專利名稱：一種與纖維蛋白特異結(jié)合的重組蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與纖維蛋白特異結(jié)合的重組蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblast growth factor, bFGF)是一個(gè)很強(qiáng)的有絲分裂原，能促進(jìn)多種中胚層來源的細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖，因此有望用來進(jìn)行治療性血管再生和損傷修復(fù)。內(nèi)源性的bFGF通常在損傷和缺血過程中往往不足以快速促進(jìn)血管新生以及損傷修復(fù)。注射重組bFGF能改善損傷以及肢體和心肌缺血過程中血管新生和血液循環(huán)，然而目前重組bFGF的使用受限制的原因之一在于重組bFGF在體內(nèi)快速擴(kuò)散，導(dǎo)致治療部位的重組bFGF積累低，藥物難以持續(xù)作用(Rinsch, C. , et al. (2001). Delivery of FGF_2but not VEGF by encapsulated genetically engineered myoblasts improves survival and vascularization in a model of acute skin flap ischemia. Gene therapy 8:523-533·)。因此，米用以位點(diǎn)特異和可持續(xù)的方式應(yīng)用bFGF的新方法就顯得非常必要。定向治療或者靶向治療(targeted therapy)，是一種非常有效的給藥方法，這種方法通過藥物與治療部位的分子靶標(biāo)特異的相互作用提高治療效果，降低副作用(Sawyers，C(2004)Targeted cancer therapy. Nature 432 :294-297. Garrett,C(2005)Targeted therapy :the fast pace of progress. Cancer Control 12:71-72.)。靶向治療很關(guān)鍵的一點(diǎn)就是尋找特異的分子靶標(biāo)。大多數(shù)損傷都伴隨著血管破裂、出血并隨后形成血漿凝集物(Plasma clot)，這種血漿凝集物的主要成分是纖維蛋白(fibrin)，也是血栓的主要成分(ffu, S. C.，Castellino, F. J.，and Wong, S. L. (2003). A fast-acting, modular-structured staphylokinase fusion with Kringle-Ifrom human plasminogen as the fibrin-targeting domain offers improved clot lysis efficacy. The Journal of biological chemistry 278 :18199-18206.)。這禾中凝集物的微觀結(jié)構(gòu)為一種多孔的三維結(jié)構(gòu)，是損傷修復(fù)的天然支架(Wu，S.C.，et al (2002) Functional production and characterization of a fibrin-specific single-chain antibody fragment from Bacillus subtilis :effects of molecular chaperones and a wall-bound protease on antibody fragment production. Applied and environmental microbiology 68 :3261-3269.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與纖維蛋白特異結(jié)合的重組蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供與纖維蛋白特異結(jié)合的重組蛋白，是將如下a)或b)或C)或d)的多肽作為融合伙伴融合到目的蛋白的氨基末端得到的重組蛋白
3
a)由序列表中序列2自氨基末端第22位-第107位所示的氨基酸序列組成的多肽；b)由序列表中序列4自氨基末端第22位-第109位所示的氨基酸序列組成的多肽；c)將a)限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且能與纖維蛋白特異結(jié)合的由a)衍生的多肽。d)將b)限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且能與纖維蛋白特異結(jié)合的由b)衍生的多肽。a)和b)的多肽分別是Kringlel和Kringle4結(jié)構(gòu)域。為了使本發(fā)明的重組蛋白便于純化，可在由序列表中序列2或4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)或d)中的重組蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述c)或d)中的重組蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1自5'末端第1-擬8 位或序列3自5'末端第1-834位所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子， 和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。