專利名稱：一株雞源h9n2禽流感病毒毒株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一株雞源H9N2禽流感病毒毒株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian influenZa，AI)，是由A型流感病毒引起的一種禽類(家禽和野禽) 傳染性疾病綜合征。根據(jù)病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶的區(qū)別將A型流感病毒分為不同亞型。
自 1966 年第一株 H9N2 亞型 AIV-A/Turkey/ffisconsin/1/66 (Ty/WI/1/66)被分離后，其
迅速在世界范圍內(nèi)流行，主要引起家禽呼吸道、產(chǎn)蛋量下降等癥狀，個(gè)別混合感染案例還能引起較高的死亡率，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前H9N2亞型AIV已廣泛分布于各大洲的多種禽類中，尤其在亞洲，H9N2亞型AIV幾乎遍布亞洲的每個(gè)角落。我國是亞洲第一株H9N2亞型AIV的分離地，也是飽受病毒危害最嚴(yán)重的國家之一。自1988年亞洲第一株H9N2亞型AIV在我國香港分離后，該亞型病毒在我國境內(nèi)便迅速傳播開來并形成了 Ck/ BJ/94-like、Ck/Y280/97-like、Ck/SH/F98-like、Qa/HK/Gl/97-like、Dk/HK/Y439/97-like 等穩(wěn)定的遺傳譜系，且通過基因重排等方式不斷變異。值得注意的是，近年甚至出現(xiàn)了 H9N2 和H5m病毒重排的現(xiàn)象。H9N2亞型AIV不僅在禽類中廣泛傳播，在哺乳動(dòng)物——豬群中也同樣存在病毒的感染和流行。1998年4月，Markwell等從香港的家豬體內(nèi)首次分離到2株H9N2亞型AIV 病毒。2001年，Peiris等證實(shí)了 H9N2亞型AIV和H3N2亞型人流感病毒在我國東南部豬群中存在共感染的現(xiàn)象。2002 2004年，又不斷有H9N2病毒感染我國豬群并導(dǎo)致發(fā)病的報(bào)道，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了一定的經(jīng)濟(jì)損失。進(jìn)一步遺傳進(jìn)化分析顯示，H9N2病毒在豬體內(nèi)發(fā)生了重排，包括雞源和鴨源H9N2病毒的重排、H9N2亞型和H5W亞型病毒的重排。H9N2亞型 AIV感染并在豬群中的傳播，說明該亞型病毒已經(jīng)突破了種間屏障，實(shí)現(xiàn)了從禽到哺乳動(dòng)物的傳播；H9N2亞型重排病毒在豬體內(nèi)的發(fā)現(xiàn)，說明H9N2亞型病毒正在通過“混合器”以重排等方式發(fā)生著變異。歷史證明1957年“亞洲流感(H2^) “、1968年“香港流感(H3^) ”以及2009年甲型Hmi流感的大流行，都是含有禽流感病毒基因片段的重排病毒。那么如果 H9N2亞型AIV在豬體內(nèi)重排出了新型病毒，將可能嚴(yán)重威脅動(dòng)物及人類的健康。H9N2亞型AIV在禽和豬群中的傳播和流行，及其偶爾感染人類的事實(shí)，表明H9N2 亞型AIV具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。很多科學(xué)家甚至預(yù)言，H9N2病毒很有可能成為下一次人類流感大流行病毒的元兇或基因供體。為此有學(xué)者利用雪貂為模型，評估了 H9N2亞型 AIV對人類的潛在危險(xiǎn)性。結(jié)果顯示試驗(yàn)所用的H9N2亞型AIV毒株均能在雪貂體內(nèi)復(fù)制， 有些毒株還能通過直接接觸傳播；HA蛋白2 位的亮氨酸對H9N2亞型AIV在雪貂間地有效傳播起著重要作用；H9N2亞型AIV表面蛋白基因和人H3N2病毒內(nèi)部基因的重排模式，能增強(qiáng)病毒復(fù)制能力和傳播效率，證明了 H9N2亞型AIV對人類具有潛在的危險(xiǎn)性。H9N2亞型病毒并不像H5W亞型病毒一樣對人類具有致死性感染的能力。在所有感染人的案例中，H9N2亞型病毒只引起了輕微的感冒樣癥狀。但近年來有些研究報(bào)道稱，發(fā)現(xiàn)了可致小鼠死亡的H9N2亞型AIV。這給我們敲響了警鐘，提醒我們在篩選疫苗的時(shí)候既需要考慮疫苗候選株的繁殖能力、免疫原性等疫苗株所必須具有的特性，還必須要考慮疫苗候選毒株對哺乳動(dòng)物的致病力，避免使用對哺乳動(dòng)物具有潛在強(qiáng)致病力的疫苗候選株， 防止H9N2亞型禽流感病毒對哺乳動(dòng)物及人類造成潛在威脅。