專利名稱：一種抗血管內皮細胞生長因子受體2/抗cd3雙特異單鏈抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因工程雙特異抗體，具體地說涉及一種抗血管內皮細胞生長因子受體2/抗CD3雙特異單鏈抗體。本發(fā)明還涉及編碼所述雙特異抗體的核苷酸序列以及含有所述核苷酸序列的載體，用所述載體轉染的宿主細胞
背景技術：
雙特異單鏈抗體(bispecificsingle-chain antibody，bsc-Ab)具有兩條抗原結合臂，可同時結合效應細胞和靶細胞表面的觸發(fā)因子，從而激活靜止狀態(tài)的效應細胞并募集到靶細胞周圍，介導靶細胞的裂解。通常介導的效應細胞主要是T細胞，其主要功能是識別并迅速地破壞病變細胞或組織。T細胞的激活是發(fā)揮細胞殺傷作用的根本前提。CD3分子是廣泛分布于成熟T細胞表面的膜抗原，與T細胞表面膜受體形成復合物，在抗原識別和細胞內信息傳遞中起著重要作用?？笴D3/抗腫瘤細胞表面抗原組成的bsc-Ab可以激活靜態(tài)的T細胞，在T細胞和靶細胞之間形成一個免疫連接，可以引發(fā)T細胞殺傷和裂解腫瘤細胞。例如，Bargou等構建的抗⑶19X⑶3雙特異單鏈抗體(MT103)能夠將病人體內的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)富集至腫瘤細胞，并激活他們溶解靶細胞，低給藥劑量即可清除非霍杰金淋巴瘤患者血液中的靶細胞，為惡性腫瘤的治愈帶來希望。相對于完整抗體，bsc-Ab具有諸多優(yōu)點，能夠充分挖掘人體內豐富的細胞毒性T 細胞(CTL)的腫瘤殺傷效應，分子量小、免疫原性小、體內半衰期短，且易穿透致密的腫瘤屏障，進入實體瘤周圍的微循環(huán)，缺乏Fc段，去除Fc介導的受體結合，使得其快速地向腫瘤集中，對靶細胞進行特異殺傷，在腫瘤的生物治療中有良好的臨床應用前景。血管內皮細胞生長因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)及其受體(VEGFR)在腫瘤的生長和轉移中起關鍵性作用，可以通過阻斷VEGF/VEGFR信號傳導通路來控制腫瘤生長,達到治療腫瘤的目的。VEGFR2 (VascularEndothelial Growth Factor Receptor 2，血管內皮細胞生長因子受體2)作為目前研究較為明確的VEGF受體之一，大量研究結果表明VEGFR2不僅在腫瘤血管內皮細胞中過表達，而且一些腫瘤細胞自身也表達VEGFR2，例如白血病和黑色素瘤，在介導內皮細胞增殖、遷移、分化、微管形成及血管通透性增加等一系列生物學活性中發(fā)揮著重要作用，可以通過封閉血管內皮細胞生長因子受體 2抑制腫瘤生長。近年來以VEGFR2為靶分子的抗腫瘤新藥研發(fā)取得了很大進展，尤其是抗 VEGFR2單克隆抗體。例如，美國ImClone公司開發(fā)的人源化抗VEGFR2抗體IMC-1121B，能夠抑制VEGF對VEGFR2的激活，針對乳腺癌的治療現(xiàn)已進入III期臨床試驗。但是該抗體不能激活機體T淋巴細胞的免疫殺傷作用，從而喪失了機體對腫瘤的殺傷效果?？筕EGFR2/ 抗⑶3 (bscVEGFR2 X⑶3)雙特異單鏈抗體也許可以有效激活靜止狀態(tài)的T細胞殺傷腫瘤細胞，改善人源化抗VEGFR2抗體的抗腫瘤效果。針對VEGFR2抗原的雙特異單鏈抗體國內外未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是 用基因工程技術開發(fā)一種表達效率高、活性好的抗 VEGFR2/抗CD3雙特異單鏈抗體。本發(fā)明的抗VEGFR2/抗⑶3雙特異單鏈抗體是由抗人VEGFR2單鏈抗體和抗人 CD3單鏈抗體連接而成的，可以同時發(fā)揮抗VEGFR2抗體和抗CD3抗體的作用，能同時結合 VEGFR2陽性細胞和CD3陽性細胞；本發(fā)明的抗VEGFR2/抗CD3雙特異單鏈抗體中，兩個單鏈抗體采用柔性短肽 Gly4Ser連接，單鏈抗體可變區(qū)采用柔性短肽(Gly4Ser) 3連接，其中絲氨酸Ser是親水性最強的氨基酸，可增加連接肽的親水性，甘氨酸Gly是分子量最小，側鏈最短的氨基酸，可增加側鏈的柔性，并且能夠減少抗原性，連接肽Gly4-Ser和(Gly4-Ser) 3能保持雙特異抗體分子的柔韌性及分子的正確折疊；本發(fā)明的抗VEGFR2/抗⑶3雙特異單鏈抗體中，功能域的排列順序為VLvkfk2- (Gly 