其中，所述目的蛋白可為能誘導(dǎo)組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)的因子。能誘導(dǎo)組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)的因子包括FGF (成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、BMP3 (骨形成蛋白3) ,PDGF (血小板衍生生長(zhǎng)因子)、EGF (表皮生長(zhǎng)因子)、TGF (轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子)、VEGF (血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、 NGF (神經(jīng)生長(zhǎng)因子)或NT3/4(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3/4)。本發(fā)明中所述目的蛋白具體為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。為了便于分離和純化本發(fā)明的能與纖維蛋白特異結(jié)合的重組蛋白，所述重組蛋白的氨基末端還加入了組氨酸標(biāo)簽；為了保證重組蛋白的正確折疊，Kringlel蛋白或 Kringle4蛋白與目的蛋白間還加入了連接肽。加入組氨酸標(biāo)簽和連接肽后的重組蛋白具體可為如下1)至4)中任一種蛋白1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
3)將1)限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且能與纖維蛋白特異結(jié)合的由1)衍生的蛋白質(zhì)；4)將2~)限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且能與纖維蛋白特異結(jié)合的由2)衍生的蛋白質(zhì)。上述將1)限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且能與纖維蛋白特異結(jié)合的由1)衍生的蛋白質(zhì)具體可為將組氨酸標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽前的多肽缺失且能與纖維蛋白特異結(jié)合的由1)衍生的蛋白質(zhì)，即氨基酸序列為自序列2的氨基末端第11-276位的蛋白質(zhì)。上述將2、限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且能與纖維蛋白特異結(jié)合的由幻衍生的蛋白質(zhì)具體可為將組氨酸標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽前的多肽缺失且能與纖維蛋白特異結(jié)合的由2)衍生的蛋白質(zhì)，即氨基酸序列為自序列4的氨基末端第11-278位的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2由276個(gè)氨基酸組成，自氨基末端第5_第10位為組氨酸標(biāo)簽，自氨基末端第22-第107位為Kringlel蛋白，自氨基末端第123-第276位為bFGF蛋白，自氨基末端第108-第122位為連接肽；序列表中序列4由278個(gè)氨基酸組成，自氨基末端第5-第10位為組氨酸標(biāo)簽，自氨基末端第22-第109位為Kringle4蛋白，自氨基末端第125-第278位為bFGF蛋白，自氨基末端第110-第IM位為連接肽。所述重組蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，所述重組蛋白的編碼基因具體可為①至④中任一所述的基因；①其核苷酸序列是序列表中序列1 ；②其核苷酸序列是序列表中序列3 ；③在嚴(yán)格條件下與①或②限定的DNA片段雜交且編碼能與纖維蛋白特異結(jié)合的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的DNA分子；④與①或②的基因具有90%以上的同源性，且編碼能與纖維蛋白特異結(jié)合的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的DNA分子。所述步驟④中的基因，與①或②的基因最好有95%以上的同源性。上述嚴(yán)格條件可為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。其中，序列表中序列1由擬8個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，自5'末端第14位-第30 位為編碼(His)6短肽的核苷酸序列，自5'末端第64位-第321位Kringlel結(jié)構(gòu)域，自 5'末端第367位-第擬8位為編碼堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的核苷酸序列，自5'末端第 322-第366位為連接序列；序列表中序列3由834個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，自5'末端第14 位-第30位為編碼(His)6短肽的核苷酸序列，自5'末端第64位-第327位Kringle4結(jié)構(gòu)域，自5'末端第373位-第834位堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的核苷酸序列，自5'末端第328-第372位為連接序列。