專利名稱：：重組人血管內(nèi)皮抑制素在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及重組人血管內(nèi)皮抑制素的制藥用途，該藥物可用于子宮內(nèi)膜異位癥的治療。
背景技術(shù)：
：正常的子宮內(nèi)膜覆蓋于子宮體腔面，如因某種因素使子宮內(nèi)膜在身體其他部位生長(zhǎng)，即可成為子宮內(nèi)膜異位癥。子宮內(nèi)膜異位癥是一種具有侵襲性的婦科常見(jiàn)病，可侵入包繞盆腔的腹膜、懸吊子宮的韌帶、子宮的近鄰一膀胱、直腸，以及大網(wǎng)膜、闌尾、小腸、腹壁切口，遠(yuǎn)及肝臟、膽嚢、腎臟、肺臟、胸腔、四肢肌肉及骨骼等臟器，甚至有發(fā)生在前庭大腺內(nèi)的異位病灶，有時(shí)輸卵管壁亦可以被累及。近年來(lái)該病的發(fā)病率具有明顯上升的趨勢(shì)。子宮內(nèi)膜異位癥臨床表現(xiàn)有通經(jīng)、慢性盆腔痛、原發(fā)或繼發(fā)不孕、月經(jīng)失調(diào)、性交痛、腸功能改變及泌尿系統(tǒng)癥狀等。子宮內(nèi)膜異位癥不孕發(fā)生率高達(dá)30%~40%,給婦女的身心健康帶來(lái)較大傷害。人血管內(nèi)皮抑制素(endostatin)是膠原XVIII羧基端的一段分子量大小為20kDa的酶切產(chǎn)物，具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，和體內(nèi)血管生成的活性，是目前已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管形成抑制因子。重組人血管內(nèi)皮抑制素是利用DNA重組工程技術(shù)，以原核或真核表達(dá)載體，將人血管內(nèi)皮抑制素基因經(jīng)克隆、表達(dá)和純化得到的有血管生成抑制活性形式的蛋白質(zhì)。中國(guó)發(fā)明專利(專利公開號(hào)為CN1324818A,公開日為2001年12月5日，發(fā)明名稱為"生產(chǎn)內(nèi)皮抑制素的方法")提供了一種改良的，以更高的產(chǎn)率和更簡(jiǎn)單的純化工藝生產(chǎn)重組人內(nèi)皮抑制素的方法。該發(fā)明利用DNA重組工程技術(shù)，以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，以簡(jiǎn)單的方法和較低的成本大批量生產(chǎn)N末端帶有(Met)GlyGlyXaaHisHisHisHisHis附加氨基酸序列的人血管內(nèi)皮抑制素(其中Xaa代表中性氨基酸或不存在)，不僅保留了endostatin的完全的生物學(xué)活性，而且沒(méi)有產(chǎn)生因加入附加N端序列所致的體內(nèi)免疫性。上述附加氨基酸序列不僅提高了內(nèi)皮抑制素結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始效率，有利于重組蛋白的純化，而且附加氨基酸序列的結(jié)構(gòu)也增加了重組蛋白的穩(wěn)定性。激素療法和手術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)用于治療子宮內(nèi)膜異位癥的兩種主要治療方式。使用激素的副反應(yīng)較多，如毛發(fā)增多、聲音變粗、水肺、體重增加等，常常導(dǎo)致中途停藥，影響療效，從而限制了這些藥物的臨床應(yīng)用。手術(shù)治療療程短，尤其對(duì)重癥者、纖維化多、粘連緊密、藥物不易奏效的病例比較適用。但即使有限的外科治療也可導(dǎo)致生育率顯著下降，而且多達(dá)40%的患者在五年內(nèi)還需再;欠手術(shù)，單用手術(shù)不能期望能治愈該疾病。
發(fā)明內(nèi)容子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期婦女的常見(jiàn)病和多發(fā)病，雖為良性，但其發(fā)生、發(fā)展卻與胂瘤類似，存在明顯的新生血管依賴性。有研究證實(shí)，子宮內(nèi)膜異位在腹腔內(nèi)生成，必須由新生血管提供足夠的血供，患者腹腔液中血管生成因子的活性也明顯增高，用腹腔鏡觀察發(fā)現(xiàn)典型的異位內(nèi)膜病灶周圍有新生的毛細(xì)血管圍繞。這些證據(jù)提示我們，新生血管的生長(zhǎng)不僅是子宮內(nèi)膜異位癥的一個(gè)重要病理表現(xiàn)，也可能在發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。從這個(gè)機(jī)制上考慮，如果能用某些治療手段特異性地抑制異位病灶新生血管的增殖，則可能為治療子宮內(nèi)膜異位癥帶來(lái)新的突破。為了克服子宮內(nèi)膜異位癥傳統(tǒng)療法副反應(yīng)大、復(fù)發(fā)率高的缺陷，本發(fā)明提供了重組人血管內(nèi)皮抑制素的一種制藥用途，具體是使用重組人血管內(nèi)皮抑制素制備治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物的制藥用途，該藥物具有特異性強(qiáng)、無(wú)毒、無(wú)耐藥性的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案涉及重組人血管內(nèi)皮抑制素在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物中的應(yīng)用。本文中所述重組人血管內(nèi)皮抑制素保留了endostatin的完全的生物學(xué)活性，可運(yùn)用基因工程手段獲得，通過(guò)將人的血管內(nèi)皮抑制素基因或?qū)⒏臉?gòu)的人血管內(nèi)皮抑制素基因構(gòu)建到大腸桿菌(￡.CoH)或畢赤酵母(Piciiiapa^oris)表達(dá)系統(tǒng)中，經(jīng)過(guò)發(fā)酵、分離、純化等手,殳得到。本發(fā)明中優(yōu)選的重組人血管內(nèi)皮抑制素是在人血管內(nèi)皮抑制素編碼氨基酸序列的起始氨基酸Met后依次添加0-4個(gè)任意氨基酸和2-8個(gè)組氨酸序列。