專利名稱：基質(zhì)金屬蛋白酶-9多肽抑制劑2及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基質(zhì)金屬蛋白酶-9多肽抑制劑2及其應(yīng)用，具體涉及具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9、具有減輕急性炎癥反應(yīng)對機體破壞的多肽。
背景技術(shù)：
膿毒血癥(s印sis) —直是一個嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問題。早期膿毒血癥不經(jīng)過及時有效治療可進(jìn)展為重癥膿毒血癥和膿毒血癥性休克，兩者死亡率分別為20% 30%和40% 70%。醫(yī)學(xué)界一直在研究有效的治療手段，如早期對癥治療、激活蛋白C、皮質(zhì)激素治療等。 近年來隨著醫(yī)學(xué)研究的深入，對膿毒血癥的認(rèn)識和治療取得了很大進(jìn)展。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)在內(nèi)毒素休克中扮演著重要角色?；|(zhì)金屬蛋白酶是一組由20幾種結(jié)構(gòu)相似和功能相關(guān)的蛋白內(nèi)切酶組成。它們可以發(fā)揮正常的生理功能，例如卵細(xì)胞著床，骨骼生長和器官發(fā)育等；這些酶還可以在諸如炎癥，傷口愈合和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮病理作用?；|(zhì)金屬蛋白酶被更多的看作是這些病理過程的調(diào)節(jié)因子。在基質(zhì)金屬蛋白酶家族中有兩種明膠酶，其中，明膠酶A/基質(zhì)金屬蛋白酶-2可在多數(shù)組織細(xì)胞中恒定表達(dá)，以維持組織細(xì)胞的基本功能；而明膠酶B/基質(zhì)金屬蛋白酶-9在TNF-α，IL-6等的細(xì)胞外因素的作用下大量誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)出胞外的基質(zhì)金屬蛋白酶-9的酶活力又可以通過酶原的激活以及活性酶的抑制作用調(diào)節(jié)。中性粒細(xì)胞是循環(huán)系統(tǒng)中最豐富的白細(xì)胞，在機體受到細(xì)菌感染時，中性粒細(xì)胞可迅速作出反應(yīng)，首先進(jìn)入被感染部位，構(gòu)成了機體免疫系統(tǒng)應(yīng)對細(xì)菌感染的第一道防線。 中性粒細(xì)胞的細(xì)胞顆粒中儲存有不同種預(yù)先產(chǎn)生的酶類，包括彈性蛋白酶(elastase)，基質(zhì)金屬蛋白酶-8(MMP-8)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)等?；|(zhì)金屬蛋白酶_8可切割膠原蛋白(collagen)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9可繼續(xù)把變性的膠原蛋白或明膠切割成更小的片段?；|(zhì)金屬蛋白酶-9本身也有切割VI型膠原蛋白的活力，VI型膠原蛋白是血管基底層的主要成分。與其它細(xì)胞不同，中性粒細(xì)胞不表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1 (TIMP-I)。這使得中性粒細(xì)胞在受到諸如LPS，IL-8和PMA等的刺激時，迅速釋放胞內(nèi)顆粒，而釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶類可被同時釋放的有氧自由基激活，在局部具有較高的濃度。這些酶除了具有正常的殺菌功能外，在病理條件下可能會對機體造成很大的破壞。內(nèi)毒素模型就是一個很好的例子，在高劑量靜脈注射LPS后(8mg/kg小鼠)，小鼠循環(huán)系統(tǒng)中的中性粒細(xì)胞可迅速釋放胞內(nèi)顆粒的內(nèi)容物，血液中的基質(zhì)金屬蛋白酶-9的濃度在30分鐘時就可以達(dá)到峰值，其酶活力可以發(fā)揮諸如破壞血管基底層等作用，并推進(jìn)了休克癥狀的發(fā)展。這一點可由基質(zhì)金屬蛋白酶-9缺失(knockout)小鼠對內(nèi)毒素休克的抑制作用證明。所以，基質(zhì)金屬蛋白酶-9可以作為以中性粒細(xì)胞為主的炎癥反應(yīng)的主要靶點?；|(zhì)金屬蛋白酶-9的抑制劑包括大分子和小分子。大分子抑制劑的制備和使用限制了它們的發(fā)展，例如重組人金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制因子-3的體內(nèi)半衰期只有4分鐘。很多成功的小分子抑制劑，例如Marimastat，可以在納摩爾水平上抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活力，但小分子抑制劑缺乏特異性，如果在慢性疾病中長期使用缺乏特異性的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑可產(chǎn)生副作用。因而，從基質(zhì)金屬蛋白酶酶抑制劑的應(yīng)用角度來看，以急性炎癥反應(yīng)作為研究對象是正確的選擇。