含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述的重組蛋白可用來制備促進(jìn)血管新生藥物，如可將所述的重組蛋白與纖維蛋白支架結(jié)合形成復(fù)合物，將該復(fù)合物應(yīng)用到?jīng)]有天然血漿凝集物的病例中促進(jìn)血管新生。本發(fā)明所述的重組蛋白也可單獨(dú)應(yīng)用促進(jìn)血管新生。本發(fā)明把纖維蛋白作為能誘導(dǎo)組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)的因子的靶標(biāo)，纖維蛋白不僅在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和信號(hào)傳遞中起重要作用，同時(shí)也在某些疾病中特異表達(dá)。為使能誘導(dǎo)組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)的因子特異結(jié)合到纖維蛋白，本發(fā)明把它們與纖維蛋白結(jié)合區(qū)(Kringlel和 Kringle4結(jié)構(gòu)域)融合，得到的重組蛋白(KlbFGF和K4WG)能與纖維蛋白特異結(jié)合。與細(xì)胞基質(zhì)中的纖維蛋白特異結(jié)合的重組蛋白能更持久地停留在治療部位，并以持續(xù)釋放的方式起作用。這種方法避免了單獨(dú)使用能誘導(dǎo)組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)的因子的低靶標(biāo)特異性，以及多次-高劑量的給藥方式等缺點(diǎn)，從而顯著增強(qiáng)治療性血管化的效果。重組蛋白 KlbFGF和K4WG與外源的纖維蛋白結(jié)合后還適合于沒有天然纖維蛋白基質(zhì)的病例。外源的纖維蛋白也能特異結(jié)合KlbFGF和K4WG形成多功能的修復(fù)體系，一方面可以以定點(diǎn)、持續(xù)的方式提供再生信號(hào)分子，同時(shí)外源的支架材料也為細(xì)胞增殖和組織再生提供了三維空間。構(gòu)建的纖維蛋白/重組KlbFGF和K4WG在動(dòng)物模型中能顯著增強(qiáng)血管新生，促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織再生，并改善修復(fù)質(zhì)量。因此重組蛋白KlbFGF和K4WG結(jié)合相應(yīng)的細(xì)胞基質(zhì)有望改善多種缺血疾病的治療，如大面積潰瘍、肢體缺血和心肌缺血。本發(fā)明的與纖維蛋白特異結(jié)合的重組蛋白可以用于創(chuàng)傷修復(fù)和利用纖維蛋白作為支架的活性組織誘導(dǎo)再生；且為將來的治療性血管新生在臨床上的實(shí)踐提供了新的方法。


圖1為重組蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。(His)6是用于純化的親和標(biāo)簽；Kringle，代表Kl 和K4，是纖維蛋白結(jié)合區(qū)；bFGF是有絲分裂原和促血管發(fā)生效應(yīng)等的功能區(qū)圖2為重組蛋白表達(dá)、純化和鑒定A和C中，1 分子量標(biāo)記，2 天然bFGF總蛋白；3 天然WG培養(yǎng)液上清；4 天然 bre純化后的蛋白；5 =KlbFGF總蛋白；6 =KlbFGF培養(yǎng)液上清；7 =KlbFGF純化后的蛋白；8， 轉(zhuǎn)空白載體的對(duì)照。B和D中，1 分子量標(biāo)記，2 天然bFGF總蛋白；3 天然WG培養(yǎng)液上清；4 天然 bFG純化后的蛋白；5 :K4bFGF總蛋白；6 :K4bFGF培養(yǎng)液上清；7 :K4bFGF純化后的蛋白；8， 轉(zhuǎn)空白載體的對(duì)照。圖3為KlbFGF、K4bFGF和bFGF分別對(duì)人成纖維細(xì)胞的促增殖曲線圖4為ELISA方法測(cè)試KlbFGF、K4bFGF和bFGF與血漿凝集物和纖維蛋白的結(jié)合能力圖5為手術(shù)后第5天KlbFGF和K4bFG促進(jìn)皮下血管新生(A) PBS ； (B) bFGF ； (C) KlbFGF ； (D) K4bFGF。圖6為H&E染色法評(píng)價(jià)皮膚切口愈合速度和質(zhì)量圖7為重組蛋白結(jié)合纖維蛋白促進(jìn)血管新生
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、制備重組KlbFGF和K4bFGF蛋白DKringlel 禾口 Kringle4 的獲得通過引物Kl-I、Kl-2、Kl-3、K1—4和K1—5的互補(bǔ)序列互補(bǔ)結(jié)合擴(kuò)增Kringlel片段。引物的加入順序?yàn)榈谝淮螖U(kuò)增使用Kl-1、K1-2，第二次使用Kl-3、K1-4，第三次 使用 Kl-l、Kl-5。引物1(1-1、1(1-2、1(1-3、1(1-4和1(1-5的序列如下Kl-I 5'-AGA GGG ACG ATG TCC AM ACA AAA AAT GGC ATC ACC TGT CAA AAATGG AGT TCC ACT TCT CCC CAC AGA CCT AGA TTC TCA CCT-3'；Kl-2 5'-CCT GCG GAT CGT TGT CTG GAT TCC TGC AGT AGT TCT CCT CCA GTCCCT CTG AGG GGT GTG TAG CAG GTG AGA ATC TAG GTC TGT-3'；Kl-3 :5，-TAT CTC TCA GAG TGC AAG ACT GGG AAT GGA AAG AAC TAC AGAGGGACG ATG TCC AAA AC-3'Kl-4 5' -CAT ATC TCT TTT CTG GAT CAG TAG TAT AGC ACC AGG GCC CCT GCG GAT CGT TGT CTG GA-3'；Kl-5 5' -TTC CTC TTC ACA CTC AAG AAT GTC GCA GTA GTC ATA TCT CTT TTC TGG ATC A-3，。