專利名稱：一種重組人血管內(nèi)皮抑制素溫度敏感型凝膠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用作注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素溫度敏感型殼聚糖凝膠的 制備方法。
背景技術(shù)：
隨著國(guó)內(nèi)生物技術(shù)和藥學(xué)的發(fā)展，原位凝膠在一些難以用傳統(tǒng)給藥方式給藥的不 穩(wěn)定藥物以及長(zhǎng)效控釋制劑、靶向定位制劑方面展示了優(yōu)勢(shì)。原位凝膠能夠以液體狀態(tài)自 由加載各種性質(zhì)及分子量的藥物。此外，多樣化的膠凝機(jī)制為設(shè)計(jì)不同途徑的藥物傳遞系 統(tǒng)提供了豐富的選擇，特別是可生物降解原位凝膠已經(jīng)在長(zhǎng)效植入系統(tǒng)和蛋白質(zhì)及多肽類(lèi) 給藥系統(tǒng)等方面展示出了令人矚目的潛力，對(duì)其深入、廣泛的研究將為藥物傳遞科學(xué)注入 新的活力。殼聚糖來(lái)源廣泛、天然，具有很好的生物降解性、生物相容性。殼聚糖通過(guò)化學(xué)或 物理的方法形成能保持大量水分而又不溶解的水凝膠。這類(lèi)水凝膠具有良好的親水性和生 物相容性，且對(duì)溫度、PH及電場(chǎng)具有一定的敏感性，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)用材料領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)源性血管生成抑制因子如Angiostatin、Endostatin能夠阻礙血 管在腫瘤組織中的生長(zhǎng)，使腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移處于停滯(0，Relly, M. S.，et al. Cell. 79 315-328，1994 ；0，Relly, M. S.，et al. Cell. 88 :277-285,1997)?；诖嗽?，先聲麥得 津開(kāi)發(fā)了注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素(恩度，Endostar)，是首個(gè)血管內(nèi)皮抑制素肺癌新 藥。恩度自2006年上市以來(lái)，取得了良好的臨床治療效果。2007年共計(jì)有一萬(wàn)多人使用了 恩度，目前已完成了接近3000名病例的IV期臨床驗(yàn)證，其安全性和有效性得到了臨床的進(jìn) 一步證實(shí)。恩度目前的給藥方式是病人需要每天靜脈滴注一次，療程為14天，休息一周后， 再繼續(xù)下一療程，治療費(fèi)用高，患者依從性不佳。近期有研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)小劑量持續(xù)給 予 Endostatin 的藥效要優(yōu)于間歇性給藥(Minoru Kuroiwa, et al J. Pediatr. Surg. 38 1499-1505,2003 ；Oliver Kisker,et al. Cancer Res. 61 :7669-7674,2001) 因此，將其開(kāi) 發(fā)成注射一次可以持續(xù)釋藥的長(zhǎng)效制劑非常必要。制備注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素溫度 敏感型殼聚糖凝膠，使藥物在體內(nèi)緩慢平穩(wěn)的釋放，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期，可以減少腫 瘤病人每個(gè)療程的給藥次數(shù)，從每天靜脈滴注給藥一次改為1-2周給藥一次，提高了病人 順應(yīng)性，降低了用藥的成本，具有良好的臨床療效和市場(chǎng)前景。同時(shí)為目前臨床恩度注射液 的最佳給藥方式的確定提供理論和實(shí)踐的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可用作注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素溫度敏感型殼聚 糖凝膠的制備方法。本發(fā)明所述溫度敏感型殼聚糖凝膠是物理凝膠，主要是利用殼聚糖溶液的pH值 變化導(dǎo)致的疏水作用及殼聚糖與多元醇中羥基的氫鍵作用。