專利名稱：人源化的axl抗體的制作方法
人源化的AXL抗體描述本發(fā)明涉及單克隆人源化抗體，其結(jié)合AXL受體酪氨酸激酶的細胞外結(jié)構(gòu)域并且至少部分地抑制AXL活性。背景AXL (Ark、UF0、Tyro_7)受體酪氨酸激酶是激酶的Tyro_3家族的成員，該家族其他成員是 Mer(Eyk、Nyk、Tyro-12)和 Sky (Rse、Tyro_3、Dtk、Etk、Brt、Tif)。其可通過嗜異性配體與抗凝血因子蛋白S同源的70-kDa蛋白)的結(jié)合來激活。與其他受體酪氨酸激酶相反，AXL酪氨酸磷酸化還可通過嗜同性結(jié)合(homophilicbinding)誘導(dǎo)。AXL激活導(dǎo)致通過PI-3-激酶/Akt (Franke等人，Oncogene 22 =8983-8998,2003)和其他主要途徑如 Ras/Erk 和 β-聯(lián)蛋白 /TCF (Goruppi 等人，Mol. Cell Biol. 21 :902-915,2001)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。AXL在許多正常組織包括腦、心臟、骨骼肌、幾種其他器官的器官囊和結(jié)締組織中以及在單核細胞但非淋巴細胞中微弱地表達。已在成纖維細胞(Goruppi等人，Mol Cell Biol 17:4442-4453 1997)、內(nèi)皮細胞(Hasanbasic 等人，Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004)、血管平滑肌細胞(Melaragno 等人，J. Mol. Cell Cardiol. 37 :881-887, 2004)和神經(jīng)元(Allen 等人，Mol. Endocrinol. 13 :191-2011999)的存活中描述了由 AXL 誘導(dǎo)的Akt磷酸化。此外，AXL在細胞粘著和趨化性中起著重要作用。AXL的敲除展示削弱的血小板聚集穩(wěn)定作用和血栓形成(由于減少的血小板整聯(lián)蛋白IIb3的激活)。已在不同癌癥類型例如乳腺癌(Meric等人，Clin. Cancer Res. 8 :361-367, 2002 ；Berclaz 等人，Ann. Oncol. 12 :819-824, 2001)、結(jié)腸癌(Chen 等人，Int. J. Cancer 83 :579-584,1999 ；Craven 等人，Int.J. Cancer 60 :791-797,1995)、前列腺癌(Jacob 等人，Cancer Detect. Prev. 23 :325-332,1999)、肺癌(ffimmel 等人，EurJ Cancer 37 2264-2274，2001)、胃癌(Wu 等人，Anticancer Res 22 1071-1078，2002)、卵巢癌(Sun 等人，Oncology 66 :450-457,2004)、子宮內(nèi)膜癌(Sun 等人，Ann. Oncol. 14 :898-906, 2003)、腎癌(Chung 等人，DNA Cell Biol. 22 :533-540, 2003)、肝細胞癌(Tsou 等人， Genomics 50 :331_340，1998)、甲狀腺癌(Ito 等人，Thyroid 12 :971_975，2002 ;Ito 等人， Thyroid 9 :563-567,1999)和食管癌(Nemoto 等人，1997)中，以及在 CML(Janssen 等人， A novel putative tyrosinekinase receptor with oncogenic potential. Oncogene, 6 :2113-2120,1991 ；Braunger 等人，Oncogene 14 :2619-2631 1997 ；0' Bryan 等人，Mol Cell Biol 11 :5016-5031,1991)、AML(Rochlitz 等人，Leukemia 13:1352-1358,1999)、 骨肉瘤(Nakano 等人，J. Biol. Chem. 270 :5702-5705, 2003)、黑素瘤(van Ginkel 等人， Cancer Res64 :128-134,2004)中和在頭頸鱗狀細胞癌(Green等人，Br J Cancer. 2006 94 1446-5,2006)中證實了 AXL的過表達。此外，AXL被鑒定為與非侵襲性細胞相比在侵襲性乳腺癌細胞系中上調(diào)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。在體外，發(fā)現(xiàn)AXL活性是遷移和侵襲所必需的，并且該活性可通過抗體處理來抑制(W004008147)。類似地，通過AXL的顯性負形式(dominant negative version)的表達(Vajkoczy, P.，等人，Proc. Natl. Acad. Science U. S. Α. 103 :5799-5804. 2005)或通過 AXL 的 siRNA 介導(dǎo)的下調(diào)(Holland 等人，Cancer Res. 65 :9294-9303,2005)產(chǎn)生的體內(nèi) AXL 活性的消除在鼠異種移植實驗中阻止了皮下和同位(orthotopic)細胞生長。到目前為止，已描述了結(jié)合AXL并且具有生物學(xué)活性的抗體。例如，一種已知抗體能夠減少AXL介導(dǎo)的細胞侵襲(W004008147)，而另一種抗體據(jù)報導(dǎo)減少AXL/配體相互作用。然而所有已知的抗體都是多克隆抗體或非人源化單克隆抗體。非人源化抗體、多克隆抗體或單克隆抗體被快速地從循環(huán)中清除并且通常引發(fā)全身性炎癥效應(yīng)，這使得它們不適合于治療施用。因此，鑒于AXL的治療潛能，存在對有效并且特異性地阻止AXL介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并且適合于治療性處理的單克隆人源化AXL抗體、其抗體片段或衍生物的高度需要。因此，本發(fā)明的第一方面涉及結(jié)合AXL (特別是人AXL)的細胞外結(jié)構(gòu)域并且至少部分抑制AXL活性的單克隆人源化抗體，包括其片段或衍生物。優(yōu)選，本發(fā)明的人源化抗體具有至少一個或多個下列特性減少或阻止AXL介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力、減少或阻止AXL磷酸化的能力、減少或阻止細胞增殖的能力、減少或阻止血管生成的能力、減少或阻止細胞遷移的能力、減少或阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的能力、和減少或阻止AXL介導(dǎo)的抗細胞凋亡(從而增加例如細胞對使用抗腫瘤劑的治療的敏感性)的能力。根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案，本文中描述的人源化抗體顯示減少和/或阻止配體誘導(dǎo)的AXL下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子例如ERK1/2、AKT、GSK-3 β、TSC2、mTOR和/或S6K1 的磷酸化的能力。此外，本發(fā)明的人源化抗體可展示對AXL，特別地人AXL的高特異性并且不顯著識別其他Tyro-3家族成員，例如MER和/或SKY和/或哺乳動物非靈長類AXL，例如鼠AXL0本文中使用的術(shù)語“活性”是指AXL的生物學(xué)功能，其影響細胞的表型，特別地但不限于癌癥表型，例如細胞凋亡的逃脫、生長信號的自足、細胞增殖、組織侵襲和/或轉(zhuǎn)移、 對抗生長信號的不敏感(抗細胞凋亡)和/或持續(xù)的血管生成。術(shù)語“AXL介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”意指通過AXL與第二信使分子的直接或間接相互作用觸發(fā)的第二信使途徑(例如下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo))的激活。術(shù)語“AXL磷酸化”是指氨基酸殘基，優(yōu)選酪氨酸殘基被第二 AXL蛋白(轉(zhuǎn)磷酸作用)或被另一種具有蛋白質(zhì)激酶活性的蛋白質(zhì)磷酸化。術(shù)語“細胞增殖”是指引起人細胞(特別地但不限于人癌細胞)的增殖的所有牽涉AXL的過程。它們促成或?qū)е录毎鸇NA的復(fù)制、復(fù)制的DNA至兩個同等大小的染色體組的分離以及整個細胞的物理分裂(稱為胞質(zhì)分裂)，并且受AXL的非催化或催化活性(優(yōu)選包括AXL磷酸化和/或AXL介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo))刺激或介導(dǎo)。術(shù)語“血管生成”是指促成從現(xiàn)有血管生長新血管，特別地但不限于新腫瘤供應(yīng)血管的所有牽涉AXL的過程。這些過程包括多個細胞事件，例如血管內(nèi)皮細胞的增殖、存活、 遷移和出芽(sprouting)、周細胞的吸引和遷移以及用于血管穩(wěn)定的基底膜形成、血管灌流、或基質(zhì)或贅生性細胞的血管生成因子的分泌，并且受AXL的非催化或催化活性(優(yōu)選包括AXL磷酸化和/或AXL介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo))刺激或介導(dǎo)。術(shù)語“轉(zhuǎn)移”是指支持癌細胞從原發(fā)性腫瘤擴散，滲入淋巴管和/或血管，通過血流循環(huán)，并且在身體的其他部位的正常組織中的遠距離病灶(轉(zhuǎn)移灶)中生長的所有牽涉AXL的過程。特別地，其是指引起轉(zhuǎn)移并且由AXL的非催化或催化活性(優(yōu)選包括AXL磷酸化和/或AXL介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo))刺激或介導(dǎo)的腫瘤細胞的細胞事件例如增殖、遷移、錨定不依賴性、細胞凋亡的逃脫或血管生成因子的分泌。術(shù)語“AXL介導(dǎo)的抗細胞凋亡”是指阻止人細胞，優(yōu)選但不限于人癌細胞程序化細胞死亡(細胞凋亡)的所有牽涉AXL的過程。特別地，其指使人細胞，優(yōu)選但不限于人癌細胞免受因生長因子的撤離、缺氧、對化療劑或輻射的暴露或hs/Apo-l受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始而誘導(dǎo)的細胞凋亡，并且受AXL的非催化或催化活性(優(yōu)選包括AXL磷酸化和/ 或AXL介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo))刺激或介導(dǎo)的過程。術(shù)語“區(qū)域”和“結(jié)構(gòu)域”在本發(fā)明中是彼此一致的。稱為“ 11B7，，和“ 11D5，，的抗體在本發(fā)明中也可分別被稱為“#11B7，，和“#11D5 ”。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本文中描述的人源化抗體來源于下列之一嵌合(大鼠/ 人)抗AXL抗體11B7 (其輕鏈和重鏈的氨基酸序列分別由SEQ ID NO :135和136顯示)、 11D5(其輕鏈和重鏈的氨基酸序列分別由SEQ ID NO :137和138顯示)或10D12或識別 AXL的細胞外結(jié)構(gòu)域上的相同表位的抗體。特別優(yōu)選的人源化抗體來源于11B7和11D5。 優(yōu)選地，人源化抗體在至少一個可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)中包含至少一個突變。此類突變可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法引入，以改變氨基酸序列。優(yōu)選，突變利用在人構(gòu)架區(qū)中保守的氨基酸替代11B7或11D5的構(gòu)架區(qū)中的氨基酸。用于確定人構(gòu)架區(qū)中的保守或共有氨基酸的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，例如使用程序例如IgBLAST的同源建模 (homology modelling)。根據(jù)另一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的人源化抗體來源于抗AXL抗體，優(yōu)選來源于抗AXL抗體11B7或11D5，其中所述抗體(優(yōu)選11B7或11M)的至少一個可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)被人或人源化構(gòu)架區(qū)替代。本發(fā)明的抗體對AXL的結(jié)合活性可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來測定。例如，活性可利用Biacore使用表面等離子共振和/或通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、 EIA(酶免疫測定)、RIA(放射免疫測定)或熒光抗體技術(shù)例如FACS來測定。優(yōu)選地，當與多克隆或單克隆非人源化抗AXL抗體例如大鼠11B7或11D5相比較時，本發(fā)明的人源化抗體具有更低的免疫原性。除了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法以夕卜，減少的免疫原性可通過基于ELISA的HAHA或HAMA測定(IBL-America，Minnesota/ LiSrarFish, Italy)來測定。此外，優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體不會從血液循環(huán)快速清除并且如果給患者施用，不會引發(fā)全身性炎癥效應(yīng)。本發(fā)明的抗體可具有至少一個抗原結(jié)合部位，例如，1或2個抗原結(jié)合部位。此外， 抗體優(yōu)選包含至少一條免疫球蛋白重鏈和至少一條免疫球蛋白輕鏈。免疫球蛋白鏈包含可變結(jié)構(gòu)域和任選地恒定結(jié)構(gòu)域。可變結(jié)構(gòu)域可包含互補決定區(qū)(⑶R)，例如⑶R1、⑶R2 和/或CDR3區(qū)，以及構(gòu)架區(qū)。術(shù)語“互補決定區(qū)”(CDR)在本領(lǐng)域內(nèi)已有明確定義(參見， 例如，Harlow 禾口 Lane, “ Antibodies, a Laboratory Manual “ , CSH Press, Cold Spring Harbour, 1988)，其是指抗體的可變區(qū)內(nèi)主要與抗原接觸的氨基酸區(qū)段。根據(jù)其他實施方案，本發(fā)明的人源化抗體來源于抗AXL抗體11B7，并且可包含選自SEQ ID N0:40至SEQ ID NO :48的重鏈氨基酸序列，或至少其可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90 %的序列同一性并且代表對Axl具有結(jié)合活性(所述結(jié)合活性等于具有100 %的序列同一性的氨基酸序列對Axl的結(jié)合活性)的可變區(qū)的氨基酸序列，或選自SEQ ID NO 80至SEQ ID NO 82的重鏈氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90 %的序列同一性并且代表對Axl具有結(jié)合活性(所述結(jié)合活性等于具有100 % 的序列同一性的氨基酸序列對Axl的結(jié)合活性)的可變區(qū)的氨基酸序列，和/或選自SEQ ID NO 18至SEQ ID NO 30的輕鏈氨基酸序列，或至少其可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90%的序列同一性并且代表對Axl具有結(jié)合活性(所述結(jié)合活性等于具有100%的序列同一性的氨基酸序列對Axl的結(jié)合活性)的可變區(qū)的氨基酸序列，或選自SEQ ID NO 73至SEQ ID NO 79的輕鏈氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90 %的序列同一性并且代表對Axl具有結(jié)合活性(所述結(jié)合活性等于具有100 % 的序列同一性的氨基酸序列對Axl的結(jié)合活性)的可變區(qū)的氨基酸序列，或其識別AXL的細胞外結(jié)構(gòu)域上的相同表位的片段。本發(fā)明的序列的描述提供于下文的“序列說明”中和序列表中。根據(jù)另一個其他實施方案，本發(fā)明的人源化抗體來源于抗AXL抗體11B7，并且可包含選自SEQ ID NO :150和SEQ ID NO :151的重鏈氨基酸序列，或至少其可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90 %的序列同一性并且代表對Axl具有結(jié)合活性(所述結(jié)合活性等于具有 100%的序列同一性的氨基酸序列對Axl的結(jié)合活性)的可變區(qū)的氨基酸序列，和/或選自SEQ ID NO :146和SEQ ID NO :147的輕鏈氨基酸序列，或至少其可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90%的序列同一性并且代表對Axl具有結(jié)合活性(所述結(jié)合活性等于具有100%的序列同一性的氨基酸序列對Axl的結(jié)合活性)的可變區(qū)的氨基酸序列。在特別優(yōu)選的實施方案中，人源化h#l 1B7抗體選自h#l 1B7-T1、h#l 1B7-T2、 h#llB7-T3, h#llB7-T4, h#llB7_T5, h#llB7_T6, h#llB7_T7, h#llB7_T8, h#llB7_T9, h#llB7-T10、h#llB7-Tll、h#llB7-T12、h#llB7-T13、h#llB7-T14、h#llB7-T15、h#llB7-T16、 h#llB7-T17、h#llB7-T18、h#llB7-T19、h#llB7-T20、h#llB7-T21、h#llB7-T22、h#llB7-T23、 h#llB7-T24、h#llB7-T25、h#llB7-T26 和 h#llB7_T27 抗體。表 1 (實施例 10)概述了具體人源化重鏈和輕鏈氨基酸序列的組合、各自相應(yīng)的表達載體的組合，其是本發(fā)明的上述人源化h#llB7抗體的特征所在。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，人源化h#llB7抗體選自h#llB7_T28， h#llB7-T29，h#llB7-T30 和 h#llB7-T31 抗體。表 2 (實施例 22)概述了上述人源化 h#llB7 抗體特征所在的具體人源化重鏈和輕鏈氨基酸序列的組合、各自相應(yīng)的表達載體的組合。來源于大鼠抗人Axl單克隆抗體#11B7的人源化抗體不限于上述段落中例舉的特定抗體，只要所述人源化抗體保留全部6個CDR和對Axl抗原的結(jié)合活性即可。所述人源化抗體分別在其重鏈中保留 CDRHl (SNYWG ；SEQ ID NO :124)、CDRH2 (YITYSGSTSYNPSLKS ；SEQ ID NO 125)和 CDRH3(TTFYY ；SEQ ID NO :126)和在其輕鏈中保留 CDRL4 (RASQDIGNYLR ；SEQ ID NO :121)、CDRL5(GATNLAA ； SEQ ID NO :122)和 CDRL6 (LQSKESPWT ;SEQ ID NO :123)。