專利名稱：一種人源性電壓門控鉀通道1.3免疫原性肽段及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人源性電壓門控鉀通道1. 3免疫原性肽段及其用途°該通道英文全稱為human voltage-gated potassium channel 1. 3,以下簡(jiǎn)稱為 hKvl. 3。應(yīng)用hKvl. 3通道胞外環(huán)肽段E314制備的抗體，以下簡(jiǎn)稱為抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段 E314抗體，可以作為hKvl. 3通道新的、特異性抑制劑。
背景技術(shù)：
電壓門控鉀通道是一類能夠允許鉀離子透過細(xì)胞膜的跨膜蛋白。它們?cè)谏窠?jīng)元、 肌細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞等可興奮及非可興奮細(xì)胞的生物電信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。電壓門控鉀通道家族成員之一的Kvl. 3通道已被證實(shí)大量分布于免疫細(xì)胞和大腦組織的某些特定區(qū)域。因此，近十年來，Kvl. 3通道的研究受到廣泛的關(guān)注。大量研究證實(shí)，Kvl. 3對(duì)特定的淋巴細(xì)胞亞群發(fā)揮著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。效應(yīng)型記憶T細(xì)胞和/或Ig-class-switched 記憶B細(xì)胞在多發(fā)性硬化、1型糖尿病、銀屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、移植排斥、移植物抗宿主病、 SjGgren綜合征以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的炎癥損傷過程中起著至關(guān)重要的作用。一系列有關(guān)Kvl. 3通道對(duì)淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)作用的研究顯示，Kvl.3通道能夠調(diào)節(jié)自身反應(yīng)的效應(yīng)型淋巴細(xì)胞的活化和增殖。伴隨著淋巴細(xì)胞的激活，Kvl. 3通道高表達(dá)于特定的淋巴細(xì)胞亞群。Kvl. 3通道在活化的效應(yīng)型記憶T細(xì)胞-Tem和Ig-class-switched 記憶B細(xì)胞上的表達(dá)量顯著升高，約從250個(gè)通道/細(xì)胞增加至1500個(gè)通道/細(xì)胞。伴隨著淋巴細(xì)胞的活化，Kvl. 3通道大量開放，鉀離子外流，使得膜電位負(fù)值加大，跨膜電勢(shì)差增大。順著電勢(shì)差，鈣離子流入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。而鈣離子是重要的第二信使，胞內(nèi)鈣離子濃度的增加能促進(jìn)Tem和Ig-class-switched記憶B細(xì)胞的活化。 抑制Kvl. 3通道能夠顯著減弱鈣離子內(nèi)流，減少胞內(nèi)鈣離子濃度的增加，從而抑制Tem或 Ig-class-switched記憶B細(xì)胞的活化。在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，抑制Kvl. 3通道能夠明顯緩解自身免疫性疾病的病理進(jìn)程。研究表明Kvl. 3成為自身免疫性疾病治療新的靶點(diǎn)，前景令人矚目。因此，尋求一種有效的、選擇性的Kvl. 3阻斷劑將受到更多的關(guān)注。目前所篩選出的選擇性Kvl. 3通道阻滯劑主要是小分子化合物或從?？托佣疽褐刑峒兊亩倦念愇镔|(zhì)。然而研究發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)多的一部分小分子化合物及其衍生物和毒肽類物質(zhì)在阻滯Kvl. 3通道的同時(shí)亦能阻滯神經(jīng)系統(tǒng)和心臟中的電壓門控鈉、鈣等離子通道。由于電壓門控鉀通道具有較高的結(jié)構(gòu)同源性，使得不同的電壓門控鉀通道具有高度一致的藥物結(jié)合位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，Kvl. 3通道與心臟復(fù)極HERG和KCNQ1/KCNE1鉀通道阻滯劑結(jié)合位點(diǎn)高度保守，因而使得現(xiàn)有的一些Kvl. 3通道阻滯劑，在阻滯Kvl. 3通道的同時(shí)，亦對(duì)HERG和KCNQ1/KCNE1通道產(chǎn)生阻滯作用，常常會(huì)導(dǎo)致藥源性的心律失常的發(fā)生，阻礙了一些Kvl. 3通道阻滯劑進(jìn)一步開發(fā)成為臨床藥物。因此，美國(guó)食品和藥品管理局要求新上市的藥物應(yīng)評(píng)估其對(duì)心臟復(fù)極電流的影響?？贵w與抗原的結(jié)合具有親和力高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，理論上開發(fā)出針對(duì)hKvl. 3、具有阻滯效應(yīng)的抗體可以作為hKvl. 3通道特異性的阻滯劑。本研究以hKvl. 3通道胞外環(huán)的一段肽段為免疫原性肽段，通過免疫學(xué)的方法制備針對(duì)該肽段的特異性抗體，觀察其對(duì)親本蛋白hKvl. 3通道以及心臟電壓門控鈉、鈣通道以及復(fù)極鉀通道的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人源性電壓門控鉀通道hKvl. 3免疫原性肽段，基于該肽段制備的抗體-抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體，可以作為hKvl. 3通道新的、特異性抑制劑。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案(1) hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314序列的選擇和描述hKvl. 3通道基因位于人1號(hào)染色體短臂第1區(qū)第3條帶的第三個(gè)亞帶，英文簡(jiǎn)寫為1ρ13. 3，該通道蛋白是一種重要的電壓門控鉀離子通道，由四個(gè)結(jié)構(gòu)相同的α亞基聚合成，每個(gè)α亞基由6個(gè)跨膜蛋白分子片段Sl S6以及N末端和C末端組成，并具有3個(gè)胞外環(huán)，分別為Ε1、Ε2和Ε3，構(gòu)成通道的主體。其中S5，S6主要構(gòu)成離子通道孔，是鉀離子進(jìn)出細(xì)胞的部位。本發(fā)明的設(shè)計(jì)人根據(jù) hKvl. 3通道α亞基跨膜片段S5和S6之間的胞外環(huán)肽段氨基酸的親水性、表露性和柔韌性等，采用Jameson-Wolf算法，通過計(jì)算機(jī)，選擇抗原指數(shù)高的包含連續(xù)14個(gè)氨基酸的一段肽段-hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314，作為抗原決定簇或半抗原。具體氨基酸序列為=Glu-Ala-A sp-Asp-Pro-Thr-Ser-Gly-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp,并應(yīng)用該肽段作為抗原決定簇 / 半抗原制備針對(duì)該肽段的抗體；該抗體可作為人源性電壓門控鉀通道1. 3新的、特異性抑制劑，用于對(duì)人源性電壓門控鉀通道1. 3功能的藥學(xué)應(yīng)用。(2)hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314的合成根據(jù)E314肽段氨基酸序列采用多肽自動(dòng)合成儀，固相法合成hKvl. 3通道胞外環(huán)肽段E314。(3)抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體的制備采用戊二醛偶聯(lián)法，以牛血清白蛋白作為載體蛋白合成多肽-BSA完全抗原。將此抗原與完全或不完全弗氏佐劑一起免疫新西蘭大白兔，制備抗hKvl.3胞外環(huán)肽段E314抗體。定期測(cè)定血清中該抗體的滴度。于免疫 5次后，取血，親合層析法提純?cè)摽贵w。(4)抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)hKvl. 3通道電流的抑制作用通過膜片鉗技術(shù)，觀察抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)穩(wěn)定表達(dá)于人胚胎腎293細(xì)胞系上的hKvl. 3 通道電流的抑制作用。該細(xì)胞系英文簡(jiǎn)稱為HEK293細(xì)胞系。(5)抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體特異性鑒定5-1，通過免疫印跡法和免疫熒光組織化學(xué)法，觀察抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的hKvl. 3通道蛋白的結(jié)合；5-2，通過免疫印跡法和免疫熒光組織化學(xué)法，觀察抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)HERG、hKCNQl/hKCNEl通道基因的HEK293細(xì)胞系和人心肌細(xì)胞上HERG通道、 hKCNQl/hKCNEl通道、電壓門控鈉通道、L型鈣通道蛋白的結(jié)合；5-3，通過膜片鉗技術(shù)，觀察抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)上述細(xì)胞系和人心房肌細(xì)胞通道電流的影響，明確抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體的特異性。發(fā)明提供的肽段的有益效果hKvl. 3通道免疫原性肽段E314可作為抗原決定簇/ 半抗原制備針對(duì)該肽段的抗體，該肽段也可用作檢測(cè)、篩選和鑒定對(duì)hKvl. 3通道蛋白具有抑制功能的抗體所針對(duì)的抗原決定簇?；趆Kvl. 3通道胞外環(huán)肽段E314制備的抗體-抗 hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體可作為hKvl. 3通道新的、特異性抑制劑，用于對(duì)hKvl. 3通道功能的研究?；贓314肽段所制備的單克隆抗體和疫苗將有助于自身免疫性疾病或自身免疫相關(guān)性疾病的治療。該抗體可用于文獻(xiàn)報(bào)道的以hKvl. 3通道為干預(yù)靶點(diǎn)的多發(fā)性硬化、1型糖尿病、銀屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、移植排斥、移植物抗宿主病、^Ogren綜合征以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病以及自身免疫相關(guān)性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化等的治療性應(yīng)用。


圖IhKvl. 3通道胞外環(huán)肽段抗原決定簇預(yù)測(cè)圖。A =Al根據(jù)氨基酸的親水性預(yù)測(cè)的hKvl. 3通道結(jié)構(gòu)圖；A2hKvl. 3通道胞外環(huán)肽段氨基酸抗原性預(yù)測(cè)圖.黑線表示所選取的肽段，E314 14個(gè)氨基酸；B 根據(jù)Jameson-Wolf法篩選出的跨膜片段S5和S6之間胞外環(huán)肽段14個(gè)氨基酸的抗原指數(shù)。圖2抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體滴度。圖3抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的hKvl. 3通道電流的抑制作用。A對(duì)照組穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的hKvl. 3通道電流；B D 不同濃度抗體組300nmol/L、75nmol/L和37. 5nmol/L抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì) hKvl. 3通道電流的抑制作用；E 不同濃度抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)hKvl. 3通道電流-電壓曲線的影響；F:去極化脈沖為+60mV時(shí)各組電流密度的平均值，每組記錄6個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)結(jié)果不同濃度抗體組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 < 0. 001。圖4抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段Ε314抗體與hKvl. 3通道蛋白的結(jié)合。A 免疫熒光結(jié)果顯示，抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞膜上的hKvl. 3通道蛋白結(jié)合。a綠色熒光顯示抗體與細(xì)胞膜的結(jié)合，b無綠色熒光顯示細(xì)胞核；B:免疫熒光結(jié)果顯示，抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與HEK293細(xì)胞膜無結(jié)合；C 免疫熒光結(jié)果顯示， 經(jīng)E314肽段孵育后的抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體，與穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞膜上的 hKvl. 3通道蛋白無結(jié)合；D 免疫印跡結(jié)果顯示，抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的hKvl. 3通道蛋白特異性結(jié)合；經(jīng)E314肽段孵育后的抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的hKvl. 3通道蛋白無結(jié)合；抗hKvl. 3 胞外環(huán)肽段E314抗體與HEK293細(xì)胞蛋白無結(jié)合。圖5抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的HERG通道蛋白的結(jié)合。A:免疫熒光結(jié)果顯示，HEK293細(xì)胞無綠色熒光，表明抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段 E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞膜上的HERG通道蛋白無結(jié)合；B 免疫印跡結(jié)果顯示， 抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的HERG通道蛋白無結(jié)合。圖6抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的hKCNQl/ hKCNEl通道蛋白的結(jié)合。A 免疫熒光結(jié)果顯示，冊(cè)1(293細(xì)胞無綠色熒光，表明抗111^1.3 胞外環(huán)肽段E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞膜上的hKCNQl/hKCNEl通道蛋白無結(jié)合； B 免疫印跡結(jié)果顯示，抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的 hKCNQl/hKCNEl通道蛋白無結(jié)合。圖7抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與人心房肌細(xì)胞膜上的離子通道的結(jié)合。A 免疫熒光結(jié)果顯示，人心房肌細(xì)胞無綠色熒光，表明抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與表達(dá)于人心房肌細(xì)胞膜上的HERG通道、hKCNQl/hKCNEl通道、Navl. 5通道、Cavl. 2通道蛋白無結(jié)合；Bl 免疫印跡結(jié)果顯示，抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)于人心房肌的 HERG通道1 α亞基、hKCNQl通道、Navl. 5通道α亞基、Cavl. 2通道α IC亞基蛋白無結(jié)合； Β2 免疫印跡結(jié)果顯示，抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與穩(wěn)定表達(dá)于人心室肌的HERG通道Ia亞基、hKCNQl通道、Navl. 5通道α亞基、Cavl. 2通道α ie亞基蛋白無結(jié)合。圖8抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)人心房肌細(xì)胞電壓門控鈉通道電流的抑制作用。A 對(duì)照組人心房肌細(xì)胞電壓門控鈉通道電流；B 抗體組300nmOl/L抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)人心房肌細(xì)胞電壓門控鈉通道電流的影響；C :300nmol/L抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)人心房肌細(xì)胞電壓門控鈉通道電流-電壓曲線的影響；D 去極化脈沖為-35mV時(shí)兩組電流密度的平均值，每組記錄6個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)結(jié)果抗體組與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P > 0. 05。圖9抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)人心房肌細(xì)胞L型鈣通道電流的抑制作用。A 對(duì)照組人心房肌細(xì)胞L型鈣通道電流；B 抗體組300nmOl/L抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)人心房肌細(xì)胞L型鈣通道電流的影響；C :300nmol/L抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段 E314抗體對(duì)人心房肌細(xì)胞L型鈣通道電流-電壓曲線的影響；D 去極化脈沖為+IOmV時(shí)兩組電流密度的平均值，每組記錄6個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)結(jié)果抗體組與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P > 0. 05。圖10抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的HERG 電流的抑制作用。A 對(duì)照組穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的HERG通道電流；B 抗體組 300nmol/L抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)HERG通道電流的影響；C :300nmol/L抗 hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)HERG通道電流-電壓曲線的影響；D 去極化脈沖為+50mV 時(shí)兩組電流密度的平均值，每組記錄6個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)結(jié)果抗體組與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P > 0. 05。圖11抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的hKCNQl/ hKCNEl通道電流的抑制作用。A 對(duì)照組穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的hKCNQl/hKCNEl通道電流；B 抗體組300nmol/L抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)hKCNQl/hKCNEl通道電流的影響；C :300nmol/L抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)KCNQ1/KCNE1通道電流電流-電壓曲線的影響；D 去極化脈沖為+40mV時(shí)兩組電流密度的平均值，每組記錄6個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)結(jié)果抗體組與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P > 0. 05。
具體實(shí)施例方式抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體抑制穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上的hKvl. 3電流的研究——一種新的、特異性hKvl. 3通道抑制劑材料與方法1. 1實(shí)驗(yàn)對(duì)象雄性新西蘭大白兔，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)，體重 2 3kg，隨機(jī)分成免疫組和假性免疫組。人心房肌和心室乳頭肌標(biāo)本取自心臟外科行先天性心臟病和瓣膜病變手術(shù)的患者，男32例，女38例，年齡(66.3 士 1.4)歲。實(shí)驗(yàn)方案符合《赫爾辛基宣言》所申明的原則和條款(2008年修訂)，得到華中科技大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。人胚腎細(xì)胞(HEK293)購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)。1. 2主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器hKvl. 3/pCI-neo, HERG/pcDNA3 和 hKCNQl/pCEP4 質(zhì)粒分別由美國(guó)默克實(shí)驗(yàn)室 Dr. GarciaMaria，美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校醫(yī)學(xué)院Dr. Robertson Gail和香港大學(xué)李貴榮教授饋贈(zèng)。hKCNElcDNA由廣州復(fù)能基因有限公司合成，經(jīng)由本室構(gòu)建成hKCNEl/ pcDNA3質(zhì)粒。DMEM培養(yǎng)基Qnvitrogen公司，美國(guó))，胎牛血清Qnvitrogen公司，美國(guó))， G418 (Invitrogen公司，美國(guó))，潮霉素(Roche公司，瑞士)，F(xiàn)uGENE HD轉(zhuǎn)染試劑盒(Roche 公司，瑞士)，Attractene轉(zhuǎn)染試劑盒OlIAGEN公司，美國(guó))，完全/不完全弗氏佐劑(Sigma， 美國(guó))，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(武漢大風(fēng)生物技術(shù)有限公司)，驢血清和異硫氰碳酸熒光素(FITC)標(biāo)記的驢抗兔IgG(Millip0re公司，美國(guó))，II型膠原酶 (Worthington公司，美國(guó))，XXIV型蛋白酶(SIGMA公司，美國(guó))，牛血清白蛋白(SIGMA公司， 美國(guó))，DAPI (江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，穿孔素Escin (SIGMA公司，美國(guó))，微電極玻璃毛細(xì)管(武漢微探科學(xué)儀器有限公司)，PSSM8型多肽自動(dòng)合成儀(Shimadzu公司，日本)， ELX800型酶標(biāo)(Bio-tek公司，美國(guó))，DEM — 11型自動(dòng)洗板機(jī)(Bio_tek公司，美國(guó))，水浴箱(寧波新芝科技生物有限公司)，37°C恒溫箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，高壓蒸汽滅菌器(SANYO，日本)，Barnstead超純水系統(tǒng)(Thermo公司，美國(guó))，渦漩混勻器(中外合資深圳天南海北有限公司)，PH儀(上海梅特勒-托利多有限公司)，電子天平(Sartorius，德國(guó))， 臺(tái)式高速離心機(jī)(TGL-16G，上海精密儀器儀表有限公司)，低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))，-70°C冰箱(Thermo公司，美國(guó))，_20°C冰箱(海爾公司，中國(guó))，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó))，生物安全柜(Heal Force公司，中國(guó))，電泳儀(Bio-Rad公司，美國(guó))，PCR儀(Applied biosysterms公司，美國(guó))，普通光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)， 激光共聚焦顯微鏡(Olympus FluoView FV1000,日本)，Axopatch200B放大器(Molecular Devices公司，美國(guó))。1. 3主要溶液配制(I)Ikvl3 細(xì)胞外液(mmol/L) =NaCl 120，KCl 5. 4，CaCl2 2，MgCl2 1，HEPES 10，葡萄糖10，PH值用NaOH調(diào)至7. 4。(2) Ikv13 電極內(nèi)液(mmol/L) :KC1 20，K-asperate 110，MgCl2 1. O, Mg2-ATP 5， Na2-Phosphocreatine 5，GTP 0. 1，EGTA 5，HEPES 10，用 KOH 調(diào) pH 至 7. 20。(3)臺(tái)氏液(mmol/L) =NaCl 135，KCl 5. 4，MgCl2 1. 0，CaCl2 1. 8，NaH2P04 0. 33, HEPES 5. 0，葡萄糖 10. 0，PH 值用 NaOH 調(diào)至 7. 4。(4)無鈣液(mmol/L) :KC1 5. 4，NaCl 135，MgCl2 1. 0，NaH2PO4 0. 33，HEPES 5. 0， 葡萄糖10. 0，PH值用NaOH調(diào)至7. 4。(5) KB 液(mmol/L) :L_ 谷氨酸 50，KCl 40，EGTA 0. 5，MgSO4 1. 8，KH2PO4 20， HEPES10,葡萄糖10，?；撬?0，KOH 70，PH值用KOH調(diào)至7. 4。(6)轉(zhuǎn)運(yùn)液(mmol/L) :KH2P0450, MgSO4 8，adenosine 5，HEPES 10，mannitol 100， ?；撬?0，葡萄糖140，PH值用KOH調(diào)至7. 4(7)1貼細(xì)胞外液(mmol/L) =NaCl 5，MgCl2 1.0，CsCl 132，CaCl2 1，Glucose 10， HEPES10，用 CsOH 調(diào) pH 至 7. 4。
(8)INa 電極內(nèi)液(mmol/L) :CsF 135, NaCl 5, EGTA 10, HEPES 5,Mg2-ATP 5 用 CsOH 調(diào)pH至7. 2。(9) Iceil 細(xì)胞外液(mmol/L) =NaCl 135，KCl 5.4，MgCl2 1.0，CaCl2 1.8，NaH2P04 0. 33，HEPES 5. 0，葡萄糖 10. 0，PH 值用 NaOH 調(diào)至 7. 4。(10) Iceil 電極內(nèi)液(mmol/L) =L-Aspartate acid 110，CsCl 20，MgCl2 LNa2-ATP 5,Na2-phosphocreatire 5, Na2GTP 0· 1，cAMPO. 05，EGTA 5, HEPES 5 用 CsOH 調(diào) pH 至 7· 20。(11) Ihekg 細(xì)胞外液(mmol/L) :NaCl 137，KCl 4. 0, MgCl2 L 0，CaCl2 L 8，HEPES 10，Glucose 10，用 NaOH 調(diào) pH 至 7. ；35。(12) Ihekg 電極內(nèi)液(mmol/L) :KC1 20，K-asperate 110，MgCl2 1. 0, Mg2-ATP 5， Na2-Phosphocreatine 5，GTP 0. 1，EGTA 5，HEPES 10，用 KOH 調(diào) pH 至 7. 20。(13) IK_/KeNE1 細(xì)胞外液(mmol/L) :NaCl 135，KCl 5. 4，MgCl2 1· 0，CaCl2 1.8, HEPES10. 0，KH2P04 0. 33，Glucose 10，NaOH 調(diào) ρ H 至 7. 40。(14) Ikcnqi/kcnei 電極內(nèi)液(mmol/L) :KC1 20，K-aspartate 110，MgCl2 1.0， Mg2-ATP5, Na2-phosphocreatine 5，GTP 0. 1，HEPES 10，EGTA 5，用 KOH 調(diào) pH 至 7· 20。(15)凝膠儲(chǔ)液(g/L)丙烯酞胺292g，N, N-亞甲叉雙丙烯酞胺8g，(避光保存)。(16)濃縮膠緩沖液(g/L) =Tris-HCl 60. 55，SDS 4，HCl 調(diào) pH 至 6. 8。(17)分離膠緩沖液(g/L) =Tris-HCl 181. 65，SDS 4，HCl 調(diào) pH 至 6. 8。(18) 10%過硫酸胺過硫酸胺(Ap) IOOmg加雙蒸水溶至1ml，宜新鮮配制。(19)電泳緩沖液(g/L) =Tris 堿 3，甘氨酸 14. 4，SDS 1，HCl 調(diào) pH 至 8. 3。(20)轉(zhuǎn)膜緩沖液(g/L) =Tris堿1. 93，甘氨酸9，甲醇200ml加雙蒸水至1L，HCl 調(diào) pH 至 8. 1-8.4。(15)TBST(g/L) =NaCl 8. 775, Tris-Base 1. 211，Tween_203ml，HCl 調(diào) pH 至 7. 5。1. 4 方法1. 4. 1抗原的合成從hkvl. 3通道胞外環(huán)篩選出一段短肽E314，其氨基酸序列為 Glu-Ala-Asp-Asp-Pro-Thr-Ser-Gly-Phe-Ser-Ser-IIe-Pro-Aspο 根據(jù)其氨基酸序列采用 PSSM8型多肽自動(dòng)合成儀，固相法合成多肽。采用戊二醛偶聯(lián)法，以BSA作為載體蛋白合成多肽-BSA完全抗原?？乖铣赏戤吅?，置于_70°C冰箱中備用。1. 4. 2動(dòng)物免疫免疫組初次免疫每只兔取抗原800 μ g，后繼免疫每只兔取抗原 400μ g，均加等體積弗氏佐劑，初次免疫用完全弗氏佐劑，以后用不完全弗氏佐劑，充分乳化后，于兔子背部、后腿皮下多點(diǎn)注射。每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共5次。假性免疫組用生理鹽水加弗氏佐劑假性免疫，劑量與方法同免疫組。1. 4. 3血清標(biāo)本的留取從初次免疫開始，每次免疫前從兔耳緣靜脈抽血1ml，動(dòng)態(tài)觀察血清抗體效價(jià)，第9周處死，留取血清制備抗體。1.4. 4抗體的制備提純抗體采用親合層析法制備提純，提純完畢后分裝，置于-20°C冰箱中備用(以下稱一抗)。1. 4. 5ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)以未接受過免疫的健康新西蘭大白兔血清為陰性對(duì)照， 將不同時(shí)段兔血清進(jìn)行檢測(cè)。參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法將合成的多肽，以每孔ι μ g包被于酶聯(lián)板，方陣滴定法先后加入制備的一抗及HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，ΤΜΒ/Η202顯色，稀 H2SO4終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450mm波長(zhǎng)處測(cè)吸收度OD值，以(待測(cè)孔OD值-空白孔OD值)/(陰性對(duì)照孔OD值-空白孔OD值)彡2. 1為陽性，< 2. 1為陰性。每次試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔陰性對(duì)照。取1份陽性樣品，進(jìn)行同一板內(nèi)及不同板間的重復(fù)試驗(yàn)。1. 4. 6穩(wěn)定表達(dá)hKvl. 3通道、HERG和hKCNQl/hKCNEl通道基因HEK293細(xì)胞系的
建立(DHEK293細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前l(fā)d，采用0. 25 %胰酶消化，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以約3 6X IO5細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基， 在37°C 5% C02飽和濕度培養(yǎng)箱中，細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿培養(yǎng)板。(2)G418 和潮霉素濃度篩選于 hKvl. 3/pCI-neo，HERG/pcDNA3, hKCNQl/pCEP4 和 hKCNEl/pcDNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前兩周，確定G418和潮霉素殺死HEK293細(xì)胞的最低濃度。(3)轉(zhuǎn)染分別按照FuGENE HDjttractene轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書進(jìn)行操作。于含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中緩緩加入脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物，搖勻，置于37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。(4)克隆篩選轉(zhuǎn)染7 后，更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并開始在DMEM培養(yǎng)基中加入合適濃度的G418和潮霉素。待單克隆長(zhǎng)出后，用克隆柱挑選單克隆，擴(kuò)增后應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞克隆IKvl3、IHEI ；和IKeNQ1/KeNE1的表達(dá)，所應(yīng)用膜片鉗記錄方法見后。挑選穩(wěn)定表達(dá)Ikv1. 3、IHEEG和 1KcnqiZKCNEI 的細(xì)胞克隆。1. 4. 7單個(gè)人心房肌細(xì)胞的分離按文獻(xiàn)采用二步酶解法分離人單個(gè)心房肌細(xì)胞。 先將心肌組織塊剪碎，用36°C 100%氧飽和的無鈣臺(tái)式液反復(fù)沖洗三遍，共15min，然后將其置入含150-200U/ml II型膠原酶、1. 2U/ml XXIV型蛋白酶和lmg/ml牛血清白蛋白的無鈣臺(tái)式液中。溫孵約50min，再將剩余組織置入上述相同的含膠原酶無鈣臺(tái)式液中繼續(xù)溫孵，每隔IOmin顯微鏡下觀察細(xì)胞狀況，待鏡下細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量最佳時(shí)，停止溫孵，離心獲取心房肌細(xì)胞。分離好的心房肌細(xì)胞置于KB液中，室溫下靜置Ih備用。1. 4. 8免疫熒光組織化學(xué)法觀察抗體與穩(wěn)定表達(dá)hKvl. 3通道、HERG和hKCNQl/ hKCNEl通道基因HEK293細(xì)胞系和人心房肌細(xì)胞的結(jié)合HEK293細(xì)胞用0. 25%胰酶消化成單細(xì)胞后，以合適濃度接種在載玻片上貼壁過夜，而人心房肌細(xì)胞滴加在載玻片上，4°C靜止30分鐘，然后4%多聚甲醛固定30分鐘，PBS振洗3次，每次IOmin ； 10%驢血清和牛血清白蛋白濕盒封閉2小時(shí)；滴加用封閉液稀釋的一抗在4°C冰箱過夜，PBS振洗3次，每次 IOmin ；加FITC標(biāo)記的1 100驢抗兔IgG室溫孵育2小時(shí)，PBS振洗3次，每次IOmin ；滴加DAPI，室溫孵育5分鐘，振洗三次，每次5分鐘；抗淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相記錄結(jié)果。1. 4. 9免疫印跡法觀察抗體與穩(wěn)定表達(dá)hKvl. 3通道、HERG和hKCNQl/hKCNEl通道基因HEK293細(xì)胞系和人心房肌及心室乳頭肌蛋白的結(jié)合細(xì)胞膜蛋白的提取參考Barry DM 等的方法，提取的蛋白用BCA法測(cè)蛋白濃度。每孔取35 μ g蛋白上樣于7. 5%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳后轉(zhuǎn)移樣品蛋白至硝酸纖維素膜上。將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中室溫?fù)u動(dòng)封閉2. 5小時(shí)，加以1 1000 —抗4°C孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次15min， 加入1 10000HRP標(biāo)記羊抗兔二抗室溫孵育2小時(shí)，TBST洗膜3次，每次15min，浸入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑，條帶顯色后暗室X線壓片曝光30秒，洗片，烘干。1. 4. 10全細(xì)胞膜片鉗記錄通過AXOpatCh200B放大器采用全細(xì)胞(IKvl.3、INa、Ihei ；) 或穿孔膜片鉗技術(shù)I Κ_1/Κ Ε1)，記錄抗體孵育前后人心房肌細(xì)胞和HEK293細(xì)胞離子電流。(1) Ikv13程序設(shè)置采樣頻率=IOKHz,低通濾波=5KHz,首先維持電位 (HP) -80mV,給予脈寬M5ms、階躍IOmV、-60 +60mV的去極化脈沖，然后維持電位 (HP)-50mV，持續(xù)50ms，分別記錄ΙΚν1.3刺激電流和尾電流，刺激頻率=0. IHz0 IKvL3電流強(qiáng)度的計(jì)算由基線零電流與測(cè)試脈沖末端穩(wěn)態(tài)電流間的差值求出。IKv, 3電流密度=電流強(qiáng)度/膜電容(pA/pF)。以不同鉗制電壓下的ΙΚν1.3電流密度對(duì)相應(yīng)測(cè)試電壓繪成電流-電壓 (I-V)曲線。