專利名稱：一種腫瘤靶向磁性水凝膠納米遞藥系統(tǒng)及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗癌藥物制備技術領域，具體涉及一種腫瘤靶向磁性水凝膠納米遞藥系統(tǒng)及其構建方法和應用。
背景技術：
世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心于2011年4月公布的一份研究報告稱，根據目前癌癥的發(fā)病趨勢，2020年全世界癌癥發(fā)病率將比現在增加50%，全球每年新增癌癥患者人數將達到1500萬人。在這些眾多類型的癌癥中，肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，它具有發(fā)病率高、病程短、惡性程度大、預后差等特點。臨床上一般采取西醫(yī)的手術、放化療與中藥結合療法，但都存在毒副作用大、治愈率低等問題，其主要原因在于抗腫瘤藥物及治療療法的靶向選擇性不高，在殺死腫瘤細胞的同時，對正常組織也產生較大的毒副作用或損害；同時腫瘤細胞易對化療藥物產生多藥耐藥性，引發(fā)自身免疫反應清除藥物或阻斷其發(fā)揮藥效。 因此，構建靶向腫瘤組織的遞藥系統(tǒng)(Drug Delivery System)以提高抗癌藥物對癌細胞的高靶向選擇性，增強對藥物的控釋能力(Controlled Released)以長效抑制腫瘤，成為治療癌癥的有效途徑。1. 1 靶向遞藥系統(tǒng)(Drug Delivery System)的構建
靶向遞藥系統(tǒng)將抗癌藥物直接靶向腫瘤組織，在降低治療劑量的同時提高抗腫瘤藥物的療效，避免其在非靶向部位的聚集。腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)可分為被動靶向和主動靶向兩大類，前者主要借助于納米尺度的遞藥載體實現，后者則建立在納米遞藥系統(tǒng)的基礎上通過腫瘤細胞膜表面的特異性受體介導。自20世紀70年代以來，無數的科研工作者們嘗試利用脂質體、膠囊、微球、納米粒子等載體運輸抗腫瘤藥物，以期最大限度地增強藥物療效。在諸多的遞藥載體中，納米粒子倍受研究者的青睞。其作為一種新型的藥物載體，由于粒徑小，能穿過組織間隙并被細胞吸收，通過人體最細的毛細血管，還可透過血腦屏障；同時由于其比表面積大，吸附能力強，經過表面修飾后可高效裝載多種抗癌藥物，并對藥物進行保護，使藥物在進入人體過程中不被胃酸和酶類等侵蝕降解，提高了藥物穩(wěn)定性，使藥物只在特定的病灶部位釋放，避免全身性的副作用。而磁性納米粒子由于其具有超順磁性，可以在外加磁場作用下被動靶向運輸抗腫瘤藥物，結合核磁共振成像及熒光成像可進行實時監(jiān)測的特點，展現出極大的應用前景。主動靶向給藥系統(tǒng)能使抗腫瘤藥物選擇性地與靶組織在細胞或亞細胞水平上結合并起作用，可使藥物能夠可控性地分布于靶區(qū)并持續(xù)緩慢地釋放藥物，在提高藥物抗癌效果的同時可降低其對正常組織的不良反應。目前，主動靶向給藥系統(tǒng)研究較多的主要有三個方面，分別是抗體介導的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)、前體藥物的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)、受體介導內化的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)?？贵w介導的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)是指利用抗原-抗體之間的特異性識別機制發(fā)揮主動靶向特定細胞作用，例如以單克隆抗體、免疫脂質體、單抗偶聯(lián)物。前體藥物的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)是利用腫瘤中某些酶的水平的升高，活化前體藥物，從而釋放出具有活性的原藥。受體介導內化的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)主要是指以腫瘤細胞表面特異性或過度表達的受體為靶點，以受體對應的配體或配體結合物為載體，利用受體和配體的特異性反應，將藥物遞送至受體表達陽性的腫瘤細胞的一種治療系統(tǒng)，包括表皮生長因子受體、唾液酸糖蛋白受體、低密度脂蛋白受體、轉鐵蛋白受體、葉酸受體等。其中葉酸受體 (Folic acid Receptor, FR)在多數惡性腫瘤中呈過表達，而在正常組織細胞中不表達，因此FR介導的靶向傳遞成為受體介導的主動靶向給藥系統(tǒng)中的研究熱點。葉酸(Folic Acid, FA)是一種小分子維生素，與其他靶向分子相比，FA相對分子質量小，價廉易得，具有較高的穩(wěn)定性，并且無免疫原性，與腫瘤細胞表面的受體有相對較高的親和力。1.2 藥物控釋(Controlled Released)系統(tǒng)的構建