在急性反應(yīng)期，機體能夠耐受短期的、金屬介質(zhì)蛋白酶-9廣譜抑制劑對正常生理功能的抑制，同時使關(guān)鍵組織器官的生理結(jié)構(gòu)免受破壞，增加了生存幾率。通過化學(xué)方法合成了多肽抑制劑。這條多肽抑制劑可以選擇性的抑制基質(zhì)金屬蛋白酶_8，基質(zhì)金屬蛋白酶-9和腫瘤壞死因子釋放酶的活力，在用內(nèi)毒素模型檢測多肽抑制劑體內(nèi)活力的實驗中，多肽抑制劑能夠使小鼠避過了注射LPS后血液中基質(zhì)金屬蛋白酶-9 的高峰期(30分鐘血液濃度達(dá)到峰值)并抑制了腫瘤壞死因子(TNF-α)的釋放(1小時時血液濃度達(dá)到峰值)，從而有效的保護(hù)了小鼠，度過了急性炎癥反應(yīng)期，增加了小鼠的生存率。目前，國際上開發(fā)出的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑已進(jìn)入II期臨床(多發(fā)性硬化癥， 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)和三期臨床(牙周炎等)。本專利中的五條多肽抑制劑已證明在急性炎癥反應(yīng)中有效，具有在其他炎癥模型中開發(fā)的前景。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明提供全新的序列，該序列基質(zhì)金屬蛋白酶-9抑制劑，對急性炎癥具有很好的療效。技術(shù)方案基質(zhì)金屬蛋白酶-9多肽抑制劑2，其特征在于其序列為 Pro-Arg- (D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu,見 kq NO. 1，其中 Bip 是二苯基丙氨酸，D-Cys 是D-型半胱氨酸?；|(zhì)金屬蛋白酶-9多肽抑制劑2在制備治療抑制急性炎癥藥物中的應(yīng)用。有益效果利用固相合成法化學(xué)合成基質(zhì)金屬蛋白酶-9多肽抑制劑2，該多肽具有全新的序列，該多肽可體外抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9，_8，-3和腫瘤壞死因子釋放酶的酶活力。在內(nèi)毒素休克模型實驗中成功的增加了小鼠的生存率。在急性炎癥反應(yīng)中，中性粒細(xì)胞釋放大量酶和有氧離子，其中包括基質(zhì)金屬蛋白酶-8和基質(zhì)金屬蛋白酶_9，這些酶可以切割并破壞機體組織，造成損傷；單核巨噬細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子釋放酶，這種酶可切割并釋放腫瘤壞死因子，腫瘤壞死因子是炎癥反應(yīng)的核心細(xì)胞因子，有加重炎癥反應(yīng)的作用。我們發(fā)現(xiàn)的多肽抑制劑可以同時抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9，-8和腫瘤壞死因子釋放酶的酶活力，從而減輕了炎癥反應(yīng)，保護(hù)機體并減輕炎癥的破壞作用。


附圖1多肽化學(xué)法合成后用HPLC純化的洗脫曲線。附圖2基質(zhì)金屬蛋白酶-9切割熒光產(chǎn)生多肽的動力學(xué)曲線。附圖3多肽抑制劑對基質(zhì)金屬蛋白酶-8的抑制曲線。附圖4多肽抑制劑對基質(zhì)金屬蛋白酶-9的抑制曲線。附圖5.多肽抑制劑對腫瘤壞死因子釋放酶的抑制曲線。
附圖6.多肽抑制劑對基質(zhì)金屬蛋白酶-3的抑制曲線。附圖7.多肽抑制劑對急性炎癥反應(yīng)的治療作用。
具體實施例方式實施例1多肽的化學(xué)合成方法多肽用Fmoc化學(xué)方法合成。合成反應(yīng)從C端向N端進(jìn)行，Rink介質(zhì)(可在Advanced ChemTech公司購得)上有自由氨基，順序連接Glu，Gly, Arg, Bip, D-Cys, Arg和Pro。每一步連接過程中，氨基酸殘基都要活化，活化混合物中有4倍于介質(zhì)上自由氨基的HBTU， HOBt, DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的連接反應(yīng)之后，都用一個吡啶/醋酸/N-甲基咪唑G 1 0. 的混合物來封閉未連接的自由氨基，封閉反應(yīng)lOmin。每次氨基酸的連接反應(yīng)之后，下一個氨基酸連接之前，都要把介質(zhì)上的Fmoc-基團(tuán)去掉，去Fmoc-基團(tuán)使用含20%哌啶的二甲基甲酰胺，需15分鐘。最后，當(dāng)所有氨基酸殘基順序連接之后，多肽用 98%三氟乙酸從介質(zhì)上切割下來，切割在室溫下進(jìn)行2小時。應(yīng)用上述化學(xué)條件可合成并獲得多肽，序列為 ftx)-Arg-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu，該序列為全新序列。圖1為多肽從介質(zhì)上切割后用 HPLC純化的洗脫曲線。實施例2多肽抑制劑體外對幾種靶點酶(基質(zhì)金屬蛋白酶_3，-8，-9及腫瘤壞死因子釋放酶)的IC5O值。重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-9由Sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá).該酶用0. 01 μ M的基質(zhì)金屬蛋白酶-3活性位點活化，所用的緩沖液為IOOmM Tris/HCl, pH 7. 