專利名稱：重組鼠骨髓瘤細(xì)胞ns0-f10及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗瘤壞死因子的單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病是威脅人類健康的慢性病，由于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎等病致殘的人數(shù)超出交通事故。早期用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀以及維持患者生活質(zhì)量的藥物為非留體類抗炎藥，比如阿司匹林、奈普生和C0X-2抑制劑，這些藥物都可以緩解疼痛和炎癥反應(yīng)。甾體激素也和非留體類抗炎藥聯(lián)合使用已進(jìn)一步減輕炎癥反應(yīng)，這種聯(lián)合治療可以獲得更強(qiáng)的短期抗炎效果，但這種效果隨著時(shí)間推移而逐漸減少直至消失。另一類治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物稱為DMARDS (disease-modifying antirheumatic drugs)，這一類藥物不僅是緩解癥狀，而且可以阻斷疾病的發(fā)展進(jìn)程。最常使用的藥物為甲氨喋呤，其他藥物包括金鹽、抗瘧藥、柳氮磺胺呲啶(Sulphasalazine)、四環(huán)素和環(huán)孢素。盡管甲氨喋呤對(duì)大多數(shù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人都有效，但許多病人無(wú)法耐受該藥的副作用，大約50%的病人最終會(huì)停止使用該藥。這些病人可以使用一些比較新的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，如來(lái)氟米特(Leflimomide，Arava)，但其作用機(jī)制和不良反應(yīng)與甲氨喋呤類似，作為二線治療藥物用于甲氨喋呤無(wú)法耐受或治療失敗的患者。上述提及的都屬于使用多年的老藥，療效確切，使用量大，但由于為非專利藥，價(jià)格低廉，因此銷售額并不高。近幾年開(kāi)發(fā)成功一系列免疫調(diào)節(jié)劑，這些免疫調(diào)節(jié)劑屬專利藥，價(jià)格高，為開(kāi)發(fā)廠家?guī)?lái)了巨額利潤(rùn)。最成功的當(dāng)屬腫瘤壞死因子(TNF)抑制劑，大約 30%中到重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者會(huì)接受TNF抑制劑治療，并且還將往輕到中度患者群滲透。本發(fā)明以人TNF重組蛋白為抗原免疫小鼠，成功獲得多株雜交瘤，能夠分泌中和 TNF生物活性的單克隆抗體，其中一株親和力達(dá)到3nM，生物活性EC50為0. 6nM。這個(gè)抗體已足以作為我們抗體藥物的前體，目前人源化步驟已完成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供分泌特異性結(jié)合人腫瘤壞死因子的單克隆抗體。本發(fā)明所提供的抗體可以為如下1)、2)所述的抗體1) 一種抗體，其重鏈可變區(qū)具有序列表中序列1所示的氨基酸殘基序列，其輕鏈可變區(qū)具有序列表中序列3所示的氨基酸殘基序列。2)由重組鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0-F10分泌得到的單克隆抗體。上述1)中所述抗體的重鏈可變區(qū)的編碼基因和輕鏈可變區(qū)的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種分泌特異性結(jié)合人腫瘤壞死因子α的單克隆抗體的細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)證明重組鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0-F10分泌的單克隆抗體人TNF α的解離常數(shù)為 3ηΜ,生物活性EC50為0. 6ηΜ。上述單克隆抗體能夠高親和力特異性識(shí)別腫瘤壞死因子，并中和其生物學(xué)活性， 可以用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎等自身免疫性疾病。


圖1為ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株3f8分泌的單克隆抗體與人TNF α的解離曲線 (縱坐標(biāo)是ELISA顯色后的光吸收值)圖2為雜交瘤細(xì)胞株3f8生物活性的測(cè)定。關(guān)于保藏的生物材料的說(shuō)明A.生物材料的保藏單位名稱和地址名稱中國(guó)科學(xué)院微生物研究所地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)郵編100101B.交保藏機(jī)構(gòu)A的日期2010 年 05 月 24 日C.保藏機(jī)構(gòu)A給予的保藏號(hào)CGMCC No. 384具體實(shí)施例方式下述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所使用的試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑購(gòu)買。實(shí)施例1、鼠雜交瘤3f8及其分泌的抗腫瘤壞死因子α (TNF α )的單克隆抗體的制備和鑒定一、雜交瘤細(xì)胞株鼠雜交瘤3f8的制備1、抗原的制備人 TNFa 與結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MT)Psts—1 蛋白氨基酸 3沈-344小肽(DQVHFQPLPPAVVKLSDAL)的融合蛋白(TNFa-MT)的獲得將編碼人TNF α的 cDNA與小肽通過(guò)PCR方法重組，得到融合基因TNF a -MT ；將融合基因克隆至刪除了 GST編碼區(qū)的PET-41a載體(N0Vagen，USA)，克隆的質(zhì)粒在DH5a里擴(kuò)增，再經(jīng)由BL21中表達(dá)，得到融合蛋白TNFa。融合蛋白中帶有6Xhis Tag，通過(guò)Ni-NTA親和層析純化。2、免疫以步驟1得到的融合蛋白作為抗原免疫NZB/W Fl小鼠，共免疫三次10微克 TNF α -MT加完全弗氏佐劑皮下免疫(第一次免疫)，14天后5微克HMGBl-MT加不完全弗氏佐劑皮下免疫(第二次免疫)。