藥物的控制釋放是一門新興的交叉學科，藥物控制釋放技術就是選用適當的載體將藥物按設計的劑量，在要求的時間范圍內以一定的模式在體內釋放或使藥物在指定部位釋放而達到治療某種疾病的目的。與傳統(tǒng)給藥方式相比，藥物控釋劑不僅可以減少給藥次數、維持血液中藥物的濃度，從而解決了藥物濃度不穩(wěn)定的問題，而且還降低了藥物毒性，提高了藥物的療效。理想的藥物載體應具有很好的生物相容性、生物可降解性、理化及生物穩(wěn)定性和極低的毒性，且有較高的載藥性。目前用作藥物載體的材料很多，包括聚乳酸(PLA)/ 乳酸-羥基乙酸(PLGA)、殼聚糖及其衍生物、絲素蛋白、高分子凝膠等。水凝膠是一類水溶脹性，通過共價鍵、氫鍵或范德華力等相互作用形成交聯(lián)結構的親水納米高分子材料。利用其對環(huán)境溫度和PH具有敏感性，體積隨著溫度、pH變化發(fā)生相變而溶脹或收縮的特性，可以利用其裝載抗癌藥物并實現控釋。其具有相變溫度 LCST (Lower Critical Solution ^Temperature)，當環(huán)境溫度低于 LCST 時，水凝膠吸水溶脹，凝膠溶于水；當環(huán)境溫度高于LCST時，水凝膠發(fā)生相變，收縮失水。利用水凝膠的這一特性，我們使其在低溫下吸附抗腫瘤藥物阿霉素，并當局部溫度高于其LCST時釋放。1. 3靶向給藥系統(tǒng)與藥物控釋的結合
為使化療藥物既能高靶向運輸至腫瘤細胞周圍，并能進行有效的控制釋放，研究者們嘗試將靶向給藥系統(tǒng)——磁性納米粒和藥物控釋載體——水凝膠進行有機結合。據已有文獻報道，水凝膠和磁性納米粒的結合方式主要有四種通過聚合反應結合、通過形成化學鍵 (比如酰胺鍵、硫醚鍵、Fe-S鍵)結合，通過直接包裹吸附，以及通過直接在水凝膠內原位聚合生成狗304。但聚合反應結合可能出現聚合不完全，包裹不均勻，水凝膠基質混凝；化學鍵結合方式往往需要復雜的化學反應，形成特殊的化學鍵，比如巰基、氨基、乙烯基等等，需要催化劑及合適的反應溫度，反應難以控制，且效率不高；直接包裹吸附則容易導致包裹吸附不緊密，不均勻。原位生成的納米粒是堿性條件下，在水凝膠中直接共沉淀生成狗304粒子， 但PH難以控制，Fe3O4粒子難以生成；而且堿性環(huán)境也很容易破壞水凝膠結構。光化學固定法一液態(tài)光接枝法操作簡單方便，接枝效率高，為解決磁性納米粒與水凝膠的高效結合提供了有效解決途徑。目前，用液態(tài)光接枝法形成磁性水凝膠的研究還未見報道。在我們的發(fā)明中，我們通過液態(tài)光接枝的手段將水凝膠粒子接枝到油酸改性的四氧化三鐵納米粒表面，形成磁性水凝膠載體。同時，我們在水凝膠最外層光接枝葉酸分子，使得我們的系統(tǒng)模型既可以利用葉酸配體與腫瘤細胞表面受體高親和力結合而主動靶向，也可以在外加磁場作用下使納米藥物被動靶向運輸至腫瘤細胞周圍；而且，利用外加磁場誘導磁性納米粒的磁熱效應，使局部溫度升高超過水凝膠的最低臨界溶解溫度(LCST)， 進而對藥物進行有效的控制釋放。1. 4內外調控機制的構建
傳統(tǒng)化療藥物療效低的原因之一是腫瘤細胞易對化療藥物產生多藥耐藥性，引發(fā)自身免疫反應清除藥物或阻斷其發(fā)揮藥效。在我們發(fā)明的納米遞藥系統(tǒng)中，我們以磁性水凝膠為載體吸附運載阿霉素，通過葉酸分子的主動靶向作用及外加磁場的定向引導，進入細胞后進行控制釋放阿霉素；同時，我們在磁性水凝膠表面通過光化學固定法接枝上具有腫瘤抑制作用的腫瘤壞死因子-α、干擾素-Y，腫瘤壞死因子-α、干擾素-Y可以分別和腫瘤細胞表面的腫瘤壞死因子-α受體、干擾素-Y受體結合，進而誘導細胞程序性死亡途徑。阿霉素(Doxorubicin，D0X)是一種傳統(tǒng)的廣譜抗腫瘤抗生素，目前是肝癌化療的一線用藥。阿霉素的化學名稱為10-[ (3-氨基-2，3，6-三去氧-a-L-來蘇己吡喃基)_氧]-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-8-(羥乙?；?-1-甲氧基_5，12-萘二酮鹽酸鹽，其結構中具有脂溶性的蒽環(huán)配基，水溶性的柔紅糖胺，又有酸性酚羥基和堿性氨基， 因此具有很強的抗癌活性。其分子結構可嵌入到DNA雙鏈中形成穩(wěn)定的復合物，影響DNA 的結構和功能，阻止腫瘤細胞DNA復制和RNA的合成。由于耐藥性的產生，阿霉素的有效率低于20%;同時，由于其對血液系統(tǒng)的毒性和胃腸道反應十分明顯，可引起惡心、嘔吐、脫發(fā)、高熱等不良反應。因此，利用納米載體靶向運輸阿霉素，可以更大程度地發(fā)揮傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的優(yōu)勢作用，在強效抑制腫瘤的同時，減少對正常組織毒副作用。腫瘤壞死因子-a (Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α )是一種由單核巨噬細胞對細菌感染或其他免疫源反應自然產生的細胞因子，可使瘤體縮小或消失，在體內體外均能有效殺傷腫瘤細胞。干擾素-Y (Interferon- γ，IFN- Y )是T細胞和NK細胞產生的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)功能的一類蛋白質，可抑制快速分裂的細胞，如各種腫瘤細胞，臨床可用于腫瘤的輔助治療。TNF-α與IFN-Y協(xié)同抗腫瘤，可在一定程度上減輕各自的毒副反應，我們的前期研究也證明了兩者的協(xié)同作用抑制率明顯高于單獨使用任何一種細胞因子的抑制率，同時降低了單一細胞因子的劑量。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于根據現有技術中存在的上述不足，提供一種以油酸改性的四氧化三鐵納米粒子為核心，通過光化學固定法將水凝膠固定于納米粒表面形成磁性水凝膠 (Fe3O4-OA /NIPA-AA)，在磁性水凝膠表面光接枝腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ，并在其最外層光接枝靶向分子配體葉酸I^e3O4-OA /NIPA-AA/ TNF-α/IFN-γ/FA)，最后以此給藥系統(tǒng)吸附阿霉素形成多功能納米藥物(Fe3O4-OA /NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA/D0X)。可利用外加磁場的定向引導及葉酸介導的主動靶向將抗腫瘤藥物阿霉素運輸至腫瘤細胞周圍腫瘤壞死因子-α、干擾素-Y與腫瘤細胞細胞表面受體結合并誘導腫瘤細胞程序性死亡；阿霉素隨載體進入細胞后通過磁性水凝膠的磁熱效應控制釋放。體內、體外實驗證明這種納米藥物具有較小的毒副作用，并且通過瘤壞死因子-α、干擾素-Y協(xié)同阿霉素于腫瘤細胞內外的共同作用機制，高效抑制肝癌細胞生長。本發(fā)明另一目的在于提供上述腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)的構建方法。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)的應用。