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株雞源H9N2禽流感病毒毒株及其應(yīng)用。禽H9N2 亞型流感病毒(Avian H9N2 Influenza A Virus) AIV-SD 株，已于 2011 年 3月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC No. 4689。禽H9N2亞型流感病毒又稱 H9N2亞型禽流感病毒。禽H9N2亞型流感病毒(Avian H9N2 Influenza A Virus) AIV-SD株 CGMCC No. 4689 簡稱 AIV-SD 株。AIV-SD株可用于制備禽流感病毒疫苗。所述禽流感病毒疫苗具體可為針對H9N2 亞型禽流感病毒的疫苗。本發(fā)明還保護(hù)一種制備AIV-SD株病毒液的方法，包括如下步驟將AIV-SD株接種雞胚，培養(yǎng)后收集尿囊液，AIV-SD株病毒液。所述雞胚可為9-10日齡的雞胚(SPF雞胚)； 所述培養(yǎng)的時(shí)間為48至96小時(shí)，優(yōu)選為72小時(shí)。所述方法制備得到的AIV-SD株病毒液也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種禽流感病毒疫苗，它的活性成分為滅活后的AIV-SD株。所述禽流感病毒疫苗具體可為針對H9N2亞型禽流感病毒的疫苗。所述禽流感病毒疫苗的制備方法可包括如下步驟將所述AIV-SD株病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到禽流感病毒疫苗。 所述禽流感病毒疫苗具體可為針對H9N2亞型禽流感病毒的疫苗。本發(fā)明還保護(hù)一種禽流感病毒疫苗的制備方法，是將所述AIV-SD株病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到禽流感病毒疫苗。所述禽流感病毒疫苗具體可為針對H9N2亞型禽流感病毒的疫苗。所述滅活的方法具體如下將所述AIV-SD株病毒液5000 Xg離心lOmin，取上清； 在所述上清中加入甲醛，使甲醛的體積百分含量為0. 1%，37°C滅活M小時(shí)，得到滅活后病毒液。所述乳化的方法具體如下將3體積份油相、1體積份水相和(質(zhì)量百分含量) 硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的終濃度為0. 01 % (質(zhì)量百分含量)，得到禽流感病毒疫苗； 所述油相的制備方法如下將94體積份白油和6體積份司本-80混合，得到混合液，每100 毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂酸鋁(如1. 75克硬脂酸鋁)；所述水相的制備方法如下將4體積份吐溫-80和96體積份所述滅活后的病毒液混勻。所述疫苗可用于家禽，如雞，具體可為白杭雞雛雞。本發(fā)明提供的AIV-SD株對雞具有致病力，但對哺乳動(dòng)物的毒性很弱。將AIV-SD 株病毒液滅活后，可以作為疫苗。接種本發(fā)明提供的疫苗后，可以大大增加雛雞對禽流感病毒的預(yù)防能力，大大提高養(yǎng)殖產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明對于禽流感病毒的防治具有重大價(jià)值。


圖1為實(shí)施例1中AIV-SD株的RT-PCR鑒定電泳圖；M =DNA marker,從上至下的大小依次為:5000，3000，2000，1000，750，500，200，100 ；C 為陽性對照，1 5 為 AIV-SD 株。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例中所用的PBS緩沖液均為pH7. 3、0. OlM的PBS緩沖液。實(shí)施例中所用的96 孔微量血凝板的型號均為每行12個(gè)孔，每列8個(gè)孔。實(shí)施例1、禽H9N2亞型流感病毒AIV-SD株的發(fā)現(xiàn)和鑒定一、H9N2亞型禽流感病毒AIV-SD株的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明人從某雞場QOlO年5月，在山東省濰坊市的雞場，由劉文軍、畢玉海發(fā)現(xiàn))的發(fā)病雞體內(nèi)分離獲得了一株禽H9N2亞型流感病毒(Avian H9N2 Influenza A Virus)，將其命名為AIV-SD株，已于2011年3月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號為 CGMCC No. 4689。