根據(jù)其他實施方案，本發(fā)明的人源化抗體來源于11D5，并且包含選自SEQ ID NO 67至SEQ ID NO :72的重鏈氨基酸序列，或至少其可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90%的序列同一性并且代表對Axl具有結(jié)合活性(所述結(jié)合活性等于具有100%的序列同一性的氨基酸序列對Axl的結(jié)合活性)的可變區(qū)的氨基酸序列，或選自SEQ ID NO :114至SEQ ID NO 120的重鏈氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90%的序列同一性并且代表對Axl具有結(jié)合活性(所述結(jié)合活性等于具有 100%的序列同一性的氨基酸序列對Axl的結(jié)合活性)的可變區(qū)的氨基酸序列，和/或選自SEQ ID NO 55至SEQ ID NO 60的輕鏈氨基酸序列，或至少其可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90%的序列同一性并且代表對Axl具有結(jié)合活性(所述結(jié)合活性等于具有100%的序列同一性的氨基酸序列對Axl的結(jié)合活性)的可變區(qū)的氨基酸序列，或選自SEQ ID N0:83至SEQ ID NO :113的輕鏈氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90%的序列同一性并且代表對Axl具有結(jié)合活性(所述結(jié)合活性等于具有100% 的序列同一性的氨基酸序列對Axl的結(jié)合活性)的可變區(qū)的氨基酸序列，或其識別AXL的細胞外結(jié)構(gòu)域上的相同表位的片段。在特別優(yōu)選的實施方案中，人源化h#llD5抗體選自h#llD5_Tl、h#llD5_T2、 h#llD5-T3、h#llD5-T4、h#llD5-T5 或 h#llD5-T6 抗體。實施例 11、12 和 14 顯示上述人源化 h#llD5抗體特征所在的具體人源化重鏈和輕鏈氨基酸序列的組合、各自相應(yīng)的表達載體的組合。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案之一是具有相對高的熱變性中點(thermaldenaturation midpoint, Tm)的人源化抗體。在本發(fā)明中，人源化抗體具有至少70°C的Tm，優(yōu)選至少75°C 的Tm，更優(yōu)選至少78°C的Tm，更優(yōu)選至少80°C的Tm，更優(yōu)選82V的Tm?；蛘撸诒景l(fā)明中， 人源化抗體具有與其原型(ancenstor)大鼠或嵌合抗體的Tm相等的Tm，但優(yōu)選具有比其原型大鼠或嵌合抗體的Tm高至少3°C的Tm，更優(yōu)選高至少6°C的Tm，更優(yōu)選高至少8°C的Tm， 更優(yōu)選高至少10°C的Tm。這樣的優(yōu)選，更優(yōu)選，特別優(yōu)選或更加優(yōu)選的人源化抗體不易于變性(解折疊)或失活，并且適合于制備成可穩(wěn)定地長期貯存的溶液制劑。來源于大鼠抗人AXL單克隆抗體#11D5的人源化抗體不限于前述段落中例舉的具體抗體，而只要所述人源化抗體保留全部6個CDR和對Axl抗原的結(jié)合活性即可。所述人源化抗體分別在其重鏈中保留 CDRHl (SNYWG ；SEQ ID NO :130)、CDRH2 (HITNSGNTTYNPSLKS ；SEQ IDNO 131)和 CDRH3(GAFDY ；SEQ ID NO :132)以及在其輕鏈中保留 CDRL4 (RASQDIGNYLS ；SEQ ID NO 127)、CDRL5 (GAIKLAV ；SEQ ID NO :128)和 CDRL6 (LQYIQFPLT ；SEQ ID NO :129)。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是(特異性)結(jié)合或識別更接近羧基端的IG結(jié)構(gòu)域之一(包含NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫ACCESSION No. P_30530的氨基酸No. 129-220的氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域SEQ ID而139;圖30幻的抗體。這樣的優(yōu)選抗體不限于人源化抗體，并且可以是人抗體或它們之一的功能性片段。更優(yōu)選地，這樣的優(yōu)選抗體抑制Axl具有的至少一個生物學(xué)活性。本發(fā)明的(完整)抗體可以例如通過進行下列步驟來產(chǎn)生構(gòu)建重鏈表達載體和輕鏈表達載體，其中每一個所述載體具有包含可變區(qū)和恒定區(qū)的插入物；將所述載體引入宿主細胞；培養(yǎng)所述細胞；從培養(yǎng)上清液(條件化培養(yǎng)基)回收抗體多肽，如實施例9至12 中所舉例說明的。如本文中所使用的，兩個多肽序列之間的“序列同一性”表示序列之間相同的氨基酸的百分比。用于確定兩個給定的多肽序列之間的“序列同一性”的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。本發(fā)明的優(yōu)選多肽序列具有至少90%，更優(yōu)選至少95%和更優(yōu)選至少98%的序列同一性。序列同一性可以例如利用BLAST (Karlin和Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, pp5873 (1993))開發(fā)的算法)或 FASTA (Methods in Enzymo 1.,183，pp63(1990))來測定。稱為 BLASTN 或 BLASTX 的程序是可獲得的(J. Mol. Biol.，215， pp403(1990))。本發(fā)明的抗體可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM類型，優(yōu)選IgG或IgM類型，包括但不限于 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgMl 和 IgM2 類型。優(yōu)選，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當?shù)姆椒?，通過同源建模設(shè)計本發(fā)明的抗體。此外，可按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法例如嵌合化或CDR移植來產(chǎn)生給定的抗體例如 11B7或11D5的人源化形式。用于產(chǎn)生人源化抗體的備選方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的并且描述于例如EP-Al O 239 400和W090/07861中。通常，人源化抗體具有一個或多個導(dǎo)入其中的來自非人來源的氨基酸殘基。此類非人氨基酸殘基通常稱為“輸入”殘基，其通常獲自 “輸入”可變結(jié)構(gòu)域。人源化可以例如按照Winter和同事的方法(Jones等人，Nature，321 522-525(1986) ；Riechmann 等人，Nature, 332 :323-327(1988) ；Verhoeyen 等人，Science, 239 :1534-1536 (1988))，通過用非人來源的⑶R或⑶R序列置換人抗體的相應(yīng)序列來進行。 因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4，816，567)，其中大體上比完整人可變結(jié)構(gòu)域小的部分被來自非人物種的相應(yīng)序列置換。實際上，人源化抗體通常是其中一些CDR 殘基和可能地一些FR殘基被來自非人抗體中類似位點的殘基置換的人抗體。人抗體可來源于人抗體的噬菌體展示文庫(Wormstone，I. Μ.等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002)43(7), p. 2301-2308 ;Carmen, S.等人， Briefings in Functional Genomicsand Proteomics(2002) , 1 (2) , p. 189-203 ； Siriwardena, D.等人，Opthalmology (2002) 109 (3)，p. 427-431)，其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。例如，可使用噬菌體展示法，其包括使人抗體的可變區(qū)以單鏈抗體，scFv的形式在噬菌體的表面上表達，然后選擇結(jié)合抗原的噬菌體(Nature Biotechnology (2005), 23, (9)，ρ·1105-1116)。通過分析所選擇的噬菌體的基因，可測定編碼結(jié)合抗原的人抗體的可變區(qū)的DNA 序列。在測定scFv的DNA序列后，可通過構(gòu)建包含所述序列的表達載體并且將所述載體引入適當?shù)乃拗骷毎?以表達所述抗體)來產(chǎn)生人抗體(W092001047、W092020791、 W093006213、W093011236、W093019172、W095001438、W095015388 禾P Annu. Rev. Immunol (1994) 12，p. 433-455 以及 Nature Biotechnology (2005) 23 (9)，p. 1105-1116)。無論產(chǎn)生其的方法如何，任何人抗體可以是本發(fā)明的實施方案，只要所述人抗體具有對人AXL抗原的結(jié)合活性和全部下列6個CDR 分別地，其重鏈中的CDRHl (SNYWG ； SEQ ID NO :130)、CDRH2(HITNSGNTTYNPSLKS ;SEQ ID NO :131)和 CDRH3 (GAFDY ;SEQ ID NO 132)和其輕鏈中的 CDRL4 (RASQDIGNYLS ；SEQ ID NO : 127)、CDRL5 (GAIKLAV ；SEQ ID NO 128) ^P CDRL6 (LQYIQFPLT ；SEQ ID NO : 1 )，或者，只要所述人抗體具有對人AXL抗原的結(jié)合活性和全部下列6個CDR 分別地，其重鏈中的CDRHl (SNYWG ；SEQ ID NO 124)、 CDRH2 (YITYSGSTSYNPSLKS ；SEQ ID NO 125)禾口 CDRH3(TTFYY ;SEQ ID NO :126)禾口其 輕鏈中的 CDRL4(RASQDIGNYLR ;SEQ ID NO :121)、CDRL5 (GATNLAA ； SEQ ID NO :122)和 CDRL6 (LQSKESPWT ； SEQ ID NO :123)。