專利名稱：川芎嗪衍生物在制備治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化學(xué)名為2，5_ 二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪的川芎嗪衍生物 (H168)，尤其是涉及H168在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝纖維化(Hepatic Fibrosis)是繼發(fā)于各種形式慢性肝損傷(包括病毒性肝炎， 酗酒，藥物作用，代謝性疾病)之后組織修復(fù)過程中的代償反應(yīng)，也是慢性肝病發(fā)展為肝硬化必經(jīng)的病理過程。肝炎是我國發(fā)病率較高的疾病之一，就目前而言我國的肝病狀況不容樂觀，肝纖維化的發(fā)病率持續(xù)上升，現(xiàn)已成為我國衛(wèi)生部門最關(guān)心、重視的課題之一。纖維化的實(shí)質(zhì)是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)合成大于降解導(dǎo)致大量ECM過度沉積。ECM主要來源于肝星狀細(xì)胞Ofepatic stellate cells，HSC)，又稱儲脂細(xì)胞、Ito細(xì)胞、維生素A儲存細(xì)胞等，是肝臟間質(zhì)細(xì)胞之一，位于肝細(xì)胞與竇內(nèi)皮細(xì)胞間的Disse腔內(nèi)，約占肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的1/3，與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞緊密接觸。正常時呈靜止?fàn)顟B(tài)，不合成或僅合成少量基質(zhì)，但在肝組織損傷時刺激HSC活化并轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞(Myofibroblasts-like cells，MFB)，收縮遷移表現(xiàn)為細(xì)胞增殖。活化的HSC 形態(tài)和功能的改變奠定了 HSC在纖維化形成中的關(guān)鍵作用，HSC激活和增生是纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。探討抑制HSC活化和誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制及尋找有效的抗纖維化的藥物至關(guān)重要，已引起國內(nèi)外學(xué)者越來越多的關(guān)注。近年來，國內(nèi)外學(xué)者針對肝纖維化的形成機(jī)制，提出了一系列抗肝纖維化治療藥物和方法，如腎上腺皮質(zhì)素、干擾素等治療，但療效不佳。秋水仙在抗肝纖維化方面的療效得到了肯定，但毒副作用大，不宜長期使用。中藥復(fù)方及單體藥物抗肝纖維化的作用一直是國內(nèi)外科研及臨床研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。目前，我國已出現(xiàn)相關(guān)抗肝纖維化的復(fù)方，但其均為中藥大復(fù)方粗制劑，具有服用量大，服用周期長，療效不確切，治療機(jī)理不明確等缺點(diǎn)。中藥單體的研究近年來取得了較大成果，如姜黃素抗肝纖維化的機(jī)制已經(jīng)明確，但胃腸道不易吸收。這就迫使我們需要尋求一種新的易吸收的、適合于臨床應(yīng)用的藥物。川芎(ligusticum chuanxiong)，為傘形科蒿木屬植物的根莖，性辛、溫，辛香行散，溫通血脈，功能活血行氣，消散淤血，祛風(fēng)止痛，被前人譽(yù)為血中之氣藥。川芎嗪是由川芎的根莖提取的有效成分，學(xué)名為2，3，5，6-四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)，為吡嗪類生物堿。分子式=C8H1J2，分子量136. 20，無色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)80-82°C (顯微測定)， 沸點(diǎn)190°C。具有特殊異臭，有吸濕性，易升華。易溶于熱水、石油醚，溶于氯仿、稀鹽酸，微溶于乙醚，不溶于冷水。川芎嗪有活血化瘀，抗血小板凝聚，擴(kuò)張小動脈，改善微循環(huán)，抗氧化，拮抗鈣離子及抗纖維化等作用。近年來，川芎嗪抗組織器官纖維化方面的作用受到關(guān)注，其對心肌纖維化、肺纖維化、腎纖維化都有公認(rèn)的療效，而且川芎嗪發(fā)揮以上抗纖維化作用的機(jī)制基本相同。鑒于川芎嗪具有代謝快、半衰期短等不利于臨床應(yīng)用的藥代學(xué)特點(diǎn)，對川芎嗪代謝產(chǎn)物的活性進(jìn)行分析，確定川芎嗪抗肝纖維化活性的必須部位和可取代部位，通過構(gòu)效分析，初步確定川芎嗪的吡嗪環(huán)為其藥效必須部位，所連接的四個取代基為可修飾基團(tuán)，因此有目的性和針對性地對川芎嗪側(cè)鏈進(jìn)行改造，得到所需要的抗肝纖維化藥物，化學(xué)名為2，5_ 二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪的川芎嗪衍生物。利用川芎嗪衍生物抗肝纖維化的研究，還未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種2，5- 二羥甲基_3， 6-二甲基吡嗪在制備抗纖維化疾病中的應(yīng)用，所述疾病為肝纖維化。技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案是體內(nèi)研究觀察H168對大鼠肝功能的檢測及肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的測定等。本發(fā)明采用大鼠肝纖維化模型及肝星狀細(xì)胞細(xì)胞株HSC-T6，研究H168 在大鼠整體、體外的細(xì)胞水平、分子水平上對HSC-T6的增殖、凋亡和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況等作用效果，揭示H168抗肝纖維化藥物的分子機(jī)制，確定其可能的作用靶點(diǎn)，為制備抗肝纖維化藥物提供了重要依據(jù)。本發(fā)明所涉及的抗肝纖維化藥物，是H168按照常規(guī)的藥物制劑工藝制備成一種適合臨床上使用的藥物制劑，并具備顯著的抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的療效。有益效果所述川芎嗪衍生物代號H168，是傘形科藁本屬植物川芎中分離所得的生物堿類化合物川芎嗪的衍生物，其化學(xué)名稱是2，5_ 二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪，分子式為 C8H12N2O2,其結(jié)構(gòu)式如下
H3C N CH2OH