通過引物K4-1、K4-2、K4_3、K4_4和K4_5的互補(bǔ)序列互補(bǔ)結(jié)合擴(kuò)增Kringle4片 段。引物的加入順序?yàn)榈谝淮螖U(kuò)增使用K4-1、K4-2，第二次使用K4_3、K4_4，第三次 使用 K4-l、K4-5。引物 K4-1、K4-2、K4-3、K4-4 和 K4-5 的序列如下K4-1 5' -GGC ACA TCC TCC ACC ACC ACC ACA GGA AAG AAG TGT CAG TCT TGG TCA TCT ATG ACA CCA CAC CGG CAC CAG AAG ACC CCA GAA-3'；K4-2 :5’ -AGG GGC CTT TAT CGG CAT CTG GAT TCC TGC AGT AGT TCA TTG TCA GGC CAG CAT TTG GGT AGT TTT CTG GGG TCT TCT GGT GCC-3'；K4-3 5' -GTC CAG GAC TGC TAC CAT GGT GAT GGA CAG AGC TAC CGA GGC ACA TCC TCC ACC ACC AC-3'；K4-4 :5’ -AGT ACT CCC ACC TGA CGC TGG GGT CTG TGG TAA AAC ACC AGG GGC CTT TAT CGG CAT CT-3'；K4-5 :5’ -AAC ACT CGC TTC TGT TCC TGA GCA TTT TTT CAG GTT GCA GTA CTC CCA CCT GAC GCT G_3，。回收并純化260bp左右的Kringlel和Kringle4的DNA片段。2)構(gòu)建 pET28a_6HiS-KlbFGF 和 pET28a_6His_K4bFGF 表達(dá)載體用NdeI和KpnI分別雙酶切Kringlel和Kringle4片段，回收純化后，分別插入 到pET28a-(His)6-bFGF表達(dá)載體(Novagen)的NdeI和KpnI酶切位點(diǎn)，獲得重組表達(dá)載體 pET28a-6Hi s-KlbFGF 和 pET28a_6Hi s_K4bFGF。用NdeI 和 KpnI 分別雙酶切 pET28a_6His_KlbFGF 和 pEI^8a-6His_K4bFGF， 獲得6His-KlbFGF和6His-K4bFGF片段，回收后分別連入pMD18_T載體中，獲得 pMD18-T-6His-KlbFGF和pMD18_T-6His_K4bFGF載體，分別進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明 BHis-KlbFGF的DNA片段具有序列表中序列1所示的核苷酸序列，由828個(gè)脫氧核糖核苷 酸組成，自5'末端第14位-第30位為編碼(His)6短肽的核苷酸序列，自5'末端第64位-第321位Kringle 1結(jié)構(gòu)域，自5'末端第367位-第擬8位為編碼堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的核苷酸序列，自5'末端第322-第366位為連接序列。序列表中序列1自5'末端第1-8 位為編碼序列，編碼序列表中序列2所示的蛋白。序列表中序列2由276個(gè)氨基酸組成，自氨基末端第5-第10位為組氨酸標(biāo)簽，自氨基末端第22-第107位為Kringlel 蛋白，自氨基末端第123-第276位為bFGF蛋白，自氨基末端第108-第122位為連接肽。按照上述方法將6His-K4bFGF的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，His_K4bFGF 的DNA片段具有序列表中序列3所示的核苷酸序列，由834個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，自5' 末端第14位-第30位為編碼(His)6短肽的核苷酸序列，自5'末端第64位-第327位 Kringle4結(jié)構(gòu)域，自5'末端第373位-第834位堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的核苷酸序列， 自5'末端第328-第372位為連接序列。序列表中序列3自5'末端第1_834位為編碼序列，編碼序列表中序列4所示的蛋白。序列表中序列4由278個(gè)氨基酸組成，自氨基末端第5-第10位為組氨酸標(biāo)簽，自氨基末端第22-第109位為Kringle4蛋白，自氨基末端第 125-第278位為bFGF蛋白，自氨基末端第110-第IM位為連接肽。將重組表達(dá)載體pET28a-6His-KlbFGF和pET28a-6His-K4bFGF分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21 (D3)中，得到重組菌 BL21 (D3)-KlbFGF 和 BL21 (D3)_K4bFGF。3)表達(dá)純化重組蛋白KlbFGF和K4bFGF重組菌BL21 (D3) -KlbFGF 和 BL21 (D3) _K4bFGF 分別接種于 IOml 新鮮的 LB 培養(yǎng)基，在37°C，200rpm培養(yǎng)12小時(shí)左右，然后按2% (體積百分比)的比例將培養(yǎng)的重組菌 BL21 (D3)-KlbFGF 和 BL21 (D3)_K4bFGF 分別接種到 150ml 新鮮 LB 培養(yǎng)基，在 37°C， 200rpm培養(yǎng)3小時(shí)左右，當(dāng)OD600達(dá)到0. 