本發(fā)明上述目的通過以下技術方案予以實現
一種腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)，包括磁性水凝膠載體和在其表面接枝的腫瘤壞死因子-α、干擾素-Y和靶向分子配體葉酸；所述磁性水凝膠載體是具有溫度和PH敏感性的水凝膠接枝到四氧化三鐵納米粒上而得。本發(fā)明上述腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)的構建方法中，所述磁性水凝膠載體的制備方法包括如下步驟
(1)超順磁性四氧化三鐵納米粒的合成及表面改性稱取I^eSO4· 7Η20和FeCl3 · 6Η20， 加入超純水，置于油浴鍋內，通入氮氣保護，60°C下攪拌30min ；取NaOH加入超純水，在60°C 下攪拌使其充分溶解，再將溶解的NaOH加入到鐵鹽溶液中，反應IOmin后，升溫至70°C，然后向其中加入HCl溶液至pH等于3，最后加入油酸，攪拌池后，在磁鐵輔助下用無水乙醇洗滌，再用丙酮洗滌，得到油酸包裹的四氧化三鐵納米粒，將其真空抽干備用；
(2)通過微乳液聚合法合成水凝膠取異丙基丙烯酰胺、丙烯酸、亞甲基雙丙烯酸酰胺和十二烷基磺酸鈉，溶于超純水中，室溫下在N2氛圍保護下攪拌20min ；向溶液中加入過硫酸鉀于70°C下聚合反應4h，反應結束后，冷卻至室溫，用透析袋除去未反應完的單體，透析兩周，每兩個小時更換一次新鮮的超純水，最后用真空管冷凍干燥機將其凍干儲存待用；
(3)光活性水凝膠的制備稱取水凝膠，溶于pH=7.4的PBS緩沖液中，吸取Iml水凝膠溶液加入到細1含有59. 19mg疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS(pH=7. 4，體積比為 4:1)溶液中，在冰浴條件下攪拌反應48h，將混合溶液轉移至透析袋純化疊氮苯基衍生物， 透析三天后取出溶液用真空冷凍干燥機凍干，凍干后，向其中加入PBS溶液溶解；
(4)磁性水凝膠載體的合成避光條件下，將光活性水凝膠溶于PBS緩沖溶液中，加入油酸改性后的四氧化三鐵納米粒，混合均勻，并用超聲波清洗器分散后轉移至培養(yǎng)皿中，振蕩條件下，于125W紫外燈下IOcm處照射20min ；
(5)接枝腫瘤壞死因子-α、干擾素-Y和靶向分子配體葉酸的方法如下分別將50μg 的IFN- y、TNF- α、FA加入25ml含768 μ g N-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，在4°C的條件下攪拌反應48h，合成結束后，分別用超濾離心管在4000rpm/min的轉速下，離心30min以純化疊氮苯基衍生物，冷凍干燥備用。本發(fā)明所述腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)可以用于制備治療癌癥的藥物，特別是可以將所述腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)溶于PBS緩沖液中，加入阿霉素溶液溶解，冰浴攪拌三天，使腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)充分吸附阿霉素，用于治療癌癥。與現有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的創(chuàng)新點主要體現在以下三個方面(1)采用光化學固定法，在磁性納米粒表面光接枝具有溫度、PH敏感性的水凝膠，形成磁性水凝膠載體并裝載可磁熱控釋阿霉素；(2)在磁性水凝膠表面光接枝葉酸分子，利用葉酸介導的主動靶向給藥(并可結合外加磁場實現抗腫瘤藥物的雙重靶向運輸)；(3)利用靶向給藥載體表面結合的腫瘤壞死因子-α、干擾素-Y的受體信號傳導作用配合細胞內水凝膠釋放阿霉素的DNA破壞作用，實現藥物的細胞內外雙重調控作用機制。


圖1顯示油酸包裹的!^e3O4納米粒全面的表征結果。A為納米粒的透射電鏡
6TEM的圖片，納米粒分散較為均勻，粒徑約為20nm ；B為納米粒的粒徑分布，其平均直徑在 13. 5士 1. 45nm ；C為納米粒于300K下測得的的磁性大小，為60 emu/g ；D為納米粒在X射線衍射儀中的衍射圖譜，與標準的四氧化三鐵的衍射圖譜基本吻合；E為納米粒在油酸改性前和包裹油酸后的紅外圖譜，通過對比官能團的變化，證明油酸包裹四氧化三鐵納米粒成功；
圖2為水凝膠(NIPA-AA)及其合成原料的紅外圖譜㈧及其LCST的測定曲線⑶。A 顯示了異丙基丙烯酰胺(NIPA)、丙烯酸(AA)及水凝膠(NIPA-AA)的紅外圖譜，通過比較官能團的變化初步證明水凝膠NIPA-AA合成成功。B顯示水凝膠的最低臨界溶解溫度(LCST) 為 38. 7 0C ；
