解或治療肺癌。從患者外周血中獲取單個(gè)核細(xì)胞后，分別制備致敏的DC以及CIK，回輸給患者，從而緩解或治療肺癌。本發(fā)明還提供了含有細(xì)胞的藥物組合物，它含有有效量的致敏DC或CIK細(xì)胞，以及與所述的細(xì)胞相容的載體。通常，可將所述的細(xì)胞配制于無毒的、惰性的和與所述的細(xì)胞相容的介質(zhì)中，其中 PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。如本文所用，術(shù)語“含有，，表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。如本文所用，術(shù)語“有效量”或“有效劑量”是指可對(duì)癌癥患者產(chǎn)生功能或活性的且可被癌癥患者所接受的量。如本文所用，“與所述細(xì)胞相容的”的成分是適用于哺乳哺乳動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)?！芭c所述細(xì)胞相容的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑，也即屬于一種藥學(xué)上可接受的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington，s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關(guān)于與所述細(xì)胞相容的載體的充分說明。在組合物中與所述細(xì)胞相容的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。本發(fā)明的組合物含有安全有效量的所述的細(xì)胞以及與所述細(xì)胞相容的載體。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。 活性成分的給藥量是治療有效量。在使用本發(fā)明的組合物時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明的細(xì)胞施用于哺乳動(dòng)物。當(dāng)然，具體的給予劑量和給予次數(shù)還應(yīng)考慮所施與的患者的體重、年齡、健康狀況等因素，這些都是本領(lǐng)域熟練人員既能范圍內(nèi)的。本發(fā)明的組合物可直接用于肺癌的緩解或治療。此外，還可同時(shí)與其它治療劑或輔劑聯(lián)合使用。較佳地，本發(fā)明的細(xì)胞聯(lián)合化療藥物來治療肺癌；所述的化療藥物是臨床上用于殺肺癌細(xì)胞的藥物。本發(fā)明還提供了一種用于緩解或治療肺癌的藥盒，其中包括容器1，其中包括有效量(如IO3 IOltl個(gè)細(xì)胞/mL;較佳地IO4 IO9個(gè)細(xì)胞/ mL ；更佳地IO5 IO8個(gè)細(xì)胞/mL)的致敏的DC細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體；和/或容器2，其中包括有效量(如IO4 IO11個(gè)細(xì)胞/mL ；較佳地IO5 101°個(gè)細(xì)胞/ mL ；更佳地IO6 IO9個(gè)細(xì)胞/mL)的CIK細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的藥盒中還包括癌癥化療藥物。所述的癌癥化療藥物例如但不限于長(zhǎng)春瑞濱和/或順鉬。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的藥盒中還包括使用說明書，以指導(dǎo)本領(lǐng)域人員采取適合的方法給藥。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、患者及給藥方案根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，患者具有組織學(xué)證實(shí)的非小細(xì)胞肺癌，血清CEA水平(其測(cè)定方法采用常規(guī)化學(xué)發(fā)光法)在6-3Mng/ml (正常值5ng/ml)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)的HLA-A2 陽性的患者，抽取外周血，分離單個(gè)核細(xì)胞?；颊吖撬瑁文I功能正常。患者無自身免疫性疾病，無腦轉(zhuǎn)移，無急性、慢性感染性疾病。在2004年8月到2005年10月，觀位III B-IV 的非小細(xì)胞肺癌患者入組。隨機(jī)進(jìn)入化療組或者免疫化療組?；颊呙?周CT評(píng)價(jià)病灶大
6小。化學(xué)發(fā)光法在每次治療前后評(píng)價(jià)CEA值。毒性反應(yīng)按照NCI (2. 0)標(biāo)準(zhǔn)。本研究獲得上海市胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。首先的評(píng)價(jià)指標(biāo)是毒性反應(yīng)，其次是無病生存率(TTP)和總生存率(OS)。28個(gè)患者的基線水平見表1。免疫治療組中6男，8女，中位年齡50歲?；熃M7 男，7女，中位年齡48歲。免疫化療組最常見的病理類型是腺癌(71.4%)?；熃M也是腺癌(78.5%)。兩組中絕大多數(shù)是IV期(分期標(biāo)準(zhǔn)為WHO標(biāo)準(zhǔn))患者(71.4%)。表1、兩組中患者特征
權(quán)利要求
