專利名稱：血管抑制素∶一種Cys－Ser－Val－Thr－Cys－Gly特異性腫瘤細(xì)胞粘附受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了血管抑制素(angioeidin)，對(duì)腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的血小板反應(yīng)蛋白Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly區(qū)具有特異性的一種細(xì)胞基質(zhì)受體，還提供了純化血管抑制素的方法及其抗體和抑制劑。血管抑制素可用于各種診斷和治療，例如癌癥的診斷和治療。
優(yōu)先權(quán)信息本申請(qǐng)要求1999年6月21日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/140,309和2000年1月19日的60/176,626的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
細(xì)胞與基底膜的相互作用機(jī)制很有意義，因?yàn)榘┘?xì)胞必須穿過基底膜才能轉(zhuǎn)移。普遍存在的基底膜是一種特化的胞外基質(zhì)，將器官實(shí)質(zhì)細(xì)胞與間質(zhì)膠原基質(zhì)隔開。正常細(xì)胞和致瘤細(xì)胞以不同的方式與這種基質(zhì)相互作用。大多數(shù)正常細(xì)胞(非轉(zhuǎn)移細(xì)胞)似乎必需一種胞外基質(zhì)才能存活、增殖和分化，而轉(zhuǎn)移細(xì)胞，不論是正常的還是致瘤的，在組織之間轉(zhuǎn)移時(shí)都必須穿過基底膜。具體地說，鱗狀上皮或腺上皮內(nèi)生成的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞必須穿過基底膜進(jìn)入循環(huán)和淋巴細(xì)胞(內(nèi)滲)。循環(huán)性致瘤細(xì)胞被截留在另一器官的毛細(xì)管層中，侵入血管壁，并穿過基底膜進(jìn)入血管外組織(外滲)，于是形成繼發(fā)性腫瘤。
細(xì)胞與胞外基質(zhì)的相互作用依賴于細(xì)胞與基質(zhì)的附著力。正常和致瘤細(xì)胞的附著似乎都由特異性糖蛋白介導(dǎo)，這些糖蛋白使細(xì)胞與基質(zhì)中的特種膠原蛋白結(jié)合。例如，成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞通過纖連蛋白與I型和II型間質(zhì)膠原相互作用而附著于細(xì)胞外基質(zhì)，軟骨細(xì)胞通過軟骨粘連蛋白與II型軟骨膠原相互作用而附著。正常細(xì)胞和致瘤細(xì)胞通過相似的機(jī)制附著于基底膜?；啄さ闹饕煞质荌V型膠原，糖蛋白和蛋白聚糖。糖蛋白層粘連蛋白通過使細(xì)胞與IV型膠原結(jié)合而介導(dǎo)上皮細(xì)胞和致瘤細(xì)胞附著于基底膜。
轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞必須在轉(zhuǎn)移過程的多個(gè)階段穿越基底膜，這種穿越從與基底膜的附著開始。因此，闡明這一機(jī)制并鑒定促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞附著于基底膜的特殊附著因子，對(duì)于癌癥的診斷、預(yù)防和治療具有重要意義。
血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1)是存在于血管基底膜腫瘤基質(zhì)中，由血小板分泌的一種細(xì)胞粘附蛋白和基質(zhì)分子。它介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的入侵和轉(zhuǎn)移。理論所述之外，據(jù)信，腫瘤細(xì)胞通過TSP-1的粘附區(qū)定居，該區(qū)含有氨基酸序列Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)，與一種稱為血管抑制素(angiocidin)的新的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)特異性腫瘤細(xì)胞受體結(jié)合。該受體是一種跨膜受體，游離，或與細(xì)胞結(jié)合。
TSP-1由3條通過二硫鍵相連的相同鏈構(gòu)成，各鏈含有1152個(gè)氨基酸(MW145000)。每條多肽鏈主要由重復(fù)性同源氨基酸序列區(qū)域構(gòu)成。這些區(qū)域是一個(gè)NH2-末端的球狀區(qū)；前膠原同源區(qū)；I型或備解素重復(fù)區(qū)(由3段與備解素序列同源的重復(fù)序列構(gòu)成)；2型重復(fù)區(qū)，由3段與上皮生長(zhǎng)因子序列同源的重復(fù)序列構(gòu)成；3型重復(fù)區(qū)，由7段Ca2+結(jié)合重復(fù)序列構(gòu)成；和一段COOH-末端球狀區(qū)。
TSP-1具有以下特殊活性促細(xì)胞粘附活性，促細(xì)胞有絲分裂活性，細(xì)胞趨化活性，止血活性，以及由這些活性衍生的活性，例如腫瘤細(xì)胞、微生物或寄生物轉(zhuǎn)移活性，血小板凝聚活性，溶纖活性和免疫調(diào)節(jié)作用。
根據(jù)多項(xiàng)研究，血小板反應(yīng)蛋白可與同一細(xì)胞上的多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，或與不同細(xì)胞上的不同受體結(jié)合。例如血小板可通過GPIIb-IIIa、GPIa-Iia結(jié)合TSP-1(Karczewski等，生物化學(xué)雜志26421332-21326(1989)和Tuszynski等，臨床研究雜志871387-11394(1991))，和玻連蛋白受體(Tuszynski等，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究182481(1989))。平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、U937單核細(xì)胞樣細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞可通過一種玻連蛋白樣受體與TSP-1結(jié)合。鱗狀細(xì)胞癌通過一種并非整連蛋白或CD36的Mw80,000/105,000分子與TSP-1結(jié)合(Yabkowitz等，癌癥研究513648-3656(1991))。
血小板反應(yīng)蛋白抗體的作用證明了該蛋白的活性和重要性。研究顯示，抗血小板反應(yīng)蛋白抗體能抑制血小板凝聚，說明血小板反應(yīng)蛋白在該系統(tǒng)中起著重要作用(Tuszynski等，血液72109-115(1988))。此外，抗血小板反應(yīng)蛋白抗體抑制細(xì)胞與涂有血小板反應(yīng)蛋白的培養(yǎng)板粘附，但不抑制與未涂血小板反應(yīng)蛋白的培養(yǎng)板粘附，這說明了細(xì)胞粘附作用。這進(jìn)一步證明，血小板反應(yīng)蛋白參與細(xì)胞粘附和相關(guān)的癌癥轉(zhuǎn)移。G.Tuszyski，癌癥研究474130-33(1987)。
已分離得到其他胞外基質(zhì)蛋白的受體。Liotta等的美國(guó)專利4,565,789描述了層粘連蛋白受體的分離。Mecham等，生物化學(xué)雜志26416652-7(1989)描述一種彈性蛋白受體，具有與67KD層粘連蛋白相似的結(jié)構(gòu)和功能。曾提出，CD36結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)序列。Asch等，生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊1821208-1217(1992)。然而，CD36是一種88KD的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)特異性受體與以往所分離的胞外基質(zhì)蛋白受體是不同的。
本發(fā)明參考了在此引用的所有文獻(xiàn)。
發(fā)明概述本發(fā)明目的之一是提供一種純化的受體，它具有對(duì)血小板反應(yīng)蛋白Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)特定區(qū)域的特異性結(jié)合親和力，宜含有序列SEQID NO2或SEQ ID NO3，或它們的片段或突變體，還提供這些受體的抗體和抑制劑。
本發(fā)明的目的還在于提供用SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的受體，或它們的片段或突變體，或其抗體或配體治療或診斷疾病的方法。
附圖簡(jiǎn)述


圖1(血管抑制素序列)是血管抑制素的序列，這是一種Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly特異性受體蛋白(SEQ ID NO2)。
圖2(血管抑制素序列)是血管抑制素的序列，這是一種Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly特異性受體蛋白(SEQ ID NO3)。
圖3(序列比較)比較
圖1和圖2兩種受體的DNA序列(SEQ ID NO4和SEQID NO5)。
圖4(血管抑制素的SDS-PAGE凝膠)是血管抑制素，Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly特異性受體蛋白的SDS-PAGE凝膠。泳道1是非還原蛋白質(zhì)(染色)。泳道2是還原蛋白質(zhì)(染色)。泳道3是非還原蛋白質(zhì)(標(biāo)記)。泳道4是還原蛋白質(zhì)(標(biāo)記)。泳道5是非還原表面標(biāo)記蛋白質(zhì)。
圖5(重組血管抑制素)是對(duì)重組受體的SDS-PAGE和Western印跡。對(duì)含有表達(dá)的受體、空載體對(duì)照和純化his-受體的細(xì)菌提取物進(jìn)行SDS-PAGE分析，并用抗受體抗體進(jìn)行印跡染色。為了進(jìn)行Western印跡，膜在受體抗體血清的TBS-Tween(含0.05％Tween-20的tris緩沖液)1∶2000稀釋液中處理2小時(shí)，用TBS-Tween洗膜，加入1∶15,000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗兔IgG檢測(cè)1小時(shí)，洗膜，然后ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)顯示，Amersham，Arlington Heights，IL。各板和各泳道如下A板染色凝膠，B板抗受體抗體印跡；泳道1預(yù)染色MW標(biāo)準(zhǔn)品，2無基因插入細(xì)菌的除垢劑提取物，3帶有插入片段細(xì)菌的除垢劑提取物，4還原的his尾純化受體，5非還原的his尾純化受體，6預(yù)染色MW標(biāo)準(zhǔn)品。
圖6(TSP-1和肽與血管抑制素的結(jié)合)顯示TSP-1和Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO6)與重組受體的結(jié)合。含表達(dá)的受體(泳道2，4，7)或不含表達(dá)的受體的對(duì)照裂解液(泳道1，3，6)用以下物質(zhì)染色抗受體抗體(泳道1，2)，生物素化的TSP-1(泳道3，4)，或生物素化的Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO6)(泳道6，7)。
圖7(受體與血小板反應(yīng)蛋白-1的結(jié)合)是受體-TSP-1結(jié)合常數(shù)的測(cè)定。用親和力檢測(cè)系統(tǒng)，一種共振鏡面生物傳感器系統(tǒng)，通過相互作用分析測(cè)定受體與TSP-1的結(jié)合。將TSP-1結(jié)合于比色杯上，加如入受體。該圖是儀器反應(yīng)對(duì)時(shí)間做圖(圖8)所得的擬一級(jí)速度常數(shù)圖。
圖8(與血小板反應(yīng)蛋白-1結(jié)合的受體)顯示用來測(cè)定受體-TSP-1結(jié)合常數(shù)的原始數(shù)據(jù)。用共振鏡面生物傳感器系統(tǒng)通過相互作用分析測(cè)定受體與TSP-1的結(jié)合。該圖顯示樣品的儀器反應(yīng)對(duì)時(shí)間圖，用于繪制圖7中的數(shù)據(jù)點(diǎn)。儀器反應(yīng)與受體-TSP-1復(fù)合物的濃度成比例關(guān)系。
圖9(受體肽對(duì)受體與TSP-1結(jié)合的影響)顯示用親和力檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)得的受體肽對(duì)受體與TSP-1結(jié)合的影響，將TSP-1結(jié)合于比色杯上，測(cè)定受體與它的結(jié)合。加入單獨(dú)的受體，或受體加肽(兩種摩爾比)。試驗(yàn)了受體肽以及一種隨機(jī)陰性對(duì)照，測(cè)定它們抑制結(jié)合的能力。
圖10(受體和肽與TSP-1的結(jié)合)顯示單獨(dú)的受體和單獨(dú)的各種肽與比色杯上固定化TSP-1的結(jié)合。受體和受體肽都與TSP-1結(jié)合，隨機(jī)陰性對(duì)照肽則不。
圖11(受體與TSP-1和Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly的結(jié)合)顯示TSP-1和肽Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO6)都與比色杯上的固定化受體結(jié)合。
圖12(受體在乳房腫瘤內(nèi)的定位)顯示受體在乳房腫瘤內(nèi)的定位。在圖的中央，可以看到圍繞腫瘤細(xì)胞邊界的著色受體。
圖13(模擬和受體轉(zhuǎn)染牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的粘附)顯示用與板上TSP-1結(jié)合的受體轉(zhuǎn)染細(xì)胞或陰性對(duì)照BSA進(jìn)行的細(xì)胞粘附研究。受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與TSP-1板的結(jié)合比BSA更強(qiáng)。
圖14(B16-F10黑素瘤細(xì)胞與受體肽的粘附)顯示用固定于板上的TSP-1、受體肽和對(duì)照進(jìn)行的細(xì)胞粘附研究。受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與纖連蛋白(陽性對(duì)照)、TSP-1和受體肽板強(qiáng)烈粘附。這說明在TSP-1相互作用中還有另一種蛋白參與。
圖15(TSP-1轉(zhuǎn)染的MDA-MB435乳房癌細(xì)胞與固定化重組受體的粘附)顯示用TSP-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(和載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞)進(jìn)行的細(xì)胞粘附研究。TSP-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與受體板的結(jié)合比對(duì)照細(xì)胞更強(qiáng)。
圖16(抗TSP-1抗體對(duì)TSP-1轉(zhuǎn)染的MDA-MB-435乳房癌細(xì)胞與固定化重組受體粘附的影響)顯示用TSP-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞粘附研究。該圖顯示，抗TSP-1和抗Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)抗體抑制與受體板的結(jié)合。
圖17(重組受體對(duì)MDA-MB-435乳房癌粘附的作用)顯示用TSP-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞粘附研究。加入的游離TSP-1以濃度依賴性方式抑制細(xì)胞與板上固定化受體的粘附。
圖18(受體對(duì)血管生成的作用)顯示血管抑制素對(duì)血管生成的作用。該圖顯示，血管抑制素抑制微管的形成。
圖19(受體對(duì)微血管穩(wěn)定性的作用)顯示血管抑制素對(duì)微血管穩(wěn)定性的作用。該圖顯示，在體外，血管抑制素破壞形成后的微管。
圖20(受體對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的作用)顯示血管抑制素對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的作用。血管抑制素濃度提高使細(xì)胞變長(zhǎng)，從板上脫離，聚集，并死亡。
圖21(受體對(duì)細(xì)胞活力的作用)顯示血管抑制素對(duì)細(xì)胞活力的作用。在受體存在下，BAEC和HUVEC細(xì)胞系活力降低，說明TSP為這些細(xì)胞系生存所必需。成纖維細(xì)胞、A549、MB231和MCF7細(xì)胞系的活力沒有顯著差異，說明TSP不是這些細(xì)胞系生存所必需。
圖22(受體對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)和牛平滑肌細(xì)胞(BSM)活力的作用)顯示血管抑制素對(duì)BAEC和BSM細(xì)胞活性的作用。血管抑制素降低BAEC細(xì)胞的活力，但不影響B(tài)SM細(xì)胞。
圖23(受體對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)和小鼠Lewis肺癌的作用)顯示血管抑制素對(duì)BAEC和小鼠Lewis肺癌細(xì)胞活力的作用。血管抑制素降低BAEC細(xì)胞的活力，但不影響Lewis肺癌細(xì)胞。
圖24(受體對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的作用)顯示血管抑制素降低HUVEC細(xì)胞活力的作用。
圖25(受體對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的作用)顯示TSP-1存在下血管抑制素對(duì)HUVEC細(xì)胞活力的作用。
圖26(受體介導(dǎo)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力)顯示TSP-1存在下血管抑制素對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的作用。