圖3顯示了四氧化三鐵、油酸、油酸包裹的四氧化三鐵、光活性水凝膠及光活性水凝膠接枝到油酸包裹的四氧化三鐵納米粒表面后的紅外圖譜，通過比較官能團特征峰的前后變化，初步證明光活性水凝膠成功接枝到油酸包裹的四氧化三鐵納米粒表面；
圖4顯示了磁性水凝膠(Fe3O4-OA /NIPA-AA)充分吸附阿霉素后于37°C、41°C下在72h 內的釋放動力學特征；
圖5為^VzPh-TNF- α /AzPh-IFN- γ的合成流程圖； 圖6為iVrfh-FA的合成流程圖7顯示了傅里葉轉換紅外線光譜分析儀表征比較光活性IFN- y、TNF- α、FA制備前后官能團的紅外圖譜的變化；
圖8通過傅里葉轉換紅外線光譜分析儀表征比較光活性IFN- y ,TNF- α及Fi^3O4-OA / OTPA-AA在接枝前后紅外圖譜中官能團的變化；
圖9中的A顯示了通過細胞計數測定空白組a(單純細胞培養(yǎng))，b游離藥物 1 (Free TNF- α +IFN-y+FA+DOX)、c 游離藥物組 2 (Free Fe304-0A/NIPA-AA +TNF- α +IFN- y +FA+DOX)、d 共固定藥物組(i^OfOA/NIPA-AA/TNF- α /IFN- γ /FA)與 H 印 G2 細胞共孵育24h后細胞存活率；B顯示了分別以阿霉素量為0 ng/well、10ng/well、20ng/well、 30ng/well計的納米藥物與HepG2細胞共孵育24h后通過細胞計數計算得到的細胞存活率；
圖10顯示了裸鼠的存活率，最早出現死亡的是生理鹽水組，接著是游離藥物組、共固定藥物但不給予加熱處理組、固定藥物并加熱處理組。陰性對照組(正常裸鼠組)和給予共固定藥物但不加熱處理組裸鼠的總體存活天數最長，只注射生理鹽水的陽性對照組裸鼠的總體存活天數最短；
圖11顯示了各組裸鼠的體重變化曲線，B至F圖分別是正常組、生理鹽水組、游離藥物組、固定藥物非加熱處理組、固定藥物加熱處理組的體重變化曲線圖12顯示的是裸鼠處死前(第36天)從A、B、C、D、E組各取一只具有代表性裸鼠拍攝的圖片及其對應的腫瘤圖片，左圖中箭頭所指位置為瘤的生長部位，右圖中顯示的是與左圖相對應的裸鼠的瘤；
圖13顯示的是B、C、D、E組裸鼠從第一次給藥時開始計算的瘤體積大小隨時間的變化曲線；
圖14為給藥前后裸鼠體內血小板、白細胞、紅細胞數量的變化； 圖15顯示了各組裸鼠的腫瘤組織HE染色的結果，Al、Bi、Cl、Dl是光學顯微鏡下100倍所觀察到的結果，A2、B2、C2、D2是400倍數下觀察到的結果。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例1腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)的制備及表征 1. 1超順磁性!^e3O4納米粒的合成及表面改性
采用化學共沉淀法合成出四氧化三鐵O^e3O4)納米粒子。稱取0. Imol FeSO4 · 7H20，
0.16mol FeCl3 ·6Η20置于三頸燒瓶中，向其中加入140ml超純水，將三頸燒瓶裝上電動攪拌器，置于油浴鍋內，通入氮氣保護，60°C下攪拌30min ；稱取0.84mol NaOH置于燒杯中，加入 280ml超純水，在60°C下用玻璃棒攪拌使其充分溶解。將NaOH溶液緩慢加入到鐵鹽溶液中 (此時混合溶液的pH=12)，反應IOmin后，升溫至70°C，然后向其中加入HCl溶液至pH=3， 最后再加入20ml油酸(Oleic acid, OA)，攪拌池后，在磁鐵輔助下用無水乙醇洗滌數次， 最后用丙酮洗滌后即得到油酸包裹的四氧化三鐵納米粒子(Fe3O4-OA)，將其真空抽干備用。油酸改性的!^e3O4納米粒(Fii3O4-OA)的表征
油酸改性的四氧化三鐵納米粒制備成功后，取適量分散于無水乙醇中，超聲分散30min 后，利用透射電鏡TEM(JEM-IOOCXII)表征其形貌；將分散于無水乙醇的納米粒用激光粒度儀(NanO-ZS90，Malvern, UK)檢測其粒徑分布；取粉末狀油酸改性的四氧化三鐵納米粒研磨后，稱取一定量后用磁學性質測量系統(tǒng)(MPMS XL-7，美國QUANTUM DESIGN公司)測其磁飽和強度大??；用X射線衍射儀(日本島津XRD-6000)檢測納米粒的衍射圖譜；用傅里葉變換紅外光譜儀(NEXUS870，美國NIC0LET公司)檢測了比較四氧化三鐵納米粒在用油酸改性錢和油酸改性后的紅外圖譜(圖1)。水凝膠(NIPA-AA)的合成
通過微乳液聚合法合成水凝膠(NIPA-AA)。稱取3.779g異丙基丙烯酰胺(NIPA)，
1.296g丙烯酸(AA), 0. 70g亞甲基雙丙烯酸酰胺(BIS)，0. 395g十二烷基磺酸鈉(SDS)，溶于IOOml超純水中，室溫下在N2氛圍保護下攪拌20min ；向溶液中加入0. 166g過硫酸鉀 (KPS)于70°C下聚合反應4h，反應結束后，冷卻至室溫，用透析袋出去未反應完的單體，透析兩周，每兩個小時更換一次新鮮的超純水。最后用真空管冷凍干燥機將其凍干儲存待用。水凝膠的表征及其最低臨界溶解溫度(LCST)的測定
水凝膠合成并凍干后，通過傅里葉變換紅外光譜儀(NEXUS870，美國NICOLE公司)表征比較異丙基丙烯酰胺(NIPA)、丙烯酸(AA)及水凝膠(NIPA-AA)的官能團紅外圖譜的變化；用PH=7. 4的PBS緩沖溶液配制質量分數為5%的水凝膠溶液，用紫外-可見分光光譜儀 (LAMBDA-35,美國PE公司)測量水凝膠溶液的吸光度值，從20°C至50°C每0. 5°C取一個點，每個溫度點靜置5min待其達到平衡后再進行測量，繪制水凝膠溶液的吸光度值隨溫度升高的變化曲線，并計算水凝膠的最低臨界溶解溫度(LCST)(圖2)。光活性水凝膠的制備及表征
稱取0. Olg水凝膠，溶于10ml pH=7. 4的PBS緩沖液中，吸取Iml水凝膠溶液加入到含有59. 19mg疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS(pH=7.4，體積比為4 :1)溶液中，在冰浴條件下攪拌反應48h。將混合溶液轉移至透析袋(MWC0 = Nominal :500)純化疊氮苯基衍生物，透析三天后取出溶液用真空冷凍干燥機(LGJ-12，BYLAB0)凍干。凍干后，向其中加入 PBS溶液溶解。光活性水凝膠制備成功后，在避光條件下取適量用傅里葉轉換紅外線光譜分析儀 (Vector-33，德國Bruker公司)進行表征比較水凝膠光活化前后官能團的變化(圖2)。磁性水凝膠載體(Fii3O4-OA /NIPA-AA)的合成及表征
通過光化學固定法一液態(tài)光接枝法將水凝膠接枝到納米粒表面。避光條件下，將之前制備的光活性水凝膠溶于PBS緩沖溶液中，加入油酸改性后的四氧化三鐵納米粒 (Fe3O4-OA),混合均勻，并用超聲波清洗器分散一段時間后轉移至培養(yǎng)皿中，振蕩條件下，于 125W紫外燈下IOcm處照射20min后，真空凍干備用。光活性水凝膠接枝到油酸改性的!^e3O4納米粒上之后，取適量通過傅里葉轉換紅外線光譜分析儀(Vector-33，德國Bruker公司)進行表征，比較光活性水凝膠接枝前后及油酸包裹的四氧化三鐵納米粒接枝前后官能團的變化(圖幻，通過比較官能團特征峰的前后變化，初步證明光活性水凝膠成功接枝到油酸包裹的四氧化三鐵納米粒表面。水凝膠的裝載效率及阿霉素釋放動力學測定 1. 7. 1水凝膠的裝載效率的測定
光活性水凝膠接枝到油酸包裹的四氧化三鐵納米粒上之后，稱取5mg溶于PBS緩沖溶液中，并加入3ml溶于PBS緩沖溶液的lmg/ml阿霉素溶液，于4°C下攪拌孵育三天，使水凝膠充分溶脹吸附阿霉素；之后將孵育的水溶液轉移至透析袋中，4°C下透析三天，以除去未吸附在水凝膠里的阿霉素。通過高效液相色譜(HPLC)定量測定透析液中阿霉素的含量，并計算水凝膠對阿霉素的裝載效率。磁性水凝膠Fe53O4-OA /NIPA-AA裝載阿霉素后釋放動力學的測定
取充分吸附裝載了阿霉素的磁性水凝膠(即i^304-0A/NIPA-AA/D0X)轉移至透析袋中， 分別置于4°C、37°C、41°C下的PBS緩沖溶液中進行透析，分別在Omin、15min、30min、45min、 讓、311、611、1211、2411、3611、4811、7211時間點從透析液中取出Iml置于EP管中，并向透析液中加入等體積的PBS緩沖液。最后，用高效液相色譜定量檢測各時間點收集的透析液中阿霉素的含量，并繪制其釋放動力學曲線(圖4)。將磁性水凝膠與阿霉素水溶液在4°C下攪拌孵育三天后在PBS緩沖液中進行透析，通過高效液相色譜(HPLC)定量測定透析液中阿霉素的含量，并計算得到水凝膠對阿霉素的裝載效率為50. 16%。圖4顯示了磁性水凝膠(Fi5304-0A/NIPA-AA)充分吸附阿霉素后于37°C、41°C下在 72h內的釋放動力學特征。從圖中可以看出，在O到72h內，阿霉素在41°C下的釋放速率比 37°C下的更大；同時，阿霉素在41°C下的總釋放率為51. 39%，比在37°C下的總釋放率(僅為33. 91%)大。這一結果一方面間接證明水凝膠確已成功接枝到納米粒上，另一方面有效證明磁性水凝膠在環(huán)境溫度低于其最低臨界溶解溫度LCST時(如在37°C下)可以很好吸附阿霉素，而在環(huán)境溫度高于其最低臨界溶解溫度LCST時(如在41°C下)可以較大程度地釋放阿霉素，這一結果為利用磁性水凝膠載體裝載抗癌藥物靶向運輸并控釋提供了有力證據。裝載了藥物的腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)(Fi5304-0A/NIPA-AA/ TNF- α /IFN- γ / FA/D0X)的制備及表征1.8. 1光活性IFN- y、TNF- α、FA的合成及表征
分別將50 μ g的IFN- y、TNF- α、FA加入25ml含768 μ gN-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS (pH=7. 4，體積比為4 1)溶液中，在4°C (冰浴、避光)的條件下攪拌反應48h。 合成結束后，分別用超濾離心管(Milipore Molecut II，IOKNa)，在4000rpm/min的轉速下，離心30min以純化疊氮苯基衍生物，冷凍干燥備用。使用前，加入50ml的PBS溶液溶解， 并調整至所需濃度Ing/μ 1。取適量凍干的光活性IFN-γ、TNF-α、FA，通過傅里葉轉換紅外線光譜分析儀 (Vector-33，德國Bruker公司)進行表征比較IFN-γ、TNF-α、FA在改性前后官能團的變化(圖5 7)。34 α /IFN- γ /FA的合成及表征
稱取Img磁性水凝膠Pe3O4-OA /ΝΙΡΑ-ΑΑ)溶于IOml PBS緩沖溶液中，吸取Iml 磁性水凝膠溶液，向其中加入Iyg光活性TNF-α、lyg光活性IFN-γ及Iyg光活性 FA (AzPh-TNF-a、AzPh-IFN-γ、AzPh-FA 的比例為 1 1 1，！^e3O4-OA /NIPA-AA 與 AzPh-TNF- a、AzPh-IFN- y、AzPh-FA的比例均為100:1)，在避光條件下混合均勻，并用超聲波清洗器分散一段時間后轉移至培養(yǎng)皿中，于125W紫外燈下IOcm處照射20min，真空凍干備用。將凍干的Fii3O4-OA /NIPA-M/TNF- a /IFN- y /FA用傅里葉轉換紅外線光譜分析儀 (Vector-33，德國Bruker公司)表征，比較光接枝前后官能團紅外圖譜的變化(圖8)。圖 8通過傅里葉轉換紅外線光譜分析儀表征比較光活性IFN-γ、TNF-α及!^e3O4-OA /NIPA-AA 在接枝前后紅外圖譜中官能團的變化，初步證明光活性IFN-γ、TNF-a、FA成功地接枝到 Fe3O4-OA /NIPA-AA磁性水凝膠上。34 a /IFN- γ /FA/D0X 的合成