禽H9N2亞型流感病毒又稱H9N2亞型禽流感病毒。禽H9N2亞型流感病毒 (Avian H9N2 Influenza A Virus)AIV-SD 株 CGMCC No. 4689 簡稱 AIV-SD 株。二、制備AIV-SD株病毒液將AIV-SD株接種SPF雞胚(10日齡)，接種72小時(shí)后收集尿囊液(AIV-SD株病毒液)。將AIV-SD株病毒液進(jìn)行256倍稀釋，稀釋液即為四單位抗原。實(shí)施例2、禽H9N2亞型流感病毒AIV-SD株的鑒定一、血凝試驗(yàn)在96孔微量血凝板的各孔內(nèi)分別加入25 μ 1 0. 9%生理鹽水。在第一列孔內(nèi)分別加入25 μ 1實(shí)施例1制備的AIV-SD株病毒液，混勻后，從第一列孔吸出25 μ 1液體加到第二列孔內(nèi)，依次倍比稀釋直至第十一列孔，從第十一個(gè)列孔吸出25 μ 1液體棄除。第十二列孔作為陰性對照。在各孔內(nèi)分別加入25μ 1 雞紅細(xì)胞懸液，振蕩混勻。室溫靜置約三十分鐘后觀察結(jié)果。陰性對照孔正常的情況下，能使雞紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋倍數(shù)為病毒液的凝集價(jià)。實(shí)施例1制備的AIV-SD株病毒液的凝集價(jià)為1 1024(1 210)。二、血凝抑制試驗(yàn)分別將購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的Η3Ν8亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和Η9Ν2亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)在96孔微量血凝板上的各孔內(nèi)分別加入25 μ 1 0. 9%生理鹽水；在第一列孔和最后一列孔內(nèi)分別加入25 μ 1禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(最后一列孔作為血清對照孔)；從第一列孔吸出25μ 1液體加到第二列孔內(nèi)，依次倍比稀釋直至第十一個(gè)孔，從第十一孔吸出25μ 1液體棄除；在最后一列孔內(nèi)分別加入25 μ 1 0.9%生理鹽水，在其它各孔內(nèi)分別加入25 μ 1實(shí)施例1制備的四單位抗原；輕輕搖勻后置室溫60min，然后在各孔內(nèi)分別加入 25 μ 11%雞紅細(xì)胞懸液，振蕩混勻，室溫靜置約三十分鐘(30min-60min均可)后觀察結(jié)果。 能夠抑制紅細(xì)胞凝集的禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的亞型即為AIV-SD株的亞型。 結(jié)果表明，AIV-SD株為H9亞型。
三、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)分別將購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的H3N8亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和H9N2亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)將禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用滅菌后的PBS緩沖液進(jìn)行10倍稀釋，然后取25 μ 1 加入試管中；將實(shí)施例1制備的AIV-SD株病毒液用滅菌后的PBS緩沖液進(jìn)行10倍稀釋，然后取25 μ 1加入上述試管中；用Para膜封蓋管口，37°C反應(yīng)1小時(shí)；然后加50 μ 1入胎球蛋白溶液(胎球蛋白0. 5g+20mL pH5. 9的PB溶液+20mL去離子水，_20°C分裝保存；pH5. 9的 PB 溶液取 81mL 0. 4M NaH2POjK溶液、19mL 0. 4M Nei2HPO4 水溶液，混勻配成 0. 4Mbuffer，調(diào) pH至5.9)，37°C反應(yīng)2小時(shí)(或過夜)；再加入50 μ 1過碘酸鈉溶液(過碘酸鈉4. ^g加入去離子水38mL，加熱溶解，室溫冷卻后加62mL 85 %正磷酸水溶液混勻，室溫避光保存)，振蕩，室溫下靜置20分鐘；加入500 μ 1亞砷酸鹽溶液(亞砷酸鈉10. 