圖27(受體結(jié)合試驗(yàn))以圖形方式說明生物素-親和素受體結(jié)合試驗(yàn)。
圖28(受體與固定化TSP-1的結(jié)合)顯示血管抑制素與固定化TSP-1結(jié)合。該圖顯示KD為9nm的可飽和結(jié)合。
圖29(受體對(duì)生物素-受體與TSP-1結(jié)合的作用)顯示血管抑制素對(duì)生物素-血管抑制素復(fù)合物與TSP-1結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用。
圖30(TSP-1受體結(jié)合的肽競(jìng)爭(zhēng))顯示肽對(duì)生物素-血管抑制素復(fù)合物與板上固定化TSP-1結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用。
圖31(由噬菌體展示文庫得到的受體結(jié)合肽)顯示通過噬菌體展示文庫篩選得到的血管抑制素結(jié)合肽。
圖32(TSP-1受體結(jié)合的肽(1mg/ml)競(jìng)爭(zhēng))顯示肽對(duì)TSP-1與血管抑制素結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用。Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)和Lys-Val-Trp-Val-Leu-Pro-Ile(SEQ ID NO14)這兩種肽都抑制結(jié)合。
圖33(血管抑制素對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC-L)活力的作用)顯示血管抑制素降低HAEC和HMVEC-L細(xì)胞活力的作用。
圖34(血管抑制素及其片段對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的作用)顯示血管抑制素及其片段降低牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的作用。
圖35(血管抑制素對(duì)Lewis肺癌生長(zhǎng)的作用)定量顯示血管抑制素對(duì)小鼠側(cè)腹Lewis肺癌腫瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)作用。
圖36(血管抑制素促進(jìn)腫瘤壞死)顯示血管抑制素在細(xì)胞水平對(duì)側(cè)腹腫瘤壞死的作用。
圖37(血管抑制素對(duì)Lewis肺癌生長(zhǎng)的體內(nèi)作用)定量顯示血管抑制素對(duì)小鼠側(cè)腹Lewis肺癌生長(zhǎng)的體內(nèi)作用。
圖38(血管抑制素治療對(duì)患Lewis肺癌小鼠存活率的作用)顯示血管抑制素治療對(duì)患Lewis肺癌小鼠存活率的作用。
圖39(活力研究)顯示血管抑制素對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的作用。
圖40(抗血管抑制素抗體對(duì)血管抑制素介導(dǎo)的BAEC活力抑制的作用)顯示抗血管抑制素抗體對(duì)血管抑制素介導(dǎo)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力抑制的作用。
圖41(血管抑制素對(duì)BAEC與底物粘附的作用)顯示血管抑制素對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附的作用。
圖42(血管抑制素氨基末端和羧基末端部分的功能)顯示血管抑制素蛋白的N-末端部分，就TSP-1結(jié)合性和抗內(nèi)皮細(xì)胞活性而言，具有全長(zhǎng)血管抑制素蛋白的全部活性。C末端部分的活性則近似+99*于陰性對(duì)照。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供純化的血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1)受體蛋白(或稱血管抑制素)的序列。此類受體的序列可參見
圖1和2(SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)。兩段序列的區(qū)別在于Gly-Glu-Arg三個(gè)氨基酸，它們DNA序列之間的差異參見圖3。
此類受體具有對(duì)血小板反應(yīng)蛋白Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)區(qū)的特異性。此類受體蛋白可用于，例如，產(chǎn)生可用于包括癌癥診斷或治療等各種治療領(lǐng)域的抗體。還可借助對(duì)Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)特異性受體結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算機(jī)造型設(shè)計(jì)新的可體內(nèi)抑制或結(jié)合Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)特異性受體位點(diǎn)的化合物。該受體蛋白與癌癥相關(guān)，且在癌癥細(xì)胞中被上調(diào)。該受體蛋白在本文中稱為血管抑制素。
無Gly-Glu-Arg受體的序列(圖2)與兩種已知非相關(guān)蛋白質(zhì)抗分泌因子和人26S蛋白酶的遍在蛋白結(jié)合亞基具有序列同源性?？狗置谝蜃邮且环N垂體制造的蛋白質(zhì)，與結(jié)腸內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合并抑制水向結(jié)腸內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。因此，該蛋白可調(diào)節(jié)流入腸腔的水量?？狗置谝蜃釉诟腥緱l件下產(chǎn)生，例如當(dāng)宿主被霍亂菌感染時(shí)。Johansson，E.，“抗分泌因子蛋白內(nèi)活性位點(diǎn)的鑒定”，生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)1362177-82(1997)。另一方面，人26S蛋白酶的遍在蛋白結(jié)合亞基與遍在蛋白結(jié)合，協(xié)助細(xì)胞內(nèi)老化蛋白質(zhì)的降解。Ferrell，K.，“人26S蛋白酶的多價(jià)遍在蛋白鏈結(jié)合亞基的分子克隆和表達(dá)”，F(xiàn)EBS Letters381143-48(1996)。
出人意料的是，血小板反應(yīng)蛋白受體序列與這兩種已知蛋白具有序列同源性。從未將這兩種已知蛋白質(zhì)與癌癥相關(guān)聯(lián)，或發(fā)現(xiàn)他們?cè)诎┘?xì)胞中上調(diào)。兩蛋白質(zhì)沒有任何相同的功能，而且在體內(nèi)作用的部位也不同。本發(fā)明的受體位于細(xì)胞表面，而抗分泌因子在血液中循環(huán)，遍在蛋白結(jié)合亞基則含于細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明受體具有與兩種已知蛋白不同的翻譯后修飾方式。所述的修飾包括糖基化，磷酸化，異位(ecto)磷酸化，亞基結(jié)構(gòu)(單體，二聚體或四聚體)和不同的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，包括巰基的結(jié)合。
據(jù)信，本發(fā)明受體的抗體和配體不會(huì)干擾抗分泌因子和遍在蛋白結(jié)合亞基的作用。遍在蛋白結(jié)合亞基位于一張酶復(fù)合物內(nèi)，隱藏在細(xì)胞內(nèi)，因此得到保護(hù)而不會(huì)發(fā)生任何交叉反應(yīng)?？狗置谝蜃铀坪踔辉跈C(jī)體受感染，特別是胃腸感染時(shí)，才產(chǎn)生。因此，一般情況下，它不存在于血液中，應(yīng)該不會(huì)與本發(fā)明受體的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。而且，抗體的特異性依賴于翻譯后修飾，而這三種蛋白質(zhì)的這種修飾是不同的。同樣，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)之間的翻譯后修飾不同，加入競(jìng)爭(zhēng)性受體蛋白也不會(huì)干擾其他的系統(tǒng)。
本發(fā)明的受體還包括SEQ ID NO2和SEQ ID NO3中有修飾或稱突變的受體，這些肽仍能結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白肽Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)，親和力約10-6-10-10，約10-7-10-9為佳，10-8最好。突變體可含有不影響二級(jí)結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)功能的保守性取代，這包括同類疏水性、親水性、堿性和酸性氨基酸取代。具體地說，這包括但不限于以下取代對(duì)纈氨酸和蘇氨酸，甘氨酸和異亮氨酸，賴氨酸和精氨酸，谷氨酸和天冬氨酸，苯丙氨酸和色氨酸，絲氨酸和蘇氨酸，以及甲硫氨酸和半胱氨酸。較好的是，對(duì)羧基末端區(qū)Ile248-Lys380(SEQ IDNO25)進(jìn)行修飾。該區(qū)似乎不會(huì)影響血管抑制素的活性。然而，也可以對(duì)其他區(qū)域進(jìn)行修飾。熟練技術(shù)人員不難看出還可進(jìn)行其他保守性取代。
此外，本發(fā)明可使用含氨基末端區(qū)(Met1-Lys132)的片段，以及氨基末端區(qū)片段的突變體。氨基末端片段(Met1-Lys132)參見SEQ ID NO24。定義和縮寫“血管抑制素”，“Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)特異性受體蛋白”，“血小板反應(yīng)蛋白受體蛋白”，“TSP-1受體”和“受體”都指包括但不限于人、豬、馬、牛和小鼠等任意哺乳動(dòng)物來源的天然血小板反應(yīng)蛋白受體蛋白，它表現(xiàn)出對(duì)肽Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)的特異性結(jié)合親和力。該受體的序列為SEQ ID NO2和3。該術(shù)語也包括合成的TSP-1受體蛋白，即用重組法產(chǎn)生或直接化學(xué)合成的蛋白質(zhì)。TSP-1受體蛋白存在于血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮(肺)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，尤其是大多數(shù)癌組織中，這包括但不限于黑素瘤細(xì)胞和肺癌細(xì)胞。
“血管生成活性”在此指抑制或增強(qiáng)血管或淋巴管形成的能力。
“抗內(nèi)皮細(xì)胞活性”在此指降低內(nèi)皮細(xì)胞，例如牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的能力。
“抗瘧疾活性”在此指抑制被瘧疾感染的血細(xì)胞粘附于內(nèi)皮細(xì)胞，瘧原蟲孢子識(shí)別和進(jìn)入肝細(xì)胞，或瘧疾合子識(shí)別和進(jìn)入紅細(xì)胞的能力?？汞懠不钚钥杀憩F(xiàn)為疫苗或能抑制細(xì)胞粘附的治療劑的形式。
“抗轉(zhuǎn)移活性”在此指預(yù)防或顯著減弱腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移程度或范圍，或抑制或引起原發(fā)實(shí)體腫瘤退化的能力。
“動(dòng)脈粥樣硬化活性”在此指血小板反應(yīng)蛋白促進(jìn)或抑制動(dòng)脈粥樣硬化性損傷形成的能力。動(dòng)脈粥樣硬化性損傷定義為含脂物質(zhì)的惡性累積，尤其是動(dòng)脈壁上的累積。
“細(xì)胞粘附活性”在此指促進(jìn)或抑制細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞附著于底物的能力。
“糖尿病性視網(wǎng)膜病理活性”在此指抑制糖尿病引起的眼內(nèi)血管生成異常的能力。
“生長(zhǎng)因子活性”在此指抑制或促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力。
“黃斑變性活性”在此指抑制黃斑變性中視網(wǎng)膜和黃斑下血管異常生長(zhǎng)的能力。
“血小板反應(yīng)蛋白樣活性”在此指各種與抑制血小板反應(yīng)蛋白生物活性類似的活性。這些活性包括促細(xì)胞粘附活性，細(xì)胞有絲分裂活性，細(xì)胞趨化活性和止血活性，以及由這些活性衍生的活性，例如腫瘤細(xì)胞、微生物或寄生物轉(zhuǎn)移活性、血小板凝聚活性、溶纖活性和免疫調(diào)節(jié)能力。優(yōu)選實(shí)施方式本發(fā)明的優(yōu)選受體蛋白具有
圖1-2所示的序列(SIQ ID NO2和SEQ IDNO3)。本發(fā)明的其他受體蛋白含有，如前所述，這些序列的突變體。一種優(yōu)選片段包含氨基末端(Met1-Lys132)(SEQ ID NO24)。
Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)特異性受體，血管抑制素，來自癌組織，例如黑色瘤細(xì)胞或肺癌細(xì)胞。受體的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析顯示，它在非還原性條件下的表觀分子量為50kD。有些制備物中，可能存在少量分子量100kD以上的二聚體。在還原性條件下，該蛋白質(zhì)遷移出兩條緊靠在一起的主要多肽條帶，表觀分子量分別為50和60kD，其中50kD的可能是60kD多肽的降解或修飾形式。這符合這樣的解釋，即，該蛋白質(zhì)由通過鏈間二硫鍵相連的兩條多肽鏈構(gòu)成，當(dāng)二硫鍵結(jié)合時(shí)形成更緊密的構(gòu)型。
該蛋白質(zhì)與整連蛋白抗體或CD36抗體無交叉反應(yīng)。Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)特異性受體蛋白，血管抑制素，是一種糖蛋白，因?yàn)樗芘c半乳糖、甘露糖和糖胺特異性外源凝集素結(jié)合。和糖的存在相一致的是，純化受體蛋白具有高260nm吸光度。
為了進(jìn)一步描述純化的天然血管抑制素蛋白的特征，研究了其在體外作為受體的活性。該受體以離子依賴性方式與血小板反應(yīng)蛋白相互作用，但不與纖連蛋白(FN)或牛血清白蛋白(BSA)相互作用。血管抑制素的用涂本發(fā)明的TSP-1受體蛋白具有多種用途。(1)可產(chǎn)生該受體的抗體或配體。這些抗體或配體可模擬血小板反應(yīng)蛋白的作用，或干擾該受體從而抑制血小板反應(yīng)蛋白活性。(2)可利用對(duì)受體序列的知識(shí)測(cè)定患者血液、活檢組織樣品或其他組織中該受體的水平。非侵襲性腫瘤不表達(dá)該受體，或只低水平地表達(dá)，侵襲性腫瘤則高水平地表達(dá)該受體。該受體的水平可指示患者的診斷或預(yù)后。這可以提供可靠的腫瘤標(biāo)志，將可能永遠(yuǎn)不會(huì)擴(kuò)散的非侵襲性腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)移并致死的侵襲性表型相區(qū)別。這有助于惡性腫瘤的檢測(cè)和治療。(3)可利用該受體設(shè)計(jì)模擬或抑制血小板反應(yīng)蛋白活性的藥物。(4)可將該受體或其片段給予患者作為血小板反應(yīng)蛋白活性的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑?？捎迷撌荏w的修飾形式代替受體或其片段。就此而言的可接受的片段宜含有可以10-6-10-8M的親和力與TSP-1結(jié)合的TSP-1結(jié)合區(qū)或該區(qū)的修飾形式。(5)可將細(xì)胞毒性藥物、激素、造影劑或放射性部分與該受體的抗體或配體(作為靶向部分)偶聯(lián)，用于癌癥等的治療。(6)可用該受體的抗體或配體涂覆或結(jié)合生物醫(yī)學(xué)器具，用于分離在細(xì)胞表面帶有血小板反應(yīng)蛋白的受體的細(xì)胞，例如血小板。(7)可用該受體或其片段抑制腫瘤的生長(zhǎng)，減小腫瘤體積，或防止腫瘤生長(zhǎng)。(8)可用該受體或其片段預(yù)防、抑制或逆轉(zhuǎn)血管生成。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以看出本發(fā)明受體的其他用途。
這些組合物都可以與無毒的其加成鹽、酰胺和酯一起給予患者，在單用時(shí)提供上述療效。這樣的組合物還可以含有可生理耐受的液體、凝膠或固體稀釋劑、佐劑和賦形劑。標(biāo)準(zhǔn)制劑是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。優(yōu)選的給藥方式包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下給藥。另一種優(yōu)選給藥方式通過(例如)將該組合物與某種靶向試劑相連，將組合物直接導(dǎo)向機(jī)體患區(qū)。適合其他給藥方式的其他制劑包括栓劑、鼻內(nèi)噴霧，有時(shí)還包括口服制劑。
例如，本發(fā)明抗體可在患者體內(nèi)介導(dǎo)血小板反應(yīng)蛋白樣活性?？蓪⒕哂幸种苹蚰M完整血小板反應(yīng)蛋白作用的本發(fā)明的抗體或含所述抗體的組合物用于各種治療或預(yù)防性用途，例如癌癥治療，動(dòng)脈粥樣硬化、瘧疾治療或預(yù)防，血栓形成和血栓溶解，血管生成，或細(xì)胞附著。這些抗體還可以用作診斷試劑、治療藥物或其他化合物的載體。這些抗體還可以用于生物醫(yī)學(xué)裝置中。
這些抗體和組合物可在獸醫(yī)上給予動(dòng)物，例如家養(yǎng)或畜養(yǎng)的動(dòng)物或牲畜，也可在臨床上象其他治療性抗體藥物一樣用于人。
在理論所述之外，本發(fā)明的抗體被認(rèn)為是天然血小板反應(yīng)蛋白的激動(dòng)劑或拮抗劑。這些抗體還被認(rèn)為是環(huán)子孢子蛋白、血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)無名蛋白和備解素補(bǔ)體蛋白的激動(dòng)劑或拮抗劑。含有TSP-1的1型重復(fù)序列的其他配體，例如METH-1和METH-2，以及屬于ADAMTS類蛋白質(zhì)的相關(guān)蛋白能與血管抑制素相互作用。Vasquez，F(xiàn).，“METH-1，ADAMTS-1的人直向同源體，和METH-2是具有血管抑制活性的一個(gè)新蛋白家族的成員”，生物化學(xué)雜志274233349-23357(1999)。該受體配體的應(yīng)用與抗體相同。還可將該受體或其片段作為血小板反應(yīng)蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性配體給予患者。該受體的突變體(即受體的修飾形式)也可以作為血小板反應(yīng)蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性配體給予患者。
可用多種體外或體內(nèi)試驗(yàn)證明抗體是否具有血小板反應(yīng)蛋白樣活性。這些試驗(yàn)包括但不限于抗體-受體結(jié)合試驗(yàn)，細(xì)胞粘附試驗(yàn)，血小板凝聚試驗(yàn)，和細(xì)胞增殖試驗(yàn)?？捎靡环N高處理量的結(jié)合試驗(yàn)篩選具有血小板反應(yīng)蛋白樣結(jié)合性的受體的抗體?？梢詫⒃撌荏w固定在測(cè)試板上，與標(biāo)記的TSP-1結(jié)合，加入待測(cè)化合物，測(cè)定它是否抑制TSP-1與該受體的結(jié)合。其他試驗(yàn)，例如以下所述，可用來測(cè)定待測(cè)抗體的功能性活性。
轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移是疾病從機(jī)體的一個(gè)部位擴(kuò)散到不相關(guān)的另一部位，例如惡性腫瘤細(xì)胞通過血液流或淋巴流轉(zhuǎn)移中所發(fā)生的那樣。轉(zhuǎn)移被認(rèn)為通過一種級(jí)聯(lián)機(jī)制發(fā)生，包括腫瘤細(xì)胞粘附于內(nèi)皮，內(nèi)皮收縮，基底膜的基質(zhì)降解和腫瘤細(xì)胞侵入血流。對(duì)該級(jí)聯(lián)中任一階段的干擾都有利于治療或預(yù)防轉(zhuǎn)移性癌癥。
已知天然血小板反應(yīng)蛋白分子能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Tuszynski等，癌癥研究474130-4133(1987)。目前對(duì)于血小板反應(yīng)蛋白的促進(jìn)機(jī)制還不完全清楚。
抗轉(zhuǎn)移活性可通過化合物體外結(jié)合黑素瘤細(xì)胞的能力(Tuszynski等，生物學(xué)年報(bào)184189-91(1990))，和體內(nèi)減小腫瘤集落的大小或減少其數(shù)量的能力(Tuszynski等，癌癥研究474130-4133(1987))來鑒定。
受體的抗體或配體可用作抗轉(zhuǎn)移劑，尤其是用作抗肺癌轉(zhuǎn)移劑。這樣的試劑抑制轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞，特別是響應(yīng)血小板反應(yīng)蛋白的那些細(xì)胞的粘附。他們還減少和縮小腫瘤集落。這些抗體和配體的特殊優(yōu)點(diǎn)是循環(huán)半壽期長(zhǎng)。
可以通過多種機(jī)制產(chǎn)生上述抗轉(zhuǎn)移活性。抗體或配體可以是細(xì)胞毒性的或抑制細(xì)胞增殖。作為細(xì)胞增殖抑制劑的試劑能夠1)抑制有絲分裂，2)抑制血管生成或3)激活補(bǔ)體途徑和相關(guān)的殺傷細(xì)胞。這些機(jī)制通過抗體或配體與該受體的結(jié)合而起效。
本發(fā)明的抗體和配體還可用在生物醫(yī)學(xué)裝置中。因?yàn)榭贵w和配體能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的附著，可以用它們涂覆生物醫(yī)學(xué)裝置，從而去除血液或淋巴液中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。這樣的生物醫(yī)學(xué)裝置還可以用來捕捉肝細(xì)胞瘤或其他惡性腫瘤。
抗體和受體的另一用途是作為載體用于將毒素、藥物、激素、造影劑或放射性部分的定向于轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞，用于診斷或治療。這些載體也結(jié)合肝細(xì)胞瘤或其他惡性腫瘤。受體本身或其片段/突變體可用于競(jìng)爭(zhēng)性地抑制血小板反應(yīng)蛋白活性。具體地說，本發(fā)明包括治療癌癥的組合物和方法，其中將TSP-1的配體或抗體與放射性部分相連。還包括放射性檢測(cè)和診斷癌癥的組合物和方法，其中將TSP-1的配體或抗體與放射性部分相連。用于治療、檢測(cè)和診斷癌癥的放射性部分是本領(lǐng)域所熟知的。最后，本發(fā)明包括用于MRI檢測(cè)、診斷和定量對(duì)癌癥治療的療效應(yīng)答的組合物和方法，其中將TSP-1的配體或抗體與MRI增強(qiáng)劑相連。用于檢測(cè)、診斷和定量癌癥療效應(yīng)答的MRI增強(qiáng)劑是本領(lǐng)域所熟知的，包括但不限于釓、錳、鐵、锝、GASTROGRAPHINTM、ISOVUETM、HEPATOLYTETM和NEUROLYTETM。熟練技術(shù)人員知道，還有其他可用的MRI增強(qiáng)劑。
動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)脈粥樣硬化是一種疾病，其特征在于動(dòng)脈內(nèi)壁上小脂肪瘤的沉積，常伴有患區(qū)的變性。
給予TSP-1受體的抗體、配體，或受體或其片段/突變體可降低血小板反應(yīng)蛋白活性，從而抑制動(dòng)脈損傷的發(fā)展。這一結(jié)果已經(jīng)在飼以高膽固醇飲食的兔中得到了證實(shí)。
糖尿病性視網(wǎng)膜病糖尿病性視網(wǎng)膜病中，視網(wǎng)膜內(nèi)的血管被損壞，滲液或出血，造成視網(wǎng)膜損傷。在增殖性視網(wǎng)膜病中，視網(wǎng)膜表面形成新的脆弱血管。這些新血管，或新血管化，會(huì)造成嚴(yán)重的視力問題，因?yàn)樗鼈儠?huì)破裂、滲漏或出血滲入晶狀體。當(dāng)晶狀體被血液遮擋時(shí)，光線就無法透過眼睛進(jìn)入視網(wǎng)膜，由此造成視力模糊和扭曲。新血管還會(huì)造成疤痕組織，將視網(wǎng)膜從眼后拉離，造成視網(wǎng)膜脫落。視網(wǎng)膜脫落會(huì)導(dǎo)致失明。最后，異常血管會(huì)在虹膜上生長(zhǎng)，造成青光眼。TSP被認(rèn)為參與了糖尿病性視網(wǎng)膜病中的異常血管生長(zhǎng)。
黃斑變性在“濕”型黃斑變性中，異常血管(又稱視網(wǎng)膜下新血管化)在視網(wǎng)膜和黃斑下生長(zhǎng)。然后，這些新血管可能破裂和滲液，因而引起黃斑膨脹或抬升，造成中心視力扭曲或損傷。這種情況下，視力的喪失會(huì)很快，很嚴(yán)重。TSP被認(rèn)為參與了黃斑變性中的異常血管生長(zhǎng)。
瘧疾瘧疾是一種傳染病，由寄生在紅血球中的多種原蟲(瘧原蟲屬)引起，由被感染的蚊子叮咬傳播給哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的抗體、配體、受體或其片段/突變體可用作治療劑抑制細(xì)胞粘附。
這些試劑抑制血小板反應(yīng)蛋白活性，因此抑制瘧疾感染紅血球與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，抑制瘧原蟲孢子識(shí)別和進(jìn)入肝細(xì)胞，或抑制瘧原蟲合子識(shí)別和進(jìn)入紅血球。
血管生成血管生成指血管和淋巴管的形成。本發(fā)明的抗體、配體、受體或其片段/突變體可用于血管生成的調(diào)節(jié)，特別是促進(jìn)愈創(chuàng)，抑制或防止腫瘤生長(zhǎng)、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。標(biāo)準(zhǔn)血管生成試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的。此類試驗(yàn)包括但不限于用各種細(xì)胞系進(jìn)行的增殖和遷移研究，膠原酶抑制，和雞尿囊絨膜上的體內(nèi)新血管化(CAM試驗(yàn))。
粘附調(diào)節(jié)本發(fā)明的抗體、配體、受體或其片段/突變體可調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，抑制TSP-1及其他蛋白與含有TSP-1受體位點(diǎn)的細(xì)胞，例如血小板的結(jié)合。
診斷本發(fā)明的抗體和配體可作為試劑用于各種癌癥的診斷/預(yù)后，包括但不限于胃腸道(胃、結(jié)腸和直腸)癌、乳房癌、肝癌和黑素瘤?？捎肨SP-1的水平進(jìn)行患者預(yù)后或診斷。對(duì)該受體序列的進(jìn)一步了解可直接用于測(cè)定患者樣品中該受體的水平。
載體可將細(xì)胞毒性藥物、激素、造影劑或放射性部分與抗體或配體偶聯(lián)，用于癌癥等的治療。
生物醫(yī)學(xué)裝置可用抗體或配體涂覆或結(jié)合于生物醫(yī)學(xué)裝置，以分離在細(xì)胞表面帶有血小板反應(yīng)蛋白受體的細(xì)胞，例如血小板。鑒定血小板反應(yīng)蛋白受體的相應(yīng)配體相應(yīng)配體包括血小板反應(yīng)蛋白，其突變體或片段(含肽Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1))，其他結(jié)合本發(fā)明受體的肽或蛋白質(zhì)。
可用噬菌體展示肽文庫試劑盒(例如New England Biolabs，Beverly，MA的產(chǎn)品)產(chǎn)生和鑒定這樣的配體。噬菌體展示是一種選擇技術(shù)，其中，肽或蛋白質(zhì)表達(dá)為與噬菌體包膜蛋白形成的融合蛋白，使得融合蛋白展示在噬菌體的外表面，而融合蛋白的編碼DNA則留在病毒顆粒內(nèi)。噬菌體展示可用來建立隨機(jī)肽序列大型文庫與各序列的編碼DNA之間的物理關(guān)聯(lián)，從而可通過一種稱為生物篩選的體外選擇過程迅速鑒定多種靶分子(包括受體)的肽配體。這一技術(shù)的實(shí)施是通過用涂有靶受體的板(或微珠)培養(yǎng)噬菌體展示肽文庫，洗去不結(jié)合的噬菌體，洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。然后擴(kuò)增洗脫的噬菌體，通過多輪生物篩選和擴(kuò)增，成功富集含有結(jié)合最牢固序列的噬菌體。3-4輪后，通過DNA測(cè)序和ELISA鑒定各克隆。
然后，可用編碼肽的寡核苷酸作為探針鑒定含有鑒定所得肽序列的蛋白質(zhì)。然后，用后文實(shí)施例中的任一結(jié)合技術(shù)評(píng)價(jià)它們與受體的結(jié)合能力。
血管抑制素的表達(dá)血管抑制素或其片段或突變體都可以在已知表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)，這些系統(tǒng)包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，昆蟲細(xì)胞，酵母細(xì)胞和大腸桿菌之類的細(xì)菌。
就異源蛋白質(zhì)的表達(dá)而言，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系具有許多優(yōu)點(diǎn)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的真核蛋白將是功能性的，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾在高等真核生物之間是保守的。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系還適合許多重組蛋白研究，包括結(jié)構(gòu)-功能試驗(yàn)和分析蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞功能的生理學(xué)效應(yīng)。
昆蟲細(xì)胞是很好的重組蛋白表達(dá)宿主。因?yàn)樽鳛楦叩日婧思?xì)胞，它們的翻譯后修飾與哺乳動(dòng)物細(xì)胞類似，但生長(zhǎng)更快，且不需要CO2培養(yǎng)箱，所以常選用它們來生成蛋白質(zhì)。此外，昆蟲細(xì)胞很容易適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，從而可進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)。
已證明，許多酵母菌株對(duì)于表達(dá)和分析真核蛋白十分有用。對(duì)于酵母的基因已十分清楚，并已知它們進(jìn)行許多類似哺乳動(dòng)物的翻譯后修飾。在特定的培養(yǎng)基中，這些單細(xì)胞真核生物生長(zhǎng)迅速，比用哺乳動(dòng)物細(xì)胞更容易，更便宜。因此，酵母是適合大規(guī)模生成重組真核蛋白的理想表達(dá)系統(tǒng)。
大腸桿菌內(nèi)的重組蛋白表達(dá)迅速而且產(chǎn)量高。然而，因?yàn)榧?xì)菌不能將蛋白質(zhì)糖基化或進(jìn)行正確折疊，所以，細(xì)菌系統(tǒng)無法產(chǎn)生具有最適活性的蛋白質(zhì)。但是，因?yàn)槭褂梅奖?，仍然常選用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)。
實(shí)施例以下實(shí)施例說明本發(fā)明但不限定本發(fā)明的范圍。在使用重組血管抑制素的實(shí)施例中，使用的是SEQ ID NO2序列。但是，本發(fā)明使用SEQ ID NO3序列、以及以上兩序列的突變體和片段，同樣效果良好。實(shí)施例1受體的純化從細(xì)胞中純化Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)特異性受體蛋白包括2個(gè)基礎(chǔ)步驟制備細(xì)胞，和通過親合層析純化受體。細(xì)胞來源優(yōu)選小鼠黑素瘤細(xì)胞和人肺癌細(xì)胞，這些已可為公眾獲得。與大多數(shù)組織來源相比，培養(yǎng)細(xì)胞另外具有無蛋白酶的優(yōu)點(diǎn)。這有利于活性受體蛋白的穩(wěn)化和純化。
制備細(xì)胞提取物，在受體可與Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)肽結(jié)合的條件下，通過固定有Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)肽的層析柱。然后，從柱上洗脫純形式的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)特異性受體。
具體地說，從4.0×107個(gè)B16-F10小鼠黑素瘤細(xì)胞或A549肺癌細(xì)胞中制備細(xì)胞提取物將細(xì)胞體溶于5ml結(jié)合緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5，含0.5％(NON-PRECENDENTIAL)*-40除垢劑，1mM CaCl2，1mM MgCl2，100μM亮抑酶肽，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，10μg/ml抑蛋白酶肽)。4℃，4,000×g離心20分鐘，去除樣品中的不溶物。
組裝Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)親合柱4mg Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)與1ml CN-活化瓊脂糖偶聯(lián)，充填成5ml的柱，以HEPES緩沖液pH7.35平衡。將提取物加到已用50ml結(jié)合緩沖液洗過的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)柱上。用50ml結(jié)合緩沖液洗柱，洗去非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。用以下緩沖液洗脫特異性吸附的蛋白質(zhì)0.1M Tris，pH10.2，含0.05％(NON-PRECENDENTIAL)*-40除垢劑，1mM CaCl2，1mM MgCl2，100μM亮抑酶肽，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和10μg/ml抑蛋白酶肽。在試管中收集10ml洗脫液，試管中含有700μl用于中和Tris的1N HCl。將試管中的洗脫峰組分加到以陰離子交換柱緩沖液(20mM Tris HCl，pH8.0，含5mM辛基葡糖苷)平衡過的陰離子交換柱(Mono Q，Pharmacia)上。用20ml NaCl梯度(100％1M NaCl)洗脫結(jié)合的物質(zhì)，以280nm和260nm檢測(cè)柱。結(jié)合物質(zhì)通常從0.3M NaCl開始洗出，維持該梯度，使得蛋白質(zhì)等梯度洗脫，得到一個(gè)在260nm處高吸光度的均一峰。
將洗脫組分和未結(jié)合的組分濃縮，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在8％聚丙烯酰胺凝膠上對(duì)濃縮物進(jìn)行SDS-凝膠分析，用考馬斯藍(lán)染色顯示。峰組分在非還原性條件下的SDS-凝膠電泳是一條表觀分子量50kD的主條帶，在還原性條件(5％β巰基乙醇)下則是50和60kD的兩條多肽帶，參見圖4(泳道1和2)。從1×107個(gè)細(xì)胞回收到約100μg蛋白質(zhì)。按標(biāo)準(zhǔn)方法(Karczewski等，生物化學(xué)雜志26421322-6(1989))，用125I標(biāo)記Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)特異性受體。簡(jiǎn)而言之，將12μg純化蛋白質(zhì)溶于100μl辛基葡糖苷緩沖液，與碘珠共培養(yǎng)5分鐘。按已知方法(Tuszynski等，生物化學(xué)年報(bào)106118-122(1980))，在以辛基葡糖苷緩沖液平衡的Sephadex G-25小柱上去除未反應(yīng)的碘。典型實(shí)驗(yàn)所得蛋白質(zhì)的特異性活性為104cpm/μg。對(duì)標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行SDS-凝膠電泳，然后的放射性自顯影顯示，在還原性條件下，主要是60kD分子量的多肽條帶。圖4，泳道3和4是這種標(biāo)記物質(zhì)的放射性自顯影照片。實(shí)施例2對(duì)Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)特異性TSP-1受體cDNA的分子克隆和序列分析制備抗體或寡核苷酸探針和DNA文庫，以及用抗體或核酸雜交對(duì)它們進(jìn)行篩選的基本策略是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的。參見，例如，DNA克隆第一卷(D.M.Glover編，1985)核酸雜交(B.D.Hames和J.Higgins編輯，1985寡核苷酸合成(M.J.Gate編，1984)T.Maniatis，E.F.Fisch & J.Sambrook，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(1982)。本發(fā)明按照這些已知方法進(jìn)行本發(fā)明受體的克隆和測(cè)序。