稱取 Img 納米藥物 Fe304-0A/NIPA-AA/TNF- a /IFN- Y /FA 溶于 4ml PBS 緩沖液中， 向其中加入Iml溶于PBS緩沖溶液的lmg/ml阿霉素溶液溶，冰浴攪拌三天，使!^e3O4-OA/ NIPA-AA/TNF- a /IFN- y /FA充分吸附阿霉素。之后，將混合溶液轉移至透析袋中，置于4°C 下透析三天，以除去未吸附到水凝膠里的阿霉素。透析結束后，將藥物溶液取出并通過過濾除菌，調整至合適濃度備用。實施例2 Fe3O4-OA /NIPA-AA/TNF- a /IFN- y /FA/D0X 對 H印G2 細胞體外抑制 1藥物對細胞抑制作用的研究
將HepG2細胞用胰酶消化后收集，吸打均勻后按每孔1 X IO6細胞接種于M孔板中。實驗分為四組A空白對照組(單純細胞培養(yǎng))；B游離TNF-a (1. 5ng/well)+IFN-γ (1. 5ng/ well)+FA(l. 5ng/well)+D0X(20 ng/well) ；C 游離 Fe304-0A/NIPA-AA (1. 5ng/ well)+TNF-a (1. 5ng/well)+IFN-y (1. 5ng/well)+FA (1. 5ng/well)+DOX (20ng/well) ；D 共固定藥物組 i^OfOA/NIPA-AA/TNF- a /IFN- y /FA/ DOX (藥量以阿霉素量為 20ng/well 計)。在相同條件下(37°C，5%C02)培養(yǎng)24h后，通過細胞計數比較實驗組相對于空白組的細胞數量，計算細胞存活率。不同劑量納米藥物對細胞抑制作用的研究
通過細胞計數法驗證不同劑量納米藥物對HepG2細胞的抑制作用。將HepG2細胞用胰酶消化后收集，吸打均勻后按每孔IX IO6細胞接種于M孔板中。實驗分為四組A空白對照組(單純細胞培養(yǎng))；B、C、D組均為共固定藥物組，各組中納米藥物的量分別以阿霉素的量為 10ng/well、20ng/well、30ng/well 計。在相同條件下(37°C，5%C02)培養(yǎng) 24h 后，通過細胞計數比較實驗組相對于空白組的細胞數量，計算細胞存活率(圖9)。圖9A顯示通過細胞計數測定空白組a (單純細胞培養(yǎng))，b游離藥物1 (Free TNF- α +IFN- y +FA+DOX)、c游離藥物組 2 (Free Fe304-0A/NIPA-AA+TNF- α +IFN- γ +FA+DOX)、(！共固定藥物組(Fii3O4-OA / NIPA-AA/TNF- α /IFN- y /FA)與H印G2細胞共孵育24h后細胞存活率。從圖中可以看出， 共固定藥物比游離藥物相比，其對HepG2細胞的抑制作用要更明顯。圖9B顯示了分別以阿霉素量為0 ng/well、10ng/well、20ng/well、30ng/well計的納米藥物與IfepG2細胞共孵育24h后通過細胞計數計算得到的細胞存活率。從圖中可以看出，不同劑量的納米藥物對 H印G2細胞都有較大程度的抑制作用，但當納米藥物以20ng/Well的濃度共孵育H印G2細胞時，其對HepG2細胞的抑制作用最為明顯。實施例3 Fe3O4-OA /NIPA-AA/TNF- α /IFN- y /FA 對 H印G2 細胞體內抑制作用 1肝癌細胞0fepG2細胞系)的培養(yǎng)
使用DMEM培養(yǎng)基(含10%新生小牛血清、0. 03mg/ml青霉素、0. 05mg/ml鏈霉素， pH=7. 2^7. 4)，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)。肝癌動物模型的建立
動物實驗選取四周齡BALB/c-nu/nu裸鼠(nude mice)，共購買20只，均為雄性，體質量14. 5士3. 2g，均購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心生產部，SPF級，許可證號 SCXK(粵)2008-0002 ；裸鼠批次為007擬66。裸鼠購買后寄養(yǎng)于中山大學北校區(qū)動物實驗中心SPF級裸鼠房(許可證號SYXK(粵)2007-0081)。將20只裸鼠隨機分為5組，每組4只， 編號為A、B、C、D、E組，其中A組為陰性對照組，不接種!fepG2細胞，B、C、D、E組均接種!fepG2 細胞。待裸鼠適應性生長3天后，在B、C、D、E組裸鼠右前腋下接種IfepG2細胞1 X IO7Cell/ ml，每只注射0. Iml0觀察三天后，再次對B、C、D、E組裸鼠右前腋下相同部位接種IfepG2細胞1\107(^11/!111，每只注射0. 1ml，共給瘤3次，直至實驗組所有裸鼠成瘤率達100%。多功能納米藥物的注射
