一種從Cohn組分I沉淀分離纖維蛋白原的方法
【專利摘要】一種從Cohn組分Ⅰ沉淀分離纖維蛋白原的方法。使用4:3-1:1的檸檬酸三鈉-氯化鈉溶液作為纖維蛋白原分離的緩沖液，蛋白質(zhì)分離過程中的溫度不高于0℃,使用不低于5%的蔗糖作為凍干保護(hù)劑。
【專利說明】一種從Cohn組分I沉淀分離纖維蛋白原的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明專利涉及人纖維蛋白原的分離方法，屬于血液制品領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]1、纖維蛋白原
人纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)即凝血因子I，是血漿中含量最高的凝血因子，也是凝血系統(tǒng)中的一個"中心"蛋白質(zhì)；凝血的最后階段是凝血酶形成，使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白；纖維蛋白原除直接參與凝血過程外，還可介導(dǎo)血小板聚集，影響血液粘度，是心、腦血管病發(fā)病的重要危險因素。
[0003]纖維蛋白原是一種含2964個氨基酸的大分子糖蛋白，相對分子質(zhì)量為340 X 103，首先在肝細(xì)胞中合成，由兩個相同的組分(Αα，Ββ，Υ)2組成六聚體，鏈間以二硫鍵相連。Αα,Ββ，Y三條多肽鏈借助AaCys28、Y Cys8和Cys9構(gòu)成對稱性二聚體。單體中Aa Cys36與另一單體Ββ Cys65組成的二硫鍵對形成二聚體分子也起到關(guān)鍵作用。Aa,Ββ, Y三條多肽鏈相對分子質(zhì)量分別為66Χ103、52Χ103和46Χ103，并分別由610個、461個和411個氨基酸殘基組成。
[0004]人纖維蛋白原主要由肝臟實質(zhì)細(xì)胞合成，大部分在血漿中，約15%在血管外，正常人血漿含量為2.4-4.0g/L。平均半壽期為96-144小時。貯存穩(wěn)定性好，熱穩(wěn)定差，在56°C可形成不可逆沉淀，生理止血需要量為正常水平的25%-50%。
[0005]在凝血共同途徑中，凝血酶先裂解纖維蛋白原兩條A a鏈氨基端Argl6.Glyl7釋放出一對纖維蛋白肽A，形成纖維蛋白單體I ;再裂解纖維蛋白原兩條Ββ鏈氨基端Argl4*Glyl5釋放出一對纖維蛋白肽B，形成纖維蛋白單體II，暴露纖維蛋白單體的聚合部位，通過非共價結(jié)合，形成了不穩(wěn)定的可溶性纖維蛋白單體。在活化的凝血因子XIII及Ca2+的作用下，纖維蛋白單體互相交聯(lián)，生成穩(wěn)定的可溶性纖維蛋白，并將血液的有形成分包繞其中，形成牢固的血栓。
[0006]2、纖維蛋白原制備技術(shù)概述
在血漿的采集、貯運和生產(chǎn)過程中，均可能產(chǎn)生凝血因子的激活，不利于獲得穩(wěn)定的人纖維蛋白原制品。通常，在關(guān)鍵的生產(chǎn)環(huán)節(jié)、半成品和成品中均要有針對性的檢測這類反應(yīng)。檢出激活的方法包括有檢驗蛋白酶等。
[0007]目前成熟的人纖維蛋白原的分離原料包括有:新鮮冷凍血漿、冷沉淀、人凝血因子珊生產(chǎn)廢棄液。常用的人纖維蛋白原的分離方法包括有硫酸鋇沉淀法、乙醇沉淀法、離子交換層析法。由于與纖溶酶原(Plasminogen, PLG)有高度親和性，故常用的分離方法難以獲得高純度的纖維蛋白原。
[0008]如下是幾個具有代表性的乙醇沉淀法的技術(shù)要領(lǐng)。
[0009]大田華燦生物科技有限公司的發(fā)明《專利纖維蛋白原的制備方法》(ZL201110188019.X)以血漿為原料，使用助劑后S/D病毒滅活，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。分離過程的溫度控制較高，達(dá)到了 36?38°C。該發(fā)明所采用的助劑，能提高纖維蛋白原制品的質(zhì)量，在病毒滅活和冷乙醇沉降過程中起到保護(hù)纖維蛋白原以及凝血因子XIII的生物學(xué)活性的作用。
