表達(dá)hTERT基因的重組非增殖型腺病毒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種表達(dá)hTERT基因的重組非增殖型腺病毒。是從質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT中酶切獲得目的基因hTERT，插入pSG218穿梭載體中巨細(xì)胞病毒啟動子的下游，得到攜帶hTERT基因的重組穿梭載體，再將該重組穿梭載體與病毒骨架載體pPE3-F11B共轉(zhuǎn)染至人胚腎293細(xì)胞，得到攜帶hTERT的非增殖型腺病毒。用該重組腺病毒感染人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，可以使細(xì)胞過度表達(dá)hTERT基因，增強(qiáng)細(xì)胞對表阿霉素的耐藥。本發(fā)明的主要用途是建立過表達(dá)hTERT基因的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株模型，并在此模型上進(jìn)一步研究hTERT基因參與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制。
【專利說明】表達(dá)hTERT基因的重組非增殖型腺病毒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種表達(dá)hTERT基因的重組腺病毒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]端粒(telomere)是真核生物染色體末端的特殊帽狀結(jié)構(gòu)，隨著每次染色體的分裂而縮短，當(dāng)其長度達(dá)到臨界狀態(tài)是即誘發(fā)細(xì)胞衰老與死亡。人類端粒酶(telomerase)的主要作用是以自身RNA亞基(TERC)為模板，利用其逆轉(zhuǎn)錄酶亞基(hTERT)逆轉(zhuǎn)錄合成端粒重復(fù)序列(TTAGGG)并添加于染色體末端，從而維持端粒長度的穩(wěn)定。hTERT是端粒酶活性的主要限速酶，在絕大多數(shù)的惡性腫瘤細(xì)胞中被激活，使細(xì)胞獲得永生化能力；此外，hTERT的激活還能通過多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對化療藥物、氧化損傷以及電離輻射的抵抗性。研究端粒酶功能的手段之一是通過構(gòu)建合適的載體導(dǎo)入外源性hTERT基因，導(dǎo)致hTERT在細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)。
[0003]端粒酶在多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤等人類淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤中同樣被激活。這類惡性疾病目前面臨的主要問題是無法徹底治愈。目前，hTERT基因表達(dá)變化對細(xì)胞內(nèi)信號通路與基因表達(dá)的影響，并不明確。調(diào)節(jié)hTERT基因的表達(dá)可能有助于找到治療上述疾病的新途徑；而且hTERT作為腫瘤通用抗原，本身也是理想的腫瘤治療靶點(diǎn)。構(gòu)建高效的負(fù)載hTERT基因的載體是進(jìn)行上述研究的重要前提。
[0004]腺病毒表達(dá)載體具有一系列獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):1.與人類基因同源，因而目的蛋白的表達(dá)水平高，功能完全；2.腺病毒基因不會與宿主染色體基因整合，因而不會影響宿主結(jié)構(gòu)基因的正常表達(dá)，也不會導(dǎo)致插入性突變，從而使目的基因準(zhǔn)確表達(dá)；3.可以插入較大的外源基因片段(8.5kB) ;4.感染效率高，對增殖細(xì)胞與非增殖細(xì)胞均有感染力；4.腺病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核的效率高達(dá)40% ;5.安全性好，對人的致病力與致突變力低。由于腺病毒載體在人類細(xì)胞上進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移與蛋白表達(dá)的高效性，因此成為當(dāng)今使用最多的病毒載體之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種表達(dá)hTERT基因的重組非增殖型腺病毒，先用內(nèi)切酶 EcoR I 從質(zhì)粒 pIRES2-EGFP-hTERT 中酶切獲得目的基因 hTERT(SEQ ID N0.l,4015bp),插入質(zhì)粒PSG218 (3926bp)中巨細(xì)胞病毒啟動子的下游的EcoR I (1008)酶切位點(diǎn)，得到攜帶hTERT基因的重組腺病毒質(zhì)粒pDC318-hTERT(7941bp)，再將該重組腺病毒載體與病毒骨架載體PPE3-F11B用脂質(zhì)體介導(dǎo)法共轉(zhuǎn)染至人胚腎293細(xì)胞(HEK細(xì)胞)進(jìn)行包裝，得到攜帶hTERT的重組非增殖型腺病毒VDC318-hTERT，hTERT基因插入pSG218穿梭載體后，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌為E.coli DH5 α，隨后在該細(xì)菌內(nèi)重組、擴(kuò)增。
[0006]所述攜帶hTERT基因的腺病毒表達(dá)載體命名為pDC318_hTERT。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述一種表達(dá)hTERT基因的重組非增殖型腺病毒在hTERT基因過表達(dá)研究中的應(yīng)用。該重組腺病毒感染靶細(xì)胞后可以使靶細(xì)胞過度表達(dá)hTERT基因，可用于進(jìn)一步研究hTERT基因介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥及其機(jī)制的研究。