待每組各只裸鼠的瘤平均大小達到3 5mm以后，分別對裸鼠進行腹腔注射藥物，其中，A組是陰性對照組，沒有接種H印G2細胞，不做任何處理；B組組是陽性對照組，接種 H印G2細胞，只注射生理鹽水(0. Iml/只)；C組為游離藥物組，接種H印G2細胞，并注射游離藥物 Fe304-0A/NIPA-AA(1. 5ng/ 只)+ TNF- α (1. 5ng/ 只)+ IFN- γ (1. 5ng/ 只)+FA (1. 5ng/ 只)+D0XG0ng/只)，注射藥物體積為0. Iml/只；D組為共固定藥物組1，接種HepG2細胞， 注射共固定藥物Fii3O4-OA /NIPA-AA/TNF- α /IFN- y /FA/DOX (藥量以阿霉素量為40ng/只計)，注射藥物體積為0. Iml/只；E組共固定藥物組2，接種HepG2細胞，注射共固定藥物 Fe3O4-OA /NIPA-AA/TNF- α /IFN- y /FA/DOX (藥量以阿霉素量為40ng/只計)，注射藥物體積為0. Iml/只，每隔一天用電吹風對長瘤部位給予加熱處理lOmin，適當控制熱源的位置使腫瘤表面溫度不超過41°C。從第一次給瘤時間開始算起，給藥時間分別為第20天、第23 天、第27天、第30天，共給藥4次。裸鼠一般生物學特征的觀察及記錄
每隔兩天稱量、記錄裸鼠的體重，繪制裸鼠體重變化曲線；用游標卡尺測量、記錄腫瘤最最長徑a (mm)與最短徑b (mm)，同時觀察裸鼠的精神狀態(tài)、活動力、反應及皮下接種區(qū)域外觀及觸感。按公式V= 1/2 (ab2)計算腫瘤體積，以腫瘤體積(mm3)為縱坐標、以時間 (days)為坐標繪制不同藥物處理下的腫瘤生長曲線。血液常規(guī)及病理學檢查
裸鼠在給藥前和給藥兩周后，在A、B、C、D、E組中各取兩只裸鼠從尾部取血并進行血清檢測，比較給藥前后裸鼠體內白細胞、紅細胞、血小板數量的變化。給藥兩周后，處死全部的裸鼠，解剖取出裸鼠的腫瘤、心臟、肝臟組織，分別置于4% 多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察腫瘤組織、心臟、肝臟病理改變。統(tǒng)計學分析
血液常規(guī)檢測及腫瘤組織檢查采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料均以X士S 表示，利用單因素方差分析比較各組數值間的差異，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。在實驗過程中，記錄每組裸鼠死亡時間，繪制裸鼠存活時間曲線。每隔兩天稱量、 記錄裸鼠的體重，并繪制裸鼠體重變化曲線。用游標卡尺測量、記錄腫瘤最最長徑a(mm)與最短徑b(mm)，同時觀察裸鼠的精神狀態(tài)、活動力、反應及皮下接種區(qū)域外觀及觸感。按公式V= 1/2 (ab2)計算腫瘤體積，以腫瘤體積(mm3)為縱坐標、以時間(days)為縱坐標繪制不同藥物處理下的腫瘤生長曲線(圖1(Γ15)。圖10顯示了裸鼠的存活率，最早出現死亡的是生理鹽水組，接著是游離藥物組、 共固定藥物但不給予加熱處理組、固定藥物并加熱處理組。陰性對照組(正常裸鼠組)和給予共固定藥物但不加熱處理組裸鼠的總體存活天數最長，只注射生理鹽水的陽性對照組裸鼠的總體存活天數最短。圖11顯示了各組裸鼠的體重變化曲線，B至F圖分別是正常組、生理鹽水組、游離藥物組、固定藥物非加熱處理組、固定藥物加熱處理組的體重變化曲線圖。給藥時間分別在第20d、23d、27d、30d，幾乎所有組的裸鼠的體重都從第一次給藥后(第20天)呈現明顯下降趨勢，陽性對照組(接種IfepG2細胞，只注射生理鹽水)的裸鼠體重下降最為明顯；其次是共固定藥物并給予加熱處理組裸鼠體重下降比較明顯。圖12顯示的是裸鼠處死前(第36天)從A、B、C、D、E組各取一只具有代表性裸鼠拍攝的圖片及其對應的腫瘤圖片，左圖中箭頭所指位置為瘤的生長部位，右圖中顯示的是與左圖相對應的裸鼠的瘤。從圖中可以看出各組裸鼠的腫瘤均呈不規(guī)則狀，界限清楚， 無明顯周圍組織和皮膚浸潤。而且，B圖生理鹽水組的裸鼠的瘤平均體積最大(195.M mm3士 12. 82mm3)，其次是 D 圖(183. 32mm3士 20. 64mm3)、C 圖(159. 54mm3士 19. 05mm3)，E 圖共固定藥物但不給予加熱處理組裸鼠的瘤的平均體積最小(85. 33mm3士 14. 26mm3)。說明共固定藥物并給予加熱處理組裸鼠在經過藥物治療后，瘤的體積得到明顯下降。圖13顯示的是B、C、D、E組裸鼠從第一次給藥時開始計算的瘤體積大小隨時間的變化曲線。如圖中所示，裸鼠給藥時間為第0天、第3天、第7天、第10天，其中第0天時各組裸鼠移植瘤的平均體積約100mm3。生理鹽水組給藥量為(0.9% NaCl,0. lml/d，共四次)，其他組包括游離和固定藥物組參考臨床上阿霉素給藥標準，給藥量為08.35kg/m2， 0. lml/d，共四次)。四次給藥結束后，注射共固定藥物并給予加熱處理組裸鼠的移植瘤體積明顯下降，而空白組、游離組和沒有給予加熱處理的共固定藥物組的移植瘤仍處于增長趨勢。裸鼠在給藥前和給藥兩周后，在生理鹽水組、游離藥物組、共固定藥物但不給予加熱處理組、共固定藥物且給予加熱處理組中各取兩只裸鼠從尾部取血并進行血清檢測，比較給藥前后裸鼠體內血小板、白細胞、紅細胞數量的變化。圖14所示，給藥前后血小板、白細胞、紅細胞數量均無明顯差異，表明各實驗組藥物對裸鼠都有一定的骨髓抑制，但都沒有明顯的毒副作用。給藥兩周后，處死小鼠，解剖取出裸鼠的腫瘤組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察腫瘤組織病理改變。Fig 15顯示了各組裸鼠的腫瘤組織HE染色的結果，Al、Bi、 Cl、Dl是光學顯微鏡下100倍所觀察到的結果，A2、B2、C2、D2是400倍數下觀察到的結果。 結果顯示生理鹽水組有很明顯的癌巢(Al)和完整的H印G2肝癌細胞，有些甚至是巨核癌細胞。游離組的癌巢并不明顯(Bi)且部分癌細胞呈現出壞死和凋亡(B2)。固定藥物非加熱處理組癌巢跟生理鹽水組相似，有明顯的癌巢(Cl)及較多正常的HEpG2肝癌細胞(C2)。 而固定藥物并給予加熱處理組卻有很多的壞死和凋亡，顯示固定藥物并給予加熱處理組對 HepG2腫瘤的抑制作用最明顯。通過上述實驗可知，本發(fā)明以磁性水凝膠為載體的腫瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)可以裝載阿霉素并靶向運輸至腫瘤細胞周圍并進行有效磁熱控制釋放；以磁性水凝膠為載體的腫瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)(i^e^-OA/NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA/ D0X)對機體具有較小的毒副作用，并且通過腫瘤壞死因子-α、干擾素-Y協(xié)同阿霉素于腫瘤細胞內外的共同作用機制，高效抑制肝癌細胞生長。