[0010]綠十字(中國)生物制品有限公司的發(fā)明專利《人纖維蛋白原的生產(chǎn)方法》(ZL200910237204.6)提供了一種從冷沉淀中提取人纖維蛋白原的方法，生產(chǎn)中采用的S/D法和水浴熱處理法雙重病毒滅活。生產(chǎn)過程中使用甘氨酸作為穩(wěn)定劑，通過延長凍干時間約需6-8天，使得產(chǎn)品在凍干過程中溫度變化穩(wěn)定，凍干后產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)均一，這時再對制品進(jìn)行水浴熱處理，可以在最短的時間內(nèi)受熱均勻，在達(dá)到有效的滅活DNA和RNA非脂包膜病毒的同時保證了人纖維蛋白原的穩(wěn)定性。該方法的操作溫度為20?40°C。通過延長凍干時間來換取了產(chǎn)品的穩(wěn)定性。
[0011]江西博雅生物制藥股份有限公司的發(fā)明專利《人纖維蛋白原制劑的制備方法》(ZL200810046747.5)提供了一種從組分沉淀I制作纖維蛋白原的方法。該制備工藝中，使用了低濃度的蔗糖-檸檬酸三鈉-氯化鈉溶液，最后使用了精氨酸鹽酸-檸檬酸三鈉-氯化鈉作為產(chǎn)品配制過程的保護(hù)劑。
[0012]哈爾濱世亨生物工程藥業(yè)股份有限公司的發(fā)明《耐熱人纖維蛋白原的生產(chǎn)方法》(CN 200710144516.3)提出了使用4% _6%蔗糖做穩(wěn)定劑，蛋白質(zhì)分離過程中的緩沖液一律使用醋酸緩沖液。
[0013]3、現(xiàn)有技術(shù)的主要問題
人纖維蛋白原產(chǎn)品的熱穩(wěn)定差，在56°C可形成不可逆沉淀。同時由于生產(chǎn)工藝需要兩步法病毒滅活，而產(chǎn)品成型之后的干熱病毒滅活是必要的工藝步驟。溫度高達(dá)100°C，時間也長，為30分鐘。為此，選擇合適的保護(hù)劑品種和使用適當(dāng)量的保護(hù)劑濃度，對于人纖維蛋白原產(chǎn)品的生產(chǎn)來說，是一個關(guān)鍵的因素。
[0014]本發(fā)明綜合上述的技術(shù)優(yōu)勢，研究一種操作簡單、管理方便的纖維蛋白原生產(chǎn)工藝。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的人纖維蛋白原的生產(chǎn)工藝在生產(chǎn)過程中特別注意了保護(hù)劑的使用，經(jīng)過篩選，選用了不低于5%的蔗糖作為保護(hù)劑。在常規(guī)的產(chǎn)品凍干工藝中，保護(hù)劑的用量為1%-3%。
[0016]生產(chǎn)過程中的乙醇使用:為了減少反應(yīng)液的體積，組分沉淀的制作使用高濃度(92%-95%)的乙醇，分離纖維蛋白原后的生產(chǎn)中使用低濃度(50%)的乙醇。
[0017]用于纖維蛋白原溶解的緩沖液為一種，不使用醋酸緩沖液,而是使用4:3-1:1的檸檬酸三鈉-氯化鈉溶液。
[0018]在纖維蛋白原生產(chǎn)的粗分離階段，使用同一分離方法重復(fù)2次。在纖維蛋白原分離過程中，采取0°C以下的工藝溫度。不像現(xiàn)有的技術(shù)那樣，采用20°C以上的工藝溫度，雖然不明顯的引起蛋白質(zhì)的變化，但是較高的溫度畢竟為蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性帶來了潛在的影響。
[0019]嚴(yán)格控制工藝溫度的變化范圍，在生產(chǎn)的一般工藝中的溫度波動范圍控制為±l°c，而病毒滅活的關(guān)鍵工藝的溫度波動范圍均為±0.5°C，既保證了產(chǎn)品的工藝要求，又最大限度的保證了產(chǎn)品質(zhì)量。
[0020]根據(jù)上述工藝開發(fā)思路，本發(fā)明的人纖維蛋白原的制備方法為:
I)原料血漿融化合并，加入乙醇使反應(yīng)液乙醇濃度為8%，溫度控制在-3.5?-2.5°C,蛋白含量控制在40?60g/L，pH 7.0?8.0，后離心分離組分I沉淀。
[0021 ] 2 )組分I沉淀稱重后，溶解于10倍?50倍體積的緩沖液I中，按照5g/L的比例加入預(yù)處理的硅藻土深濾。(緩沖液I為4:3-1:1的檸檬酸三鈉-氯化鈉溶液)。
[0022]3)調(diào)整澄清液的pH為6.5?7.5，蛋白含量為10?20g/L，計算體積，加入3.3%的TNBP和11%的Tween-80,使其終含量為0.3%和1%，23.5?24.5°C保溫6小時。
[0023]4)調(diào)整溶液的pH為6.5?7.5，降溫，加50%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為8%，溫度控制在-3?-1°C，離心分離沉淀物，得粗制纖維蛋白原沉淀。
[0024]5)粗制纖維蛋白原沉淀稱重后，按沉淀重量加10倍體積的緩沖液I溶解沉淀，力口硅藻土 (按5g/L的比例)澄清過濾。
[0025]6)調(diào)整濾液的pH為6.5?7.5，蛋白含量為10?20g/L，降溫，加50%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為8%，溫度控制在-3?-1 °C，離心分離沉淀物，得精制纖維蛋白原沉淀。
[0026]7)精制纖維蛋白原沉淀稱重后，按沉淀重量加5倍體積的緩沖液II溶解，澄清過濾，取樣進(jìn)行原液檢定。(緩沖液II為8:13:51-9:14:50的氯化鈉-檸檬酸三鈉-蔗糖溶液)。
[0027]8)配制、除菌過濾、灌裝、凍干。
[0028]9)凍干后制品100°C ±0.5°C干熱滅活處理30分鐘；成品檢驗合格后包裝。
[0029]本發(fā)明的纖維蛋白原的制備方法，其原料可以是原料血漿、Cohn組分沉淀及其他含有纖維蛋白原的廢棄沉淀。

【具體實施方式】
[0030]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0031 ] 實施例1:以原料血漿分離纖維蛋白原
I)原料血漿融化合并，加入乙醇使反應(yīng)液乙醇濃度為8%，溫度控制在-3.5?-2.5°C,蛋白含量控制在40?60g/L，pH 7.0?8.0，后離心分離組分I沉淀。
[0032]2)組分I沉淀稱重后，溶解于30倍體積的緩沖液I中，按照5g/L的比例加入預(yù)處理的硅藻土過濾。(緩沖液I為4:3-1:1的檸檬酸三鈉-氯化鈉溶液)。
[0033]3)調(diào)整澄清液的pH為6.5?7.5，蛋白含量為10?20g/L，計算體積，加入3.3%的TNBP和11%的Tween-80,使其終含量為0.3%和1%，23.5?24.5°C保溫6小時。
[0034]4)調(diào)整溶液的pH為6.5?7.5，降溫，加50%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為8%，溫度控制在-3?-1°C，離心分離沉淀物，得粗制纖維蛋白原沉淀。
[0035]5)粗制纖維蛋白原沉淀稱重后，按沉淀重量加15倍體積的緩沖液I溶解沉淀，力口硅藻土 (按5g/L的比例)澄清過濾。
[0036]6)調(diào)整濾液的pH為6.5?7.5，蛋白含量為10?20g/L，降溫，加50%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為8%，溫度控制在-3?-1 °C，離心分離沉淀物，得精制纖維蛋白原沉淀。
[0037]7)精制纖維蛋白原沉淀稱重后，按沉淀重量加5倍體積的緩沖液II溶解，澄清過濾，取樣進(jìn)行原液檢定。(緩沖液II為8:13:51-9:14:50的氯化鈉-檸檬酸三鈉-蔗糖溶液)。
[0038]8)配制、除菌過濾、灌裝、凍干。
[0039]9)凍干后制品100°C ±0.5°C干熱滅活處理30分鐘；成品檢驗合格后包裝。
[0040]實施例2:以Cohn組分沉淀或廢棄沉淀為原料分離纖維蛋白原
DCohn組分沉淀或廢棄沉淀稱重后，溶解于40倍體積的緩沖液I中，按照5g/L的比例加入預(yù)處理的硅藻土過濾。(緩沖液I為4:3-1:1的檸檬酸三鈉-氯化鈉溶液)。
[0041]2)調(diào)整澄清液的pH為6.5?7.5，蛋白含量為10?20g/L，計算體積，加入3.3%的TNBP和11%的Tween-80,使其終含量為0.3%和1%，23.5?24.5°C保溫6小時。