6-0. 8，加入誘導(dǎo)物IPTG(IPTG終濃度ImM)誘導(dǎo)。 8000g離心IOmin收集沉淀。用15mlPBS (含0. 5M NaCl)溶解上述收集的沉淀，超聲破碎， 13000g離心30分鐘，分離上清，0. 45um濾膜過濾上清；用瓊脂糖-Ni2+柱(購(gòu)買于Amersham Biosciences公司)純化。然后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot，檢測(cè)蛋白純度。Western blot 使用 anti-his (Sigma)抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，圖2A為KlbFGF的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，圖2C為KlbFGF的 Western blot檢測(cè)結(jié)果，表明重組蛋白KlbFGF在大腸桿菌中表達(dá)，并經(jīng)分離和純化獲得重組蛋白 KlbFGF ；圖 2B 為 K4bFGF 的 SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果，圖 2D 為 K4bFGF 的 Western blot 檢測(cè)結(jié)果，表明重組蛋白K4bFGF在大腸桿菌中表達(dá)，并經(jīng)分離和純化獲得重組蛋白K4bFGF。實(shí)施例2、體外驗(yàn)證KlbFGF和K4bFGF的生物學(xué)活性1)重組蛋白有絲分裂原活性鑒定用人成纖維細(xì)胞測(cè)試重組蛋白KlbTOF和K4bFGF的有絲分裂原活性。人成纖維細(xì)胞按3000個(gè)/孔接種到48孔板，用含有10% (體積比)胎牛血清 (FBS) U% (質(zhì)量比)谷氨酰氨、(質(zhì)量比)非必需氨基酸、100U青霉素/ml和IOOyg鏈霉素/ml高糖DMEM培養(yǎng)基(H-DMEM)，在37°C，5% (X)2及飽和濕度下培養(yǎng)M小時(shí)。M小時(shí)后將培養(yǎng)基的FBS濃度更換成2% (體積比)，其它條件不變。然后向每個(gè)培養(yǎng)孔中依次加入終濃度為0、30、120、600、1500和3000pmol/L的KlbFGF或K4bFGF，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行樣，繼續(xù)培養(yǎng)3天，向各培養(yǎng)孔中加入終濃度為lmg/ml MTT(methylthiazoletetrazolium, Sigma公司)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)，4小時(shí)后棄掉上清，向其中加入400μ 1 二甲亞楓(dimethl sulfoxid)，待充分溶解后，在492nm酶標(biāo)儀下讀取OD值。圖3中，縱坐標(biāo)為OD值的絕對(duì)增加值，代表細(xì)胞密度的增加量；橫坐標(biāo)為培養(yǎng)基中添加的重組蛋白KlbFGF或K4bFGF的終濃度(μ M)，數(shù)值以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組蛋白KlbFGF和K4bFGF的活性和天然形式的bFGF沒有顯著差別。2)重組蛋白的結(jié)合能力的測(cè)試用ELISA方法檢測(cè)重組蛋白與純化的人纖維蛋白和兔血漿的結(jié)合能力。a)生長(zhǎng)因子與血漿凝集物(plasma clot)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)(1)分離兔血漿從健康兔耳中央動(dòng)脈采血20ml，預(yù)先在注射器吸入1/10體積的 3.8% (質(zhì)量百分含量)檸檬酸鈉作為抗凝劑。取IOml抗凝兔血IOOg離心15min，收集上層渾濁液作為富含血小板血漿(PRP)；另取IOml抗凝兔血1500g離心15min，收集上清液作為不含血小板血漿(PPP)，_80°C凍存；(2)制備血漿凝集物4°C解凍PPP和PRP ；先向96孔板(NUNC公司)每孔加3 μ 1 濃縮CaCl2和thrombin (凝血酶，Roche公司)混合物(CaCl2終濃度為30mM，thrombin終濃度為1. ONIH unit/ml)，每孔加入50 μ 1 PPP或PRP，室溫凝固2-3小時(shí)，用前PBS洗2次;(3)向上述制備的血漿凝集物加入不同梯度的KlbFGF、bFGF(0,0. 1、1、2、3、4和 5uM) 100 μ 1/ 每孔，37°C，60rpm 離心 2hr ；(4)用PBS洗(3)中的沉淀4次，加封閉液(含有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2. 5% BSA+體積百分?jǐn)?shù)為 0. 1 % Tween20 的 PBS 溶液)，100 μ 1/ 每孔，37°C，60rpm 離心 1. 5hr ；(5)用PBS洗(4)中的沉淀4次，加一抗(anti-hi s，用PBS按體積比為1 2000 稀釋，Sigma公司),100 μ 1/每孔，37 V，60rpm離心100分鐘；(6)用PBS洗(5)中的沉淀4次，加二抗(anti-mouse IgG,用PBS按體積比為 1 10000 稀釋，Sigma 公司)，100μ 1/每孔，37°C，60rpm 離心 Ihr ；(7)用PBS洗(6)中沉淀4次，加AP顯色底物溶液對(duì)-硝基苯磷酸(P-NPP， Amersham) (2mg/ml)，80 μ 1/每孔，避光反應(yīng)8. 