其制備方法同中國(guó)發(fā)明專利(專利公開號(hào)為CN1324818A，公開日為2001年12月5日，發(fā)明名稱為"生產(chǎn)內(nèi)皮抑制素的方法")。上述重組人血管內(nèi)皮抑制素的起始氨基酸Met可能被切除，原因是在表達(dá)宿主中蛋白翻譯后加工過(guò)程中可能被刪除。本發(fā)明優(yōu)選的重組人血管內(nèi)皮抑制素的氨基酸序列如SEQIDN0:1NO:2相同，該序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的制備方法和上述公開專利的制備實(shí)施例相同。上述治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物的制劑可以是注射液或凍干制劑。所述述藥物的活性組分可以是重組人血管內(nèi)皮抑制素、PEG修飾的重組人血管內(nèi)皮抑制素或重組人血管內(nèi)皮抑制素孩i球。所述PEG的分子量是5000-30000,PEG通過(guò)共價(jià)鍵(如琥珀酰亞氨基或巰基)與重組人血管內(nèi)皮抑制素相連。所述重組人血管內(nèi)皮抑制素微球是通過(guò)基質(zhì)材料與重組人血管內(nèi)皮抑制素混合制備而成，其基質(zhì)材料可以是聚乳酸羥基乙酸嵌段共聚物(PLGA),聚乙醇酸(PLA)等。上述治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物中還含有保護(hù)劑和pH值調(diào)節(jié)劑。所述保護(hù)劑選自多元醇、糖類、氨基酸、表面活性劑，人血白蛋白、EDTA和NaCl。所述藥物的pH值范圍是4.0-8.5。本發(fā)明中所述治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物可與手術(shù)或激素類藥物聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明還公開了一種治療子宮內(nèi)膜異位癥的重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液，其特征在于它是由重組人血管內(nèi)皮抑制素和藥用輔料配制而成按每毫升注射液計(jì)含有重組人血管內(nèi)皮抑制素lmg~10mg、甘露醇5mg~80mg，pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH值為4.0~8.5。本發(fā)明的實(shí)施例中還公開了重組人血管內(nèi)皮抑制素凍干制劑的制備工藝，該工藝制得的凍干制劑產(chǎn)品穩(wěn)定性好，能夠長(zhǎng)期保存。凍干制劑使用時(shí)需要溶于注射用水中，使用量根據(jù)病變程度酌情使用。本發(fā)明適用于各種原因引起的子宮內(nèi)膜異位癥的治療，治療劑量可根據(jù)病情酌情加減，一般采用病變局部注射或靜脈注射的方法應(yīng)用。為了更好的說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合藥物實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床實(shí)驗(yàn)說(shuō)明其在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物中的用途。在下文的實(shí)驗(yàn)例以及制備實(shí)施例中所使用的重組人血管內(nèi)皮抑制素具有SEQIDN0:1所示的氨基酸序列。如無(wú)特殊說(shuō)明，下文中所涉及的實(shí)驗(yàn)用材料均可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。1、子宮內(nèi)膜異位癥雞胚絨毛尿嚢膜模型實(shí)驗(yàn)將子宮內(nèi)膜異位癥患者在位子宮內(nèi)膜組織(lmmxlmmxlmm)接種于8天胎齡的雞胚絨毛尿嚢膜上的相對(duì)無(wú)血管區(qū)，建立子宮內(nèi)膜異位癥雞胚絨毛尿嚢膜模型，分設(shè)接種組、接種治療組(重組人血管內(nèi)皮抑制素)和空白組，前兩組各20枚。接種24h后，以無(wú)菌明膠海綿為載體，接種組每只給予生理鹽水20ja1/d，接種治療組每只每天給予重組人血管內(nèi)皮抑制素5|ag/20)al，空白組另設(shè)空白載體組和單純空白組，各10枚，不接種子宮內(nèi)膜組織，空白載體組以無(wú)菌明膠海綿為載體，給予生理鹽水20|Lil/d,單純空白組則在開窗后即予無(wú)菌貼膜封口，用以排除胚蛋開窗后污染、操作技術(shù)等非處理因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。接種72h后加入固定液固定15min，剪下雞胚絨毛尿嚢膜，平鋪于濾紙并攝片。顯孩i鏡下計(jì)數(shù)載體盤周圍5mm范圍的血管分支點(diǎn)數(shù)。部分雞胚絨毛尿嚢膜用10%曱醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，.光鏡觀察。結(jié)果接種組雞胚絨毛尿嚢膜血管生成反應(yīng)明顯增強(qiáng)，血管數(shù)目顯著高于對(duì)照組；接種治療組血管數(shù)目顯著低于接種組(見(jiàn)表1);接種治療組病灶在光鏡下可見(jiàn)明顯壞死，重組人血管內(nèi)皮抑制素能明顯抑制子宮內(nèi)膜異位病灶形成。表1血管內(nèi)皮抑制素對(duì)子宮內(nèi)膜異位病灶血管生成的抑制作用分組__血管分支點(diǎn)數(shù)4妄種組2035.2±5.14'空白載體組1021.6±3.89"單純空白組1018.6±2.76^妄種治療組_^_19.4±3.65_*P<0.01,4妻種組和空白載體組、單純空白組及接種治療組相比壽交；**P>0.05,空白載體組和單純空白組相比較。結(jié)論子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜能明顯促進(jìn)雞胚絨毛尿嚢膜的血管生成，重組人血管內(nèi)皮抑制素能顯著抑制子宮內(nèi)膜異位病灶的血管形成，并抑制子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)，說(shuō)明抗血管途徑是治療子宮內(nèi)膜異位癥的有效策略之一。2、子宮內(nèi)膜異位癥鼠模型實(shí)驗(yàn)取子宮內(nèi)膜異位癥患者在位子宮內(nèi)膜組織，減成l2mn^大小，每15小塊加200nlPBS配成組織懸液。選取雌性重度復(fù)合性免疫缺陷病(severecombinedimmtmodefieiencydisease,SCID)小鼠50支，6~8周齡,體重2025g，隨機(jī)分成5組(見(jiàn)表2),SPF(specificpathogenfree)條件飼養(yǎng)。小鼠用乙醚麻醉后，消毒腹部，取臍下正中穿刺點(diǎn)，用16號(hào)注射器針頭將組織懸液接種于小鼠皮下。接種后第2天，于小鼠腿部肌肉注射O.02ml(lmg/ml)苯曱酸雌二醇，以促進(jìn)種植內(nèi)膜的生長(zhǎng)。接種后第3周開始給予用藥(見(jiàn)表2),連續(xù)注射2周。每隔2天以游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下病灶的長(zhǎng)和寬，根據(jù)公式體積V(mm3)=0.52_x長(zhǎng)x寬H十算病灶體積。末次注射24小時(shí)后，全部處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，異位病灶稱重后多聚甲醛固定。病灶標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡觀察腺體、間質(zhì)和上皮的變化；采用免疫組化檢測(cè)微血管密度，微血管密度(microvasculardensity,MVD)的i十算參照文獻(xiàn)。結(jié)果用藥前各組異位病灶生長(zhǎng)情況基本相同，用藥后治療組病灶體積增長(zhǎng)緩慢，并且用藥后期病灶體積有縮小趨勢(shì)。治療組病灶重量及體積低于對(duì)照組(P〈0.05),見(jiàn)表2。標(biāo)本HE染色，光鏡下可見(jiàn)治療組腺體萎縮，結(jié)構(gòu)不完整，間質(zhì)伴有不同程度的壞死。表2血管內(nèi)皮抑制素對(duì)小鼠異位病灶重量與體積的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與生理鹽水對(duì)照組比，*P<0.05血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記抗原CD34免疫組化染色(TjaimaW,VanMarckE,WeylerJ,etal.Quantificationandprognosticrelevanceofangiogenicparametersininvasivecervicalcancer.BrJCancer,1998,78(2):170~174.)定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色，微血管有的形成管腔，有的僅為單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇。接種4周異位病灶MVD(14.76/個(gè)/HPF(高倍視野))比1周MVD(4.23個(gè)/HPF)顯著增加(P<0.05)。對(duì)照組MVD為14.76±3.22個(gè)/HPF,治療組MVD為5.34±1.86個(gè)/HPF，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論重組人血管內(nèi)皮抑制素具有抑制子宮內(nèi)膜異位癥病灶生長(zhǎng)和血管生成的作用。上述藥物試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜能明顯促進(jìn)雞胚絨毛尿嚢膜的血管生成，重組人血管內(nèi)皮抑制素能顯著抑制子宮內(nèi)膜異位病灶的血管形成，并抑制子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)，病灶在光鏡下可見(jiàn)明顯壞死；重組人血管內(nèi)皮抑制素能抑制小鼠子宮內(nèi)膜異位癥病灶生長(zhǎng)和血管生成，光鏡下可見(jiàn)治療組腺體萎縮，結(jié)構(gòu)不完整，間質(zhì)伴有不同程度的壞死。以下通過(guò)臨床療效觀察來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明藥物的有益效果。病例一女，28歲，已婚。結(jié)婚2年半同居未孕，痛經(jīng)，經(jīng)前半月乳房脹痛、拒按，體溫曲線呈單相，提示不排卵。婦檢、B超等檢查，診斷為子宮內(nèi)膜異位癥，右側(cè)卵巢巧克力嚢腫，證屬胞宮瘀阻而不孕。使用重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液，每天一次，每次7.5mg重組人血管內(nèi)皮抑制素，連續(xù)使用14天后，痛經(jīng)明顯減輕，乳房脹痛程度減輕，時(shí)間縮短為4天，停經(jīng)36天，尿妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性，診斷為早孕，后生產(chǎn)一男嬰。病例二女，43歲，已婚。痛經(jīng)，月經(jīng)紊亂，血暗紅，淋漓不盡，確診為子宮內(nèi)膜異位癥。使用重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液，每天一次，每次7.5mg重組人血管內(nèi)皮抑制素，連續(xù)使用14天后，宮血停止，腹痛消失。用重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液治療的297例子宮內(nèi)膜異位癥的臨床療效情況統(tǒng)計(jì)如下病例選擇子宮內(nèi)膜異位癥患者297例，年齡18-45歲，平均34歲，病程最短l年，最長(zhǎng)18年，已婚255例，已婚不孕102例，異位部位后穹窿性包塊121例，子宮骶韌帶15例，主韌帶12例，一側(cè)及雙側(cè)附件嚢性包塊18例，符合中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合研究會(huì)婦產(chǎn)科專業(yè)委員會(huì)第三屆學(xué)術(shù)會(huì)議修定的子宮內(nèi)膜異位癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。靜脈滴注本品，治愈96例，治愈率32.3%,其中手術(shù)后用本品，治愈率83.3%;顯效142例，有效55例，有效率98.7°/;無(wú)效4例。無(wú)毒副作用或其他不良反應(yīng)發(fā)生，表明該藥在臨床使用安全有效，特別是手術(shù)后用藥，治愈率高。本發(fā)明的有益效果是1)挖掘了重組人血管內(nèi)皮抑制素的新的適應(yīng)癥的治療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。2)本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑制素特異抑制異位病灶新生血管的增殖，安全無(wú)毒，無(wú)耐藥性，預(yù)示著有很好的應(yīng)用前景。3)本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合手術(shù)或其它藥物治療的效果顯著，治愈率高。在手術(shù)后使用重組人血管內(nèi)皮抑制素可使殘存的病灶萎縮、消退、有效控制子宮內(nèi)膜異位癥的復(fù)發(fā)。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1配制含有重組人血管內(nèi)皮抑制素的注射液，使其每毫升含有血管內(nèi)皮抑制素5mg、甘露醇40mg,加入濃度為40mM醋酸鈉調(diào)節(jié)pH值為5.5。過(guò)濾除菌，無(wú)菌灌裝，每支3ml。用法與用量每天一支，注入300500ml生理鹽水或葡萄糖注射液中，靜脈滴注3~4個(gè)小時(shí)。實(shí)施例2使用30mMpH5.5土0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制151.5ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入20°/。甘露醇60ml及20y。蔗糖溶液7.5ml，補(bǔ)加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液2.98ml,加入注射水至300ml。經(jīng)O.22lim微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于預(yù)灌封注射器中，于4'C保存。實(shí)施例3:使用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制90.9ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入20%甘露醇60ml，補(bǔ)加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液4.20ml，加入注射水至300ml。經(jīng)0.22Hm微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-40°C，保持3-4小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-20。C，保持8小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至25°C,保持6小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。實(shí)施例4:使用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制151.5ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入20%甘露醇60ml及20%蔗糖溶液15ml,補(bǔ)加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液2.98ml,加入注射水至300ml。經(jīng)0.22jam微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-40°C,保持4-5小時(shí),抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-25。C,保持10小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至30°C,保持4小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。實(shí)施例5:使用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制97.8ml濃度為30.61mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入20%甘露醇60ml及20%_^糖溶液60ml,補(bǔ)加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液4.04ml,加入注射水至300ml。經(jīng)0.22jum微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-45°C,保持6小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-30°C，保持6小時(shí)，再加熱升高溫度至-25。C,保持6小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至25。C,保持8小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)真空壓塞后取出，軋蓋。實(shí)施例6:使用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制147ml濃度為30.61mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入20%甘露醇60ml、20%蔗糖溶液60ml及20。/。海藻糖溶液30ml，補(bǔ)加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液3.06ml,加入注射水至300ml。經(jīng)0.22nm孩i孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-45。C,保持2-4小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-3(TC,保持12小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至3(TC,保持6小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。實(shí)施例7:使用10mMpH6.0±0.5左右的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制30ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入2°/。甘氨酸15ml、吐溫-800.I5ml,補(bǔ)加1.0MpH6.5左右的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液2.70ml，加入注射水至300ml。經(jīng)0.22laiM鼓孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-4(TC,保持2-4小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-3(TC，保持8小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至30。C,保持8小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。.實(shí)施例8:使用10mMpH7.0±0.5左右的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制73.5ml濃度為30.61mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入2%EDTA30ml、20%甘露醇溶液30ml及20%蔗糖溶液7.5ml，補(bǔ)加1.5MpH7.0±0.5左右的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液2.26ml,加入注射水至300ml。經(jīng)0.22jam微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至_45°C，保持8小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-30°C,保持12小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至25°C，保持10小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。實(shí)施例9:使用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制15ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入10°/谷氨酸15ml及10y。蘇氨酸15ml,補(bǔ)加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液5.7ml,加入注射水至300ml。經(jīng)0.22jum微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-4(TC,保持4-5小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-25。C，保持10小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至30。C，保持4小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。實(shí)施例10:^f吏用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制151.5ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入20%人血白蛋白溶液30ml，補(bǔ)加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液2.98ml,加入注射水至300ml。經(jīng)0.22|im微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-4(TC,保持4-5小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至一15°C,保持10小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至20。C，保持10小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。實(shí)施例lh稱取重組人血管內(nèi)皮抑制素微球(PLGA包合)30g，內(nèi)包合重組人血管內(nèi)皮抑制素3g,加入20%甘露醇60ml,20。/。