當(dāng)采用低溫條件下將堿性物質(zhì)(含多元醇或與多元醇混合)添加入殼聚糖，由于分子運(yùn)動(dòng)緩慢，多元醇與殼聚糖鏈間的氫 鍵作用使殼聚糖鏈分離，因此殼聚糖溶液保持溶液狀態(tài)；升溫后分子運(yùn)動(dòng)加劇，氫鍵作用被 破壞，殼聚糖分子鏈之間的疏水作用使其相互纏繞形成凝膠。該凝膠制備過(guò)程在低溫及生 理溫度條件下完成，不涉及高溫處理及有機(jī)化學(xué)試劑，這對(duì)于穩(wěn)定性差的大分子蛋白非常 適合，有助于保持生物活性。本發(fā)明所述溫度敏感型殼聚糖凝膠包括殼聚糖和重組人血管內(nèi)皮抑制素。本發(fā)明的溫度敏感型殼聚糖凝膠的制備方法采用下列步驟(1)將殼聚糖酸性溶液與血管內(nèi)皮抑制素混合；(2)攪拌的條件下加入生物相容 性的助劑；C3)停止攪拌，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系溫度，靜置得血管內(nèi)皮抑制素的殼聚糖凝膠。殼聚糖酸性溶液優(yōu)選殼聚糖鹽酸溶液。鹽酸溶液濃度優(yōu)選為5 15mg/mL的，更 優(yōu)選為10mg/mL。殼聚糖溶液濃度優(yōu)選為10 30mg/mL。殼聚糖分子量范圍優(yōu)選為10000 500000道爾頓，更優(yōu)選為10000 200000道爾頓。殼聚糖與血管內(nèi)皮抑制素質(zhì)量比優(yōu)選為1 3 1 12。血管內(nèi)皮抑制素是人或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的，優(yōu)選為人源的；更優(yōu)選地為重組人 血管內(nèi)皮抑制素，最優(yōu)選地為重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar。血管內(nèi)皮抑制素優(yōu)選溶解在緩沖液中；所述緩沖液優(yōu)選為醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽 緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液中的一種，最優(yōu)選地為醋酸鹽緩沖液。緩沖液pH 值優(yōu)選為2 9，更優(yōu)選為4 7。殼聚糖酸性溶液與血管內(nèi)皮抑制素混合的反應(yīng)體系溫度優(yōu)選為0 10攝氏度。生物相容性的助劑可以直接加入，也可以以溶液形式或混懸液形式加入；優(yōu)選地 為以溶液形式或混懸液形式加入。生物相容性的助劑優(yōu)選地為甘油磷酸鹽、碳酸氫鈉、甘油或海藻酸鈉中的一種或 多種。更加優(yōu)選地為選自濃度為100 600mg/mL的甘油磷酸鹽溶液，濃度為5 50mg/mL 的海藻酸鈉溶液，濃度為50 200mg/mL的碳酸氫鈉/甘油混懸液中的一種。本發(fā)明中碳酸氫鈉/甘油混懸液是指將碳酸氫鈉混懸于甘油中。生物相容性的助劑與血管內(nèi)皮抑制素的質(zhì)量比優(yōu)選為1 1.5 1 32。加入生物相容性的助劑后，繼續(xù)攪拌，時(shí)間優(yōu)選為IOmin 12h，更優(yōu)選為20min 4h。加入生物相容性的助劑的反應(yīng)體系溫度優(yōu)選為0 10攝氏度。停止攪拌后調(diào)節(jié)反應(yīng)體系溫度，溫度優(yōu)選地為30 45攝氏度，更優(yōu)選為36 38 攝氏度。靜置時(shí)間優(yōu)選為IOmin 12h，更優(yōu)選地為30min 他。當(dāng)溶液轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)流動(dòng)性 的半固體或固體，即得載血管內(nèi)皮抑制素的殼聚糖凝膠。本發(fā)明中可以采用磁力攪拌、螺旋槳攪拌，優(yōu)選攪拌轉(zhuǎn)速在100 600轉(zhuǎn)/分。生物相容性的助劑是指對(duì)生物安全，不影響生物功能的，并能賦予產(chǎn)品某種特有 的應(yīng)用性能所添加的輔助物質(zhì)。本發(fā)明中生物相容性的助劑可以為一種單一的物質(zhì)，也可 以為幾種物質(zhì)組成的混合物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有1.