對于治療目的，可用治療效應(yīng)物基團例如放射性基團或細胞毒性基團(cytotoxicgroup)綴合抗體。對于診斷目的，可標記抗體。合適的標記包括放射性標記、熒光標記或酶標記。如上所論述的，除了完整抗體外，本發(fā)明的抗體還可以以多種形式存在，包括例如 Fv,Fab,Fab'和F(ab' )2、雙抗體(diabody)、minibody、包含多于1個抗體的片段的二價或多價抗體，以及以單鏈(scFV)形式存在；參見例如W08809344。本發(fā)明的抗體可以是特異于多于一個抗原或表位的雙特異性抗體或多特異性抗體。scFv可通過下列來獲得通過多肽接頭將免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)與免疫球蛋 SfeIiIW nT^Kffin- (Pluckthun, The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, 113, 由 Rosenburg 禾口 Moore 編著，SpringerVerlag, New York, p. 269—315(1994)禾口 Nature Biotechnology (2005)，23，p. 1126-1136)。BiscFv可通過使用多肽接頭融合2個不同的 scFV來獲得。用于產(chǎn)生scFv的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的(US4，946，778， US5, 260，203，US5，091，513，US5，455，030等)。優(yōu)選地，兩個可變區(qū)之間的接頭不產(chǎn)生綴合物(Huston, J. S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1988)85，p. 5879-5883)。scFV 免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和scFV免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)可來源于相同抗體或兩種抗體(其中的一種與另一種不同)。多肽接頭可以是由例如12至19個氨基酸殘基組成的單鏈肽。編碼scFV的DNA可通過PCR產(chǎn)生，其包括使用編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的全長或部分的DNA和相應(yīng)于兩個末端的各末端的兩個寡核苷酸分別作為模板和一對引物來擴增DNA片段，隨后使用經(jīng)設(shè)計的一對引物來進行擴增，以便將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別連接至多肽接頭的一個末端和另一個末端?？贵w的功能性片段(包括scFv)可通過下列來產(chǎn)生將編碼所述scFv的DNA引入宿主細胞并且培養(yǎng)所述細胞，如本說明書的其他地方中所描述的。本發(fā)明的實施方案之一是，對抗原具有比單體抗體更高的結(jié)合親和力的多聚體抗體。所述多聚體抗體的單位可以是相同的或彼此不同的(此時一個單位結(jié)合抗原的一個表位并且另一個單位結(jié)合相同抗原的不同表位)。IgG CH3結(jié)構(gòu)域與2個結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白的scFv的結(jié)合以及螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序列的引入可用于產(chǎn)生多聚體抗體。需要時，可在重鏈和/或輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域中突變本發(fā)明的抗體以改變抗體的結(jié)合性質(zhì)。例如，可在一個或多個CDR區(qū)中產(chǎn)生突變以增加或減少抗體對于AXL的Kd或改變抗體的結(jié)合特異性。定點誘變技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。參見，例如，Sambrook等人和 Ausubel等人，同上。此外，可在AXL抗體的可變區(qū)中對已知發(fā)生改變(與種系相比)的氨基酸殘基進行突變。在另一個方面，除了關(guān)于人源化的突變外，還可將其他突變導(dǎo)入一個或多個構(gòu)架區(qū)?？稍跇?gòu)架區(qū)或恒定結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生突變以增加AXL抗體的半衰期。參見，例如， W00009560。還可在構(gòu)架區(qū)或恒定結(jié)構(gòu)域中進行突變以改變抗體的免疫原性，以提供用于與另一個分子共價或非共價結(jié)合的位點，或以改變性質(zhì)如補體結(jié)合(complementfixation)。 可在單個突變抗體的每一個構(gòu)架區(qū)、恒定結(jié)構(gòu)域和可變區(qū)中產(chǎn)生突變。備選地，可以只在單個突變抗體的構(gòu)架區(qū)、可變區(qū)或恒定結(jié)構(gòu)域中的一個區(qū)域中產(chǎn)生突變。本發(fā)明的實施方案之一是包含多于一種本發(fā)明的抗體的多克隆抗體。
本發(fā)明的實施方案之一是本發(fā)明的抗體或其功能性片段的化學(xué)修飾。分子例如聚合物(聚乙二醇等)可用于產(chǎn)生修飾的抗體或修飾的功能性片段。在另外的方面，根據(jù)本發(fā)明的人源化抗體可具有擁有效應(yīng)子功能的恒定結(jié)構(gòu)域， 由此在細胞表面上結(jié)合抗體、其抗體片段或衍生物的表達AXL的細胞可被免疫系統(tǒng)功能攻擊。例如，抗體可能能夠結(jié)合補體和參與補體依賴性細胞毒性(CDC)。此外，抗體可能能夠結(jié)合效應(yīng)子細胞例如單核細胞和天然殺傷(NK)細胞上的Fc受體，并參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在另一個方面，本文中描述的抗體可用于治療性治療，優(yōu)選用于治療過度增殖性疾病，心血管疾病，特別地動脈粥樣硬化和血栓形成，糖尿病相關(guān)疾病，特別地腎小球肥大或糖尿病性腎病，和特別地與AXL表達、過表達或過度活躍相關(guān)、與其相伴或由其引起的病癥。過度增殖性疾病優(yōu)選選自與AXL表達、過表達或過度活躍相關(guān)、與其相伴或由其引起的病癥，例如癌癥，例如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、濾泡性淋巴瘤、髓性白血病、皮膚癌/黑色素瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、巴雷特食管(Barrett' s esophagus) 和食管癌、胃癌、膀胱癌、宮頸癌、肝癌、甲狀腺癌和頭頸癌，或增生性和贅生性疾病或其他表達或過表達AXL的過度增殖性疾病?？赏ㄟ^體外、體內(nèi)或離體實驗來證明、顯示或表明本發(fā)明的抗體用于治療任何Axl 相關(guān)疾病例如過度增殖性疾病的適用性，所述實驗包括基于下列的實驗配體誘導(dǎo)的Axl 的自磷酸化、對Axl介導(dǎo)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)例如配體誘導(dǎo)的Akt和P42/44MAP-激酶磷酸化的影響、癌細胞遷移或增殖、配體誘導(dǎo)的表達Axl的細胞的遷移或增殖、組織或細胞的血管生成，和移植至非人動物例如異種移植小鼠的人癌癥或癌細胞的生長或轉(zhuǎn)移，以及任何其他臨床前/非臨床實驗和臨床試驗。在另一個方面，本發(fā)明的抗體可用于與抗腫瘤劑共施用，以治療上述病癥之一。如本文中使用的，共施用包括將本發(fā)明的抗體與抗腫瘤劑，優(yōu)選誘導(dǎo)細胞凋亡的抗腫瘤劑一起施用。術(shù)語共施用還包括以單一組合物的形式或以兩個或更多個不同組合物的形式施用本發(fā)明的抗體和抗腫瘤劑，優(yōu)選誘導(dǎo)細胞凋亡的抗腫瘤劑。共施用包括同時 (即，在相同的時間)或相繼(即，以一定的間隔)施用本發(fā)明的抗體與抗腫瘤劑，優(yōu)選誘導(dǎo)細胞凋亡的抗腫瘤劑。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的抗體、抗體片段或其衍生物的核酸分子。編碼上述抗體、抗體片段或其衍生物的本發(fā)明的核酸分子可以是例如DNA、cDNA、RNA或合成產(chǎn)生的DNA 或RNA或重組產(chǎn)生的嵌合核酸分子(其單獨地或組合地包含任何此類核酸分子)。核酸分子還可以是相應(yīng)于完整基因或其大部分或相應(yīng)于其片段和衍生物的基因組DNA。核苷酸序列可以相應(yīng)于天然發(fā)生的核苷酸序列或可包含單個或多個核苷酸置換、缺失或添加。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，核酸分子是cDNA分子。