14天后5微克HMGBl-MT加不完全弗氏佐劑皮下第三次免疫；3天后的NZB/W Fl小鼠取脾中的免疫細(xì)胞與鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞以5 1比例混合， 用聚乙二醇進(jìn)行融合，HAT篩選后得到雜交瘤。3、雜交瘤篩選GST-TNF α重組蛋白的制備將人TNF α的編碼區(qū)(序列如序列表中序列5所示)克隆至PET-41a載體(Novagen, USA)的EcoR I和HindIII酶切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化至DH5 α，抗性篩選得到陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，測(cè)序，結(jié)果質(zhì)粒中TNFa的序列及插入方向正確；將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；純化融合蛋白中帶有GST Tag, 通過(guò)谷胱甘肽親和層析純化，具體步驟是，將誘導(dǎo)后的菌液5000rpm IOmin離心收集，棄上清，用PBS將菌體重懸，超聲破碎，5000rpm離心lOmin，棄沉淀，將上清緩慢通過(guò)谷胱甘肽層析柱(Sigma)，用谷胱甘肽洗脫液將掛在谷胱甘肽層析柱上的融合蛋白洗脫下來(lái)，得到 GST-TNF α重組蛋白。分泌特異性結(jié)合TNF α抗體的雜交瘤檢測(cè)以GST-TNF α重組蛋白(10微克/毫升)作為包被原包板，雜交瘤上清(進(jìn)行梯度稀釋)為一抗，HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG多克隆抗體(R&D Systems)為二抗進(jìn)行ELISA檢測(cè)。亞克隆用限制性稀釋法多次克隆分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，最后獲得雜交瘤細(xì)胞株鼠雜交瘤抗人TNF α雜交瘤細(xì)胞株3f8。4、單克隆抗體的制備(1)腹水的制備方法Balb/C小鼠腹腔注射降植烷0. 5ml/只十天后，將雜交瘤細(xì)胞懸液接種于小鼠腹腔，待小鼠腹腔有明顯腫脹后收集腹水，離心取上清。通過(guò)蛋白A/G親和層析柱(Pierce)純化抗體，0. lMGlycine/HCl (pH2. 5)洗脫(2)體外培養(yǎng)方法將已經(jīng)建立的雜交瘤細(xì)胞3f8置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37°C和5% C02孵箱中培養(yǎng)，每隔2d換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞濃度大于105個(gè)/ml時(shí)停止換液，持續(xù)培養(yǎng)到細(xì)胞全部死亡。1500rpm，離心10分鐘，收集培養(yǎng)上清，上清含有高水平的單克隆抗體，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｋ黾?xì)胞培養(yǎng)基為向DMEM培養(yǎng)基中添加胎牛血清，使胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (體積百分含量)，所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7. 4。純化將體外培養(yǎng)得到的上清進(jìn)行如下純化，將上述上清緩慢通過(guò)蛋白A/G親和層析柱(Pierce)，再用0. IM Glycine/HCl (pH2. 5)將掛在層析柱上的目的蛋白洗脫下來(lái)， 得到純化后的蛋白。5、雜交瘤3f8分泌的抗體的性能檢測(cè)(I)ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株3f8分泌的單克隆抗體與TNF α的解離曲線。實(shí)驗(yàn)方法用TNF α -MT (制備方法見(jiàn)步驟1) (2ug/ml)作為包被抗原，步驟4制備純化的雜交瘤細(xì)胞3f8分泌的單抗作為一抗(以160ug/ml為起始濃度，二倍二倍進(jìn)行稀釋)，羊抗小鼠IgG-HRP (R&D) (1 2000)為二抗進(jìn)行ELISA測(cè)定。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖1所示，ELISA最大讀數(shù)的50%相對(duì)應(yīng)的抗體濃度為抗體的解離常數(shù)。表明雜交瘤細(xì)胞株3f8分泌的單克隆抗體與TNF α的解離常數(shù)為3ηΜ。圖 1的橫坐標(biāo)是雜交瘤細(xì)胞株3f8分泌的單克隆抗體的濃度。(2)抗體亞型鑒別實(shí)驗(yàn)以GST-TNF α重組蛋白(10微克/毫升)包板，雜交瘤上清為一抗，HRP偶聯(lián)的大鼠抗小鼠IgGl，186加，或IgG2b單克隆抗體(BDPharmingen)為二抗進(jìn)行ELISA檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證明雜交瘤細(xì)胞株3f8分泌的單克隆抗體為IgG2b亞型。(3)抗體生物活性的測(cè)定實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖2所示，生物活性EC50為0. 6nM。實(shí)施例2、抗TNF α人源化抗體pCI-DHFRr-gpt_hu3f8的制備
鼠抗體在人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，因此只能用于急癥的治療，一旦人體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)鼠抗體的抗抗體，作為藥物的鼠抗體就會(huì)失效。為了克服這一缺點(diǎn)，本發(fā)明對(duì)鼠抗體進(jìn)行了人源化，制備了人源化抗體ch-TNF α。該抗體的可變區(qū)序列來(lái)自鼠抗體-雜交瘤細(xì)胞株3f8分泌的單克隆抗體，不變區(qū)序列來(lái)自人IgGl。這種抗體保持了鼠單抗的抗原結(jié)合特異性，同時(shí)降低了在人體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)。制備人源化抗體的步驟如下從雜交瘤細(xì)胞株3f8中分離純化mRNA，用oligo-dT合成第一鏈cDNA。