用由A549人肺癌細(xì)胞分離的受體的多克隆抗血清篩選λUni-ZAP(Stratagene，La Jolla，CA)前列腺癌細(xì)胞(PC3-NI)文庫，該文庫由MCP-Hahneman大學(xué)的MarkSteams博士和Min Wang博士提供。按照PicoBlue免疫染色試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)的方法，用吸附噬菌體和細(xì)菌的抗受體抗血清的1∶1000稀釋液篩選了200,000個(gè)空斑。分離出4個(gè)抗體陽性空斑，克隆，并用ExAssist抗干擾輔助噬菌體法(Stratagene，LaJolla，CA)將噬菌粒轉(zhuǎn)移到XL1藍(lán)細(xì)菌中。用Wizard plusminiprep(Promega，Madison，WI)純化質(zhì)粒DNA，用Sequenase2.0(U.S.BiochemicalCorp.)，用T7/T3引物組通過雙脫氧鏈終止法測(cè)序。所得序列見
圖1和2(SEQ IDNO2和SEQ ID NO3)。圖3是這兩種受體DNA序列的比較(SEQ ID NO4和SEQ ID NO5)。實(shí)施例3重組血管抑制素的表達(dá)將全長(zhǎng)受體cDNA亞克隆入含有PBK-CMV啟動(dòng)子的XL-1藍(lán)細(xì)菌中，用目前分子生物學(xué)中的方法，用IPTG(異丙基-b-D-硫半乳糖吡喃糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)。用B-Per細(xì)菌蛋白質(zhì)抽提劑(Pierce Chemical Co.Rockfort，III)裂解細(xì)菌。
也可以在其他細(xì)菌、桿狀病毒和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如COS細(xì)胞)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)該重組受體。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道，細(xì)菌因?yàn)椴荒軐⒌鞍踪|(zhì)糖基化或進(jìn)行正確折疊，可能無法產(chǎn)生最佳的活性蛋白質(zhì)。但是，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能產(chǎn)生大量的表達(dá)蛋白質(zhì)，而且該系統(tǒng)還能夠進(jìn)行許多翻譯后修飾，例如糖基化、折疊、磷酸化和分泌?？蓪⑹荏wcDNA插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體(MaxBac 2.0試劑盒+pBlueBacHis2 Xpress試劑盒，Invitrogen，Carlsbad，CA)。對(duì)重組病毒進(jìn)行3次純化，用Western印跡法估測(cè)Sf11細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中產(chǎn)生的受體量。此外，也可以用pcDNA3.1/His載體(Invitrogen)在COS細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)受體。這是一種哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，其中，用受體cDNA轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，用CMV啟動(dòng)子構(gòu)建物誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)。COS細(xì)胞易用多種方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。實(shí)施例4帶His-尾重組血管抑制素的表達(dá)與純化用Express蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad，CA)制備氨基末端連有6個(gè)組氨酸殘基的重組受體。以克隆在PBK-CMV載體中的全長(zhǎng)cDNA作為模板產(chǎn)生含有正確限制性位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，這些位點(diǎn)使得DNA可連接于帶His尾的載體pTrcHISA。這是用rTth DNA聚合酶XL(Perkin Elmer，F(xiàn)oster City，CA)，分別含有Bgl II和EcoRl限制性位點(diǎn)的正向引物GGG AGA TCT ATG GTG TTG GAA AGCACT(SEQ ID NO12)和反向引物GGG GAA TTC TCA CTT CTT GTC TTCCTC(SEQ ID NO13)進(jìn)行PCR完成的。所得的1.1kb產(chǎn)物含有一個(gè)5′端的Bgl II限制性位點(diǎn)和一個(gè)3′端的EcoR1位點(diǎn)，用T4 DNA連接酶將其連入用BamH1和EcoR1消化的載體。實(shí)施例5Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly和TSP-1與重組血管抑制素的結(jié)合用還原和非還原性SDS-PAGE分析含受體cDNA插入片段和空載體對(duì)照以及純化His尾重組受體的細(xì)菌裂解液。將凝膠電印跡到硝酸纖維素紙上，印跡在室溫下用1％BSA封閉1小時(shí)。
為了進(jìn)行Western印跡，膜在受體抗體血清的TBS-Tween(含0.05％Tween-20的tris緩沖液)1∶2000稀釋液中處理2小時(shí)，用TBS-Tween洗膜，加入1∶15,000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗兔IgG檢測(cè)1小時(shí)，洗膜，然后ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)顯示，Amersham，Arlington Heights，IL，見圖5。
為了進(jìn)行配體印跡，膜用生物素化的TSP-1或生物素化的Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO6)(5μg)室溫下處理1小時(shí)，用TBS-Tween洗膜，加入1∶2,000稀釋的辣根過氧化物酶-親和素檢測(cè)1小時(shí)，洗膜，然后ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)顯示，Amersham，Arlington Heights，IL，見圖6。
用Pierce蛋白質(zhì)生物素化法(EZ-連接的硫代-NHS-LC-生物素，PierceChemical Co Rockfort III)將TSP-1和Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ IDNO6)生物素化。透析去除未反應(yīng)的生物素。實(shí)施例6非變性血管抑制素結(jié)合TSP-1的評(píng)價(jià)用親和力檢測(cè)系統(tǒng)(Cambridge，UK)評(píng)價(jià)非變性(以上配體印跡法中，受體因SDS而變性)重組受體與TSP-1的結(jié)合。這是一種光學(xué)結(jié)合法，用共價(jià)偶聯(lián)了配體或受體的比色杯。用激光束檢測(cè)與蛋白質(zhì)衍生的比色杯表面結(jié)合的蛋白質(zhì)。該方法具有高靈敏度，而且既可測(cè)定配體受體相互作用的結(jié)合速度常數(shù)，也可測(cè)定其解離速度常數(shù)。儀器假設(shè)一分子受體結(jié)合一分子TSP-1，根據(jù)以下關(guān)系計(jì)算解離常數(shù)KD1.平衡時(shí)，kass＝[R][TSP-1]＝kdiss[R-TSP-1]，其中kass是結(jié)合的二級(jí)速度常數(shù)，kdiss是解離的一級(jí)速度常數(shù)；2. KD＝[R][TSP-1]/[R-TSP-1]＝kdiss/kass3. [R-TSP-1]t＝[R-TSP-1]eq[1-exp(-kont)]，其中，儀器反應(yīng)測(cè)定值弧光秒與受體-TSP-1復(fù)合物[R-TSP-1]成正比。
4.kon＝kass[L]+kdiss，其中kon是受體與TSP-1相互作用的擬一級(jí)速度常數(shù)。
將1μg TSP-1通過其氨基與比色杯表面的COOH基團(tuán)與比色杯偶聯(lián)。然后用乙醇胺和白蛋白封閉比色杯表面上未反應(yīng)的基團(tuán)。在HEPES緩沖液pH7.00中濃度189nM以上的受體在7分鐘后顯示為可飽和結(jié)合，這樣的結(jié)合可用緩沖液部分解離，或用低pH緩沖液完全解離。將擬一級(jí)結(jié)合速度常數(shù)對(duì)受體濃度做圖，計(jì)算出解離常數(shù)為44nm，見圖7。用圖8的儀器反應(yīng)對(duì)時(shí)間讀數(shù)來繪制圖7中的數(shù)據(jù)點(diǎn)，其中，儀器反應(yīng)與受體-TSP-1復(fù)合物濃度成比例關(guān)系。
在緩沖液中加入除垢劑Tween20不改變特異性結(jié)合。此外，10倍摩爾過量TSP-1的1型重復(fù)區(qū)Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO6)存在下，受體的結(jié)合程度為緩沖液對(duì)照的47％，10倍亂序肽(scrambled)Val-Cys(Acm)-Thr-Gly-Ser-Cys(Acm)(SEQ ID NO7)存在下，是緩沖液對(duì)照的88％，這說明含有Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)序列的肽能夠部分競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。以上結(jié)果證明克隆了一種結(jié)合TSP-1的蛋白質(zhì)。實(shí)施例7評(píng)價(jià)血管抑制素和肽與固定化TSP-1的結(jié)合按照實(shí)施例6的方法，但將TSP-1固定在比色杯上，然后加入以下溶液之一單獨(dú)的受體，肽加受體(肽受體等于1000和100摩爾比)。所用的肽是Val-Cys-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ ID NO8)，Val-Cys(Acm)-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ IDNO9)和Pro-His-Ser-Arg-Asn(SEQ ID NO10)。前兩種肽來自受體與TSP-1的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)部分結(jié)合的部分。第三種肽是對(duì)照。
圖9顯示，肽Val-Cys-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ ID NO8)通過與TSP結(jié)合，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制受體與固定化TSP-1的結(jié)合。比較不同的肽與受體摩爾比可以看出，這種相互作用與濃度相關(guān)。
此外，
圖10顯示受體衍生肽與比色杯上固定化的TSP-1直接結(jié)合。以受體為陽性對(duì)照，以Pro-His-Ser-Arg-Asn(SEQ ID NO10)為陰性對(duì)照可以看出，肽Val-Cys-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ ID NO8)和肽Val-Cys(Acm)-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ ID NO9)直接結(jié)合固定化的TSP-1。
以上三圖顯示，本發(fā)明受體上的Val-Cys-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ ID NO8)區(qū)與TSP-1蛋白結(jié)合。實(shí)施例8血管抑制素與固定化TSP-1和C(Acm)SVTC(Acm)G(SEQ ID NO6)結(jié)合的評(píng)價(jià)按照實(shí)施例6的方法，但將TSP-1和Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO6)固定在比色杯上，然后加入受體。在本實(shí)驗(yàn)中，用肽的Acm版用來提高其穩(wěn)定性。
圖11顯示，TSP-1和所述肽都與本發(fā)明受體結(jié)合。這證明，TSP-1的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)區(qū)與本發(fā)明受體結(jié)合。實(shí)施例9血管抑制素的表面標(biāo)記如Tuszynski等，生物化學(xué)年報(bào)106118-122(1980)所述，用乳過氧化物酶以125I表面標(biāo)記完整的生長(zhǎng)期的A549肺癌細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，幾乎長(zhǎng)滿細(xì)胞單層的75mm燒瓶用10ml DMEM洗滌3次。然后，用5ml含0.2單位/ml乳過氧化物酶和500μCi125I的DMEM覆蓋細(xì)胞單層。每隔1分鐘，溫和攪拌加入1μl30％H2O2，共加5份。然后加入5μl 1mM NaN3終止反應(yīng)，用DMEM洗滌細(xì)胞單層3次，收獲細(xì)胞，用于純化Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)結(jié)合性蛋白質(zhì)。
對(duì)被標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行SDS-凝膠電泳分析而后放射性自顯影顯示，非還原條件下Mw為50,000的多肽經(jīng)體外碘化而被標(biāo)記(圖4，泳道5)。
受體先以時(shí)間依賴性方式結(jié)合TSP-1，但在60分鐘后不再依賴于時(shí)間。當(dāng)1mM CaCl2和1mM MgCl2同時(shí)存在時(shí)，結(jié)合最強(qiáng)，1mM EDTA存在下，結(jié)合量顯著但很少。本實(shí)施例說明，受體與TSP-1不僅以時(shí)間依賴性方式結(jié)合，而且受體表達(dá)在細(xì)胞表面。實(shí)施例10血管抑制素的免疫組織化學(xué)
圖12顯示受體在乳房腫瘤內(nèi)的定位。腫瘤位于圖中央大垂直條，右側(cè)有兩個(gè)島。左右兩側(cè)較小的細(xì)胞是炎性細(xì)胞，大的白色細(xì)胞是脂肪組織。為了進(jìn)行比較，在圖的左下方顯示了一簇正常的乳腺管。
組織在冷的95％乙醇中固定10分鐘，用石蠟包埋。切成5μm的切片，貼到顯微鏡載玻片上。對(duì)載玻片進(jìn)行去石蠟處理，并在二甲苯-乙醇分級(jí)溶液中重新水合。用3％H2O2處理5分鐘以猝滅內(nèi)源性過氧化物酶的活性，接著用水洗。然后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌載玻片，并以5-20μg/ml的第—IgG(免疫或非免疫IgG)含0.1％BSA PBS(PBS-BSA)溶液處理30分鐘。PBS-BSA洗滌后，用Vectastain ABC免疫過氧化物酶染色試劑盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)的方法，載玻片以生物素化第二抗體的1∶250稀釋液處理30分鐘，洗滌并顯影。然后，用蘇木精對(duì)載玻片進(jìn)行反染色，蓋上蓋玻片，用明場(chǎng)顯微鏡檢視。
可以看到，被染色的受體圍繞在腫瘤細(xì)胞的周圍，但在左下角正常細(xì)胞的周圍則沒有。這說明，受體結(jié)合于細(xì)胞膜，并且，在腫瘤細(xì)胞中更多。
實(shí)施例11瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和細(xì)胞粘附試驗(yàn)用Wizard Plus試劑盒(Promega，WI)，以純化的受體編碼DNA轉(zhuǎn)染牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)和MDA-MB-231細(xì)胞，乳房癌細(xì)胞。用Superfect轉(zhuǎn)染劑(Qiagen，CA)使DNA進(jìn)入細(xì)胞。將細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板上，在長(zhǎng)至80％鋪滿時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用12μl的轉(zhuǎn)染劑和2.5μg DNA(最低濃度為0.1μg/ml)。在無血清、無抗生素的培養(yǎng)基中形成Superfect-DNA復(fù)合物。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)3-4小時(shí)。更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收獲細(xì)胞進(jìn)行粘附試驗(yàn)。