根據(jù)其他方面，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其選自(a)編碼本發(fā)明的多克隆抗體、抗體片段或其衍生物的核酸序列，(b)如選自 SEQ ID NO :5 至 SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :31 至 SEQID NO :39、SEQ ID NO 49 至 SEQ ID NO 54 和 SEQ ID NO 60 至 SEQ IDNO 66 的 SEQ ID NO 之一所示的核酸序列，(c)編碼選自 SEQ ID NO 18 M SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 40 至 SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 55 至 SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :67 至 SEQID NO 72,SEQ ID NO 73 至 SEQ ID NO 120和SEQ ID NO :121至132的多肽的核酸序列，(d)與(a)至(C)中的任何序列互補的核酸，或(e)在嚴格條件下能夠與(a)、(b)、(c)或(d)雜交并且編碼多肽的核酸序列，其中包含所述多肽的抗體或其功能性片段結(jié)合AXL的細胞外結(jié)構(gòu)域，(f)如選自 SEQ ID NO :144 和 SEQ ID 145 以及 SEQ ID NO :148 和 SEQ ID NO :149 的SEQ ID NO之一所示的核酸序列，(g)編碼選自 SEQ ID NO :146 和 SEQ ID NO :147 以及 SEQ ID NO :150 和 SEQ ID NO 151的多肽的核酸序列，(h)與(f)或(g)中的任何序列互補的核酸，或(i)能夠在嚴格條件下與(f)，(g)或(h)雜交并且編碼多肽的核酸序列，其中包含所述多肽的抗體或其功能性片段結(jié)合AXL的細胞外結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“在嚴格條件下雜交”意指兩個核酸片段在例如Sambrook等人，“Expression of cloned genes in Ε.coli" in MolecularCloning:A laboratory manual (1989), Cold Spring HarborLaboratory Press, New York, USA 中描述的標準雜交條件下彼此雜交。此類條件例如在大約45°C下于6. OxSSC中雜交，然后在50°C下使用2. OxSSC，優(yōu)選在65°C下使用2. OxSSC，或在50°C下使用0. hSSC，優(yōu)選在65°C下使用 0. 2xSSC進行清洗步驟。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸分子的載體。所述載體可以是例如，噬菌體、質(zhì)粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是有復(fù)制能力或復(fù)制缺陷型載體。在后一種情況下，病毒繁殖通常只在互補宿主細胞(complementing host cell)中發(fā)生?？蓪⒈景l(fā)明的核酸分子與包含選擇標記的載體連接以在宿主中進行擴增。通常， 以沉淀例如磷酸鈣沉淀或氯化銣沉淀的形式，或以與帶電荷的脂質(zhì)的復(fù)合物的形式或以碳基簇(carbon-based cluster)例如富勒烯(fulleren)的形式導(dǎo)入質(zhì)粒載體。如果載體是病毒，那么其在應(yīng)用于宿主細胞之前可使用合適的包裝細胞系進行體外包裝。優(yōu)選，本發(fā)明的載體是其中核酸分子有效地連接至一個或多個控制序列(從而允許在原核和/或真核宿主細胞中轉(zhuǎn)錄和任選地表達)的表達載體。所述核酸分子的表達包括核酸分子的轉(zhuǎn)錄(優(yōu)選至可翻譯的mRNA)。確保在真核細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞中表達的調(diào)控元件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。它們通常包括確保轉(zhuǎn)錄的起始的調(diào)控序列和任選地確保轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定的poly-A信號。另外的調(diào)控元件可包括轉(zhuǎn)錄和翻譯增強子。允許在原核宿主細胞中表達的可能的調(diào)控元件包括大腸桿菌(E.coli)中的 lac.trp或tac啟動子，允許在真核宿主細胞中表達的調(diào)控元件的實例是酵母中的AOXI或 GALl啟動子或哺乳動物和其他動物細胞中的CMV啟動子、SV40啟動子、RSV(勞斯肉瘤病毒)啟動子、CMV增強子、SV40增強子或珠蛋白內(nèi)含子。除了負責轉(zhuǎn)錄起始的元件以外，此類調(diào)控元件還可包括多核苷酸下游的轉(zhuǎn)錄終止信號例如SV40-poly-A位點或tk-poly-A位點。在本說明書中，合適的表達載體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，例如Okayama-Berg cDNA表達載體 pcDVl (Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNAl、pcDNA3 (Invitrogen)或 pSPORTI (GIBC0 BRL)。優(yōu)選，所述載體是表達載體和/或基因轉(zhuǎn)移或靶向性載體。源自病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒或牛乳頭瘤病毒的表達載體可用于將本發(fā)明的多核苷
13酸或載體遞送入靶向的細胞群體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)建重組病毒載體； 參見，例如，Sambrook, Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory (2001，第 3 片反)N. Y.禾口 Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N. Y. (1994)中描述的技術(shù)。備選地，可將本發(fā)明的核酸分子重構(gòu)入脂質(zhì)體以遞送至靶細胞。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的載體的宿主。所述宿主可以是原核或真核細胞或非人轉(zhuǎn)基因動物?？蓪⒋嬖谟谒拗髦械谋景l(fā)明的多核苷酸或載體整合入宿主的基因組或其可以保持在染色體外。在該方面，還應(yīng)理解，本發(fā)明的核酸分子可用于“基因打靶”和/或“基因替代”，以恢復(fù)突變基因或通過同源重組產(chǎn)生突變基因；參見例如Mouellic，Proc. Nat ！. Acad. Sci. USA,87(1990),4712-4716 ；Joyner, GeneTargeting, A Practical Approach, Oxford University Press。宿主可以是任何原核或真核細胞，例如細菌細胞、昆蟲細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞或優(yōu)選，人細胞。優(yōu)選的真菌細胞是例如酵母菌屬 (Saccharomyces)的真菌細胞，特別地釀酒酵母(S. cerevisiae)的真菌細胞。術(shù)語“原核的”意欲包括可用多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染以表達本發(fā)明的變異多肽的所有細菌。原核宿主可包括革蘭氏陰性以及革蘭氏陽性細菌，例如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium), 粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何技術(shù)將編碼本發(fā)明的變異多肽的突變體形式的多核苷酸用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主。用于制備融合的，有效連接的基因和在細菌或動物細胞中表達它們的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(Sambrook, Molecular Cloning ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001，第3版)。本文中描述的基因構(gòu)建體和方法可用于在例如原核宿主中表達本發(fā)明的變異抗體、其抗體片段或衍生物。通常，結(jié)合宿主，使用包含促進插入的核酸分子的有效轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的表達載體。表達載體通常包含復(fù)制起點、啟動子和終止子以及能夠提供轉(zhuǎn)化的細胞的表型選擇的特定基因?？砂凑毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)在發(fā)酵罐中生長和培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的原核宿主以獲得最佳的細胞生長。然后可從生長培養(yǎng)基、細胞裂解物或細胞膜級分分離本發(fā)明的抗體、抗體片段或其衍生物。可通過任何常規(guī)方法例如制備型色譜分離和免疫分離(例如包括單克隆或多克隆抗體的使用的那些)來分離和純化微生物或其他生物表達的本發(fā)明的抗體、抗體片段或其衍生物。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，宿主是細菌、真菌、植物、兩棲動物或動物細胞。優(yōu)選的動物細胞包括但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(CH0細胞，ATCC CCL-61)或其二氫葉酸還原酶缺陷株系(Urlaub，G.和 Chasin，L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1980) 77， p.4126-4220)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)(Gluzman, Y. Cell(1981)23， p. 175-182 和 ATCC CRL-1650)、來源于小鼠成纖維細胞(ATCCNo. CRL-1658)的 NIH3T3 細胞或3T3細胞、NSO細胞和許多其他細胞系包括人細胞，例如Per. C6。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述動物細胞是昆蟲細胞。優(yōu)選的昆蟲細胞包括但不限于SF9細胞系細胞。 