[0042]3)調(diào)整溶液的pH為6.5?7.5，降溫，加50%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為8%，溫度控制在-3?-1°C，離心分離沉淀物，得粗制纖維蛋白原沉淀。
[0043]4)粗制纖維蛋白原沉淀稱重后，按沉淀重量加30倍體積的緩沖液I溶解沉淀，加硅藻土 (按5g/L的比例)澄清過濾。
[0044]5)調(diào)整濾液的pH為6.5?7.5，蛋白含量為10?20g/L，降溫，加50%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為8%，溫度控制在-3?-1 °C，離心分離沉淀物，得精制纖維蛋白原沉淀。
[0045]6)精制纖維蛋白原沉淀稱重后，按沉淀重量加5倍體積的緩沖液II溶解，澄清過濾，取樣進(jìn)行原液檢定。(緩沖液II為8:13:51-9:14:50的氯化鈉-檸檬酸三鈉-蔗糖溶液)。
[0046]7)配制、除菌過濾、灌裝、凍干。
[0047]8)凍干后制品100°C ±0.5°C干熱滅活處理30分鐘；成品檢驗合格后包裝。
【權(quán)利要求】
1.一種從Cohn組分I沉淀分離纖維蛋白原的方法，其特征在于其分離過程為: 1)原料血漿融化合并，加入乙醇使反應(yīng)液乙醇濃度為8%，溫度控制在-3.5?-2.5°C,蛋白含量控制在40?60g/L，pH 7.0?8.0，后離心分離組分I沉淀； 2)組分I沉淀稱重后，溶解于10倍?50倍體積的緩沖液I中，按照5g/L的比例加入預(yù)處理的硅藻土過濾；(緩沖液I為4:3-1:1的檸檬酸三鈉-氯化鈉溶液)； 3)調(diào)整澄清液的pH為6.5?7.5，蛋白含量為10?20g/L，計算體積，加入3.3%的TNBP (磷酸三丁酯)和11%的Tween-80,使其終含量為0.3%和1%，23.5?24.5°C保溫6小時； 4)調(diào)整溶液的pH為6.5?7.5，降溫，加50%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為8%，溫度控制在-3?-1°C，離心分離沉淀物，得粗制纖維蛋白原沉淀； 5)粗制纖維蛋白原沉淀稱重后，按沉淀重量加10倍體積的緩沖液I溶解沉淀，加硅藻土 (按5g/L的比例)澄清過濾； 6)調(diào)整濾液的pH為6.5?7.5，蛋白含量為10?20g/L，降溫，加50%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為8%，溫度控制在-3?-1 °C，離心分離沉淀物，得精制纖維蛋白原沉淀； 7)精制纖維蛋白原沉淀稱重后，按沉淀重量加5倍體積的緩沖液II溶解，澄清過濾，取樣進(jìn)行原液檢定；(緩沖液II為8:13:51-9:14:50的氯化鈉-檸檬酸三鈉-蔗糖溶液)； 8)配制、除菌過濾、灌裝、凍干； 9)凍干后制品100°C±0.5°C干熱滅活處理30分鐘；成品檢驗合格后包裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從Cohn組分I沉淀分離纖維蛋白原的方法，其特征在于纖維蛋白原分離工藝的特點為，在組分沉淀分離階段的所用乙醇濃度為92?95%，在蛋白質(zhì)分離、精制階段所用乙醇濃度為50%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從Cohn組分I沉淀分離纖維蛋白原的方法，其特征在于纖維蛋白原的分離工藝中，除了溫度要求較高的工藝步驟外，組分沉淀分離及蛋白質(zhì)精制純化的工藝溫度控制在0°c以下，優(yōu)選為-3V?-l°c。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種從Cohn組分I沉淀分離纖維蛋白原的方法，纖維蛋白原分離使用的緩沖液為使用4:3-1:1的檸檬酸三鈉-氯化鈉溶液,優(yōu)選為4:3的檸檬酸三鈉-氯化鈉溶液。
【文檔編號】C07K14/75GK104387466SQ201410629847
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】張庭喜, 孔維權(quán), 王連群, 侯彩霞, 石正國 申請人:貴州中泰生物科技有限公司