權利要求
1.一種腫瘤靶向磁性水凝膠納米遞藥系統(tǒng)，其特征在于所述系統(tǒng)包括磁性水凝膠載體和在其表面接枝的腫瘤壞死因子-α、干擾素-Y和靶向分子配體葉酸，以及吸附的阿霉素；所述磁性水凝膠載體是具有溫度和PH敏感性的水凝膠接枝到油酸包裹的四氧化三鐵納米粒上而得。
2.權利要求1所述腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)的構建方法，其特征在于所述磁性水凝膠載體的制備方法包括如下步驟(1)超順磁性四氧化三鐵納米粒的合成及表面改性稱取i^eSCM·7Η20和i^eC13 ·6Η20， 加入超純水，置于油浴鍋內，通入氮氣保護，60°C下攪拌30min ；取NaOH加入超純水，在60°C 下攪拌使其充分溶解，再將溶解的NaOH加入到鐵鹽溶液中，反應IOmin后，升溫至70°C，然后向其中加入HCl溶液至pH等于3，最后加入油酸，攪拌池后，在磁鐵輔助下用無水乙醇洗滌，再用丙酮洗滌，得到油酸包裹的四氧化三鐵納米粒，將其真空抽干備用；(2)通過微乳液聚合法合成水凝膠取異丙基丙烯酰胺、丙烯酸、亞甲基雙丙烯酸酰胺和十二烷基磺酸鈉，溶于超純水中，室溫下在N2氛圍保護下攪拌20min ；向溶液中加入過硫酸鉀于70°C下聚合反應4h，反應結束后，冷卻至室溫，用透析袋出去未反應完的單體，透析兩周，每兩個小時更換一次新鮮的超純水，最后用真空管冷凍干燥機將其凍干儲存待用；(3)光活性水凝膠的制備稱取水凝膠，溶于pH=7.4的PBS緩沖液中，吸取Iml水凝膠溶液加入到細1含有59. 19mg疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS(pH=7. 4，體積比為 4 :1)溶液中，在冰浴條件下攪拌反應48h，將混合溶液轉移至透析袋純化疊氮苯基衍生物， 透析三天后取出溶液用真空冷凍干燥機凍干，凍干后，向其中加入PBS溶液溶解；(4)磁性水凝膠載體的合成避光條件下，將光活性水凝膠溶于PBS緩沖溶液中，加入油酸改性后的四氧化三鐵納米粒，混合均勻，并用超聲波清洗器分散后轉移至培養(yǎng)皿中，振蕩條件下，于125W紫外燈下IOcm處照射20min ；(5)接枝腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ和靶向分子配體葉酸分別將50μ g的IFN- γ、 TNF-α、FA加入25ml含768μ g N-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，在4°C的條件下攪拌反應48h，合成結束后，分別用超濾離心管在4000rpm/min的轉速下，離心30min 以純化疊氮苯基衍生物，冷凍干燥備用。
3.權利要求1所述腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)在制備治療癌癥的藥物中的應用。
4.根據權利要求3所述腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)的應用，其特征在于將所述腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)溶于PBS緩沖液中，加入阿霉素溶液溶解，冰浴攪拌三天，使腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)充分吸附阿霉素，用于治療癌癥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腫瘤靶向磁性水凝膠納米遞藥系統(tǒng)及其構建方法和應用。本發(fā)明所述腫瘤靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)是通過光化學固定法將具有溫度和pH敏感性的水凝膠接枝到四氧化三鐵納米粒表面形成磁性水凝膠載體，并在其表面接枝腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ和靶向分子配體葉酸，再吸附阿霉素。本發(fā)明所述系統(tǒng)可以利用主動靶向將抗腫瘤藥物運送至腫瘤細胞周圍，腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ與腫瘤細胞表面受體結合并誘導腫瘤細胞程序性死亡，抗腫瘤藥物阿霉素隨載體進入細胞后釋放。實驗證明本發(fā)明所述遞藥系統(tǒng)具有可忽略的毒副作用，并且通過腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ協(xié)同抗腫瘤藥物阿霉素于腫瘤細胞內外的共同作用機制，高效抑制癌細胞生長。
文檔編號A61K38/21GK102228425SQ20111018341
公開日2011年11月2日 申請日期2011年7月1日 優(yōu)先權日2011年7月1日
發(fā)明者關燕清, 劉俊明, 黃崢 申請人:華南師范大學