專利名稱：動物血纖維連接蛋白聯(lián)產(chǎn)工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，尤其涉及一種將FN、SOD、免疫球蛋白、血紅素幾種生化物質，在同一個工藝流程中分離提取出來的動物血纖維連接蛋白聯(lián)產(chǎn)工藝。
背景技術：
纖維連接蛋白也稱“纖粘蛋白”、“纖維結合素”，國內通用名“FN”，英文Fibronectin。FN是1974年國外研究發(fā)現(xiàn)的一種大分子糖蛋白，具有多種生物活性和生物學功能。目前國內外大量對FN的應用研究主要表現(xiàn)在兩個方面1、作為生化試劑，為細胞培養(yǎng)和生物工程的工業(yè)化應用提供基礎。2、應用于多種疾病的診斷和治療，(如傷口的修復和愈合，癌癥的診斷和治療等)。美國sigma公司已生產(chǎn)有牛血，鼠血，人血FN生化試劑。我國至今沒有FN上市產(chǎn)品，其應用主要依靠進口。從90年代初開始，我國一些大專院校和科研單位對人血漿提取FN進行研究和小量臨床論證，近幾年也有少數(shù)單位對動物血提取FN開始研究，但至今都處于實驗室制備，實驗報告，論證探討階段。目前報導的制備方法均為單產(chǎn)，工藝復雜，成本高，不適合工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中存在的不足而提供的一種原料來源豐富，工藝簡單，適合規(guī)?；a(chǎn)的動物血纖維連接蛋白聯(lián)產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的目的是這樣來實現(xiàn)的其工藝步驟如下A、采集新鮮動物血，加入檸檬酸三鈉抗凝，離心，分別收集血漿和血球，貯存于10度以下環(huán)境中；
B、向A步驟中所得到的血漿中加硫酸銨至飽和度20-30％，靜置1小時以上，過濾，收集纖維連接蛋白沉淀物并溶解，上親和層析柱，提取分離出FN主峰液，再經(jīng)分子篩層析純化，超濾濃縮，最后冷凍干燥，得FN產(chǎn)品；C、向B步驟的濾液中加入硫酸銨至飽和度50-60％，靜置1小時以上，過濾，收集沉淀物，經(jīng)超濾脫鹽，冷凍干燥，得免疫球蛋白產(chǎn)品；D、用生理鹽水將A步驟中的血球洗滌干凈，加等體積水溶血，溶血液在溫度為60---75度下加熱10-20分鐘，過濾分別收集濾液和血紅蛋白沉淀；E、將D步驟中的濾液按體積加入0.25倍的乙醇、0.15倍的氯仿，在4度環(huán)境下靜置1小時以上，離心、收集上清液，經(jīng)超濾濃縮制得SOD粗品液；F、將D步驟中得到的血紅蛋白沉淀物用水調成粥狀，然后按體積加入3-5倍丙酮和鹽酸混合液，過濾，向濾液中加入濾液體積1％的乙酸鈉或5％鞣酸，靜置30分鐘以上，離心或過濾，收集沉淀物即為血紅素粗品。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、工藝為聯(lián)產(chǎn)，比單產(chǎn)工藝設備利用率高，節(jié)約原料、輔料、人力，可顯著降低FN、SOD、免疫球蛋白、血紅素生產(chǎn)成本。
2、工藝中FN制備采用了鹽析，與層析相結合的方法，既可提高投料量，節(jié)省價格昂貴的層析介質和生產(chǎn)周期，同時又分離出免疫球蛋白。
3、工藝中SOD制備采用先加熱(60---75度)，使大部分血紅蛋白熱變性分離出來，又保持了SOD活性，血紅蛋白沉淀物又可提取出血紅素，比單產(chǎn)工藝顯著節(jié)約試劑的用量。
具體實施例方式
采集新鮮動物血，加入檸檬酸三鈉抗凝，迅速離心，分別收集血漿和血球，貯存于10度以下環(huán)境中；向血漿中加硫酸銨至飽和度20-30％，靜置1小時以上，過濾，取纖維連接蛋白沉淀物溶解，上親和層析柱，提取分離出FN主峰液，再經(jīng)分子篩層析純化，超濾濃縮，除菌，最后冷凍干燥，得FN產(chǎn)品。
向濾液中加入硫酸銨至飽和度50-60％，靜置1小時以上，過濾，收集沉淀物，經(jīng)超濾脫鹽，脫水濃縮，冷凍干燥，得免疫球蛋白產(chǎn)品。
用生理鹽水將血球洗滌干凈，加等體積水溶血，溶血液在溫度為60---75度下加熱10-20分鐘，過濾分別收集濾液和血紅蛋白沉淀；將濾液按體積加0.25倍的乙醇、0.15倍的氯仿，在4度環(huán)境下靜置1小時以上，離心、收集上清液，經(jīng)超濾濃縮制得SOD粗品液；血紅蛋白沉淀物用水調成粥狀，然后按體積加入3-5倍丙酮和鹽酸混合液，過濾，向濾液中加入濾液體積1％的乙酸鈉或5％鞣酸，靜置30分鐘以上，離心或過濾，收集沉淀物即為血紅素粗品。
動物血與3.8％的檸檬酸三鈉抗凝劑的重量比優(yōu)選7-10∶1，離心時間為10-20分鐘，每分3000-5000轉。纖維連接蛋白沉淀物溶解上親和層析柱再經(jīng)分子篩層析柱進行純化，將純化液經(jīng)超濾濃縮，冷凍干燥。經(jīng)離心后得到的血球用生理鹽水洗滌2-3次，之后，加入蒸餾水，蒸餾水體積與干凈紅血球體積比1∶1，使血球變成溶血液，然后60-75度加熱10-20分鐘使大部分血紅蛋白沉淀。溶血液先加熱使血紅蛋白沉淀，濾液加95％乙醇和氯仿，4度預冷。將SOD粗品液經(jīng)過離子交換層析、分子篩層析分離純化得SOD成品液。血紅蛋白沉淀用少量水調成粥狀，加丙酮鹽酸液為pH2～3，攪拌水解10～30分。
實施例1以1000毫升動物血進行FN聯(lián)產(chǎn)工藝生產(chǎn)方法如下1、采集新鮮動物血1000毫升，加入100毫升量的3.8％的檸檬酸三鈉抗凝劑，離心10分鐘，每分鐘5000轉，分別收集血球和血漿，貯存于10度以下環(huán)境中。
2、向所得到的血漿中，按體積加入硫酸銨至飽和度20％，攪拌溶解后靜置1小時以上。過濾或吊濾，分別收集纖維連接蛋白沉淀物和濾液。
將纖維連接蛋白沉淀物溶解，上親和層析柱，所述的上親和層析柱是明膠-瓊脂糖凝膠2B，提取分離出FN主峰液；再經(jīng)分子篩層析柱，所述的分子篩層析柱是葡聚糖凝膠G75，進行純化，將純化液經(jīng)超濾濃縮，除菌，冷凍干燥得FN成品。
將濾液按體積第二次加入硫酸銨至均和度50％，靜置1小時以上，過濾，收集沉淀物，經(jīng)超濾脫鹽，脫水濃縮，冷凍干燥，得免疫球蛋白。
3、將第一步驟中的血球用生理鹽水洗滌2次，干凈紅血球按體積加等量蒸餾水，攪拌溶血。溶血液加熱至60℃，保溫10分鐘。然后過濾或離心分別收集濾液和血紅蛋白沉淀。
濾液按體積加0.25倍乙醇(95％)和0.15倍氯仿，放4℃環(huán)境下靜置1小時以上，離心10分鐘，收集上清液，經(jīng)超濾濃縮制得SOD粗品液。將SOD粗品液經(jīng)過離子交換層析(所述的離子交換層析是二乙胺基乙基-葡聚糖凝膠A25)和分子篩層析(所述的分子篩層析是葡聚糖凝膠G75)分離純化得SOD成品液。
血紅蛋白沉淀物用少量水調成粥狀，加入3倍的丙酮和鹽酸混合液(Ph值為2)，攪拌水解10分鐘，過濾或離心，收集濾液，向濾液中加入濾液體積1％的乙酸鈉或5％鞣酸，充分攪拌，靜置30分鐘以上，離心或過濾，收集沉淀物，經(jīng)脫水，干燥得血紅素粗品。
實施例21、采集新鮮動物血1000毫升，加入142毫升的3.8％的檸檬酸三鈉抗凝劑，離心20分鐘，每分3000轉，分別收集血球和血漿。
2、血漿按體積加入硫酸銨至飽和度30％，攪拌溶解后靜置1小時以上。過濾或吊濾，分別收集沉淀和濾液。將沉淀物溶解上親和層析柱，所述的上親和層析柱是明膠-瓊脂糖凝膠6B，再經(jīng)分子篩層析柱，所述的分子篩層析柱是葡聚糖凝膠G200，進行純化，將純化液經(jīng)超濾濃縮，冷凍干燥得FN成品。
將濾液按體積第二次加入硫酸銨至均和度60％，過濾，收集沉淀，經(jīng)超濾脫鹽，冷凍干燥，得免疫球蛋白。
3、血球用生理鹽水洗滌3次，干凈紅血球按體積加等量蒸餾水，攪拌溶血。溶血液加熱至75℃，保溫20分鐘。然后過濾或離心分別收集濾液和血紅蛋白沉淀。
濾液按體積加0.25倍乙醇(95％)和0.15倍氯仿，放10℃環(huán)境下靜置1小時以上。離心20分，收集上清液，經(jīng)超濾濃縮制得SOD粗品液。將SOD粗品液經(jīng)離子交換層析，所述的離子交換層析是二乙胺基乙基-葡聚糖凝膠A50，分子篩層析，所述的分子篩層析是葡聚糖凝膠G200，分離純化得SOD成品液。