[0008]本發(fā)明公開的攜帶hTERT基因的重組非增殖型腺病毒VDC318_hTERT，可高效感染人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株，并在細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)hTERT基因。本發(fā)明的主要用途是建立了過表達(dá)hTERT基因的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株模型，并在此模型上進(jìn)一步研究hTERT基因參與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)證明，受本發(fā)明的攜帶hTERT基因的重組非增殖型腺病毒VDC318-hTERT體外感染的人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPM1-8226，可分別在基因水平和蛋白水平檢測到hTERT的表達(dá)上調(diào)；并且，上調(diào)hTERT基因表達(dá)后，RPM1-8226細(xì)胞對表阿霉素的抗藥性顯著增強(qiáng)。
[0009]所述受本發(fā)明的重組腺病毒VDC318-hTERT感染的過表達(dá)hTERT的RPM1-8226骨髓瘤細(xì)胞模型也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為pDC318-hTERT載體酶切鑒定電泳圖；將hTERT基因插入pSG218穿梭載體中巨細(xì)胞病毒啟動子的下游，得到攜帶hTERT基因的重組穿梭載體的酶切鑒定結(jié)果。圖中Ml 為 ADNA/EcoRI+Hindlll marker, M2 為 lOObpDNALadder，泳道 I 為 BamH I 單酶切獲得1519bp + 6422bp 片段，泳道 2 為 Kpn I + Sac I 酶切獲得 1431bp + 2465bp + 4045bp 片段，泳道 3 為 Pvu II 單酶切獲得 330bp + 441bp + 526bp + IlOObp + 1515bp + 4029bp片段，泳道 4 為 Pst I 單酶切獲得 30bp + 185bp + 496bp + 825bp + 1260bp + 5145bp 片段。
[0011]圖2為通過PCR擴(kuò)增11型Fiber鑒定重組腺病毒VDC318-hTERT的結(jié)果；PCR產(chǎn)物長度731bp。其 中M為IOObp DNA Ladder ；N為陰性對照；P為陽性對照(上述已構(gòu)建的pDC318-hTERT質(zhì)粒)；1_3分別為包裝好的1_3號病毒樣本，目標(biāo)條帶731bp。
[0012]圖3為通過PCR擴(kuò)增hTERT鑒定重組腺病毒VDC318_hTERT的結(jié)果；PCR產(chǎn)物長度1085bp。其中M為IOObp DNA Ladder ;N為陰性對照；P為陽性對照(上述已構(gòu)建的pDC318-hTERT質(zhì)粒)；1_3分別為包裝好的1_3號病毒樣本；目標(biāo)條帶1085bp。
[0013]圖4為不同MOI值的重組腺病毒VDC318-hTERT對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPM1-8226活力的影響。用MOI值為0，2，10,50的VDC318-hTERT腺病毒數(shù)轉(zhuǎn)染RPM1-8226細(xì)胞24及48小時(shí)后用MTT法檢測細(xì)胞活力。
[0014]圖5A為重組腺病毒VDC318-hTERT轉(zhuǎn)染RPM1-8226細(xì)胞的hTERT表達(dá)上調(diào)的RT-PCR鑒定結(jié)果。轉(zhuǎn)染后擴(kuò)增hTERT基因，產(chǎn)物長度304bp。
[0015]圖5B為重組腺病毒VDC318-hTERT轉(zhuǎn)染RPM1-8226細(xì)胞的hTERT表達(dá)上調(diào)的RT-PCR鑒定結(jié)果。轉(zhuǎn)染后擴(kuò)增hTERT基因，產(chǎn)物長度196bp。
[0016]圖6為重組腺病毒VDC318-hTERT轉(zhuǎn)染RPM1-8226細(xì)胞的hTERT表達(dá)上調(diào)的Western Blot鑒定結(jié)果。
[0017]圖7為MTT法檢測重組腺病毒VDC318-hTERT轉(zhuǎn)染RPM1-8226細(xì)胞對表阿霉素抗藥性增強(qiáng)的鑒定結(jié)果。其中A.用不同濃度的表阿霉素處理24小時(shí)后，8226-hTERT細(xì)胞株的細(xì)胞活力顯著高于對照細(xì)胞株用不同濃度的表阿霉素處理48小時(shí)后，8226-hTERT細(xì)胞株的細(xì)胞活力顯著高于對照細(xì)胞株；C.8226-hTERT細(xì)胞株對表阿霉素的24小時(shí)IC50值較對照細(xì)胞提高55.06% ；48小時(shí)IC50值較對照細(xì)胞提高59.31%。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0019]下述實(shí)施例中所用方法如無特殊說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《MolecularCloning: A Laboratory Manual)) (Sambrook, J., Russell, David ff., MolecularCloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0020]所述百分比濃度如無特殊說明均為質(zhì)量/體積百分比濃度(W/V)或體積/體積百分比濃度(V/V)。
[0021 ] 所用引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。
[0022]實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá)到具體公開的目的，不應(yīng)成為對本發(fā)明生物材料來源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律或道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提示替換使用。
[0023]實(shí)施例1構(gòu)建攜帶hTERT基因的重組質(zhì)粒pDC318_hTERT。
[0024]取本實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的質(zhì)粒pIRES2-EGFP_hTERT，用內(nèi)切酶EcoR I內(nèi)切，回收4015bp處條帶(hTERT基因 )。取pSG218載體，用內(nèi)切酶EcoR I內(nèi)切，回收3926bp處條帶。將上述兩種酶切回收產(chǎn)物12°C連接12小時(shí)。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，鋪瓊脂板(含100ug/ml AMP)后培養(yǎng)12小時(shí)，挑克隆，37°C搖床擴(kuò)增12小時(shí)。抽提陽性克隆的質(zhì)粒DNA，分別用BamH I,Kpn I +Sac 1.Pvu IKPst I進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖1所示(Ml 為 ADNA/EcoRI+Hindlll marker,M2 為 IOObpDNALadder，泳道 I 為 BamH I 單酶切獲得 1519bp + 6422bp 片段，泳道 2 為 Kpn I + Sac I 酶切獲得 1431bp + 2465bp + 4045bp片段，泳道 3 為 Pvu II 單酶切獲得 330bp + 441bp + 526bp + IlOObp + 1515bp + 4029bp片段，泳道 4 為 Pst I 單酶切獲得 30bp + 185bp + 496bp + 825bp + 1260bp + 5145bp 片段)。構(gòu)津的重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，即目的基因hTERT (4015bp) (SEQ IDN0.1)插入質(zhì)粒DSG218 (3926bp)中巨細(xì)朐病毒(CMV)啟動子下游的EcoR I (1008)酶切位點(diǎn)，得到檇帶hTERT某閔的重纟目質(zhì)粒(794IbD),命名為pDC318-hTERT。
[0025]實(shí)施例2脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pDC318-hTERT與腺病毒骨架載體PPE3_F11B共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，以及重組病毒的鑒定、擴(kuò)增與滴度測定。
[0026]一、脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pDC318_hTERT與腺病毒骨架載體PPE3_F11B共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝
在轉(zhuǎn)染前一天，在60mm平皿中接種7.5 X IO5個(gè)人胚腎293細(xì)胞，置于37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前3-4小時(shí)進(jìn)行全量換液，加入5ml無血清培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞呈指數(shù)生長。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染實(shí)施例1獲得的重組質(zhì)粒pDC318-hTERT、病毒骨架載體質(zhì)粒PPE3-F11B和脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (購自Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(具體步驟省略)，培養(yǎng)
7-14天后出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化后收集細(xì)胞，于-80°C和37°C之間反復(fù)凍融3次，然后4°C、5000rpm離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片，將包裝好的腺病毒顆粒分裝后_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027]二、重組腺病毒的鑒定1.應(yīng)用QIAGEN DNA Blood Mini Kit (購自QIAGEN公司)提取重組腺病毒DNA。具體步驟略。
[0028]2.用 PCR 擴(kuò)增 11 型 Fiber，上游引物序列為:5’ -CAACCACAGGCGGATCTCTAC-3’ (SEQ ID N0.2)，下游引物序列為:5’ -GTTCCAGGACCAAGTTATACG-3’ ( SEQ ID N0.3)。反應(yīng)條件為:95°C 3 分鐘，(95°C 40 秒，48°C 40 秒，72°C 60 秒)X35 cycles，72°C終末延長 10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示(M為IOObp DNA Ladder [NEB公司];N為陰性對照；P為陽性對照[上述已構(gòu)建的pDC318-hTERT質(zhì)粒];1_3分別為包裝好的1-3號病毒樣本)，檢出731bp目標(biāo)條帶，與陽性對照一致。
[0029]3.用hTERT特異性引物I擴(kuò)增hTERT，上游引物序列為:5’ -TCCTGCACTGGCTGATGAGTG -3’ ( SEQ ID N0.4),下游引物序列為:5’-CACCACTGTCTTCCGCAAGTTC-3’ ( SEQ ID N0.5)。反應(yīng)條件為:95°C 3 分鐘，(95°C 40秒，56°C 40秒，72°C 80秒)X 35 cycles，72°C終末延長10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如 圖3所示(M為IOObp DNA Ladder [NEB公司];N為陰性對照；P為陽性對照[上述已構(gòu)建的pDC318-hTERT質(zhì)粒];1_3分別為包裝好的1_3號病毒樣本)，檢出1085bp目標(biāo)條帶，與陽性對照一致。
[0030]綜上所述，所得重組非增殖型腺病毒鑒定正確，命名為VDC318_hTERT。
[0031]三、重組腺病毒的擴(kuò)增、純化及滴度測定
將人胚腎293細(xì)胞接種于75cm2培養(yǎng)瓶，加入20ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，至80-90%的細(xì)胞融合度時(shí)，換成含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基15ml。取0.5ul經(jīng)病毒空斑純化獲得的、鑒定正確的病毒保存液，小心加入培養(yǎng)瓶，十字形慢慢晃動3次。在37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后收集病毒上清或細(xì)胞沉淀，沉淀細(xì)胞加AD buffer保存液，-80°C至37°C凍融3次，600g離心20分鐘后去沉淀取上清。按上述步驟反復(fù)擴(kuò)增至需要的病毒量。然后HPLC法病毒純化。用50%組織培養(yǎng)感染劑量法測定病毒滴度為3.5 X IO9 PFU/ml。
[0032]實(shí)施例3檢測重組腺病毒VDC318_hTERT體外轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率以及表達(dá)情況。
[0033]以人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPM1-8226為例，檢測本發(fā)明重組腺病毒VDC318_hTERT體外轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞后hTERT基因的表達(dá)鑒定，具體檢測方法如下:
一、人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPM1-8226的培養(yǎng)
從液氮罐中取出凍存的RPM1-8226細(xì)胞株，37 V水浴融化后加入含10%FBS的RPM1-1640培養(yǎng)基，置于37 °C, 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)，1000rpm離心5分鐘，用含10%FBS的RPM1-1640培養(yǎng)基全量換液以去除防凍劑DMS0。置于37°C，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，1-2天傳代或半量換液一次。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
[0034]二、MOI值的估算:準(zhǔn)備一塊潔凈的6孔板，每孔接種2 X IO5個(gè)人胚腎293細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后，各孔分別加入0.25ul、0.5ul、lul、2ul、4ul上述實(shí)施例2中已測定滴度的重組腺病毒VDC318-hTERT，剩余I孔作空白對照。培養(yǎng)72小時(shí)后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)加入Iul病毒的孔發(fā)生完全CPE，根據(jù)表1的公式計(jì)算MOI值。
【權(quán)利要求】
1.一種表達(dá)hTERT基因的重組非增殖型腺病毒，其特征在于，通過以下步驟獲得:先用內(nèi)切酶EcoR I從質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT中酶切獲得SEQ ID N0.1的目的基因hTERT，插入質(zhì)粒PSG218中巨細(xì)胞病毒啟動子的下游的EcoR I酶切位點(diǎn)，得到攜帶hTERT基因的重組腺病毒質(zhì)粒pDC318-hTERT，再將該重組腺病毒載體與病毒骨架載體PPE3_F11B用脂質(zhì)體介導(dǎo)法共轉(zhuǎn)染至人胚腎293細(xì)胞，得到攜帶hTERT的重組非增殖型腺病毒VDC318-hTERT，其中hTERT基因插入pSG218后，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌為萬.coli DH5 α，隨后在該細(xì)菌內(nèi)重組、擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)hTERT基因的重組非增殖型腺病毒，其特征在于，hTERT基因插入pSG218穿梭載體后，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌為萬.coli DH5 α，隨后在該細(xì)菌內(nèi)重組、擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)hTERT基因的重組非增殖型腺病毒，其特征在于，所述攜帶hTERT基因的腺病毒表達(dá)載體命名為pDC318-hTERT。
4.權(quán)利要求1所 述的一種表達(dá)hTERT基因的重組非增殖型腺病毒在hTERT基因過表達(dá)研究中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/861GK103952380SQ201410194781
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月10日
【發(fā)明者】張?jiān)椒? 金潔 申請人:浙江大學(xué)