HOH2C 八 N 八CH3 ι所述的H168主要通過體內(nèi)觀察H168對大鼠肝功能的檢測及肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的測定；體外對肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡等來研究H168抗肝纖維化作用。實(shí)驗表明，H168具有優(yōu)良的抗肝纖維化效果，不管是在整體對大鼠肝纖維化模型，還是抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡都有很強(qiáng)的作用。所述的H168是一種具有抗肝纖維化作用的新化合物，可以用于制備抗肝纖維化藥物。


圖1為H168對HSC-T6增殖的影響；圖2為H168對HSC-T6的細(xì)胞毒性作用；圖3為不同濃度H168對HSC-T6細(xì)胞凋亡率的影響；圖4為H168對HSC-T6的Bcl_2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。
具體實(shí)施例方式體內(nèi)試驗實(shí)施例1 觀察H168對大鼠肝纖維化的作用1. 1 動物清潔級SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量QOO士20) g，由上海斯萊克公司提供，許可證號SCXK (滬)2007-0005。1. 2藥物與主要試劑H168 (由南京中醫(yī)藥大學(xué)李偉教授惠贈)，CCl4(南京化學(xué)試劑廠產(chǎn)品批號 20090120)，ALT,AST,ALP測定試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)，LN、HA、PCIIIELISA 試劑盒(自上海西諾生物科技有限公司)。1. 3主要儀器全自動生化儀(日立型號7020)。1. 4動物分組隨機(jī)分為5組，每組12只。1.5動物模型的建立將CCl4制成50%橄欖油劑，按lml/kg體重在每只大鼠腹腔注射，第一周三次，第二周后每周二次，同時喂以10%的酒精飲料，共六周。除正常組(腹腔注射相同體積生理鹽水)外，余組均同步予以造模。1. 6治療方法藥物治療組每日治療1次，一周6日，灌胃給藥H168100mg/kg、200mg/kg、300mg/ kg，共6周。模型組每日1次，一周6日，灌胃給200mg/kg生理鹽水，共6周。1. 7指標(biāo)檢測治療與造模結(jié)束后，將所有的大鼠通過頸總動脈取血，離心后分離血清，使用半自動生化儀檢測大鼠ALT (丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)、AST (天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)、ALP (血清堿性磷酸酶) 含量，使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清HA(透明質(zhì)酸)、LN(層粘連蛋白)、PCIII (III型前膠原)的含量。1. 8統(tǒng)計學(xué)方法實(shí)驗數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(χ士s)表示，采用EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間均數(shù)比較用方差分析，t檢驗，以P < 0. 05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。1. 9 結(jié)果H168對大鼠血清指標(biāo)ALT、AST、ALP的影響ALT、AST、ALP主要為細(xì)胞內(nèi)酶，正常機(jī)體血清中這三種酶活性很低，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時，細(xì)胞內(nèi)酶大量入血，從而引起血液中這三種酶的活性升高，臨床上也用ALT、AST、ALP作為比較敏感的肝功能檢測指標(biāo)，它的升高標(biāo)志著肝細(xì)胞膜和細(xì)胞器的損傷。(見表一)表一各組大鼠血清指標(biāo)ALT、AST、ALP檢測結(jié)果(χ士 s)
Group 生理鹽水組
模型組
低劑量組
N 12
9
10 11 11
ALT 40.11±8.12 68.32±11.89** 55.25士 12.73** 51.14±13.45* 46.35±10.12*
5
AST 120.31±28.91 181.25±69.54** 127.81 士 30.15** 127.32±35.76* 115.42±29.15
ALP 243. 69±89.25 312.33±99.15* 300.15士63.65* 279.45±71.15* 271.31±63.45
中劑量組高劑量組
(與正常組相比*P < 0. 05，**P < 0. 01)H168對大鼠纖維化血清指標(biāo)HA、LN、PCI11的影響HA是一種廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的高分子多糖，由肝內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞主要是HSCs 合成，主要由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行降解。因此，HA可以反映肝臟的損傷程度和纖維化的發(fā)展變化。LN是一種大分子非膠原糖蛋白，由肝星狀細(xì)胞合成后主要分布于基底膜的透明層中。 肝纖維化，肝星狀細(xì)胞大量合成和分泌膠原、LN等間質(zhì)成分，形成完整的基底膜。PCIII是 III型前膠原分泌至肝細(xì)胞外沉積前，PCIII升高反映的是肝臟纖維增生活躍。(見表二)表二 各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)HA、LN、PCIII檢測結(jié)果(χ士 s)
權(quán)利要求
1.2,5- 二羥甲基-3，6- 二甲基吡嗪在制備抗纖維化疾病中的應(yīng)用，所述疾病為肝纖維化。
全文摘要
本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，公開了川芎嗪衍生物(2，5-二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪)在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。該川芎嗪衍生物的化學(xué)名為2，5-二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪，其分子式為C8H12N2O2。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)該川芎嗪衍生物從體內(nèi)和體外實(shí)驗均表現(xiàn)出良好的抗肝纖維化作用。
文檔編號A61P1/16GK102198137SQ20111008308
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者嚴(yán)令耕, 倪春艷, 呂旋, 張峰, 李偉, 王愛云, 鄭仕中, 陸茵 申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué)