專利名稱：注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物及其制備方法。本發(fā) 明重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物，載藥量高，粒徑分布均勻，可制成注射液和凍干粉 針供靜脈注射用，同時延緩重組人血管內(nèi)皮抑制素的釋放。
背景技術：
美國哈佛醫(yī)學院的Folkman教授在20世紀60年代提出“腫瘤生長依賴血管生長” 學說，即實體瘤在生長和轉(zhuǎn)移過程中，血管的生成起到了至關重要的作用，此時腫瘤細胞會 發(fā)出一些促進血管向腫瘤組織增生的細胞因子(aFGF，bFGF，VEGF等)。Folkman教授在上 世紀七十年代又提出了用血管內(nèi)皮抑素(Endostatin)來抑制腫瘤生長的“餓死腫瘤療法” 理論。O'Reilly教授于1997年從小鼠內(nèi)皮細胞系EOMAD的培養(yǎng)液中分離得到了具有抑制 血管內(nèi)皮細胞生長的物質(zhì)(血管內(nèi)皮抑制素，Endostatin)，其通過抑制腫瘤血管的生成能 夠顯著地抑制多種原發(fā)性腫瘤的生長(0，Relly，M. S.，et al. Cell. 1997，88 :277_285)。但 由于Endostatin在表達制備過程中存在著易于沉淀和復性困難等問題，限制了其在腫瘤 患者中的大規(guī)模應用。清華大學教授羅永章和以他為主的留美博士研發(fā)團隊通過修飾人血管內(nèi)皮抑制 素的核苷酸編碼序列，歷經(jīng)八年艱辛探索，生產(chǎn)出N末端帶有9個附加氨基酸序列的重組人 血管內(nèi)皮抑制素(取名為Endostar ，中文名恩度 ) (ZL 00107569. 1)，大大簡化了純化 步驟，提高了產(chǎn)物的純度(ZL 00107569. 1)，并成功解決了大規(guī)模復性的問題。所生產(chǎn)的重 組人血管內(nèi)皮抑制素由192個氨基酸構成，其氨基酸序列為(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVA LNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSE GPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHA YIVLCIENSFMTASK。重組的人血管內(nèi)皮抑制素Endostar保持內(nèi)源性Endostatin的所有生物活性，沒 有因為附加N端序列而導致體內(nèi)免疫原性，其注射液已經(jīng)獲得中國國家藥品食品監(jiān)督管理 局的批準上市銷售，臨床上聯(lián)合NP化療方案用于非小細胞肺癌患者。但是作為外源性蛋 白，重組的人血管內(nèi)皮抑制素在體內(nèi)很容易被免疫系統(tǒng)識別，進而被降解，因此體內(nèi)半衰期 很短。目前市場上銷售的Endostar為普通注射液，規(guī)格為15mg/3ml/支，臨床使用中患者 需每天注射一次，連續(xù)14天為一個療程，休息一周后，再繼續(xù)下一療程。由于頻繁的注射給 藥，在生理上給患者帶來了巨大的痛苦，同時給患者帶來了巨大的經(jīng)濟壓力。近期有研究 發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)小劑量持續(xù)給予Endostatin的藥效要優(yōu)于間歇性給藥(MinoruKuroiwa，et al.J.Pediatr. Surg. 2003, 381499-1505 ；Oliver Kisker, et al. Cancer Res. 2001,61 7669-7674)。Folkman報道采用連續(xù)皮下給藥方式能夠使rhEndostatin對小鼠Lewis肺癌 的抑制率達到99 %。因此，將Endostar開發(fā)成注射一次可以持續(xù)釋藥多日的長效制劑是必 要的。目前將半衰期短，分子量大，質(zhì)量不穩(wěn)定的蛋白藥物制成長效制劑通常采用將藥物制成緩釋微球的形式，通過組成微球的聚合物材料在體內(nèi)的緩慢降解從而達到藥物在體 內(nèi)緩慢釋放、吸收的目的。組成微球的聚合物材料主要是聚酯類，如常用的聚乳酸、聚羥基 乙酸或兩者的共聚物(聚乳酸-羥基乙酸，PLGA)。雖然微球技術擁有很多優(yōu)點，但微球生 產(chǎn)過程非常復雜，一般需要專門化的和無菌的生產(chǎn)設備；生產(chǎn)過程中用到有機溶劑，生產(chǎn)低 溶劑殘留量的產(chǎn)品通常很困難，且易破壞的藥物可能在加工過程中降解(或損失活性)；微 球所用材料對質(zhì)量要求較高，價格比較昂貴；開發(fā)這些復雜的產(chǎn)品具有挑戰(zhàn)性，特別是資金 和/或時間的限制，因而在實際的開發(fā)過程中面臨著諸多困難。納米粒是指粒徑為10 IOOOnm的給藥體系。由于人體最小毛細管的直徑大約 為4 μ m，因此直徑小于1 μ m的納米粒很容易通過這些毛細管，從而通過非胃腸道途徑給藥 可以達到緩釋和在特定組織或靶部位釋藥的目的。納米粒作為蛋白質(zhì)類藥物的載體是近來 研究的熱點。納米粒制備工藝相對簡單，所用載體材料主要為天然聚合物，來源廣泛，使用 過程中可避免使用有機溶劑。大量研究表明納米粒有助于選擇更為方便的給藥途徑，保護 蛋白的活性，降低毒副作用，延長半衰期，起到緩釋、靶向的作用(Calonge P，et a 1. Pharm Res.1996，13(2) 311-315 ；Kawashima Y, et al. J Controlled Release.1999，62(1-2) 279-287)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物及制備方 法，將重組人血管內(nèi)皮抑制素制備成納米粒，供靜脈注射，可以延緩藥物釋放，從而降低患 者生理上的痛苦，提高患者的臨床順應性。本發(fā)明的注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物包括可生物降解的聚合物， 生物相容性助劑和注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素。本發(fā)明所述的可生物降解的聚合物系指在生物體內(nèi)能被降解或酶解，生成的小分 子物質(zhì)被機體吸收并排出體外的聚合物。該聚合物為合成的聚合物或天然聚合物，合成的 聚合物包括聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚己內(nèi)酯、聚β-羥基丁酸、聚 磷酸酯、聚羧酸酐，天然聚合物包括白蛋白、膠原蛋白、纖維蛋白原、明膠、海藻酸鹽、纖維 素、殼聚糖及其衍生物、右旋糖酐、透明質(zhì)酸鹽、淀粉。優(yōu)選的，本發(fā)明中可生物降解的聚合 物主要是天然聚合物殼聚糖或殼聚糖的衍生物，其中殼聚糖衍生物包括羧甲基殼聚糖、羧 基殼聚糖、羥烷基殼聚糖、?；瘹ぞ厶?、磺化殼聚糖、殼聚糖季銨鹽的一種或多種。更優(yōu) 選的，可生物降解的聚合物分子量范圍在10000至500000道爾頓，重量占組合物重量的 50% -80%。本發(fā)明中所述生物相容性助劑包括化學交聯(lián)劑、表面活性劑、陰離子大分子或凝 聚劑。其中化學交聯(lián)劑可以是戊二醛或三聚磷酸鈉。其中表面活性劑可以是聚乙二醇、聚 氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、山梨醇脂肪酸酯、泊洛沙姆、聚山梨酯、脂肪酸山梨坦(司盤 類)、辛基苯基聚氧乙烯醚或聚氧乙烯脂肪酸酯。其中陰離子大分子可以是羧甲基纖維素 鈉、丙烯酸樹脂、海藻酸鈉或DNA。其中凝聚劑可以是硫酸鈉、氯化鈉或硫酸銨。本發(fā)明中所述重組人血管內(nèi)皮抑制素為重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar，重組人 血管內(nèi)皮抑制素重量占組合物重量的wt至50% wt，優(yōu)選20% wt至35% wt。本發(fā)明中注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物通過已知方法制備，包括共
4價交聯(lián)法、離子誘導法、大分子復合法、去溶劑化法、反相膠束法。本發(fā)明中重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物可制成注射液或凍干粉針。