血紅蛋白沉淀用少量水調成粥狀，加入5倍丙酮鹽酸液(Ph3)攪拌水解30分，過濾或離心，收集紅色清液(濾液)。按體積加入5％鞣酸(或1％乙酸鈉)，充分攪拌，靜置30分鐘以上，離心或過濾，收集沉淀，經(jīng)脫水，干燥得血紅素粗品。
權利要求
1.一種動物血纖維連接蛋白聯(lián)產(chǎn)工藝，其特征在于由下述步驟完成A、采集新鮮動物血，加入檸檬酸三鈉抗凝，離心，分別收集血漿和血球，貯存于10度以下環(huán)境中；B、向A步驟中所得到的血漿中加硫酸銨至飽和度20-30％，靜置1小時以上，過濾，收集纖維連接蛋白沉淀物并溶解，上親和層析柱，提取分離出FN主峰液，再經(jīng)分子篩層析純化，超濾濃縮，最后冷凍干燥，得FN產(chǎn)品；C、向B步驟的濾液中加入硫酸銨至飽和度50-60％，靜置1小時以上，過濾，收集沉淀物，經(jīng)超濾脫鹽，冷凍干燥，得免疫球蛋白產(chǎn)品；D、用生理鹽水將A步驟中的血球洗滌干凈，加等體積水溶血，溶血液在溫度為60---75度下加熱10-20分鐘，過濾分別收集濾液和血紅蛋白沉淀；E、將D步驟中的濾液按體積加入0.25倍的乙醇、0.15倍的氯仿，在4度環(huán)境下靜置1小時以上，離心、收集上清液，經(jīng)超濾濃縮制得SOD粗品液；F、將D步驟中得到的血紅蛋白沉淀物用水調成粥狀，然后按體積加入3-5倍丙酮和鹽酸混合液，過濾，向濾液中加入濾液體積1％的乙酸鈉或5％鞣酸，靜置30分鐘以上，離心或過濾，收集沉淀物即為血紅素粗品。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種動物血纖維連接蛋白聯(lián)產(chǎn)工藝，其特征在于動物血與3.8％的檸檬酸三鈉抗凝劑的重量比為7-10∶1，離心時間為10-20分鐘，每分鐘3000-5000轉。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種動物血纖維連接蛋白聯(lián)產(chǎn)工藝，其特征在于在B步驟中所述的上親和層析柱是明膠-瓊脂糖凝膠2B，所述的分子篩層析柱是葡聚糖凝膠G75。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種動物血纖維連接蛋白聯(lián)產(chǎn)工藝，其特征在于將E步驟中的SOD粗品液經(jīng)過離子交換層析和分子篩層析分離純化得SOD成品液，所述的離子交換層析是二乙胺基乙基-葡聚糖凝膠，所述的分子篩層析是葡聚糖凝膠。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種動物血纖維連接蛋白聯(lián)產(chǎn)工藝，其特征在于在所述的F步驟中的丙酮和鹽酸混合液中，丙酮與鹽酸的體積比為97∶3，丙酮和鹽酸混合液的pH為2～3，血紅蛋白沉淀物與丙酮和鹽酸混合液的攪拌水解時間為10～30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將FN、SOD、免疫球蛋白、血紅素幾種生化物質，在同一個工藝流程中分離提取出來的動物血纖維連接蛋白聯(lián)產(chǎn)工藝，采集新鮮動物血，加入檸檬酸三鈉抗凝，迅速離心，分別收集血漿和血球，貯存于10度以下環(huán)境中，向血漿中加硫酸銨至飽和度20－30％，靜置1小時以上，過濾或吊濾，取沉淀物溶鮮，上親和層析柱，提取分離出FN主峰液，再經(jīng)分子篩層析純化，超濾濃縮，除菌，最后冷凍干燥，得FN產(chǎn)品，具有原料來源豐富，工藝簡單，適合規(guī)模化生產(chǎn)的優(yōu)點。
文檔編號C07K14/78GK1709910SQ20051001771
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月22日 優(yōu)先權日2005年6月22日
發(fā)明者王德亮 申請人:王德亮