在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方案中，所述宿主是人細胞或人細胞系。所述人細胞包括但不限于人胚腎細胞(HEK293、293TJ93freestyle)。此外，所述人細胞系包括但不限于 HeLa細胞、人肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、A549細胞。 本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，其包含一個或多個可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的本發(fā)明的核酸分子?？稍谏窖?、牛、馬、豬、大鼠、小鼠、兔子、倉鼠或其他哺乳動物的組織或體液例如奶、血液或尿中產(chǎn)生和回收抗體。參見，例如，美國專利5，827，690 ；5, 756,687 ； 5，750, 172 ；和5，741，957。如上所述，可通過用AXL或其部分進行免疫來產(chǎn)生包含人免疫球蛋白基因座的非人轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明還涉及用于制備抗體的方法，其包括在允許所述抗體合成的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主和從所述培養(yǎng)物回收所述抗體?？砂凑毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)在發(fā)酵罐中生長和培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主以獲得最佳細胞生長。在表達后，可按照本領(lǐng)域內(nèi)的標準方法包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳等純化本發(fā)明的完整抗體、它們的二聚體、單獨的輕鏈和重鏈或其他免疫球蛋白形式；參見， Scopes, “ Protein Purification"，Springer-Verlag，N. Y. (1982)。然后可從生長培養(yǎng)基、細胞裂解物或細胞膜級分分離本發(fā)明的抗體或其相應(yīng)的免疫球蛋白鏈?？梢酝ㄟ^任何常規(guī)方法例如制備型色譜分離和免疫分離(例如包括抗例如本發(fā)明的抗體的恒定區(qū)的單克隆或多克隆抗體的使用的那些)分離和純化例如微生物表達的本發(fā)明的抗體或免疫球蛋白鏈。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很顯然的是，還可將本發(fā)明的抗體偶聯(lián)至其他部分以進行例如藥物靶向和成像應(yīng)用?？稍诳贵w或抗原表達后通過化學(xué)方法進行至附著位點的偶聯(lián)，或在DNA水平上將偶聯(lián)產(chǎn)物工程改造至本發(fā)明的抗體或抗原中。然后在合適的宿主系統(tǒng)中表達DNA，以及，需要時收集和使表達的蛋白質(zhì)復(fù)性。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將抗體偶聯(lián)至效應(yīng)物例如放射性同位素或毒性化療劑。優(yōu)選，此類抗體綴合物用于靶向表達AXL的細胞，例如癌細胞，以消除其。本發(fā)明的抗體/抗體片段與放射性同位素的連接例如為腫瘤的治療提供了有利方面。與化學(xué)療法和其他形式的癌癥療法不同，放射免疫療法或放射性同位素-抗體組合的施用直接靶向癌細胞而對周圍的正常、健康組織的損害最小。優(yōu)選的放射性同位素包括例如3H、14C、15N、35S、9°Y、 "Tc,111In^125K131I0此外，當用毒性化療藥物例如格爾德霉素(Mandler等人，J. Natl. Cancer Inst.，92 (19) ,1549-51 (2000))和美登素例如美坦生類(maytansinoid)藥物， DMl (Liu 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 93 :8618-8623 (1996)和 auristatin-E 或 monomethylauristatin-E(Doronina 等人，Nat. Biotechnol. 21 :778-784(2003)或卡奇霉素(calicheamicit))綴合時，本發(fā)明的抗體可用于治療癌癥；將在酸性或還原條件下或當暴露于特定的蛋白酶時釋放藥物的不同連接體用于該技術(shù)?？扇绫绢I(lǐng)域中所述綴合本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的實施方案之一是本發(fā)明的抗體或其功能性片段的化學(xué)修飾。分子例如聚合物(聚乙二醇等)可用于產(chǎn)生修飾的抗體或修飾的功能性片段。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的抗體、核酸分子、載體、宿主或通過本發(fā)明的方法獲得的抗體的藥物組合物。術(shù)語“組合物”，如本文中所使用的，包含至少一種本發(fā)明的化合物。優(yōu)選，這樣的組合物是藥物組合物或診斷組合物。優(yōu)選，所述藥物組合物包含可藥用載體和/或稀釋劑。本文中公開的藥物組合物可部分地用于治療與AXL表達、過表達或過度活躍相關(guān)、與其相伴或由其引起的病癥，例如過度增殖性疾病、心血管疾病，特別地動脈粥樣硬化和血栓形成、糖尿病相關(guān)疾病，特別地腎小球肥大或糖尿病性腎病。所述病癥包括但不限于癌癥例如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、 濾泡性淋巴瘤、髓性白血病、皮膚癌/黑色素瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、 巴雷特食管和食管癌、胃癌、膀胱癌、宮頸癌、肝癌、甲狀腺癌和頭頸癌、或其他增生性疾病或贅生性疾病或其他AXL表達或過表達的疾病。術(shù)語“過度活躍”在本文中是指可由負調(diào)控的缺乏和/或功能障礙引起的不受控制的AXL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，負調(diào)控包括蛋白質(zhì)的去磷酸化、降解和/或內(nèi)吞作用。此外，不受控制的AXL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以是遺傳改變(體細胞或種系)的結(jié)果，所述遺傳改變導(dǎo)致AXL 氨基酸序列的變化。合適的藥物載體、賦形劑和/或稀釋劑的實例在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，包括磷酸緩沖鹽溶液、水、乳劑例如油/水乳劑、各種類型的濕潤劑、無菌溶液等。包含此類載體的組合物可通過熟知的常規(guī)方法來配制?？梢砸院线m的劑量給受試者施用此類藥物組合物?？赏ㄟ^不同的方法，例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、局部、皮內(nèi)、鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)施用進行合適的組合物的施用。還可將本發(fā)明的組合物直接施用至靶部位，例如通過基因槍 (biollistic)遞送至外部或內(nèi)部靶部位如腦。給藥方案將由主治醫(yī)生和臨床因素決定。如在醫(yī)療領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，用于任何一個患者的劑量取決于許多因素，包括患者的尺寸大小、 身體表面積、年齡、待施用的特定化合物、性別、施用的時間和途徑、總體健康狀況和其他同時施用的藥物。蛋白質(zhì)性質(zhì)的藥物活性物質(zhì)可以以1 μ g至100mg/kg體重/劑的量存在； 然而，預(yù)期使用低于或高于該示例性范圍的劑量，特別地在考慮到上述因素的情況下。如果方案是連續(xù)輸注，其還應(yīng)當在Ipg至IOOmg/千克體重/分鐘的范圍內(nèi)?？赏ㄟ^定期評估來監(jiān)控進展?？删植炕蛉硇允┯帽景l(fā)明的組合物。用于胃腸外施用的制劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油和可注射有機酯例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩沖的介質(zhì)。胃腸外媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖 (Ringer' s dextrose)、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏或不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)媒介物包括液體和營養(yǎng)補充劑、電解質(zhì)補充劑(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。還可存在防腐劑和其他添加劑例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。此外，取決于藥物組合物的期望的用途，本發(fā)明的藥物組合物還可包含另外的試劑。特別優(yōu)選，藥物組合物包含至少一種另外的活性劑，例如另外的抗腫瘤劑、小分子抑制劑、抗腫瘤試劑或化療劑或此類試劑的組合。本發(fā)明還涉及包含與至少一種另外的抗腫瘤劑組合的本發(fā)明的人源化抗AXL抗體的藥物組合物。所述組合在例如抑制異常細胞生長中是有效的。許多抗腫瘤劑目前在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。一般地，該術(shù)語包括能夠預(yù)防、減輕和/ 或治療過度增殖性病癥的所有試劑。在一個實施方案中，抗腫瘤劑選自治療性蛋白，包括但不限于抗體或免疫調(diào)節(jié)蛋白。在另一個實施方案中，抗腫瘤劑選自小分子抑制劑或化療劑，包括有絲分裂抑制劑、激酶抑制劑、烷基化試劑、抗代謝藥、嵌入抗生素(intercalating antibiotics)、生長因子抑制劑、細胞周期抑制劑、酶、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、組蛋白脫乙?；敢种苿⒖勾婊顒?anti-survival agent)、生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、抗激素例如抗雄激素和抗血管生成劑。
可與本文中提供的抗體組合使用的抗腫瘤劑的特定實例包括例如吉非替尼、拉帕替尼、舒尼替尼、培美曲塞、貝伐珠單抗、西妥昔單抗、伊馬替尼、曲妥珠單抗、阿侖珠單抗、 利妥昔單抗、厄洛替尼、硼替佐米等。用于本文中描述的和要求保護的組合物的其他特定抗腫瘤劑包括例如化療劑例如卡培他濱、柔紅霉素、道諾霉素、放線菌素D、多柔比星、表柔比星、伊達比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、雙氯乙基亞硝脲、 白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、普卡霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、他莫昔芬、達卡巴嗪、丙卡巴胼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲、氮芥、 美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5_氮雜胞苷、羥基脲、脫氧助間型霉素、4-羥基過氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨喋呤 (MTX)、秋水仙堿、泰素(taxol)、長春新堿、長春堿、依托泊苷、三甲曲沙、替尼泊苷、順鉬和己烯雌酚(DES)。通常參見，The MerckManual of Diagnosis and Therapy，第 15 版 1987， pp. 1206-1228，Berkow等人，eds.，Rahway，N. J。特別優(yōu)選的是誘導(dǎo)細胞凋亡的此類抗腫瘤劑。本發(fā)明還涉及包含多于一種本發(fā)明的抗體的多克隆抗體。當與所述AXL抗體一起使用時，此類抗腫瘤劑可單獨地(例如，5-FU和抗體)、相繼地(例如，5-FU和抗體進行一段時間，然后施用MTX和抗體)或與一種或多種其他此類抗腫瘤劑組合(例如，5-FU、MTX和抗體，或5-FU、放射療法和抗體)使用。術(shù)語“抗腫瘤劑”還可包括治療方法，例如輻射或放射療法。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選用于人醫(yī)療，但也可用于獸醫(yī)目的。此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的核酸分子、載體、宿主或通過本發(fā)明的方法獲得的抗體用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于診斷、預(yù)防或治療過度增殖性疾病、心血管疾病，特別地動脈粥樣硬化和血栓形成、糖尿病相關(guān)疾病，特別地腎小球肥大或糖尿病性腎病，和特別地與AXL表達、過表達或過度活躍相關(guān)、與其相伴或由其引起的病癥。上述過度增殖性疾病包括任何瘤形成，即任何異常和/或不受控制的新的組織生長。術(shù)語“不受控制的新的組織生長”，如本文中所使用的，可依賴于生長調(diào)控的功能障礙和 /或喪失。過度增殖性疾病包括腫瘤疾病和/或癌癥，例如轉(zhuǎn)移或侵襲性癌癥。在本發(fā)明的用途的優(yōu)選實施方案中，所述過度增殖性疾病特別地是乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、濾泡性淋巴瘤、髓性白血病、皮膚癌/黑色素瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、巴雷特食管和食管癌、胃癌、膀胱癌、宮頸癌、肝癌、甲狀腺癌和頭頸癌、或增生性或贅生性疾病或其他表達或過表達AXL的過度增殖性疾病。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的人源化抗AXL抗體用于制備藥物的用途，所述藥物用于與抗腫瘤劑共施用，以治療上述病癥之一。根據(jù)另外的優(yōu)選實施方案，本發(fā)明涉及本發(fā)明的人源化抗AXL抗體用于制造治療抗藥性癌癥的藥物組合物的用途。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的核酸分子、載體、宿主或通過本發(fā)明的方法獲得的抗體和任選地可藥用的載體的診斷組合物。本發(fā)明的診斷組合物可用于檢測不同細胞、組織或其他合適的樣品中哺乳動物 AXL的不期望的表達、過表達或過度活躍，包括將樣品與本發(fā)明的抗體接觸，和檢測AXL在樣品中的存在。因此，本發(fā)明的診斷組合物可用于評估過度增殖性疾病的起始或疾病狀態(tài)。此外，可用本發(fā)明的抗體靶向惡性細胞例如表達AXL的癌細胞。因此已結(jié)合本發(fā)明的抗體的細胞可能受到免疫系統(tǒng)功能例如補體系統(tǒng)或受到細胞介導(dǎo)的細胞毒性的攻擊， 從而減少癌細胞的數(shù)目或根除癌細胞。這些考慮同樣地用于治療轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)性腫瘤。在本發(fā)明的另一個方面，將本發(fā)明的抗體偶聯(lián)至標記基團。此類抗體特別適合于診斷應(yīng)用。如上文所指出的，術(shù)語“標記基團”是指可檢測的標志物，例如放射性標記的氨基酸或可通過標記的抗生物素蛋白檢測的生物素基部分。用于標記多肽或糖蛋白例如抗體的各種方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且可用于進行本發(fā)明。合適的標記基團的實例包括但不限于下列放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、9°Y、99TC、mIn、125I、mI)、-* 基團(例如FITC、羅丹明、鑭系元素(Ianthanide)、磷光體(phosphor))、酶基團(例如辣根過氧化物酶、β -半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光基團、生物素基團或預(yù)先確定的被第二報告分子識別的多肽表位(例如亮氨酸拉鏈對序列、二抗的結(jié)合部位、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標簽)。在某些方面，可能期望通過不同長度的間隔臂連接標記基團以減少潛在的位阻。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及評估表達AXL的細胞的存在的方法，包括將本發(fā)明的抗體與懷疑在它們/它的表面具有AXL的細胞或組織接觸。用于檢測樣品中的AXL 表達的合適方法可以是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或免疫組織化學(xué)(IHC)?？稍谖⒘康味ò灏媸街羞M行ELISA測定，其中例如微量滴定板的孔吸附有AXL抗體。漂洗板，并且用封閉劑例如乳蛋白或白蛋白進行處理以阻止分析物的非特異性吸附。然后用測試樣品處理孔。在漂洗掉測試樣品或標準后，用標記的第二 AXL抗體(例如通過生物素綴合)處理孔。在清洗掉過量第二抗體后，用例如抗生物素蛋白綴合的辣根過氧化物酶(HRP)和合適的生色底物檢測標記。通過與由標準樣品產(chǎn)生的標準曲線比較來測定測試樣品中AXL抗原的濃度。關(guān)于IHC，可使用石蠟包埋的組織，其中例如將組織首先在二甲苯中脫蠟，然后例如用乙醇脫水，和在蒸餾水中漂洗?？赏ㄟ^表位暴露(印itope unmasking)、酶促降解或皂苷來暴露被甲醛固定和石蠟包埋掩蔽的抗原表位。關(guān)于表位暴露，可在蒸氣發(fā)生器、水浴或微波爐中于表位修復(fù)液(印itope retrieval solution)例如2N HCl溶液(pHl. 0)中加熱石蠟切片，進行20至40分鐘。在酶促降解的情況下，可將組織切片在不同的酶溶液例如蛋白酶K、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶、胃蛋白酶等中于37°C下溫育10至30分鐘。在漂洗掉表位修復(fù)液或過量的酶后，用封閉緩沖液處理組織切片以防止非特異性相互作用。以合適的濃度加入第一 AXL抗體。漂洗掉過量的一抗，將切片在室溫下于過氧化物酶封閉液中溫育10 分鐘。在進行另一個清洗步驟后，將組織切片與第二標記抗體(例如用可用作酶的錨的基團標記)一起溫育。因此，實例是被偶聯(lián)至辣根過氧化物酶的鏈霉抗生物素蛋白識別的生物素標記的二抗。通過與合適的生色底物一起溫育進行抗體/酶復(fù)合物的檢測。在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及阻止AXL功能的方法，其包括將本發(fā)明的抗體與懷疑在它們/其表面上具有AXL的細胞或組織在其中抗體能夠阻止AXL功能的條件下接觸。接觸可以是體外或體內(nèi)的。本發(fā)明還涉及治療過度增殖性疾病、心血管疾病，特別地動脈粥樣硬化和血栓形成、糖尿病相關(guān)疾病，特別地腎小球肥大或糖尿病性腎病的方法，其包括給有此需要的患者施用合適劑量的本發(fā)明的抗體或抗體片段或其衍生物。過度增殖性疾病優(yōu)選選自與AXL表達、過表達或過度活躍相關(guān)、與其相伴或由其引起的病癥，例如癌癥，例如乳腺癌、結(jié)腸癌、 肺癌、腎癌、濾泡性淋巴瘤、髓性白血病、皮膚癌/黑色素瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、巴雷特食管和食管癌、胃癌、膀胱癌、宮頸癌、肝癌、甲狀腺癌和頭頸癌或增生性疾病或贅生性疾病或其他表達或過表達AXL的過度增殖性疾病。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，待治療的癌癥是抗藥性癌癥，優(yōu)選選自上述癌癥。本發(fā)明還涉及治療疾病的方法，其中給哺乳動物施用本發(fā)明的抗體并且其中所述疾病與AXL的異常水平的表達或活性直接或間接相關(guān)。最后，本發(fā)明涉及包括抗AXL抗體，優(yōu)選本發(fā)明的抗體、抗體片段或其衍生物、編碼所述組分的核酸分子和/或本發(fā)明的載體的試劑盒。涉及本文中公開的化合物的所有實施方案可用作單個化合物或組合地用于藥物的制備。附圖概述