5分鐘，加等體積0. 2Μ NaOH終止反應(yīng)。8)取100 μ 1 (7)中終止反應(yīng)后的溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm下的OD值。b)生長(zhǎng)因子與纖維蛋白(fibrin)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)1)實(shí)驗(yàn)所用干粉人纖維蛋白原從華蘭生物工程股份有限公司購(gòu)買(商品名康普欣)，每毫克該樣品含0. 125IU凝血因子XIII。用PBS配成100 μ g/ml的溶液，按100 μ 1/ 每孔加入96孔酶標(biāo)板，4°C過夜吸附；2)次日將過夜包被的酶標(biāo)板中未吸附的蛋白溶液倒掉，以PBS洗3次。加入3% (質(zhì)量百分比)BSA (用PBS配制不含Tween20,)封閉，100 μ 1/每孔，37°C，60rpm離心1. 5 小時(shí)；3)用PBS徹底洗2、中的沉淀4次后加入凝血酶溶液INIH unit/ml (無(wú)菌雙蒸水配制，含 30mM CaCl2)，100 μ 1/ 每孔，37°C，60rpm 離心 2 小時(shí);4)用PBS徹底洗3)中的沉淀4次后加入不同濃度的bFGF、KlbFGF或K4bFGF(0、 0. 2、0. 5、1、2、3、4、5μΜ)，100μ 1/每孔，37°C，60rpm 離心 2. 5 小時(shí)；5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加一抗(anti-hi s，用PBS按體積比為1 2000 稀釋)。100 μ 1/每孔，370C，60rpm離心1. 5小時(shí);6)用PBS洗5)中的沉淀4次，加二抗(anti-mouse IgG,用PBS按體積比為1 10000 稀釋)，100μ 1/每孔，37°C，60rpm 離心 Ihr ；7)用PBS洗6)中的沉淀4次，加AP顯色液P-NPP (2mg/ml)，80 μ 1/每孔，避光反應(yīng)8. 5分鐘，加等體積0. 2Μ NaOH終止反應(yīng)。8)取100 μ 1 (7)中終止反應(yīng)后的溶液100 μ 1，用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm下的OD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，表明KlbFGF和K4bFGF的纖維蛋白結(jié)合能力要顯著高于天然形式的 bFGF(Sigma，106096-93-9)。圖4中，A為KlbFGF、K4bFGF和bFGF分別與纖維蛋白的結(jié)合曲線，B為KlbFGF、 K4bFGF和bFGF分別與血漿凝集物的結(jié)合曲線。橫坐標(biāo)代表重組蛋白的濃度，縱坐標(biāo)表示結(jié)合在纖維蛋白或血漿凝集物上的重組蛋白的相對(duì)量；“**”代表P < 0. 005 ；“***”，ρ < 0.001 ；數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)施例3、重組蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的功能評(píng)價(jià)DKlbFGF和K4WG在大鼠皮膚隨機(jī)缺血模型中的效應(yīng)評(píng)價(jià)大鼠皮膚隨機(jī)缺血模型(the model of random skin flap)可用來檢測(cè)血管的新生。由于該模型中有血漿凝集物(Plasma clot)形成，可把重組蛋白直接應(yīng)用到該模型中然后觀察血管新生的狀況。重組蛋白應(yīng)用到大鼠皮膚隨機(jī)缺血模型的方法如下1)動(dòng)物模型大鼠“隨機(jī)皮膚蓋”(random pattern skin flap)，雄性Wistar大鼠，180g左右，按40mg/kg體重的劑量從腹腔注射(i. p.)戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉；去除背毛， 酒精消毒；在背部剪4個(gè)15*15mm2的以兩側(cè)為基礎(chǔ)的皮膚蓋；2)分別將580pmol (約相當(dāng)于10 μ g天然bFGF)量的KlbFGF和bFGF涂布到創(chuàng)面。 每個(gè)樣品的位置在不同大鼠中不同，以消除位置的影響；3)縫合傷口，每個(gè)開口側(cè)面縫一針；4)術(shù)后大鼠在清潔級(jí)動(dòng)物房喂養(yǎng)；5)術(shù)后5天，給大鼠注射過量麻醉劑處死，將整個(gè)皮膚背部皮膚從背脊線向兩邊解剖開，觀察記錄血管新生的表觀狀況。實(shí)驗(yàn)分四組對(duì)照組、KlbFGF組、K4bFG組和bFGF組。對(duì)照組用PBS處理大鼠5天；KlbFGF組用KlbFGF處理大鼠5天；K4bFGF組用 K4bFGF處理大鼠5天；bFGF組用bFGF處理大鼠5天。每組5處理5只大鼠，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，表明手術(shù)后第5天，重組蛋白KlbFGF和K4bTO能顯著增強(qiáng)血管的新生，說明重組蛋白能特異結(jié)合在創(chuàng)傷位點(diǎn)的血漿凝集物上，增加了局部因子的濃度， 從而促進(jìn)血管的新生。2) KlbFGF和K4bFGF在大鼠全皮膚切口模型中的效應(yīng)評(píng)價(jià)全皮膚切口模型(full-skin incision model)是用來評(píng)價(jià)損傷愈合的經(jīng)典模型， 把重組蛋白KlbFGF和K4bFGF直接應(yīng)用到該模型中，可評(píng)價(jià)重組蛋白KlbFGF和K4bFGF對(duì)損傷愈合的影響。重組蛋白應(yīng)用到全皮膚切口模型中的方法如下1)動(dòng)物模型全皮膚切口(full skin incision)，雄性Wistar大鼠，200g左右，按 40mg/kg體重的劑量從腹腔注射(i. p.)戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉；去除背毛，酒精消毒；在裸露區(qū)用手術(shù)剪剪開4個(gè)2cm長(zhǎng)的全皮膚切口 ；