用PCR方法分別擴(kuò)增抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)，輕鏈引物為5’GAYATT GTG MTS ACM CARffCT MCA 3’和 5，CTC CAGATG TTAACT GCTCAC 3，；重鏈引物為5，ATG SARGTN MAG CTG SAG SAG TC 3， 和 5，GGTCAA GGT CAC TGG CTC AGG3，。其中，R = G 或 A，Y = T 或 C，M = A 或 C，S = G 或 C，W = T或A，N = G或A或C或T。將PCR產(chǎn)物分別克隆到T載體中測(cè)序。結(jié)果表明雜交瘤細(xì)胞株3f8分泌的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的編碼基因具有序列表中序列6的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列7的氨基酸殘基序列的重鏈可變區(qū)；雜交瘤細(xì)胞株3f8分泌的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的編碼基因具有序列表中序列8的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列9的氨基酸殘基序列的輕鏈可變區(qū)。將得到的抗體重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因人源化，抗體重鏈可變區(qū)的編碼基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列?？贵w輕鏈可變區(qū)的編碼基因具有序列表中序列4的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列。人源化的單克隆抗體3f8的輕鏈可變區(qū)基因與輕鏈載體pCI-gpt的連接用PCR 方法將人源化輕鏈可變區(qū)引入Ml I和)(ba I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，引物為5’ CCC agggtc gac egg aga cat tgt get cac cca gtc tcc age ttc 3'和 5' gaa tttctagaa gac aat agt gaa aaa tta ctt tgc age ate 3’。人源化的單克隆抗體3f8的輕鏈可變區(qū)基因可通過(guò) Sal I和)(ba I兩個(gè)酶切位點(diǎn)插入到載體pCI-gpt中，得到pCI-gpt-hu3f8_VL人源化的單克隆抗體3f8的重鏈可變區(qū)基因與輕鏈載體pCI-DHFRr的連接用 PCR方法將人源化輕鏈可變區(qū)引入Not I和)(ba I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，引物為5’ggtggc ggc cgc aac agg tgc cca ctc cca ggt cca act ggt ccag 3'^P 5'aag ctctag aag aca ata gtg aaa aat tac tta ccg ctt gag gag ac3’。人源化的單克隆抗體3f8的重鏈鏈可變區(qū)基因可通過(guò)I和)(ba I兩個(gè)酶切位點(diǎn)插入到載體pCI-DHFRr中，得到pCI-DHFRr-hu3f8_VH。將pCI-DHFRr-hu3f8-VH中的可變區(qū)部分和不變區(qū)部分用內(nèi)切酶Not I/Xho I切下，插入到pCI-gpt-hu3f8-VL的Not I/Xho I兩個(gè)酶切位點(diǎn)中，從而構(gòu)建出人源化抗體 pCI-DHFRr-gpt-hu3f8。用電轉(zhuǎn)染的方法將含有人源化抗體基因的表達(dá)載體pCI-DHFRr-gpt_hu3f8導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞NS/0(ECACC購(gòu)買)中。用霉酚酸酯(Mycophenolate)在含黃嘌呤 (Xanthine)的培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，記作NS0-F10，保藏在中國(guó)微生物菌種管理委員會(huì)，普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 3846。NS0-F10分泌的單克隆抗體經(jīng)ELISA檢測(cè)，與人TNF-alpha的解離常數(shù)為3nM。細(xì)胞NS/3f8的培養(yǎng)方法用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。序列表
序列 1QvqlvqsgselkkpgasvkisckasgytftnygnmwvrqapgkglewmgwintytgeptyaddfkgrfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycarrrsydydvamdywgqgtIvtvss序列 2Caggtccaactggtccagtctggatctgagctgaagaagcctggagcttctgtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgcggcaggctccaggaaagggtttagagtggatgggctggataaacacctacactggagagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgtcttctctttggatacctctgtcagcactgcctatttgcagatctcgtcgctcaaagctgaggacacagctgtctattactgtgcaagaagaagaagctatgattacgacgtggctatggactactggggtcaaggaaccctagtcaccgtctcctca序列 3DivmtqspdslavslgqratincrasesvdsygnyfmhwyqqkpgqppklliyrasnlesgvpdrfsgsgsgtdftItisslqaedvatyycqqsneepltfgqgtkleikradaa序列 4Gacattgtgatgacccagtctccagattctttggctgtgtctctagggcagagggccaccataaactgcagagccagtgaaagtgttgatagttatggcaattattttatgcactggtatcagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctggggtccctgacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaccattagtagtctgcaggctgaagatgttgcaacctattactgtcaacaaagtaatgaggagcctctcacgttcggccaggggacaaagttggaaataaaacgggctgatgctgca序列 