0)1貼程序設(shè)置采樣頻率=ΙΟΚΗζ，低通濾波=5KHz,HP = _120mV、脈寬100ms、 階躍5mV、-70 +30mV的系列去極化脈沖刺激記錄INa，刺激頻率=IHz0 INa的電流強(qiáng)度的計(jì)算測(cè)量?jī)?nèi)向電流峰值與刺激結(jié)束后的穩(wěn)態(tài)值之差。I·電流密度=電流強(qiáng)度/膜電容 (pA/pF)。以不同鉗制電壓下的INa電流密度對(duì)相應(yīng)測(cè)試電壓繪成I-V曲線。(3) IHERG程序設(shè)置采樣頻率=ΙΟΚΗζ，低通濾波=5KHz，首先給予HP = -80mV, 繼而給予脈寬4000ms、階躍10mV、-40 +50mV的去極化脈沖，然后HP = -50mV,持續(xù) 5000ms，分別記錄Ihek刺激電流和尾電流(Itail)，刺激頻率=0. 05Hz。Itail的電流強(qiáng)度的計(jì)算測(cè)量階躍電流的峰值減去刺激結(jié)束穩(wěn)態(tài)電流水平(PA)。Itail電流密度=電流強(qiáng)度/膜電容(pA/pF)。以不同鉗制電壓下的Ihem的Itail電流密度對(duì)相應(yīng)測(cè)試電壓繪成I-V曲線。(4) ICaL程序設(shè)置采樣頻率=IOKHz，低通濾波=5KHz，HP = _40mV、脈寬300ms、 階躍10mV、-40 +60mV的系列去極化脈沖刺激記錄Ι。Λ，刺激頻率=0. 2Hz。ICaL的電流強(qiáng)度的計(jì)算測(cè)量?jī)?nèi)向電流峰值與刺激結(jié)束后的穩(wěn)態(tài)值之差。ICaL電流密度=電流強(qiáng)度/膜電容(pA/pF)。以不同鉗制電壓下的電流密度對(duì)相應(yīng)測(cè)試電壓繪成I-V曲線。(5) Ikcnqi7kcnei程序設(shè)置采樣頻率=IOKHz，低通濾波=5KHz，首先維持電位 (HP) -80mV,給予脈寬3000ms、階躍20mV、-60 +60mV的去極化脈沖，然后維持電位 (HP) -40mV,持續(xù)3000ms，分別記錄Ikcnqvkcnei刺激電流和尾電流，刺激頻率=0. IHz0 Iks的刺激電流強(qiáng)度的計(jì)算測(cè)量階躍電流的峰值減去刺激結(jié)束穩(wěn)態(tài)電流水平(PA)。Iks電流密度 =電流強(qiáng)度/膜電容(PA/pF)。以不同鉗制電壓下的IKNQ1/raE1的刺激電流密度對(duì)相應(yīng)測(cè)試電壓繪成I-V曲線。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)pCLAMP9. 0軟件采集，Digidatal322A模-數(shù)/數(shù)-模轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換，存盤于計(jì)算機(jī)。實(shí)驗(yàn)在室溫(20°C 25°C )下進(jìn)行。1. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS12. 0統(tǒng)計(jì)軟件包，進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P < 0. 05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果2. 1抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體滴度變化ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在0周，2周留取的血清抗體滴度為0，第4周留取的血清抗體滴度為1 800，效價(jià)偏低，第6周留取的血清抗體滴度為1 6400，效價(jià)有一次明顯的飛躍。 表明隨著免疫時(shí)間及免疫次數(shù)的增加，抗體的滴度在上升，第8周抗體滴度達(dá)1 12800、第 9周抗體滴度也為1 12800，說明抗體滴度已達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定較高的水平。見圖22. 2抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體對(duì)ΙΚν1.3的抑制作用。圖 3 為預(yù)孵 300nmol/L、75nmol/L、37. 5nmol/L 三組濃度抗 hKvl. 3 胞外環(huán)肽段E314抗體組與穩(wěn)定表達(dá)hKvl. 3通道基因?qū)φ战MHEK293細(xì)胞系ΙΚν1.3電流圖。以各脈沖刺激下平均電流密度值對(duì)相應(yīng)膜電位求得I-V曲線。結(jié)果顯示，不同濃度Ε314抗體對(duì)hKvl. 3電流均有抑制作用，在去極化脈沖為+60mV條件下，300nmol/L E314抗體抑制該電流達(dá)94%，Ikvl3電流密度平均值與對(duì)照組相比有明顯差異(0.0202士0.00437nA/pF vsO. 35224士0. 07443nA/pF, P < 0. 001) ；75nmol/L E314抗體抑制該電流達(dá)84%，IKvl 3 電流密度平均值與對(duì)照組相比有明顯差異(0.05657士0.0196nA/pF vs 0. 35224士0. 07443nA/ pF，P < 0. 001) ；37. 5nmol/L E314抗體抑制該電流達(dá)66%，ΙΚν1.3電流密度平均值與對(duì)照組相比有明顯差異(0. 12054士0. 01692nA/pF vs 0. 35224士0. 07443nA/pF, P < 0. 001)。2. 3抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體與hKvl. 3通道蛋白特異性結(jié)合 2. 3. 1免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體特異性地結(jié)合于穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞膜的hKvl. 3通道蛋白，而抗hKvl. 3通道胞外環(huán)肽段E314 抗體與人心房肌細(xì)胞膜上的HERG通道、hKCNQl/hKCNEl通道、Navl. 5通道、Cavl. 2通道蛋白及穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞膜上的HERG通道、hKCNQl/hKCNEl通道蛋白均不結(jié)合。見圖4 圖5圖6圖72. 3. 2免疫印跡結(jié)果表明，抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體能特異識(shí)別穩(wěn)定表達(dá)于 HEK293細(xì)胞系上的63. 8KD的hKvl. 3通道蛋白。而抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體未識(shí)別人心肌和穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞系上145kDa/155KD的HERG通道蛋白、120KDd的hKCNQl 通道蛋白、190KD的Cavl. 2通道蛋白α 1C亞基和220KD的Navl. 5通道蛋白α亞基。見圖 4圖5圖6圖72. 4 抗 hKvl. 3 胞外環(huán)肽段 E314 抗體對(duì) INa、ICaL, Iheeg 和 I_1/KCNE1 的影響圖8為預(yù)孵抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314 300nmol/L抗體組和對(duì)照組人心房肌細(xì)胞 1-電流圖。以各脈沖刺激下平均電流密度值對(duì)相應(yīng)膜電位求得I-V曲線。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，去極化脈沖為-35mV條件下預(yù)孵抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體組INa電流密度平均值無明顯差異(0. 03855士0. 00673nA/pF vs 0. 03733士0. 00667nA/pF, P > 0. 05)。圖9為預(yù)孵抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314300nmol/L抗體組和對(duì)照組人心房肌細(xì)胞電流圖。以各脈沖刺激下平均電流密度值對(duì)相應(yīng)膜電位求得I-V曲線。結(jié)果顯示，與對(duì)
照組比較，去極化脈沖為+IOmV條件下預(yù)孵抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體組電流密度平均值無明顯差異(0. 01684士0. 0018nA/pF vs 0. 01603士0. 00323nA/pF, P > 0. 05)。圖10為預(yù)孵抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314300nmol/L抗體組和對(duì)照組HEK293細(xì)胞 Iheeg的電流圖。Ihei ；在_40mV時(shí)迅速激活，峰值電位在OmV，當(dāng)膜電位大于OmV后，隨著膜電位的增加，電流反而減小，呈現(xiàn)出明顯的內(nèi)向整流特性。當(dāng)恢復(fù)到HP = -50mV,記錄到電流幅度更高的Itail。以各脈沖刺激下平均電流密度值對(duì)相應(yīng)膜電位求得I-V曲線。Itail在 +40mV時(shí)達(dá)到峰值，當(dāng)膜電位再升高時(shí)尾電流飽和。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，去極化脈沖為 +40mV條件下預(yù)孵抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體組Ihek的Itail電流密度平均值無明顯差異(0.03958士0. 00513nA/pF vs 0. 03838士0. 00502nA/pF,P > 0.05)。圖11為預(yù)孵抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314 300nmol/L抗體組和對(duì)照組HEK293細(xì)胞 ikcnqi/kcnei的電流圖。ikenq1/k e1在_40mV時(shí)緩慢激活，失活緩慢，當(dāng)恢復(fù)到HP = -40mV,記錄至Ijltail。以各脈沖刺激下平均電流密度值對(duì)相應(yīng)膜電位求得I-V曲線。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，去極化脈沖為+40mV條件下預(yù)孵抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體組Ikcmqviknei電流密度平均值無明顯差異(0. 26768士0. 01369nA/pF vs 0. 24104士0. 01804nA/pF, P > 0. 05)。
權(quán)利要求
1.一種人源性電壓門控鉀通道1.3免疫原性肽段，該肽段由人源性電壓門控鉀通道 1. 3 α亞基跨膜片段S5和S6之間胞外環(huán)上連續(xù)的14個(gè)氨基酸構(gòu)成。其特征在于所述肽段的氨基酸序列為 Glu-Ala-Asp-Asp-Pro-Thr-Ser-Gly-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp,應(yīng)用該肽段作為抗原決定簇/半抗原制備針對(duì)該肽段的抗體。
2.一種針對(duì)權(quán)利要求1所述肽段的抗體，其特征在于該抗體可作為人源性電壓門控鉀通道1. 3新的、特異性抑制劑，用于對(duì)人源性電壓門控鉀通道1. 3功能的藥學(xué)應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人源性電壓門控鉀通道1.3免疫原性肽段及其用途。所述肽段由人源性電壓門控鉀通道1.3α亞基跨膜片段S5和S6之間胞外環(huán)上連續(xù)的13個(gè)氨基酸構(gòu)成，肽段的氨基酸序列為Glu-Ala-Asp-Asp-Pro-Thr-Ser-Gly-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp，通過免疫學(xué)的方法制備針對(duì)上述肽段的抗體可以作為人源性電壓門控鉀通道1.3新的、特異性抑制劑，該抗體可用于調(diào)節(jié)人源性電壓門控鉀通道1.3功能的研究?；谏鲜鲭亩嗡苽涞膯慰寺】贵w和疫苗將有助于自身免疫性疾病或自身免疫相關(guān)性疾病的治療。
文檔編號(hào)A61P37/02GK102180950SQ20111004441
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月24日
發(fā)明者劉坤, 劉琳玲, 劉金平, 廖玉華, 曾秋棠, 李曉衛(wèi), 楊勇, 楊曉芳, 王彥富, 王敏, 王朝暉, 連亦田, 高翔 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院