為了進(jìn)行粘附試驗(yàn)，在96孔板上，每?jī)煽淄恳訲SP-1(40μg/ml)、纖連蛋白(40μg/ml)或1％牛血清白蛋白(BSA)。孔過夜干燥，然后用BSA封閉。在涂有蛋白質(zhì)的孔中加入100μl含2×105個(gè)細(xì)胞的懸浮液，37℃培養(yǎng)20分鐘至1小時(shí)。去除沒有粘附的細(xì)胞，用Hepes緩沖液洗孔。用2.5％戊二醛固定粘附細(xì)胞10分鐘，并用0.2％Giemsa染色。洗去染劑，清點(diǎn)1mm區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。以粘附BSA的細(xì)胞為背景，以粘附纖連蛋白的細(xì)胞為陽性對(duì)照。參見
圖13。實(shí)施例12瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和細(xì)胞粘附試驗(yàn)按照實(shí)施例11的方法，但將受體肽Val-Cys-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ IDNO8)和Val-Cys(Acm)-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ ID NO11)固定在培養(yǎng)板上。培養(yǎng)板上還固定以TSP-1和纖連蛋白，作為陰性對(duì)照的肽(Ala-Ser-Val-Thr-Ala-Arg(SEQ ID NO11)和Pro-His-Ser-Arg-Asn(SEQ ID NO10))和牛血清白蛋白。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果
圖14顯示，受體肽引起細(xì)胞與培養(yǎng)板粘附，對(duì)陽性對(duì)照纖連蛋白和對(duì)TSP-1的親和力相近。這支持這樣的觀點(diǎn)可能有另一種蛋白質(zhì)與TSP-1或其受體結(jié)合，或者，受體因另一種蛋白質(zhì)的作用而被釋放并與細(xì)胞膜重新結(jié)合。實(shí)施例13瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和細(xì)胞粘附試驗(yàn)按照實(shí)施例12的方法，但將完整受體蛋白固定在培養(yǎng)板上，并加入以TSP-1 cDNA或載體對(duì)照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。原本低水平表達(dá)TSP-1的細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后超量表達(dá)該蛋白質(zhì)。
圖15顯示，與對(duì)照細(xì)胞系相比，TSP-1cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞與涂有受體的培養(yǎng)板結(jié)合更多(多2.5倍，p＜0.001)。分別以纖連蛋白和BSA作為細(xì)胞粘附的陽性和陰性對(duì)照。這支持這樣的觀點(diǎn)本發(fā)明受體結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白。
在該系統(tǒng)中加入抗TSP-1抗體，抗Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO1)抗體和對(duì)照IgG證實(shí)了這一特異性相互作用。
圖16顯示，抗TPS-1抗體和抗Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO1)抗體都抑制TSP-1表達(dá)細(xì)胞與結(jié)合于培養(yǎng)板上的受體粘附。
而且，在此粘附系統(tǒng)內(nèi)加入非結(jié)合受體溶液減少細(xì)胞與培養(yǎng)板的粘附。
圖17顯示，本發(fā)明受體本身競(jìng)爭(zhēng)性抑制非轉(zhuǎn)染天然TSP-1表達(dá)細(xì)胞與結(jié)合于培養(yǎng)板的受體粘附，進(jìn)一步說明是這一相互作用導(dǎo)致粘附。實(shí)施例14抗血管抑制素(TSP-1受體)抗體的產(chǎn)生可用天然或合成(重組)Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO1)特異性受體蛋白來產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體。如果需要多克隆抗體，可用純化的受體蛋白免疫選定動(dòng)物(例如小鼠、兔、山羊、馬等)，然后收集免疫動(dòng)物的血清按照已知方法進(jìn)行檢測(cè)。將含有針對(duì)受體蛋白之外多種抗原的多克隆抗體的組合物通過一結(jié)合了該受體的柱，可基本去除非針對(duì)受體蛋白的抗體。洗滌后，可從柱上洗脫受體的多克隆抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員也不難制備出抗受體蛋白單克隆抗體。用雜交瘤制備單克隆抗體的一般方法是眾所周知的。也可以用融合以外的方法，例如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞或用EB病毒轉(zhuǎn)染，制得無限繁殖的抗體產(chǎn)生細(xì)胞系。參見，M.Schreier等，“雜交瘤技術(shù)”(1980)；Hammerling等，“單克隆抗體和T細(xì)胞雜交瘤”(1981)；Kennett等，“單克隆抗體”(1980)等。
用TSP-1受體蛋白(天然或合成)作為抗原免疫生產(chǎn)單克隆抗體的無限繁殖化B細(xì)胞的來源，可得到識(shí)別受體蛋白分子上不同位點(diǎn)表位的一組單克隆抗體。通過抗體與TSP-1的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)可方便地鑒定出識(shí)別受體蛋白結(jié)合區(qū)一表位的抗體。此類抗體如能在體內(nèi)抑制TSP-1與其受體的結(jié)合而不激起與TSP-1肽結(jié)合相關(guān)的生理反應(yīng)，則可能具有治療潛力。
具體地說，按照標(biāo)準(zhǔn)方法，每3-4周一次50μg注射，在兔中產(chǎn)生Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO1)特異性受體的多克隆抗血清。第一次注射采用完全Freund佐劑，以后用不完全Freund佐劑。通過ELISA測(cè)定抗體的效價(jià)和特異性。本實(shí)施例使用天然的純化受體。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。簡(jiǎn)而言之，在微滴板上涂以2μg Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO1)特異性受體、纖連蛋白或BSA，用1％BSA封閉1小時(shí)。各孔與50μl不同稀釋度的第一抗體溶液(10mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含150mM NaCl和0.05％Tween-20(PBS-T))共培養(yǎng)1小時(shí)，用PBS-1洗滌3次，然后與堿性磷酸酯酶偶聯(lián)的兔抗羊IgG的PBS-T1∶800稀釋液一起培養(yǎng)1小時(shí)，用PBS-T溶液洗孔3次，接著用不含的Tween-20的PBS-T緩沖液洗3次，然后用50μl堿性磷酸酯酶的底物溶液(以0.10M甘氨酸配制的1mg/ml磷酸對(duì)硝基苯酯溶液，pH10.4，含1mM ZnCl2和1mM MgCl2)處理。30分鐘后，加入5μl 1N NaOH終止顯色，測(cè)定405nm處的吸光度。
如表1所示，直接ELISA顯示該抗體是單特異性的。

實(shí)施例15抗體對(duì)粘附的抑制以下實(shí)施例是為了測(cè)定抗Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO1)特異性受體抗體抑制癌細(xì)胞與TSP-1結(jié)合的能力。A549癌細(xì)胞表達(dá)血小板反應(yīng)蛋白的受體蛋白。拆卸式微滴孔(Immulon 4 Removawell)內(nèi)涂以TSP-1、纖連蛋白或?qū)诱尺B蛋白以20mM bis-tris-丙烷(pH6.5)配制的40μg/ml溶液50μl，4℃過夜，用200μl1％BSA封閉1小時(shí)。A549細(xì)胞與200μg/ml抗Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ IDNO1)特異性受體的IgG或非免疫血清共培養(yǎng)30分鐘，離心去除不結(jié)合的抗體。將沉淀重懸于DMEM，細(xì)胞在涂有蛋白質(zhì)的孔內(nèi)37℃培養(yǎng)60分鐘。清點(diǎn)與微滴孔表面粘附的細(xì)胞數(shù)。表2中的結(jié)果是非免疫IgG處理的粘附細(xì)胞百分比。表2顯示，抗Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO1)特異性受體抗體抑制A549細(xì)胞與涂有TSP-1表面的粘附，但對(duì)細(xì)胞與纖連蛋白或?qū)诱尺B蛋白的粘附?jīng)]有作用。該抗體還抑制TSP-1與組織培養(yǎng)塊的粘附。

實(shí)施例16血管抑制素對(duì)血管生成的作用實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了血管抑制素對(duì)血管生成的作用。將牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)接種在膠原基質(zhì)上。接著，在細(xì)胞上覆蓋一層膠原。在處理板內(nèi)細(xì)胞上加血管抑制素(37μg/ml)，對(duì)照板則只加緩沖液。24小時(shí)后，拍攝相襯顯微照片(200×)。結(jié)果見
圖18。對(duì)照板內(nèi)，BAEC細(xì)胞自身重排成微血管網(wǎng)絡(luò)。但在血管抑制素處理板內(nèi)，沒有形成微血管，發(fā)生細(xì)胞死亡。
該膠原試驗(yàn)是一種被廣泛認(rèn)可的血管生成模型。Qian等，“血小板反應(yīng)蛋白-1在體外通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9來調(diào)節(jié)血管生成”，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究235403-412(1997)。以上結(jié)果證明血管抑制素是有效的血管生成抑制劑。實(shí)施例17血管抑制素對(duì)微血管穩(wěn)定性的作用按照實(shí)施例16進(jìn)行本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)，但起初不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。24小時(shí)后，兩種樣品中都有微血管形成，且外觀與對(duì)照板類似，
圖19。然后在對(duì)照和處理板中分別加入緩沖液和血管抑制素。又24小時(shí)后，拍攝Hoffman干擾光學(xué)顯微照片。該實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照沒有受到影響。但是，血管抑制素的加入破壞了處理板中已形成的微血管。結(jié)果見
圖19。這表明血管抑制素不僅防止血管生成，而且可逆轉(zhuǎn)血管的形成。實(shí)施例18血管抑制素對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的作用該實(shí)驗(yàn)中，將BAEC細(xì)胞單層培養(yǎng)物接種在含1％BSA的無血清培養(yǎng)基中，在遞升濃度血管抑制素(對(duì)照＝0，0.37μg/ml，3.7μg/ml，37μg/ml)存在下，培養(yǎng)24小時(shí)。用Hoffman干擾光學(xué)顯微鏡拍攝細(xì)胞照片。隨著血管抑制素濃度升高，BAEC細(xì)胞變長(zhǎng)，從板上脫落，聚集，死亡。結(jié)果見圖20。實(shí)施例19血管抑制素對(duì)細(xì)胞活力的作用用37μg/ml受體或僅緩沖液處理牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、成纖維細(xì)胞、A549人肺癌細(xì)胞(A549)、MDA-MB231人乳房癌細(xì)胞(MB231)、MCF7人乳房癌細(xì)胞(MCF7)24小時(shí)。用ALAMAR BLUETM試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力，該試驗(yàn)測(cè)定的是細(xì)胞代謝ALAMAR BLUETM顏料的能力。ALAMARBLUETM試驗(yàn)(購自Biosource International，Camarillo，CA)定量測(cè)定細(xì)胞系的增殖，可以確認(rèn)化學(xué)試劑的相對(duì)細(xì)胞毒性。該試驗(yàn)采用一種依賴于代謝活性檢測(cè)的熒光測(cè)定/比色測(cè)定生長(zhǎng)指示劑。此系統(tǒng)采用氧化-還原(氧還)指示劑，在細(xì)胞生長(zhǎng)引起的生長(zhǎng)培養(yǎng)基還原反應(yīng)中產(chǎn)生熒光和變色反應(yīng)。這使得氧還指示劑由其被氧化非熒光蘭色形式轉(zhuǎn)變成被還原熒光紅色形式?？捎脽晒鈾z測(cè)設(shè)備(530-560nm激發(fā)波長(zhǎng)，590nm發(fā)射波長(zhǎng))或吸光度檢測(cè)設(shè)備(570nm和600nm)收集數(shù)據(jù)。
在本發(fā)明受體存在下，BACE和HUVEC細(xì)胞系活力降低，說明TSP為這些細(xì)胞系的活力所必需，見圖21。用血管抑制素處理后，內(nèi)皮細(xì)胞活力降低70-80％。成纖維細(xì)胞、A549、MB231和MCF7細(xì)胞系中沒有顯著差異，說明TST不為這些細(xì)胞系的活力所必需。實(shí)施例20血管抑制素對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)和牛平滑肌細(xì)胞(BSM)活力的作用用遞升濃度血管抑制素(0，0.625，1.25，2.5，5，15，26和37μg/ml)處理BAEC和BSM細(xì)胞24小時(shí)。用ALAMAR BLUETM試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力。血管抑制素劑量依賴性地抑制BAEC細(xì)胞的活力，表現(xiàn)為一條一級(jí)單常數(shù)指數(shù)衰減曲線，圖22。相反，BSM細(xì)胞未受影響。
類似的，用同樣方法比較了受體對(duì)BAEC細(xì)胞和小鼠Lewis肺癌細(xì)胞活力的作用。血管抑制素降低BAEC細(xì)胞的活力，但對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞沒有作用，見圖23。這表明血管抑制素不直接影響Lewis肺癌細(xì)胞的活力。對(duì)HUVEC細(xì)胞進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞活力降低。結(jié)果見表24。實(shí)施例21血管抑制素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的作用評(píng)價(jià)血管抑制素對(duì)HUVEC細(xì)胞活力的作用，并且加入FGF和TSP-1以確定它們是否削弱血管抑制素對(duì)細(xì)胞活力的作用。FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)是一種促內(nèi)皮細(xì)胞分裂素，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。單獨(dú)的FGF(2ng/ml)和TSP-1(20μg/ml)都刺激細(xì)胞生長(zhǎng)高于對(duì)照。然而，加入FGF或TSP-1都不能逆轉(zhuǎn)血管抑制素(37μg/ml)的抑制作用。結(jié)果見圖25。本以為TSP-1能逆轉(zhuǎn)血管抑制素的抑制作用；然而，加入的量可能不足以提供合適的摩爾比。實(shí)施例22受體介導(dǎo)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力按照實(shí)施例21的方法進(jìn)行，但使用BAEC細(xì)胞。此外，加入20μg/ml和5μg/ml的TSP-1。圖26的結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，TSP能部分改善血管抑制素的抑制作用。實(shí)施例23受體結(jié)合試驗(yàn)圖27以圖形形式顯示受體結(jié)合試驗(yàn)。在以下實(shí)驗(yàn)中，TSP-1與一基質(zhì)共價(jià)結(jié)合，在培養(yǎng)板中加入生物素化的血管抑制素，然后加入親和素-過氧化物酶來測(cè)定有多少生物素化的血管抑制素與TSP-1結(jié)合。用分光光度計(jì)測(cè)定450nm吸光度來測(cè)定親和素-過氧化物酶。
圖28顯示血管抑制素與TSP-1的結(jié)合。顯示為KD＝9nM的可飽和結(jié)合。用BSA作為陰性對(duì)照。
在此系統(tǒng)中加入游離血管抑制素，與生物素化的血管抑制素競(jìng)爭(zhēng)。圖29顯示血管抑制素對(duì)于生物素-血管抑制素復(fù)合物結(jié)合TSP-1的競(jìng)爭(zhēng)作用。用固定化BSA作為陰性對(duì)照。隨著血管抑制素與生物素-血管抑制素復(fù)合物之比升高，結(jié)合呈線性減少。
在此系統(tǒng)中加入TSP-1肽Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)，與培養(yǎng)板上的TSP-1競(jìng)爭(zhēng)與生物素化血管抑制素的結(jié)合。如圖30所示，Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)能夠與TSP-1競(jìng)爭(zhēng)與生物素-血管抑制素復(fù)合物的結(jié)合。用作陰性對(duì)照的亂序肽Val-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys(SEQ ID NO15)沒有作用。實(shí)施例24-血管抑制素結(jié)合肽的鑒定用New England Biolabs(Beverly，MA)的噬菌體展示肽文庫試劑盒鑒定結(jié)合血管抑制素的肽。用涂有靶受體的培養(yǎng)板(珠)培養(yǎng)噬菌體展示肽文庫，洗去不結(jié)合的噬菌體，洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。然后擴(kuò)增洗脫的噬菌體，進(jìn)一步進(jìn)行生物篩選和擴(kuò)增循環(huán)，從而成功富集含有最強(qiáng)結(jié)合序列的噬菌體。3輪后，用DNA測(cè)序和ELISA進(jìn)行各個(gè)克隆的鑒定。
如圖31所示，噬菌體展示文庫鑒定到一系列受體結(jié)合肽，它們是Lys-Ser-Trp-Val-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO16)；Lys-Leu-Trp-Val-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO17)；Lys-Val-Trp-Val-Leu-Pro-Ile(SEQ ID NO18)；Lys-Val-Trp-Val-Leu-Ile-Pro(SEQ ID NO19)；Lys-Val-Trp-Val-Leu-Pro-Ile(SEQ ID NO18)和Lys-Val-Trp-Ile-Val-Ser-Thr(SEQ ID NO20)。
圖31中的每條線都代表被測(cè)序的8個(gè)克隆之一。這些肽之間的差異很小，只是就電荷和類別(例如疏水性、芳香性或親水性)而言的保守性氨基酸取代。
因?yàn)檫@些序列不是來自TSP-1的線性序列，它們被認(rèn)為代表TSP-1折疊蛋白質(zhì)內(nèi)的一個(gè)活性位點(diǎn)?；蛘?，它們可能代表結(jié)合血管抑制素的另一種蛋白質(zhì)的序列。實(shí)施例25肽對(duì)TSP-1與血管抑制素結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)用前述親和素-生物素系統(tǒng)來評(píng)價(jià)多種肽對(duì)TSP-1與血管抑制素結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用。如圖32所示，實(shí)施例24中用噬菌體展示所鑒定的肽Lys-Val-Trp-Val-Leu-Pro-Ile(SEQ ID NO18)抑制結(jié)合。此外，Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ IDNO1)肽能有效抑制結(jié)合。更穩(wěn)定的乙?；腃ys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO6)也能抑制結(jié)合。鏡像乙?；膁-Gly-Cys(Acm)-Thr-Val-Ser-Cys(Acm)(SEQ ID NO23)能抑制結(jié)合，很可能是因?yàn)樗哂邢嗤牧Ⅲw構(gòu)型。以亂序肽Val-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Gly(SEQ ID NO21)和d取向肽d-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO22)作為陰性對(duì)照。實(shí)施例26血管抑制素對(duì)HAEC和HMVEC-L細(xì)胞活力的作用如實(shí)施例19所述，將血管抑制素加入人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和肺人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC-L)。根據(jù)ALAMAR BLUETM試驗(yàn)測(cè)定，如圖33所示，血管抑制素對(duì)這兩個(gè)細(xì)胞系的活力都不利。實(shí)施例27血管抑制素及其片段對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的作用如實(shí)施例19所述，將血管抑制素加入BAEC細(xì)胞。同樣地加入血管抑制素片段。圖34顯示，血管抑制素及其氨基末端片段Met1-Lys132(表達(dá)為GST融合蛋白，GST偶聯(lián)在氨基末端一側(cè))能抑制細(xì)胞活力。血管抑制素的中段及其羧基末端對(duì)細(xì)胞活力沒有作用。用GST作為陰性對(duì)照。V36-R42即抗分泌因子的活性位點(diǎn)沒有作用，說明血管抑制素的作用與抗分泌因子不同。實(shí)施例28血管抑制素對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞側(cè)腹腫瘤生長(zhǎng)的作用向動(dòng)物側(cè)腹內(nèi)皮下注射106個(gè)Lewis肺癌細(xì)胞。側(cè)腹腫瘤評(píng)價(jià)是一個(gè)已被普遍認(rèn)可的血管生成模型，因?yàn)閭?cè)腹腫瘤高度依賴于血管生成。O′Reilly，M.S.，“Angiostatin一種新的血管生成抑制劑，介導(dǎo)對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用”，細(xì)胞79315-28(1994)。9天后，當(dāng)可以看到腫瘤形成時(shí)，將小鼠分成2組，一組5只。一組接受50μg血管抑制素以Hepes緩沖液所配溶液的IV注射。對(duì)照組用Hepes緩沖液處理。在分組后的第1、3和5天進(jìn)行處理，在第7天殺死。
圖35顯示對(duì)照和處理組的側(cè)腹腫瘤發(fā)展。去除皮膚以露出腫瘤，腫瘤以方框標(biāo)出。血管抑制素處理小鼠的腫瘤比對(duì)照的小得多。而且，血管抑制素處理小鼠的腫瘤軟，棉，壞死，受壓時(shí)破裂。對(duì)照小鼠的腫瘤則實(shí)，突，硬，健康，而且生長(zhǎng)迅猛。
將腫瘤包在石蠟中，切成5μm的切片。切片以蘇木精和曙紅染色。蘇木精將DNA染成藍(lán)色，曙紅則把蛋白質(zhì)染成分紅色。圖36顯示了對(duì)照(分圖A和C)與血管抑制素處理(分圖B和D)細(xì)胞之間的差異。分圖A和B是光顯微鏡下放大400倍的照片，分圖C和D則是明光微鏡下放大200倍的照片。血管抑制素處理組顯示明顯的壞死和細(xì)胞死亡。
圖37顯示相對(duì)腫瘤體積，如下測(cè)定 7天處理內(nèi)進(jìn)行全程測(cè)定。對(duì)照腫瘤呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，而受處理腫瘤只以線性速度略有生長(zhǎng)。這說明血管抑制素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成具有顯著作用。
結(jié)合實(shí)施例20，本實(shí)施例證明血管抑制素直接影響血管生成，但不作用于Lewis肺癌細(xì)胞本身。因此，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤活力的作用來自于對(duì)血管生成的作用。沒有所需的供血來確保氣體交換和營(yíng)養(yǎng)，依賴于血管化的2mm3以上的側(cè)腹腫瘤無法存活。實(shí)施例29-患Lewis肺癌小鼠的存活研究給10只小鼠IV注射106個(gè)Lewis肺癌細(xì)胞。培養(yǎng)3天后，將小鼠分成兩組。一組的5只小鼠接受50μg血管抑制素Hepes緩沖液制劑IV注射處理。對(duì)照組的5只接受Hepes緩沖液處理。在第1、3、5、7和9天進(jìn)行處理。
評(píng)價(jià)兩組的存活。即使只接受中等水平的處理(隔天處理，第9天結(jié)束)，血管抑制素組中值存活期(19天)仍比對(duì)照組(16天)長(zhǎng)，參見圖38。
肺腫瘤不是很好的血管生成模型，因?yàn)榉问且粋€(gè)高度血管化的部位，因此，腫瘤不必如此顯著地依賴于附加的血管化。但是，它顯示血管抑制素能有效治療癌性肺腫瘤，在此過程中延長(zhǎng)壽命。
實(shí)施例30血管抑制素在人乳房癌組織中的定位用免疫過氧化物酶染色法染色入侵襲性乳房腫瘤樣品，以及作為對(duì)照的良性和正常組織樣品。用抗TSP-1和血管抑制素的多克隆抗體標(biāo)記樣品，然后加入抗第一抗體的第二抗體。第二抗體與過氧化物偶聯(lián)，然后與底物DAB混合，形成棕色。所有原發(fā)性乳房導(dǎo)管癌瘤樣品(n＝11)呈TSP-1和血管抑制素染色陽性。相反，所有良性腫瘤和正常乳房組織呈TSP-1和血管抑制素染色陰性，但發(fā)生增生的兩份纖維變性乳房樣品例外。
在癌瘤樣品中，TSP-1著色位于腫瘤附近致密的基質(zhì)膠原中，血管抑制素染色則位于腫瘤細(xì)胞內(nèi)。以上結(jié)果顯示，導(dǎo)管上皮內(nèi)TSP-1和血管抑制素的表達(dá)增強(qiáng)與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。實(shí)施例31血管抑制素在人頭及頸部腫瘤組織中的定位用蘇木精、曙紅和血管抑制素抗體染色人頭及頸部腫瘤樣品。用計(jì)算機(jī)圖象顯微鏡分析被染色的腫瘤，該顯微鏡發(fā)射單波長(zhǎng)光(620nm)，測(cè)定染色腫瘤區(qū)的光密度。還分析了每份樣本的附近正常粘膜。各樣品特異性染色的目標(biāo)抗體閾值確定為分析陰性對(duì)照(對(duì)照IgG)切片，從血管抑制素染色區(qū)的值中扣除該值。如此，可以精確定量受體染色陽性細(xì)胞百分比。用此圖象分析技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)，陽性染色值高的患者其微血管密度也高，會(huì)在開始治療后的12個(gè)月內(nèi)因轉(zhuǎn)移而死亡。陽性染色值低的患者其微血管數(shù)也少，能至少保持2年不發(fā)病。數(shù)據(jù)見表3。

實(shí)施例32內(nèi)毒素研究用Sigma(St.Louis，MO)的計(jì)時(shí)凝膠形成內(nèi)毒素試劑盒分析血管抑制素樣品中內(nèi)毒素的存在，以確保沒有會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)的污染性內(nèi)毒素存在。血管抑制素樣品的測(cè)得值是0.0076pg內(nèi)毒素/mg蛋白質(zhì)。1ng以下認(rèn)為是對(duì)組織培養(yǎng)安全的。所以，顯然是血管抑制素本身具有抑制細(xì)胞活力的作用。實(shí)施例33活力研究將帶His尾的血管抑制素與帶His尾的對(duì)照GST蛋白比較，以證明His尾對(duì)細(xì)胞活力沒有任何影響。牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)在含37μg His尾血管抑制素或His尾GST的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。血管抑制素和GST都在pTrcHisA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌內(nèi)表達(dá)，通過非還原鎳親合性層析純化。用ALAMARBLUETM試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力。
圖39顯示，血管抑制素對(duì)細(xì)胞活力具有劑量依賴性作用，細(xì)胞活力隨著血管抑制素濃度的升高而降低。GST對(duì)細(xì)胞活力沒有任何作用。該研究顯示，在非變性條件下(即比變性條件更接近生理?xiàng)l件)，His尾對(duì)細(xì)胞活力沒有影響。實(shí)施例34抗血管抑制素抗體對(duì)血管抑制素介導(dǎo)的BAEC活力抑制的作用該研究檢測(cè)抗血管抑制素抗體對(duì)血管抑制素介導(dǎo)的BAEC活力抑制的作用。BAEC在含5μg/ml血管抑制素，5μg/ml血管抑制素加100μg/ml對(duì)照IgG，或5μg/ml血管抑制素加100μg/ml抗血管抑制素IgG的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。如前所述，用ALAMAR BLUETM試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力。
圖40顯示，抗血管抑制素IgG幾乎完全消除血管抑制素對(duì)BAEC活力的抑制。對(duì)照IgG沒有明顯作用。該實(shí)施例顯示，血管抑制素的作用是特異性的，不是由于制劑中的污染。實(shí)施例35血管抑制素對(duì)BAEC與基質(zhì)粘附的作用該實(shí)施例評(píng)價(jià)了血管抑制素對(duì)BAEC與基質(zhì)粘附的作用。處理組的細(xì)胞用血管抑制素(37μg/ml)預(yù)處理。對(duì)照組的細(xì)胞不接受預(yù)處理。立即將細(xì)胞(50,000)接種到涂有2μg纖連蛋白、TSP-1或BSA的微滴孔中。纖連蛋白是很強(qiáng)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，它吸引BAEC，以其作為陽性對(duì)照，BSA不是粘附蛋白，作為陰性對(duì)照。30分鐘后，將非粘附細(xì)胞吸出，用PBS洗孔，用2.5％戊二醛固定，用Giemsa染色，清點(diǎn)每1mm2上的粘附細(xì)胞數(shù)。
圖41顯示該研究的結(jié)果。在沒有用血管抑制素處理過的細(xì)胞內(nèi)，纖連蛋白組顯示很強(qiáng)的粘附，TSP-1組顯示強(qiáng)粘附。用血管抑制素處理細(xì)胞后，纖連蛋白組細(xì)胞的粘附不變(很強(qiáng)的粘附)，TSP-1組細(xì)胞的粘附則急遽降低。
這說明，加入血管抑制素顯著降低BAEC與涂在板上的TSP-1的粘附，但對(duì)作為陽性對(duì)照的纖連蛋白板則沒有作用。血管抑制素與TSP-特異性地相互作用，即破壞其粘附機(jī)制。實(shí)施例36血管抑制素氨基末端和羧基末端的功能該研究檢測(cè)血管抑制素的氨基末端(Met1-Lys132)和羧基末端部分(Ile248-Lys380)(分別為SEQ ID NO24和25)。將非變性重組血管抑制素片段的結(jié)合與全長(zhǎng)血管抑制素相比。用GST作為陰性對(duì)照。用光學(xué)結(jié)合法評(píng)價(jià)結(jié)合，該方法使用共價(jià)偶聯(lián)了TSP-1的比色杯。用極光束來檢測(cè)被測(cè)蛋白質(zhì)(片段、血管抑制素或GST)是否與TSP-1衍生的比色杯表面結(jié)合。用1μg TSP-1衍生比色杯。用1％BSA封閉比色杯表面，以防非特異性結(jié)合。加入以PBS緩沖液配制的被測(cè)蛋白質(zhì)10nM溶液。圖42的結(jié)果顯示，血管抑制素與其氨基末端片段(Met1-Lys132)的結(jié)合性非常近似，都是nmol級(jí)的。圖42顯示了與血管抑制素相比的活性百分比。GST和羧基末端片段沒有結(jié)合活性。實(shí)施例37血管抑制素氨基末端和羧基末端部分的功能該研究檢測(cè)血管抑制素的氨基末端(Met1-Lys132)和羧基末端(Ile248-Lys380)(分別為SEQ ID NO24和25)。將片段的抗內(nèi)皮活性與全長(zhǎng)血管抑制素蛋白的相比。
內(nèi)皮細(xì)胞與37μg/ml血管抑制素、其片段和GST共培養(yǎng)過夜。用ALAMARBLUETM試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力。
結(jié)果也顯示在圖42中，表示為片段與血管抑制素相比的抗內(nèi)皮活性百分比。結(jié)果顯示，氨基末端具有與全長(zhǎng)血管抑制素相同的抗內(nèi)皮活性。而且，此結(jié)合與氨基末端的抗內(nèi)皮活性具有良好的關(guān)聯(lián)性。
序列表<110>Tuszynski，GeorgeWilliams，Taffy<120>血管抑制素一種CYS-SER-VAL-THR-CYS-GLY特異性腫瘤細(xì)胞粘附受體<130>07206.0028<140><141><150>60/140，309<151>1999-06-21<150>60/176，626<151>2000-01-19<160>26<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>6<212>PRT<213>智人<400>1Cys Ser Val Thr Cys Gly1 5<210>2<211>380<212>PRT<213>智人<220><223>Xaa代表未知氨基酸<400>2Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met1 5 10 15Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala20 25 30Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn35 40 45Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu50 55 60Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro65 70 75 80Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala85 90 95Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala Phe100 105 110Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu Ala115 120 125Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Val Asn Val Asp Ile Ile Asn Phe Gly130 135 140Glu Glu Glu Val Asn Thr Glu Lys Leu Thr Ala Phe Val Asn Thr Leu145 150 155 160Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro Gly165 170 175Pro Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu Ala Gly Glu180 185 190Gly Gly Ala Met Leu Gly Leu Gly Ala Ser Asp Phe Glu Phe Gly Val195 200 205Asp Pro Ser Ala Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser Met210 215 220Glu Glu Gln Arg Gln Arg Gln Glu Glu Glu Ala Arg Arg Ala Ala Ala225 230 235 240Ala Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Gly Glu245 250 255Arg Asp Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu260 265 270Phe Gly Arg Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu275 280 285Gln Ile Ala Tyr Ala Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly290 295300Gln Ala Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser305 310 315 320Glu Pro Ala Lys Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Val Xaa Gln Asp Pro Glu325 330 335Phe Leu Gln Ser Val Leu Glu Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn340 345 350Glu Ala Ile Arg Asn Ala Met Gly Ser Leu Ala Ser Gln Ala Thr Lys355 360 365Asp Gly Lys Lys Asp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys370 375 380<210>3<211>377<212>PRT<213>智人<220><223>Xaa代表未知氨基酸<400>3Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met1 5 10 15Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala
20 25 30Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn35 40 45Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu50 55 60Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro65 70 75 80Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala85 90 95Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala Phe100 105 110Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu Ala115 120 125Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Val Asn Val Asp Ile Ile Asn Phe Gly130 135 140Glu Glu Glu Val Asn Thr Glu Lys Leu Thr Ala Phe Val Asn Thr Leu145 150 155 160Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro Gly165 170 175Pro Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu Ala Gly Glu180 185 190Gly Gly Ala Met Leu Gly Leu Gly Ala Ser Asp Phe Glu Phe Gly Val195 200 205Asp Pro Ser Ala Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser Met210 215 220Glu Glu Gln Arg Gln Arg Gln Glu Glu Glu Ala Arg Arg Ala Ala Ala225 230 235 240Ala Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Asp Ser245 250 255Asp Asp Ala Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu Phe Gly Arg260 265 270Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu Gln Ile Ala275 280 285Tyr Ala Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly Gln Ala Glu290 295 300Ser Ala Asp Ile Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser Glu Pro Ala305 310 315 320Lys Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Val Xaa Gln Asp Pro Glu Phe Leu Gln325 330 335Ser Val Leu Glu Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn Glu Ala Ile340 345 350Arg Asn Ala Met Gly Ser Leu Ala Ser Gln Ala Thr Lys Asp Gly Lys355 360 365Lys Asp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys370 375<210>4<211>1259<212>DNA<213>智人<220><221>CDS<222>(1)..(1140)<223>n/Xaa代表未知堿基/氨基酸<400>4atg gtg ttg gaa agc act atg gtg tgt gtg gac aac agt gag tat atg 48Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met1 5 10 15cgg aat gga gac ttc tta ccc acc agg ctg cag gcc cag cag gat gct 96Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala20 25 30gtc aac ata gtt tgt cat tca aag acc cgc agc aac cct gag aac aac 144Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn35 40 45gtg ggc ctt atc aca ctg gct aat gac tgt gaa gtg ctg acc aca ctc 192Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu50 55 60acc cca gac act ggc cgt atc ctg tcc aag cta cat act gtc caa ccc 240Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro65 70 75 80aag ggc aag atc acc ttc tgc acg ggc atc cgc gtg gcc cat ctg gct 288Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala85 90 95ctg aag cac cga caa ggc aag aat cac aag atg cgc atc att gcc ttt 336Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala Phe100 105 110gtg gga agc cca gtg gag gac aat gag aag gat ctg gtg aaa ctg gct 384Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu Ala115 120 125aaa cgc ctc aag aag gag aaa gta aat gtt gac att atc aat ttt ggg 432Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Val Asn Val Asp Ile Ile Asn Phe Gly130 135 140gaa gag gag gtg aac aca gaa aag ctg aca gcc ttt gta aac acg ttg 480Glu Glu Glu Val Asn Thr Glu Lys Leu Thr Ala Phe Val Asn Thr Leu145 150 155 160aat ggc aaa gat gga acc ggt tct cat ctg gtg aca gtg cct cct ggg 528Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro Gly165 170 175ccc agt ttg gct gat gct ctc atc agt tct ccg att ttg gct ggt gaa 576Pro Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu Ala Gly Glu180 185 190ggt ggt gcc atg ctg ggt crt ggt gcc agt gac ttt gaa ttt gga gta 624Gly Gly Ala Met Leu Gly Leu Gly Ala Ser Asp Phe Glu Phe Gly Val195 200 205gat ccc agt gct gat cct gag ctg gcc ttg gcc ctt cgt gta tct atg 672Asp Pro Ser Ala Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser Met210 215 220gaa gag cag cgg cag cgg cag gag gag gag gcc cgg cgg gca gct gca 720Glu Glu Gln Arg Gln Arg Gln Glu Glu Glu Ala Arg Arg Ala Ala Ala225 230 235 240gct tct gct gct gag gcc ggg att gct acg act ggg act gaa ggt gaa 768Ala Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Gly Glu245 250 255aga gac tca gac gat gcc ctg ctg aag atg acc atc agc cag caa gag 816Arg Asp Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu260 265 270ttt ggc cgc act ggg ctt cct gac cta agc agt atg act gag gaa gag 864Phe Gly Arg Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu275 280 285cag att gct tat gcc atg cag atg tcc ctg cag gga gca gag ttt ggc 912Gln Ile Ala Tyr Ala Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly290 295 300cag gcg gaa tca gca gac att gat gcc agc tca gct atg gac aca tcc 960Gln Ala Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser305 310 315 320gag cca gcc aag gag gag gat gat tac gac gtg atn cag gac ccc gag 1008Glu Pro Ala Lys Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Val Xaa Gln Asp Pro Glu325 330 335ttc ctt cag agt gtc cta gag aac ctc cca ggt gtg gat ccc aac aat 1056Phe Leu Gln Ser Val Leu Glu Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn340 345 350gaa gcc att cga aat gct atg ggc tcc ctg gcc tcc cag gcc acc aag 1104Glu Ala Ile Arg Asn Ala Met Gly Ser Leu Ala Ser Gln Ala Thr Lys355 360 365gac ggc aag aag gac aag aag gag gaa gac aag aag tgagactgga1150Asp Gly Lys Lys Asp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys370 375 380gggaaagggt agctgagtct gcttagggga ctgcatggga agcacggaat atagggttag 1210atgtgtgtta tctgtaacca ttacagccta aataaagctt ggcaacttt 1259<210>5<211>1250<212>DNA<213>智人<220><221>CDS<222>(1)..(1131)<223>n/Xaa代表未知的堿基/氨基酸<400>5atg gtg ttg gaa agc act atg gtg tgt gtg gac aac agt gag tat atg 48Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met1 5 10 15cgg aat gga gac ttc tta ccc acc agg ctg cag gcc cag cag gat gct 96Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala20 25 30gtc aac ata gtt tgt cat tca aag acc cgc agc aac cct gag aac aac 144Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn35 40 45gtg ggc ctt atc aca ctg gct aat gac tgt gaa gtg ctg acc aca ctc 192Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu
50 55 60acc cca gac act ggc cgt atc ctg tcc aag cta cat act gtc caa ccc 240Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro65 70 75 80aag ggc aag atc acc ttc tgc acg ggc atc cgc gtg gcc cat ctg gct 288Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala85 90 95ctg aag cac cga caa ggc aag aat cac aag atg cgc atc att gcc ttt 336Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala Phe100 105 110gtg gga agc cca gtg gag gac aat gag aag gat ctg gtg aaa ctg gct 384Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu Ala115 120 125aaa cgc ctc aag aag gag aaa gta aat gtt gac att atc aat ttt ggg 432Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Val Asn Val Asp Ile Ile Asn Phe Gly130 135 140gaa gag gag gtg aac aca gaa aag ctg aca gcc ttt gta aac acg ttg 480Glu Glu Glu Val Asn Thr Glu Lys Leu Thr Ala Phe Val Asn Thr Leu145 150 155 160aat ggc aaa gat gga acc ggt tct cat ctg gtg aca gtg cct cct ggg 528Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro Gly165 170 175ccc agt ttg gct gat gct ctc atc agt tct ccg att ttg gct ggt gaa 576Pro Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu Ala Gly Glu180 185 190ggt ggt gcc atg ctg ggt ctt ggt gcc agt gac ttt gaa ttt gga gta 624Gly Gly Ala Met Leu Gly Leu Gly Ala Ser Asp Phe Glu Phe Gly Val195 200 205gat ccc agt gct gat cct gag ctg gcc ttg gcc ctt cgt gta tct atg 672Asp Pro Ser Ala Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser Met210 