2)分別用300pmol (約相當(dāng)5 μ g天然形式bFGF)的KlbFGF、K4bFGF和bFGF以及 PBS處理切口，不縫合；3)術(shù)后大鼠在清潔級(jí)動(dòng)物房喂養(yǎng)；4)在手術(shù)后1、3、6周，給動(dòng)物注射過量麻醉劑處死，以切口為中線將兩側(cè)1. 5cm以內(nèi)的全皮膚剪下，再?gòu)呐c切口垂直的方向?qū)悠芬环譃槎?。其中一份?%甲醛固定用于組織學(xué)分析，另一份用預(yù)冷的PBS保存并及時(shí)進(jìn)行撕裂強(qiáng)度測(cè)試。撕裂強(qiáng)度測(cè)試方法如下1)儀器數(shù)字力學(xué)測(cè)量?jī)x(Instron 5848microtester, Japan)，測(cè)量范圍和精度為 1000士0. OlN ；2)將樣品兩端分別用測(cè)量?jī)x的移動(dòng)臂和固定臂上的夾具固定，移動(dòng)臂以lOmm/s 的恒定速度牽拉皮膚樣品。樣品從切口中線拉斷所需最大力由電腦記錄；3)每組有5個(gè)樣本，每個(gè)樣本的最大力即代表撕裂強(qiáng)度，用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)分四組對(duì)照組、KlbFGF組、K4bFGF組和bFGF組。對(duì)照組用PBS處理大鼠一周；KlbFGF組用KlbFGF處理大鼠一周；K4bFGF組用 K4bFGF處理大鼠一周；bFGF組用bFGF處理大鼠一周。每組5處理5只大鼠，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，處理1周后使用重組蛋白KlbFGF或K4bFGF的切口，其表皮再生和肉芽組織形成的速度要高于對(duì)照組和使用bFGF組，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示有顯著差異。處理 6周后，重組蛋白KlbFGF或K4bFGF處理組的皮膚撕裂強(qiáng)度要顯著高于對(duì)照組和bFGF處理組，表明重組蛋白KlbFGF或K4bFGF處理組修復(fù)質(zhì)量要高于對(duì)照組和bFGF處理組。圖6中，A-D為組織學(xué)方法評(píng)價(jià)表皮新生(箭頭)和肉芽(GT)形成，A =PBS處理1 周表皮新生(箭頭)和肉芽(GT)形成；B :bFGF處理1周表皮新生(箭頭)和肉芽(GT)形成；C =KlbFGF處理1周表皮新生(箭頭)和肉芽(GT)形成；D :K4bFGF處理1周表皮新生 (箭頭)和肉芽(GT)形成。虛線表示切口原始邊界，標(biāo)尺，ΙΟΟμπι。E-H為Η&Ε染色分析膠原沉積和瘢痕形成，E =PBS處理6周；F :bFGF處理6周；G =KlbFGF處理6周；H :K4bFGF處理6周。虛線表示瘢痕邊線，標(biāo)尺，ΙΟΟμπι。I 量化分析1周肉芽組織形成。J:量化分析6 周瘢痕面積，數(shù)值以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n = 5)。K 撕裂強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，數(shù)值以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n = 5)，“*”代表ρ < 0. 05。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組蛋白KlbFGF和K4bFGF能顯著加速損傷愈合，改善修復(fù)質(zhì)量。說明重組KlbFGF和K4bFGF能與創(chuàng)傷處的天然纖維蛋白特異結(jié)合達(dá)到促進(jìn)血管新生的目的。3) KlbFGF和K4bFGF與纖維蛋白支架結(jié)合對(duì)血管再生的效應(yīng)纖維蛋白是一種優(yōu)良和成熟的生物材料，將重組蛋白和生物材料結(jié)合再移植到大鼠皮下來評(píng)價(jià)對(duì)血管再生的影響。重組蛋白與纖維蛋白支架結(jié)合對(duì)血管再生影響的測(cè)試方法如下人纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)N)從華蘭生物公司(河南，新鄉(xiāng))購(gòu)買，其中含有凝血因子XIII，0. 125U/mg人纖維蛋白原；2)用PBS溶解人纖維蛋白原(溶解前先將PBS和FN在水浴鍋中預(yù)熱到37°C再將二者混合)。纖維蛋白凝膠有FN溶液、凝血酶和CaCl2混合凝聚而成，三者的終濃度依次為50mg/ml、20IU/ml、40mM。操作時(shí)先將濃縮的凝血酶和CaCl2溶液按比例加入48孔板的孔中，然后取200 μ 1 FN溶液(含870pmol生長(zhǎng)因子，約15yg天然形式的bFGF)加入孔中并迅速混勻，37°C恒溫箱中放置1小時(shí)。實(shí)驗(yàn)分四組對(duì)照組、纖維蛋白支架/KlbFGF組、纖維蛋白支架/K4bFGF組和纖維蛋白支架/bFGF組。