1.一種用于緩解或治療肺癌的細(xì)胞組合，包括(a)致敏的DC細(xì)胞；該細(xì)胞如下制備獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞，在含有GM-CSF 和IL-4的條件下培養(yǎng)，用SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的肽刺激，獲得致敏的DC細(xì)胞；和(b)CIK細(xì)胞；該細(xì)胞如下制備獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞，在含有IFN-Y的條件下培養(yǎng)，之后加入抗人⑶3抗體和IL-2，獲得CIK細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞組合，其特征在于，(a)中，獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞后，所述的單個(gè)核細(xì)胞如下處理將肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞置于容器中，靜置使之形成兩部分細(xì)胞，一部分黏附在容器壁上，一部分為懸浮細(xì)胞；分離其中的黏附細(xì)胞；和/或(b)中，獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞后，所述的單個(gè)核細(xì)胞如下處理將肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞置于容器中，靜置使之形成兩部分細(xì)胞，一部分黏附在容器壁上，一部分為懸浮細(xì)胞；分離其中的非黏附細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞組合，其特征在于，(a)中，單個(gè)核細(xì)胞在含有1000士 200 單位/mL GM-CSF，500士 100單位/mL IL-4的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞組合，其特征在于，(a)中，細(xì)胞在含有GM-CSF和IL-4的條件下培養(yǎng)6-10天后，與SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的肽共孵育12士2小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞組合，其特征在于，(b)中，單個(gè)核細(xì)胞在含有1000士100 單位/mL IFN-Y的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)對(duì)士5小時(shí)，之后加入50士 lOng/mL的抗⑶3抗體，細(xì)胞每3士 1天換液，換液時(shí)補(bǔ)充1000士200單位/mLIL-2，培養(yǎng)9士2天。
6.一種制備致敏的DC細(xì)胞的方法，該方法包括獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞，在含有GM-CSF和IL-4的條件下培養(yǎng)，用SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的肽刺激，獲得致敏的DC 細(xì)胞。
7.一種制備CIK細(xì)胞的方法，該方法包括獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞，在含有 IFN- γ的條件下培養(yǎng)，之后加入抗⑶3抗體和IL-2，獲得CIK細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞組合的用途，用于制備緩解或治療肺癌的組合物。
9.一種用于緩解或治療肺癌的藥盒，其中包括容器1，其中包括有效量的致敏的DC細(xì)胞，以及與所述細(xì)胞相容的載體；所述的致敏的DC細(xì)胞如下制備獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞，在含有GM-CSF和IL-4的條件下培養(yǎng)， 用SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的肽刺激，獲得致敏的DC細(xì)胞；和/或容器2，其中包括有效量的CIK細(xì)胞，以及與所述細(xì)胞相容的載體；所述的CIK細(xì)胞如下制備獲取肺癌患者自身單個(gè)核細(xì)胞，在含有IFN-γ的條件下培養(yǎng)，之后加入抗CD3抗體和IL-2，獲得CIK細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的藥盒，其特征在于，其中還包括癌癥化療藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及樹突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞在肺癌治療中的應(yīng)用。本發(fā)明制備了致敏的DC細(xì)胞以及CIK細(xì)胞，將兩種細(xì)胞回輸給肺癌患者可有效延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，且毒副作用低。
文檔編號(hào)A61K35/14GK102357101SQ20111033546
公開日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者鐘華, 鐘潤(rùn)波, 韓寶惠 申請(qǐng)人:上海市胸科醫(yī)院