215 220gaa gag cag cgg cag cgg cag gag gag gag gcc cgg cgg gca gct gca 720Glu Glu Gln Arg Gln Arg Gln Glu Glu Glu Ala Arg Arg Ala Ala Ala225 230 235 240gct tct gct gct gag gcc ggg att gct acg act ggg act gaa gac tca 768Ala Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Asp Ser245 250 255gac gat gcc ctg ctg aag atg acc atc agc cag caa gag ttt ggc cgc 816Asp Asp Ala Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu Phe Gly Arg260 265 270act ggg ctt cct gac cta agc agt atg act gag gaa gag cag att gct 864Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu Gln Ile Ala275 280 285tat gcc atg cag atg tcc ctg cag gga gca gag ttt ggc cag gcg gaa 912Tyr Ala Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly Gln Ala Glu290 295 300tca gca gac att gat gcc agc tca gct atg gac aca tcc gag cca gcc 960Ser Ala Asp Ile Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser Glu Pro Ala305 310 315 320aag gag gag gat gat tac gac gtg atn cag gac ccc gag ttc ctt cag 1008Lys Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Val Xaa Gln Asp Pro Glu Phe Leu Gln325 330 335agt gtc cta gag aac ctc cca ggt gtg gat ccc aac aat gaa gcc att 1056Ser Val Leu Glu Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn Glu Ala Ile340 345 350cga aat gct atg ggc tcc ctg gcc tcc cag gcc acc aag gac ggc aag 1104Arg Asn Ala Met Gly Ser Leu Ala Ser Gln Ala Thr Lys Asp Gly Lys355 360 365aag gac aag aag gag gaa gac aag aag tgagactgga gggaaagggt 1151Lys Asp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys370 375agctgagtct gcttagggga ctgcatggga agcacggaat atagggttag atgtgtgtta 1211tctgtaacca ttacagccta aataaagctt ggcaacttt1250<210>6<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<220><221>MOD_RES<222>(1)<223>Cys(Acm)<220><221>MOD_RES<222>(5)<223>Cys(Acm)<400>6Cys Ser Val Thr Cys Gly1 5<210>7<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Cys(Acm)<220><221>MOD_RES<222>(6)<223>Cys(Acm)<400>7Val Cys Thr Gly Ser Cys1 5<210>8<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<400>8Val Cys His Ser Lys Thr Arg1 5<210>9<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Cys(Acm)<400>9Val Cys His Ser Lys Thr Arg1 5<210>10<211>5<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<400>10Pro His Ser Arg Asn1 5<210>11<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<400>11Ala Ser Val Thr Ala Arg1 5<210>12<211>27<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的說明引物<400>12gggagatcta tggtgttgga aagcact27<210>13<211>27<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的說明引物<400>13ggggaattct cacttcttgt cttcctc 27<210>14<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<400>14Lys Val Trp Val Leu Pro Ile1 5<210>15<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<400>15Val Cys Thr Gly Ser Cys1 5<210>16<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<400>16Lys Ser Trp Val Ile Pro Gln1 5<210>17<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<400>17Lys Leu Trp Val Ile Pro Gln1 5<210>18<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<400>18Lys Val Trp Val Leu Pro Ile1 5<210>19<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<400>19Lys Val Trp Val Leu Ile Pro1 5<210>20<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<400>20Lys Val Trp Ile Val Ser Thr1 5<210>21<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<400>2lVal Cys Thr Gly Ser Cys Gly1 5<210>22<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<400>22Cys Ser Val Thr Cys Gly1 5<210>22<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Cys(ACm)<220><221>MOD_RES<222>(6)<223>Cys(Acm)<400>23Gly Cys Thr Val Ser Cys1 5<210>24<211>132<212>PRT<213>智人<400>24Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met1 5 10 15Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala20 25 30Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn35 40 45Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu50 55 60Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro65 70 75 80Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala85 90 95Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala Phe100 105 110Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu Ala115 120 125Lys Arg Leu Lys130<210>25<211>133<212>PRT<213>智人<220><223>Xaa代表未知氨基酸<400>25Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Gly Glu Arg Asp Ser Asp Asp Ala Leu1 5 10 15Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu Phe Gly Arg Thr Gly Leu Pro20 25 30Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu Gln Ile Ala Tyr Ala Met Gln35 40 45Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly Gln Ala Glu Ser Ala Asp Ile50 55 60Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser Glu Pro Ala Lys Glu Glu Asp65 70 75 80Asp Tyr Asp Val Xaa Gln Asp Pro Glu Phe Leu Gln Ser Val Leu Glu85 90 95Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn Glu Ala Ile Arg Asn Ala Met100 105 110Gly Ser Leu Ala Ser Gln Ala Thr Lys Asp Gly Lys Lys Asp Lys Lys115 120 125Glu Glu Asp Lys Lys130<210>26<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的說明合成肽<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Cys(Acm)<220><221>MOD_RES<222>(6)<223>Cys(Acm)<400>26Val Cys Thr Gly Ser Cys Gly1 權(quán)利要求
1.一種純化的受體蛋白，對(duì)血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1)的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO1)區(qū)具有特異性結(jié)合親和力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的受體，含有的序列選自SEQ ID NO2和SEQ IDNO3，及它們的片段和突變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的受體，其中的片段含有SEQ ID NO24或其片段或突變體。
4.一種使用模擬血小板反應(yīng)蛋白活性的抗體的治療方法，包括分離權(quán)利要求1或2所述的受體，產(chǎn)生此受體的抗體，用此抗體治療患者。
5.一種使用抑制血小板反應(yīng)蛋白活性的抗體的治療方法，包括分離權(quán)利要求1所述的受體，產(chǎn)生此受體的抗體，用此抗體治療患者。
6.一種使用抑制血小板反應(yīng)蛋白活性的配體的治療方法，包括分離權(quán)利要求1所述的受體，產(chǎn)生此受體的配體，用此配體治療患者。
7.一種檢測(cè)惡性腫瘤的方法，包括檢測(cè)權(quán)利要求1所述受體的存在，判斷是否存在惡性腫瘤。
8.一種用模仿血小板反應(yīng)蛋白活性的配體的治療方法，包括分離權(quán)利要求1所述的受體，產(chǎn)生此受體的配體，用此配體治療患者。
9.一種用權(quán)利要求1所述受體的治療方法，包括將此受體給予患者，讓該受體競(jìng)爭(zhēng)性抑制血小板反應(yīng)蛋白的活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，該方法抑制或逆轉(zhuǎn)血管生成。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，該方法抑制、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)腫瘤生長(zhǎng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，該方法延長(zhǎng)患者的生命。
13.一種用權(quán)利要求1所述受體的片段的治療方法，包括將該受體的片段給予患者，讓該片段競(jìng)爭(zhēng)性抑制血小板反應(yīng)蛋白的活性。
14.一種診斷腫瘤患者或確定其預(yù)后的方法，包括測(cè)定權(quán)利要求1所述受體的水平，相對(duì)轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性腫瘤的已知水平進(jìn)行評(píng)估。
15，一種治療癌癥的組合物，含有與靶向部分連接的化療藥物，靶向部分選自針對(duì)權(quán)利要求1所述受體的抗體或針對(duì)權(quán)利要求1所述受體的配體。
16.一種治療癌癥的組合物，含有與靶向部分連接的放射性部分，靶向部分選自針對(duì)權(quán)利要求1所述受體的抗體或針對(duì)權(quán)利要求1所述受體的配體。
17.一種治療癌癥的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求16所述組合物，可以用藥學(xué)上認(rèn)可的載體，讓靶向部分導(dǎo)向癌癥，讓放射性部分治療癌癥。
18.一種用于放射性檢測(cè)癌癥，診斷癌癥和定量評(píng)價(jià)對(duì)癌癥治療方法的療效應(yīng)答的組合物，含有與靶向部分連接的放射性部分，靶向部分選自針對(duì) 1所述受體的抗體或針對(duì)權(quán)利要求1所述受體的配體。
19.一種用于放射性檢測(cè)癌癥，診斷癌癥和定量評(píng)價(jià)對(duì)癌癥治療方法的療效應(yīng)答的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求18所述組合物，可以用藥學(xué)上認(rèn)可的載體，讓靶向部分導(dǎo)向癌癥，讓放射性部分標(biāo)記癌癥，然后檢測(cè)癌癥、診斷癌癥或定量評(píng)價(jià)對(duì)癌癥治療方法的療效應(yīng)答。
20.一種用于MRI檢測(cè)癌癥，診斷癌癥和定量評(píng)價(jià)對(duì)癌癥治療方法的療效應(yīng)答的組合物，含有與靶向部分連接的MRI增強(qiáng)劑，靶向部分選自針對(duì) 1所述受體的抗體或針對(duì)權(quán)利要求1所述受體的配體。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中MRI增強(qiáng)劑選自釓、錳和鐵。
22.一種用于MRI檢測(cè)癌癥，診斷癌癥和定量評(píng)價(jià)對(duì)癌癥治療方法的療效應(yīng)答的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求20所述組合物，可以用藥學(xué)上認(rèn)可的載體，讓靶向部分導(dǎo)向癌癥，用MRI檢測(cè)癌癥、診斷癌癥或定量評(píng)價(jià)對(duì)癌癥治療方法的療效應(yīng)答，讓MRI增強(qiáng)劑增強(qiáng)MRI。
23.一種生物醫(yī)學(xué)設(shè)備，包括獲取細(xì)胞的工具，該細(xì)胞獲取工具與靶向部分連接，該靶向部分選自針對(duì)權(quán)利要求1所述受體的抗體或針對(duì)權(quán)利要求1所述受體的配體。
24.一種設(shè)計(jì)模擬或抑制血小板反應(yīng)蛋白活性的藥物的方法，包括開發(fā)一種候選藥物，評(píng)價(jià)其與權(quán)利要求1所述受體的結(jié)合能力。
25.一種降低內(nèi)皮細(xì)胞活力的方法，包括給予藥學(xué)上可接受量的權(quán)利要求1所述純化受體蛋白，讓它與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用從而降低內(nèi)皮細(xì)胞活力。
26.一種降低細(xì)胞粘附活性的方法，包括給予藥學(xué)上可接受量的權(quán)利要求1所述純化受體蛋白，讓它與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用從而降低細(xì)胞粘附活性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對(duì)血小板反應(yīng)蛋白的Cys－Ser－Val－Thr－Cys－Gly(SEQ IDNO:1)區(qū)具有特異性的細(xì)胞基質(zhì)受體的序列。本發(fā)明還提供純化、克隆和表達(dá)方法。該受體蛋白可廣泛用于診斷、預(yù)防和治療領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1335887SQ00801745
公開日2002年2月13日 申請(qǐng)日期2000年6月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月21日
發(fā)明者G·圖沙伊斯基, T·威廉姆斯 申請(qǐng)人:印坎藥物股份有限公司, 費(fèi)城健康及教育有限公司