本發(fā)明中所述凍干粉針是在注射劑中加入藥學上可接受的賦形劑后噴霧干燥或 冷凍干燥得到。所述的賦形劑為下述一種或其中任意兩種或兩種以上混合的多元醇，包括 甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇或果糖?？紤]從靜脈注射用藥的安全性，本發(fā)明制備的重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒的粒 徑分布為10-1 OOOnm。本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物可以延長重組人血管內(nèi)皮抑制素 的釋放。本發(fā)明的優(yōu)點主要在于第一本發(fā)明組合物中可生物降解的材料主要是天然聚合物殼聚糖或殼聚糖的衍 生物，在許多無機或有機酸的水溶液中都可以溶解，可以避免制備過程中使用有機溶劑 (如聚乳酸_羥基乙酸需使用二氯甲烷等有機溶劑溶解)，破壞蛋白活性；第二與微球等給藥系統(tǒng)相比，本發(fā)明中的組合物工藝路線簡單可行，成本低廉；制 備條件溫和，對蛋白活性影響很小。第三本發(fā)明得到的組合物釋放時間可控制在7天，且釋放完全。因此，將重組人血管內(nèi)皮抑制素制備成納米粒制劑不僅能保護蛋白不會失活，并 能實現(xiàn)緩釋，降低毒副作用，達到長效、安全的目的，該劑型的研究將改善患者的痛苦，提高 患者的臨床順應性。


圖1實施例4的重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物粒徑分布圖。圖2實施例5的重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物釋放曲線。
具體實施例方式本發(fā)明通過下列實施例作更詳細的描述，但本發(fā)明的保護范圍不局限于此。實施例一稱取分子量為100000道爾頓的羧基殼聚糖lOOmg，溶于50ml司盤-80溶液中。以 蒸餾水配制5mg/ml的硫酸鈉溶液4ml。將含30mg Endostar醋酸鹽緩沖液(pH5. 5)加入殼 聚糖溶液中，磁力攪拌下緩慢滴加硫酸鈉溶液，反應30分鐘，100W功率下超聲5分鐘，10000 轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘，分離納米粒。將所得納米粒重新分散于50ml水中，加入Ig果 糖，冷凍干燥，即得重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒。所得納米粒載藥量為17. 1%。實施例二稱取分子量為200000道爾頓的羧甲基殼聚糖500mg，溶于50ml 的醋酸溶液 中。以蒸餾水配制5mg/ml的海藻酸鈉溶液20ml。將含200mg Endostar醋酸鹽緩沖液 (pH5. 5)加入殼聚糖溶液中，磁力攪拌下緩慢滴加海藻酸鈉溶液，反應60分鐘，將上述溶液 在4攝氏度，10000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘，分離納米粒。將所得納米粒重新分散于50ml 水中，加入Ig蔗糖，冷凍干燥，即得重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒。所得納米粒載藥重為 20. 7%。
實施例三稱取分子量為150000道爾頓的殼聚糖250mg，溶于50ml 的醋酸溶液中， 得到5mg/ml的殼聚糖溶液。以蒸餾水配制2. 5mg/ml的三聚磷酸鈉溶液20ml。將含 IOOmgEndostar磷酸鹽緩沖液(pH5. 5)和IOml聚乙二醇加入殼聚糖溶液中，磁力攪拌下緩 慢滴加三聚磷酸鈉溶液，反應10分鐘，100W功率下探頭超聲2分鐘，將上述溶液在4攝氏 度，10000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘，分離納米粒。將所得納米粒重新分散于50ml水中， 加入1.5g海藻糖，冷凍干燥，即得重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒。所得納米粒載藥量為
22. 1 % ο實施例四稱取分子量為100000道爾頓的殼聚糖250mg，溶于50ml 1 %的醋酸溶液中。以蒸 餾水配制5mg/ml的三聚磷酸鈉溶液10ml。將含IOOmg Endostar醋酸鹽緩沖液(pH5. 5)加 入殼聚糖溶液中，磁力攪拌下緩慢滴加三聚磷酸鈉溶液，反應5分鐘，IOOff功率下探頭超聲 2分鐘。將上述溶液在4攝氏度，10000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘，分離納米粒。將所得納 米粒重新分散于50ml水中，加入1. Og海藻糖，冷凍干燥，即得重組人血管內(nèi)皮抑制素納米 粒。所得納米粒載藥量為19.8%。將凍干后的納米粒用蒸餾水復溶，用nanO-ZS90馬爾文粒徑儀測定納米粒粒徑。 所得重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒粒徑分布均勻，平均粒徑為192nm，粒徑分布見圖1。