本發(fā)明中殼聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性，是蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的良 好載體；2.與微球等給藥系統(tǒng)相比，本發(fā)明中的工藝路線簡(jiǎn)單可行，成本低廉；制備條件 溫和，可以避免制備過(guò)程中使用有機(jī)溶劑，對(duì)蛋白活性影響很小，載藥能力大。3.本發(fā)明得到的殼聚糖凝膠可調(diào)控活性成分的釋放時(shí)間，使在體內(nèi)的釋放時(shí)間在 7天 觀天，甚至更長(zhǎng)?？梢詼p少腫瘤病人每個(gè)療程的給藥次數(shù)，從每天靜脈滴注給藥一次 改為1-2周給藥一次，提高病人的順應(yīng)性，降低用藥的成本，具有良好的臨床療效和市場(chǎng)前
旦
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圖1實(shí)施例一中凝膠掃描電鏡圖。圖2實(shí)施例二中凝膠累積釋放曲線圖。圖3實(shí)施例三中凝膠電泳(SDS-PAGE)圖，其中1，2，3為釋放10天的樣品，4，5，6 為釋放20天的樣品，7為對(duì)照。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例作更詳細(xì)的描述，但不能將其解釋為限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例一稱取分子量為100000道爾頓的殼聚糖500mg，溶于25mL 的鹽酸溶液中，得到 20mg/mL的殼聚糖溶液。取4. 5mL上述溶液置冰水浴中磁力攪拌(溫度為0攝氏度)，加入 含500mg的Endostar緩沖溶液，磁力攪拌使其混合均勻。稱取β -甘油磷酸鈉11. 2g，溶于 20mL水中，得到560mg/mL的β -甘油磷酸鈉溶液，冷藏放置30min，然后取0. 5mL緩慢加入 至含有Endostar的殼聚糖溶液中，繼續(xù)在冰水浴中磁力攪拌30min。停止攪拌，將溫度調(diào)節(jié) 至37攝氏度，靜置30min，即得載重組人血管內(nèi)皮抑制素的殼聚糖凝膠。將所制備凝膠采用 冷凍干燥技術(shù)去除水分后，用掃描電鏡觀察凝膠的微觀形態(tài)，見(jiàn)圖1。實(shí)施例二稱取分子量為50000道爾頓的殼聚糖500mg，溶于20mL 的鹽酸溶液中，得到 25mg/mL的殼聚糖溶液。取4. 5mL上述溶液置冰水浴中磁力攪拌(溫度為0攝氏度)，加入 含800mg的Endostar緩沖溶液，磁力攪拌使其混合均勻。稱取碳酸氫鈉500mg，混懸于5mL 甘油中，得到lOOmg/mL的碳酸氫鈉/甘油混懸液，冷藏放置30min，然后取0. 5mL緩慢加入 至含有Endostar的殼聚糖溶液中，繼續(xù)在冰水浴中磁力攪拌lh。停止攪拌，將溫度調(diào)節(jié)至 37攝氏度，靜置2h，即得載重組人血管內(nèi)皮抑制素的殼聚糖凝膠。將形成的凝膠置于37°C恒溫水浴震蕩器中，加入25mL磷酸鹽緩沖液PBS 7. 4。每 個(gè)取樣點(diǎn)取釋放液2mL，同時(shí)補(bǔ)充同體積新鮮的磷酸緩沖液。釋放樣品中Endostar的含量 用BCA法測(cè)定。用藥物的累積釋放百分率與釋藥時(shí)間作圖(參見(jiàn)圖2)。第1天釋放0. 77%, 第5天釋放65. 48 %，第20天釋放90. 60 %。實(shí)施例三
稱取分子量為20000道爾頓的殼聚糖400mg，溶于25mL 的鹽酸溶液中，得到 16mg/mL的殼聚糖溶液。取5mL上述溶液置冰水浴中磁力攪拌(溫度為0攝氏度)，加入含 600mg的Endostar緩沖溶液，磁力攪拌使其混合均勻。稱取海藻酸鈉lOOmg，溶于IOmL水 中，得到lOmg/mL的海藻酸鈉溶液，冷藏放置30min，然后取5mL緩慢加入至含有Endostar 的殼聚糖溶液中，繼續(xù)在冰水浴中磁力攪拌池。停止攪拌，將溫度調(diào)節(jié)至40攝氏度，靜置 6h，即得載重組人血管內(nèi)皮抑制素的殼聚糖凝膠。將形成的凝膠置于37°C恒溫水浴震蕩器中，加入25mL磷酸鹽緩沖液PBS 7. 4。分 別于釋放10天、20天后取出釋放液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果說(shuō)明釋 放后的重組人血管內(nèi)皮抑制素分子量未發(fā)生變化，即蛋白未發(fā)生降解。
權(quán)利要求