5ctccctcagcaaggacagcagaggaccagctaagagggagagaagcaactacagaccccccctgaaaacaaccctcagacgccacatcccctgacaagctgccaggcaggttctcttcctctcacatactgacccacggctccaccctctctcccctggaaaggacaccatgagcactgaaagcatgatccgggacgtggagctggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctgcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctggcccaggcagtcagatcatcttctcgaaccccgagtgacaagcctgtagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtgaggaggacgaacatccaaccttcccaaacgcctcccctgccccaatccctttattaccccctccttcagacaccctcaacctcttctggctcaaaaagagaattgggggcttagggtcggaacccaagcttagaactttaagcaacaagaccaccacttcgaaacctgggattcaggaatgtgtggcctgcacagtgaagtgctggcaaccactaagaattcaaactggggcctccagaactcactggggcctacagctttgatccctgacatctggaatctggagaccagggagcctttggttctggccagaatgctgcaggacttgagaagacctcacctagaaattgacacaagtggaccttaggccttcctctctccagatgtttccagacttccttgagacacggagcccagccctccccatggagccagctccctctatttatgtttgcacttg
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權(quán)利要求
1.重組鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0-F10CGMCCNo. 3846。
2.重組鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0-F10CGMCCNo. 3846分泌的單克隆抗體及其衍生物，所述單克隆抗體的衍生物為單鏈抗體、Fab片段或人-鼠嵌合抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體及其衍生物，其特征在于所述重組鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0-F10CGMCC No. 3846分泌的單克隆抗體、由所述單克隆抗體衍生的Fab片段或人-鼠嵌合抗體的重鏈可變區(qū)具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列，輕鏈可變區(qū)具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單克隆抗體衍生物，其特征在于由所述單克隆抗體衍生的人-鼠嵌合抗體的輕鏈具有序列表中序列8的氨基酸殘基序列，重鏈具有序列表中序列9 的氨基酸殘基序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體及其衍生物，其特征在于由所述單克隆抗體衍生的單鏈抗體具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列。
6.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體及其衍生物的編碼基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的編碼基因，其特征在于由所述單克隆抗體衍生的人-鼠嵌合抗體的輕鏈編碼基因具有序列表中序列6的核苷酸序列，重鏈編碼基因具有序列表中序列7的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體及其衍生物在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物為治療由人TNF-alpha參與的炎癥反應(yīng)的藥物、由人TNF-alpha參與的自身免疫性疾病或器官損傷性疾病的藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述炎癥反應(yīng)為敗血癥，全身炎癥反應(yīng)綜合癥或急性肺損傷；所述自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病或紅斑狼瘡；所述器官損傷性疾病為心肌梗塞，腦梗，藥物性或病毒性肝損傷。
10.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體及其衍生物在檢驗(yàn)人TNF-alpha中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了重組鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0-F10及其應(yīng)用。一種抗體，其重鏈可變區(qū)具有序列表中序列1所示的氨基酸殘基序列，其輕鏈可變區(qū)具有序列表中序列3所示的氨基酸殘基序列。實(shí)驗(yàn)證明重組鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0-F10分泌的單克隆抗體與人TNFα的解離常數(shù)分別為3nM，生物活性EC50為0.6nM。上述單克隆抗體及其衍生物能夠高親和力特異性識(shí)別腫瘤壞死因子α，并中和其生物學(xué)活性，可以用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎等自身免疫性疾病。
文檔編號(hào)A61P29/00GK102260648SQ20111014039
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者周洪哲, 唐捷, 杭海英, 王云波, 賈俊英 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所