4, IOOmM NaCl, IOmM CaCl2 and 0.01% Tween-20?；罨瘯r基質(zhì)金屬蛋白酶_9的濃度為92ng/μ 1 (1 μ Μ)。酶活力的檢測是通過切割熒光產(chǎn)生多肽底物Mca-Pr0-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2并檢測產(chǎn)生的熒光值實現(xiàn)的(激發(fā)波長=3^nm，檢測波長= 392nm).所有的檢測在37°C下100 μ 1反應(yīng)體系中進(jìn)行。重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-8的檢測與-9的檢測類似并使用同樣的熒光產(chǎn)生底物。 反應(yīng)也是在37°c下100 μ 1反應(yīng)體系中進(jìn)行。檢測時向反應(yīng)體系中加20 μ 1重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-8(2ng/y 1).底物的終濃度為10 μ M。重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-3用另外一個熒光產(chǎn)生底物Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys (Dnp)-NH2 來檢測(激發(fā)波長=320nm，發(fā)射波長=405nm)。反應(yīng)在 37°C下100 μ 1反應(yīng)體系中進(jìn)行。反應(yīng)開始時向反應(yīng)體系中加10 μ 1基質(zhì)金屬蛋白酶-3存儲液(lng/μ 1)底物的終濃度為10 μ Μ。腫瘤壞死因子釋放酶的活力是通過切割熒光產(chǎn)生底物Mca-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala -Val-Dpa-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-NH 檢測的(激發(fā)波長=320nm，發(fā)射波長=405nm)。反應(yīng)在37°C下100 μ 1反應(yīng)體系中進(jìn)行。反應(yīng)開始時向反應(yīng)體系中加4μ 1基質(zhì)金屬蛋白酶-3 存儲液(lng/μ 1)底物的終濃度為10 μ Μ。實施例3用內(nèi)毒素休克模型檢測多肽抑制劑的體內(nèi)活力
在建立內(nèi)毒素休克模型之前，我們首先測定了 LPS(E. coli 0111 :B4)小白鼠的LD50為50 μ g每只小鼠，在實驗中我們采用了 100 μ g每只小鼠，這樣，對照組的小鼠可全部死亡。在我們前面的科研工作中，發(fā)現(xiàn)Regas印in2(另外一條多肽抑制劑，已公開)可提高C57BL/6小鼠在內(nèi)毒素休克過程中的生存率。為了在我們的小白鼠上建立內(nèi)毒素休克模型，我們用Regas印in2做了一個陽性對照實驗。對照組小鼠注射100 μ g LPS,而Regas印in2實驗組的小鼠在注射LPS 5分鐘之后，每只小鼠再注射0. 7mg的多肽。通過制作Kaplan-Meier生存曲線發(fā)現(xiàn)Regas印in2可有效的保護(hù)注射了 IOOygW 小鼠，提高了生存率(圖7)。成功地在小白鼠上建立內(nèi)毒素休克模型之后，用該模型檢測 Pro-Arg-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu 的體內(nèi)活力。對照組小鼠(12 只)注射 100μ gLPS， 而多肽抑制劑組小鼠(12只)在注射LPS 5min后，每只小鼠注射0.7mg多肽抑制劑。用 Kaplan-Meier生存曲線分析，多肽Pro-Arg- (D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu可有效地保護(hù)小白鼠，提高內(nèi)毒素休克小鼠的生存率。這些數(shù)據(jù)表明，抑制MMP-9和TACE活力可有效提高內(nèi)毒素休克小鼠的生存率。
權(quán)利要求
1.基質(zhì)金屬蛋白酶-9多肽抑制劑2，其特征在于其序列為ftx)-Arg-(D-Cys)-Bip-Arg -Gly-Glu0
2.基質(zhì)金屬蛋白酶-9多肽抑制劑2在制備、治療抑制急性炎癥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9和腫瘤壞死因子釋放酶、具有減輕急性炎癥反應(yīng)對機體破壞的多肽。其序列為Pro-Arg-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu(Bip是二苯基丙氨酸，D-Cys是D-型半胱氨酸)是全新的序列，它們可以在1微摩爾水平上體外抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9和腫瘤壞死因子釋放酶的活力，并在體內(nèi)試驗中增加內(nèi)毒素休克小鼠的生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值。
文檔編號A61K38/08GK102268070SQ20111018284
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者李偉光, 胡加亮, 邱鄭 申請人:中國藥科大學(xué)