蔗糖溶液15ml加入1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液6.Oml，加入注射水至300ml，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-40°C,保持4-5小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-25°C,保持IO小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至3(TC,保持4小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。序列表<110>山東先聲麥得津生物制藥有限公司<120>重組人血管內(nèi)皮抑制素在制藥中的應(yīng)用<130>MP071322<160>1<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>192<212>PRT<213>Artificial<220><223>重組人血管內(nèi)皮抑制素<400>1MetGlyGlySerHisHisHisHisHisHisSerHisArgAspPheGin151015ProValLeuHisLeuValAlaIxuAsnSerProIxuSerGlyGlyMet202530ArgGlylieArgGlyAlaAspPheGinCysPheGinGinAlaArgAla354045ValGlyLeuAlaGlyThrPheArgAlaPhelxuSerSerArgLeuGin505560AspLeuTyrSerlieValArgArgAlaAspArgAlaAlaValProlie65707580ValAsnLeuLysAspGluLeuLeuPheProSerTrpGluAlaLeuPhe859095SerGlySerGluGlyProLeuLysProGlyAlaArgliePheSerPhe100105110AspGlyLysAspValLeuArgHisProThrTrpProGinLysSerVal115120125TrpHisGlySerAspProAsnGlyArgArglxuThrGluSerTyrCys130135140GluThrTrpArgThrGluAlaProSerAlaThrGlyGinAlaSerSer145150155160LeuLeuGlyGlyArgLeuLeuGlyGinSerAlaAlaSerCysHisHis165170175AlaTyrlieValLeuCyslieGluAsnSerPheMetThrAlaSerLys180185190權(quán)利要求1、重組人血管內(nèi)皮抑制素在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物中的應(yīng)用。2、權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組人血管內(nèi)皮抑制素是在人血管內(nèi)皮抑制素編碼氨基酸序列的起始氨基酸Met后依次添加0-4個(gè)任意氨基酸和2-8個(gè)組氨酸序列。3、—又利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組人血管內(nèi)皮抑制素的起始氨基酸Met可以被切除。4、權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組人血管內(nèi)皮抑制素的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。5、權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物的制劑是注射液或凍干制劑。6、權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的活性組分是重組人血管內(nèi)皮抑制素、PEG修飾的重組人血管內(nèi)皮抑制素或重組人血管內(nèi)皮抑制素微球。7、權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述PEG的分子量是5000-30000，PEG通過(guò)共^K定與重組人血管內(nèi)皮抑制素相連。8、權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組人血管內(nèi)皮抑制素微球是通過(guò)基質(zhì)材料與重組人血管內(nèi)皮抑制素混合制備而成。9、權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物中還含有保護(hù)劑和pH值調(diào)節(jié)劑。10、權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述保護(hù)劑選自多元醇、糖類、氨基酸、表面活性劑，人血白蛋白、EDTA和NaCl。11、權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的pH值范圍是4.0-8.5。12、權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物可與手術(shù)或激素類藥物耳關(guān)合應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及重組人血管內(nèi)皮抑制素在制藥中的應(yīng)用，具體公開了重組人血管內(nèi)皮抑制素在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物中的應(yīng)用。重組人血管內(nèi)皮抑制素能夠特異抑制異位病灶新生血管的增殖，安全無(wú)毒，無(wú)耐藥性，聯(lián)合手術(shù)或其它藥物治療的效果顯著，治愈率高，具有很好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A61K38/17GK101219207SQ20081000606公開日2008年7月16日申請(qǐng)日期2008年2月1日優(yōu)先權(quán)日2008年2月1日發(fā)明者武劉,靜姜,鵬朱,羅興洪申請(qǐng)人:山東先聲麥得津生物制藥有限公司