1.一種制備血管內(nèi)皮抑制素殼聚糖溫度敏感型凝膠的方法，其特征在于(1)將殼聚糖酸性溶液與血管內(nèi)皮抑制素混合；(2)攪拌的條件下加入生物相容性的助劑；(3)停止攪拌，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系溫度，靜置得血管內(nèi)皮抑制素的殼聚糖凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于(1)殼聚糖酸性溶液為殼聚糖鹽酸溶液；血管內(nèi)皮抑制素溶解在緩沖液中；(2)生物相容性的助劑可以直接加入，也可以以溶液形式或混懸液形式加入；(3)當(dāng)溶液轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)流動(dòng)性的半固體或固體，即得載血管內(nèi)皮抑制素的殼聚糖凝膠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于(1)殼聚糖溶液濃度為10 30mg/mL;鹽酸溶液濃度為5 15mg/mL;血管內(nèi)皮抑制素 緩沖液選自醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液中的一種，其 中緩沖液PH值在2 9之間；(2)生物相容性的助劑選自甘油磷酸鹽、碳酸氫鈉、甘油或海藻酸鈉中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于(1)殼聚糖分子量范圍在10000 500000道爾頓；(2)生物相容性的助劑以溶液形式或混懸液形式加入；(3)靜置時(shí)間為10mirTl2h。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于(1)殼聚糖分子量范圍在10000 200000道爾頓；(2)生物相容性的助劑選自濃度為10(T600mg/mL的甘油磷酸鹽溶液，濃度為5飛Omg/ mL的海藻酸鈉溶液，濃度為5(T200mg/mL的碳酸氫鈉/甘油混懸液中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于(1)殼聚糖與血管內(nèi)皮抑制素質(zhì)量比為1:3 1:12;(2)生物相容性的助劑與血管內(nèi)皮抑制素的質(zhì)量比為1:1.5 1:32。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于(1)反應(yīng)體系溫度控制在0 10攝氏度；(2)加入生物相容性的助劑后，攪拌10mirTl2h；反應(yīng)體系溫度控制在0 10攝氏度；(3)停止攪拌后調(diào)節(jié)反應(yīng)體系溫度為3(Γ40攝氏度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于所述的血管內(nèi)皮抑制素 是人或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于所述的血管內(nèi)皮抑制素 是重組人血管內(nèi)皮抑制素。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于所述的血管內(nèi)皮抑制素 為重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素溫度敏感型殼聚糖凝膠的制備方法，該殼聚糖凝膠包括殼聚糖和重組人血管內(nèi)皮抑制素。溫度敏感型殼聚糖凝膠制備方法采用物理凝膠法，即先將殼聚糖加入鹽酸溶液中，攪拌至完全溶解，置于水浴中；將注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素緩沖液溶于殼聚糖鹽酸溶液中；控制水浴溫度，不斷攪拌的條件下加入生物相容性的助劑；停止攪拌，調(diào)節(jié)水浴溫度，靜置。當(dāng)溶液轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)流動(dòng)性的半固體或固體，即得載重組人血管內(nèi)皮抑制素的殼聚糖凝膠。
文檔編號(hào)A61K47/36GK102119917SQ20111004457
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月23日
發(fā)明者劉春暉, 李玲, 王青松, 許向陽(yáng) 申請(qǐng)人:江蘇先聲藥物研究有限公司