0g、無水硫酸鈉7. lg，加入去離子水IOOmL,加熱溶解，室溫冷卻后加0. 3mL濃硫酸，室溫保存)，并振蕩至顏色消失； 再加入1. 25ml硫代巴比妥酸溶液(無水硫酸鈉17. 75g、硫代巴比妥酸1. 5g，加入去離子水 250mL，沸水中加熱溶解，室溫保存)，并振蕩；沸水中煮沸15分鐘，觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)粉紅色表明抗血清無抑制作用；無色者表明血清有抑制作用，由此判定神經(jīng)氨酸酶的亞型。結(jié)果表明，AIV-SD株為N2亞型。四、分子生物學(xué)鑒定提取AIV-SD株的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GENBANK發(fā)表的AIV全基因序列設(shè)計(jì)的一對特異性引物(Pl和P2 ；靶序列為HA基因的部分片段，目的條帶為480bp)。以cDNA 為模板，用Pl和P2組成的引物對進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。Pl :5’ -TTGGTATGGATTCCAGCATTC-3，；P2 :5’ -GATTCCAGCTTGACCCCCTCT-3，。RT-PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，見圖1。結(jié)果表明，AIV-SD毒株為禽流
感病毒。五、全基因組序列的測定1、RT-PCR引物的合成根據(jù)已發(fā)表的H9亞型AIV序列資料，設(shè)計(jì)并合成了 AIV基因組8個(gè)基因片段(PB2、 PB1、PA、HA、NA、NP、M、NS)的 RT-PCR 引物(見表 1)。表1禽流感H9N2病毒各基因片段擴(kuò)增所用的引物序列
權(quán)利要求
1.禽H9N2亞型流感病毒(AvianH9N2 Influenza A Virus) AIV-SD株，它的保藏編號為 CGMCC No. 4689。
2.權(quán)利要求1所述禽H9N2亞型流感病毒AIV-SD株在制備禽流感病毒疫苗中的應(yīng)用。
3.制備AIV-SD株病毒液的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求1所述禽H9N2亞型流感病毒AIV-SD株接種雞胚，培養(yǎng)后收集尿囊液，即為AIV-SD株病毒液。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述雞胚為9-10日齡的雞胚；所述培養(yǎng)的時(shí)間為48至96小時(shí)。
5.權(quán)利要求3或4所述方法制備得到的AIV-SD株病毒液。
6.一種禽流感病毒疫苗，它的活性成分為滅活后的權(quán)利要求1所述禽H9N2亞型流感病毒 AIV-SD 株。
7.如權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于所述疫苗的制備方法包括如下步驟將權(quán)利要求5所述AIV-SD株病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到禽流感病毒疫苗。
8.一種制備禽流感病毒疫苗的方法，是將權(quán)利要求5所述AIV-SD株病毒液依次進(jìn)行滅活和乳化，得到禽流感病毒疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株雞源H9N2禽流感病毒毒株及其應(yīng)用。禽H9N2亞型流感病毒(Avian H9N2 Influenza A Virus)AIV-SD株，已于2011年3月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.4689。本發(fā)明提供的AIV-SD株對雞具有致病力，但對哺乳動(dòng)物的毒性很弱。將AIV-SD株病毒液滅活后，可以作為疫苗。接種本發(fā)明提供的疫苗后，可以大大增加雛雞對禽流感病毒的預(yù)防能力，大大提高養(yǎng)殖產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明對于禽流感病毒的防治具有重大價(jià)值。
文檔編號A61P31/16GK102443571SQ20111032202
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者劉文軍, 孫蕾, 張萬林, 李晶, 楊利敏, 畢玉海, 范國兵 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所, 北京信得威特科技有限公司