4Ser) 3-VHVEGFE2-Gly4Ser-VHCD3- (Gly4Ser) 3_VLCD3 ；其中VLvkfk2表示抗人血管內皮細胞生長因子受體2單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)；其中VHvkfk2表示抗人血管內皮細胞生長因子受體2單鏈抗體的重鏈可變區(qū)；其中VHera表示抗人⑶3單鏈抗體的重鏈可變區(qū)；其中VLm3表示抗人⑶3單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)；本發(fā)明的抗VEGFR2/抗CD3雙特異單鏈抗體中，抗人VEGFR2單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)具有序列表SEQ ID NO 1所示氨基酸序列；本發(fā)明的抗VEGFR2/抗CD3雙特異單鏈抗體中，抗人血管內皮細胞生長因子受體 2單鏈抗體的重鏈可變區(qū)具有序列表SEQ ID NO 2所示氨基酸序列；本發(fā)明的抗VEGFR2/抗CD3雙特異單鏈抗體中，抗人CD3單鏈抗體的重鏈可變區(qū)具有序列表SEQ ID NO 3所示氨基酸序列；本發(fā)明的抗VEGFR2/抗CD3雙特異單鏈抗體中，抗人CD3單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)具有序列表SEQ ID NO 4所示氨基酸序列；本發(fā)明的抗VEGFR2/抗⑶3雙特異單鏈抗體中連有分泌信號肽；本發(fā)明的抗VEGFR2/抗⑶3雙特異單鏈抗體中的分泌信號肽具有如SEQID NO 5 所示氨基酸序列；本發(fā)明提供一種編碼以上所述bsc-Ab的核苷酸序列；本發(fā)明提供一種含有所述核苷酸序列的載體，所述載體為真核表達載體 pcDNA3. l(+),pcDNA3. 1的選擇標記基因neo前為弱啟動子，目的基因前為強啟動子CMV，所以下游neo基因表達量遠遠低于上游bscVEGFR2X⑶3的表達量。neo基因編碼的磷酸轉移酶能使G418失活，當細胞表達了這種neo抗性基因以后就會在含有G418的選擇培養(yǎng)基中存活；本發(fā)明提供一種所述表達載體轉染的宿主細胞，所述細胞為CHO-Kl細胞，CHO具有一套完整的合成、組裝和分泌蛋白質的細胞裝置，因此，產(chǎn)生的抗體分子能維持正確的蛋白構象以及翻譯后糖基化加工，成為功能性抗體分子，并分泌到細胞外，便于分離純化；本發(fā)明提供一種制備所述bsc-Ab的方法，包括轉染宿主細胞、篩選及培養(yǎng)穩(wěn)定高效表達bsc-Ab的宿主細胞并從培養(yǎng)物中分離所述的bsc-Ab。
本發(fā)明與現(xiàn)有針對VEGFR2抗原的其他形式的抗體相比有以下優(yōu)點抗VEGFR2/ 抗CD3雙特異單鏈抗體，可以同時發(fā)揮抗VEGFR2抗體和抗CD3抗體的作用，可以同時結合 VEGFR2陽性細胞和CD3陽性細胞，可引導T細胞募集在靶細胞周圍，為進一步細胞毒性實驗和體內實驗奠定基礎；利用中國倉鼠細胞表達的重組bsc-Ab，產(chǎn)量高，活性好，適合進行產(chǎn)業(yè)化。抗VEGFR2/抗CD3雙特異單鏈抗體分子量小、免疫原性小、且易穿透致密的腫瘤屏障，進入實體瘤周圍的微循環(huán)，在制備腫瘤治療藥物中具有應用前景


圖1為bscVEGFR2 X⑶3基因片段的設計和表達載體的構建；圖2為直接競爭ELISA法篩選表達bscVEGFR2XCD3的陽性克隆株；圖 3 為純化 bscVEGFR2XCD3 的 SDS-PAGE (泳道 1)和 Western blot 結果(泳道 2)；圖 4 為 FCM 分析 bscVEGFR2XCD3 與 VEGFR2+ 細胞系 A375 (A)、CD3+ 細胞系 Jurkat⑶、VEGFR2和CD3雙陰性細胞系K562 (C)的結合活性。
具體實施例方式1、bscVEGFR2XCD3基因片段的設計和表達載體的構建根據(jù)VLVKFK2、VHvegfe2, VHCD3> VLcd3的氨基酸序列和功能域的排列順序VLvkfk2- (Gly4 Ser) 3-VHVEGFE2-Gly4Ser-VHCD3- (Gly4Ser) 3_VLCD3。在序列的 5，端依次添加 Hindi11 酶切位點、 KOZAK序列和分泌信號肽序列，在起始密碼子ATG前設計KOZAK序列GCCACCATG，可提高翻譯的起始效率，在ATG后加入分泌信號肽序列(SEQ ID NO :5)，以利于在哺乳動物細胞中分泌表達。在序列的3’端依次添加六個組氨酸標簽和EcoR I酶切位點，組氨酸標簽便于重組雙特異抗體的純化和鑒定。bscVEGFR2X⑶3的全基因序列示意圖為=KOZAK-Secretary signal sequence-VLVEGFE2- (Gly4Ser) 3~VHVEGFE2-Gy4Ser-VHCD3- (Gly4Ser) 3~VLCD3- (His) 6。 參照哺乳動物細胞常用密碼子，使用OptimumGene 軟件對設計的bsc_Ab基因片段進行密碼子優(yōu)化，編碼雙特異單鏈抗體的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。由公司合成編碼 bscVEGFR2XCD3的全基因序列(共1548bp)并用Hind III/EcoR I亞克隆入真核表達載體 pcDNA3. 1 (+)，命名為 pcDNA3. Ι/bsc-Ab (圖 1)。pcDNA3. 1/bsc-Ab 轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 α，挑取陽性克隆菌落進行測序分析。2、bscVEGFR2 X CD3在CHO細胞中的穩(wěn)定表達 將測序正確的pcDNA3. Ι/bsc-Ab菌液擴大培養(yǎng)，取過夜培養(yǎng)菌液150ml提取純化 pcDNA3. Ι/bsc-Ab,提取的 pcDNA3. 1/bsc-Ab 濃度為 730mg/L，使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)轉染pcDNA3. 1/bsc-Ab至CHO細胞中，同時設立轉染空載體 pcDNA3. 1的CHO細胞為對照組，用濃度為800mg/L的G418加壓篩選兩周，待陽性克隆長出后，以有限稀釋法進行克隆化，取96孔板中CHO細胞培養(yǎng)上清于1. 5mL離心管中，1500r/ min離心lOmin，取100 μ L上述的培養(yǎng)上清，以轉染空載體的CHO細胞培養(yǎng)上清為陰性對照組，以帶His標簽的⑶20重組蛋白為陽性對照組，包被酶標板，4°C孵育過夜，含0. 5mL/ LTween20的磷酸鹽緩沖液(PBST)，洗滌后加入200 1 30g/L牛血清白蛋白(BSA)封閉 2h，PBST洗滌后加入100 1鼠抗His-tag mAb (濃度為lmg/L)，37°C反應lh，PBST洗滌5次，加入100 1 HRP標記羊 抗鼠IgG多克隆抗體后PBST洗滌，TMB顯色，酶標儀測A450 吸光度值。篩選到6株高效分泌表達bsc-Ab的克隆株(圖2)，分別命名為18D11、18E11、 12G11、1A4、24E10、24D8。取成功篩選的單克隆細胞株各2X 106個細胞置于25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞長至80%匯合度，換成無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)3d，取細胞培養(yǎng)的上清液，以轉染空載體的CHO細胞上清液為陰性對照，ELISA法檢測bsc-Ab的分泌量，18D11分泌量最高，為2. 5mg/L。3、bscVEGFR2 X CD3 的純化18D11細胞株細胞調整濃度為106/ml傳至75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞長至80% 匯合度，換成無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)3d，收集約IL無血清上清液，5000r/min, 4°C離心 30min，取離心后的上清超濾濃縮至15ml，采用NI-NTA柱分離純化，用咪唑濃度為500mmol/ L的洗脫液洗脫目的蛋白，收集的洗脫液行12% (V/V)的SDS-PAGE蛋白電泳，可見在軋約為56000的區(qū)域出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，與bsc-Ab的Mr —致，純度達到90%，Western-blot 分析，證明Anti-His抗體能與這條蛋白條帶發(fā)生特異性結合，說明洗脫液中包含目的蛋白 (圖3)。收集特定蛋白的洗脫液，置于PBS中4°C透析過夜后，BCA法測得的蛋白濃度為 1.59g/L，為以后的體內外實驗創(chuàng)造了條件。4、純化bscVEGFR2 X CD3生物學活性的初步分析生長狀態(tài)良好的Jurkat (CD3陽性細胞系)、A375 (VEGFR2陽性細胞系)、K562 (CD3 和VEGFR2雙陰性細胞系)，經(jīng)PBS洗滌后，IO6個細胞重懸于PBS (含3%胎牛血清和0. 1 % 疊氮鈉)中，4°C孵育30min，PBS洗滌兩次，加入100 μ 1 bsc-Ab (200mg/L，用含3%胎牛血清和0. 疊氮鈉的PBS稀釋)，4°C孵育30min，PBS洗滌兩次，為了檢測Bsc-Ab，使用一種 FITC標記抗His-tag多克隆抗體。單獨使用FITC標記抗His-tag抗體作為陰性對照，力口適量固定液，上流式細胞儀檢測。結果表明bscVEGFR2X⑶3能與⑶3陽性細胞Jurkat和 VEGFR2陽性細胞A375特異性結合，而與CD3和VEGFR2雙陰性細胞系K562沒有結合(圖 4)，說明bscVEGFR2 X CD3具有與CD3和VEGFR2特異性結合能力。
權利要求
1.一種抗血管內皮細胞生長因子受體2/抗CD3雙特異單鏈抗體，其特征在于它是由抗人血管內皮細胞生長因子受體2單鏈抗體和抗人CD3單鏈抗體連接而成的。
2.根據(jù)權利要求1所述的雙特異單鏈抗體，其特征在于兩個單鏈抗體采用柔性短肽 Gly4Ser連接，單鏈抗體可變區(qū)采用柔性短肽(Gly4Ser) 3連接。
3.根據(jù)權利要求1所述的雙特異單鏈抗體，其特征在于所述雙特異單鏈抗體功能域的排列順序為 VLvegfk2- (Gly4Ser) 3-VHVEGFK2-Gly4Ser-VHCD3- (Gly4Ser) 3_VLCD3。
4.根據(jù)權利要求1所述的雙特異單鏈抗體，其特征在于所述雙特異單鏈抗體連有分泌信號肽。
5.根據(jù)權利要求1至4中任何一項所述的雙特異單鏈抗體，其特征在于抗人血管內皮細胞生長因子受體2單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
6.根據(jù)權利要求1至4中任何一項所述的雙特異單鏈抗體，其特征在于抗人血管內皮細胞生長因子受體2單鏈抗體的重鏈可變區(qū)具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
7.根據(jù)權利要求1至4中任何一項所述的雙特異單鏈抗體，其特征在于抗人CD3單鏈抗體的重鏈可變區(qū)具有如SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。
8.根據(jù)權利要求1至4中任何一項所述的雙特異單鏈抗體，其特征在于抗人CD3單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)具有如SEQ ID NO :4所示氨基酸序列。
9.根據(jù)權利要求4所述的雙特異單鏈抗體，其特征在于所述雙特異單鏈抗體的分泌信號肽具有如SEQ ID NO :5所示氨基酸序列。
10.編碼權利要求1至9中任何一項所述的雙特異單鏈抗體的核苷酸序列。
11.一種載體，其特征在于所述載體含有權利要求10所述的核苷酸序列。
12.—種宿主細胞，其特征在于含有權利要求11所述載體的轉染宿主細胞。
13.權利要求1至9任何一項所述的雙特異單鏈抗體在制備治療抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因工程抗體，具體地說涉及一種抗血管內皮細胞生長因子受體2/抗CD3雙特異單鏈抗體，該雙特異抗體包括兩個分別對血管內皮細胞生長因子受體2和CD3抗原特異性的結合位點。本發(fā)明還涉及編碼所述雙特異抗體的核苷酸序列以及含有所述核苷酸序列的載體以及用所述載體轉染的宿主細胞。本發(fā)明提供的抗VEGFR2/抗CD3雙特異單鏈抗體分子量小、免疫原性小、且易穿透致密的腫瘤屏障，進入實體瘤周圍的微循環(huán)，在制備腫瘤治療藥物中具有應用前景。
文檔編號A61P35/00GK102219856SQ20111012929
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月18日 優(yōu)先權日2011年5月18日
發(fā)明者唐曉波, 李新禹, 李淑珍, 李郁梅, 鄢成偉, 陳莉 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學