實施例五稱取分子量為100000道爾頓的殼聚糖lOOmg，溶于50ml 的醋酸溶液中，得到 2mg/ml的殼聚糖溶液。以蒸餾水配制2mg/ml的三聚磷酸鈉溶液IOml。將含80mgEndOStar 醋酸鹽緩沖液(PH5. 5)加入殼聚糖溶液中，磁力攪拌下緩慢滴加三聚磷酸鈉溶液，反應60 分鐘，IOOff功率下超聲2分鐘。將上述溶液在4攝氏度，10000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘， 分離納米粒。將所得納米粒重新分散于50ml水中，加入1. 5g甘露醇，冷凍干燥，即得重組 人血管內(nèi)皮抑制素納米粒。所得納米粒載藥量為34.9%。
稱取重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒lOOmg，置透析袋內(nèi)，加入pH值為7. 4的磷酸鹽 緩沖液5ml，扎緊袋口后置于盛有(37 士0. 5) °C、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液50ml的恒溫 振蕩器中，轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分。定時取樣5ml，同時補加等量同溫介質(zhì)，釋放的重組人血管內(nèi) 皮抑制素含量采用BCA方法(試劑盒來自于Thermo Scientific，名為BCA Protein Assay Kit)測定，釋放曲線見圖2。
權利要求
一種注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物，其特征在于包括a)殼聚糖或殼聚糖的衍生物；b)生物相容性的助劑；和c)重組人血管內(nèi)皮抑制素。
2.根據(jù)權利要求1所述的納米粒組合物，其特征在于所述殼聚糖衍生物包括羧甲基 殼聚糖、羧基殼聚糖、羥烷基殼聚糖、?；瘹ぞ厶恰⒒腔瘹ぞ厶?、殼聚糖季銨鹽的一種或多 種。
3.根據(jù)權利要求1所述的納米粒組合物，其特征在于所述的生物相容性的助劑包括化 學交聯(lián)劑、表面活性劑、陰離子大分子或凝聚劑。
4.根據(jù)權利要求3所述的納米粒組合物，其特征在于所述的化學交聯(lián)劑包括戊二醛或三聚磷酸鈉。
5.根據(jù)權利要求3所述的納米粒組合物，其特征在于所述的表面活性劑包括聚乙二 醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、山梨醇脂肪酸酯、泊洛沙姆、聚山梨酯、脂肪酸山梨 坦、辛基苯基聚氧乙烯醚或聚氧乙烯脂肪酸酯。
6.根據(jù)權利要求3所述的納米粒組合物，其特征在于所述的陰離子大分子包括羧甲基 纖維素鈉、丙烯酸樹脂、海藻酸鈉或DNA。
7.根據(jù)權利要求3所述的納米粒組合物，其特征在于所述的凝聚劑包括硫酸鈉、氯化 鈉或硫酸銨。
8.根據(jù)權利要求1所述的納米粒組合物，其特征在于所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素為 重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar。
9.根據(jù)權利要求1所述的納米粒組合物，其特征在于所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素重 量占組合物重量的wt至50% wt。
10.根據(jù)權利要求1-9中任一項所述的納米粒組合物，其特征在于所述的納米粒組合 物可制成注射液或凍干粉針。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物及其制備方法。本發(fā)明中重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物可通過共價交聯(lián)法、離子誘導法等，采用可生物降解的聚合物作為載體制備。本發(fā)明重組人血管內(nèi)皮抑制素納米粒組合物可制成注射液和凍干粉針，載藥量高，粒徑分布均勻，可供靜脈注射，同時延緩重組人血管內(nèi)皮抑制素的釋放。
文檔編號A61K9/19GK101954065SQ20091026304
公開日2011年1月26日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權日2009年12月15日
發(fā)明者劉春輝, 李玲, 王青松, 許向陽 申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司