對(duì)照組將纖維蛋白支架/PBS移植大鼠皮下5天；纖維蛋白支架/KlbFGF組將纖維蛋白支架/KlbFGF移植大鼠皮下5天；纖維蛋白支架/K4bFGF組將纖維蛋白支架/ K4bFGF移植大鼠皮下5天；纖維蛋白支架/bFGF組將纖維蛋白支架/bFGF移植大鼠皮下 5天。每組5處理5只大鼠，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，表明重組蛋白KlbFGF和K4bFGF處理組中能觀察到大量新形成的血管，而對(duì)照組中則極少，bFGF處理組中也有新形成的血管，但比重組蛋白KlbFGF 和K4bFGF處理組少，統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著差異。圖7中，A 纖維蛋白支架/PBS ；B 纖維蛋白支架/bFGF ;C 纖維蛋白支架/ KlbFGF ；D 纖維蛋白支架/K4bFGF ；標(biāo)尺3mm。上述結(jié)果說明重組蛋白能特異結(jié)合纖維蛋白支架從而有效改善血管的再生。
權(quán)利要求
1.一種重組蛋白，是將如下b)或d)的多肽作為融合伙伴融合到目的蛋白的氨基末端得到的融合蛋白b)由序列表中序列4自氨基末端第22位-第109位所示的氨基酸序列組成的多肽；d)將b)限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且能與纖維蛋白特異結(jié)合的由b)衍生的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛋白，其特征在于所述目的蛋白為能誘導(dǎo)組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)的因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組蛋白，其特征在于所述目的蛋白為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、骨形成蛋白3、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3/4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白，其特征在于所述目的蛋白為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組蛋白，其特征在于所述重組蛋白為如下2)或4)中任一種蛋白2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；4)將2~)限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且能與纖維蛋白特異結(jié)合的由2)衍生的蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求1至5中任一所述重組蛋白的編碼基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因，其特征在于所述重組蛋白的編碼基因?yàn)棰谥立苤腥我凰龅幕?；②其核苷酸序列是序列表中序?；③在嚴(yán)格條件下與②限定的DNA片段雜交且編碼能與纖維蛋白特異結(jié)合的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的DNA分子；④與②的基因具有90%以上的同源性，且編碼能與纖維蛋白特異結(jié)合的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的DNA分子。
8.含有權(quán)利要求6或7所述編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
9.權(quán)利要求1至5中任一所述的重組蛋白在制備促進(jìn)血管新生藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1至5中任一所述的重組蛋白與纖維蛋白支架結(jié)合形成的復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與纖維蛋白特異結(jié)合的重組蛋白及其應(yīng)用。該蛋白是將如下a)或b)或c)或d)的多肽作為融合伙伴融合到目的蛋白的氨基末端得到的融合蛋白a)由序列表中序列2自氨基末端第22-107位所示的氨基酸序列組成的多肽；b)由序列表中序列4自氨基末端第22-109位所示的氨基酸序列組成的多肽；c)將a)限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且能與纖維蛋白特異結(jié)合的由a)衍生的多肽；d)將b)限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且能與纖維蛋白特異結(jié)合的由b)衍生的多肽。本發(fā)明的與纖維蛋白特異結(jié)合的重組蛋白可用于創(chuàng)傷修復(fù)和活性組織誘導(dǎo)再生。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102399293SQ20111032265
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2008年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月3日
發(fā)明者戴建武, 趙文學(xué) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所