圖1 本圖描述了命名為h#llB7_TlL至h#llB7_T7L的大鼠抗人AXL單克隆抗體 #11B7的輕鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖2 本圖描述了命名為h#llB7-T8L至h#llB7-T14L的大鼠抗人AXL單克隆抗體 #11B7的輕鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖3 本圖描述了命名為h#llB7-T15L至h#llB7-T20L的大鼠抗人AXL單克隆抗體#11B7的輕鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖4 本圖描述了命名為h#llB7_TlH至h#llB7_T6H的大鼠抗人AXL單克隆抗體 #11B7的重鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖5 本圖描述了命名為h#llB7-T7H至h#llB7-T12H的大鼠抗人AXL單克隆抗體 #11B7的重鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖6 本圖描述了命名為h#llD5_TlL至h#llD5_T7L的大鼠抗人AXL單克隆抗體 #11D5的輕鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖7 本圖描述了命名為h#llD5-T8L至h#llD5-T14L的大鼠抗人AXL單克隆抗體 #11D5的輕鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖8 本圖描述了命名為h#llD5-T15L至h#llD5-T21L的大鼠抗人AXL單克隆抗體#11D5的輕鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖9 本圖描述了命名為h#llD5-T22L至h#llD5-D8L的大鼠抗人AXL單克隆抗體#11D5的輕鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖10 本圖描述了命名為h#llD5-T29L至h#llD5-T35L的大鼠抗人AXL單克隆抗體#11D5的輕鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖11 本圖描述了命名為h#llD5-T36L和h#llD5-T37L的大鼠抗人AXL單克隆抗體#11D5的輕鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖12 本圖描述了命名為h#llD5_TlH至h#llD5_T7H的大鼠抗人AXL單克隆抗體 #11D5的重鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖13 本圖描述了命名為h#llD5-T8H至h#llD5-T13H的大鼠抗人AXL單克隆抗體#11D5的重鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖14 本圖描述了引物EFFl和EfsmR、包含分泌信號以及人κ鏈的恒定區(qū)和 Poly(A)額外信號的片段B、編碼包含人IgGl信號和恒定結(jié)構(gòu)域的多肽的DNA片段以及前導(dǎo)序列的核苷酸序列，以及大鼠抗人AXL單克隆抗體11Β7和11D5的⑶R、嵌合#11Β7抗體重鏈和輕鏈(化61/!0、嵌合#1105抗體重鏈和輕鏈(IgGl/κ)以及前導(dǎo)序列的氨基酸序列。圖15. A. Rati-模擬和Ratl-AXL cl. 2成纖維細胞中細胞表面AXL的流式細胞術(shù)分析。收集通過分別用PLXSN和pLXSN-hAXL親嗜性病毒(ecotrophic virus)感染Rati 成纖維細胞產(chǎn)生的多克隆Rati-模擬和克隆性RatI-AXL cl. 2細胞，并用3 μ g/ml的小鼠對照抗體72A1 (左圖)或小鼠抗AXL MABlM—抗(右圖)以及PE-綴合的抗小鼠二抗染色。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。RatI-AXL cl. 2細胞的染色導(dǎo)致3個數(shù)量級的偏移，并證明 AXL在這些細胞的表面上過表達。B. NIH3T3-模擬和NIH3T3-AXL cl. 7成纖維細胞中細胞表面AXL的流式細胞術(shù)分析。收集通過分別用PLXSN和pLXSN-AXL親嗜性病毒感染NIH3T3成纖維細胞產(chǎn)生的多克隆NIH3T3-模擬和克隆性NIH3T3-AXL cl. 7細胞，并用3 μ g/ml的小鼠對照抗體72A1 (左圖)或小鼠抗AXL MABlM—抗(右圖)以及PE-綴合的抗小鼠二抗染色。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。NIH3T3-AXL cl. 7細胞的染色導(dǎo)致2個數(shù)量級的偏移，并證明AXL在這些細胞的表面上過表達。圖16.研究大鼠抗AXL抗體對裸小鼠中人前列腺癌生長的作用的同位異種移植模型。將PC-3-LN前列腺癌細胞同位植入NMRI-nu/nu小鼠的前列腺。動物被隨機分入4個組，并且接受25mg/kg的同種型對照抗體1D5或拮抗型大鼠抗AXL抗體11B7，以及40mg/kg 索坦(Sutent)或12. 5mg/kg泰索帝(Taxotere)。在處理過程中，通過體內(nèi)生物發(fā)光成像在第15天、第23天、第四天和第34天每周一次監(jiān)控同位生長的PC-3-LN腫瘤的生長以及外周轉(zhuǎn)移。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。與同種型對照抗體1D5相比較，拮抗型大鼠抗AXL抗體 11B7減少了裸小鼠中PC-3-LN前列腺腫瘤的總體生長。圖17.研究大鼠抗AXL抗體對裸小鼠中人前列腺癌轉(zhuǎn)移的作用的同位異種移植模型。將PC-3-LN前列腺癌細胞同位植入NMRI-nu/nu小鼠的前列腺。動物被隨機分入4個組，并且接受25mg/kg的同種型對照抗體1D5或拮抗型大鼠抗AXL抗體11B7，以及40mg/kg 索坦或12.5mg/kg泰索帝。尸體剖檢后，收集選擇的器官(肝、脾、肺、股骨和部分的腰椎) 并且通過生物發(fā)光成像分析轉(zhuǎn)移的存在。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。與同種型對照抗體1D5 相比較，本發(fā)明的拮抗型大鼠抗AXL抗體11B7減少了脾轉(zhuǎn)移的發(fā)生。值得注意的是，該實驗中11B7的抗轉(zhuǎn)移作用比索坦更強。圖18 本圖描述了載體PEF6KCL的構(gòu)建體。圖19 本圖描述了使用人AXL-Fc包被的板通過ELISA測定的大鼠抗人AXL人源化抗體h#llB7-Tl至h#llB7-T6的結(jié)合活性。圖20 本圖描述了使用人AXL-Fc包被的板通過ELISA測定的大鼠抗人AXL人源化抗體h#llB7-T7至h#llB7-T13的結(jié)合活性。圖21 本圖描述了使用人AXL-Fc包被的板通過ELISA測定的大鼠抗人AXL人源化抗體h#llB7-T14至h#llB7-T20的結(jié)合活性。
圖22 本圖描述了使用人AXL-Fc包被的板通過ELISA測定的大鼠抗人AXL人源化抗體h#llB7-T21至h#llB7-T27的結(jié)合活性。圖23 本圖描述了使用人AXL-Fc包被的板通過ELISA測定的大鼠抗人AXL人源化抗體h#llD5-Tl至h#llD5-T6的結(jié)合活性。圖M(上圖和下圖)本圖描述了利用直接蛋白質(zhì)吸光度測定法測定的大鼠抗人 AXL人源化抗體h#llB7-Tl至h#llB7_T27的蛋白質(zhì)濃度。圖25 本圖描述了利用直接蛋白質(zhì)吸光度測定法測定的大鼠抗人AXL人源化抗體 h#llD5-Tl至h#llD5-T6的蛋白質(zhì)濃度。圖沈本圖描述了大鼠抗人AXL單克隆抗體#11B7在人AXL抗原上所結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的確定。圖27.研究人源化11B7抗AXL抗體對Axl受體磷酸化的作用的ELISA實驗。饑餓Hs578T乳腺癌細胞(頂部)和NCI-H292肺癌細胞(底部)，用10 μ g/ml的Gammagard 對照抗體、本發(fā)明的嵌合抗Axl mAbChmllB7(IgGl/K)以及人源化抗AXL抗體h#llB7_T2、 h#llB7-T3、h#llB7-T4、h#llB7-T5 和 h#llB7-T6(T2-T6)預(yù)溫育所述細胞，用或不用 400ng/ ml mGas6處理細胞，然后進行裂解。將裂解物轉(zhuǎn)移至抗磷酸-酪氨酸抗體4G10包被的 Maxi-Sorp 96孔板，之后，清洗板，用0. 125g/ml生物素化的大鼠抗AXL抗體12B7、AP綴合的鏈霉抗生物素蛋白和AttoWlos底物溶液進行溫育以收集熒光強度。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。與Gammagard對照抗體相比較，本發(fā)明的嵌合抗AXL抗體chml 1B7以及人源化抗AXL 抗體 h#llB7-T2、h#llB7-T3、h#llB7_T4、h#llB7-T5 和 h#llB7_T6 能夠在兩個細胞系中阻止或顯著減少(ias6-介導(dǎo)的Axl激活，如與相應(yīng)的非刺激的細胞相比，Gas6-刺激的細胞中降低的Axl酪氨酸磷酸化水平所顯示的。圖觀々.研究人源化11B7抗AXL抗體對ERK1/2磷酸化的作用的Western印跡實驗。饑餓Hs578T乳腺癌細胞(頂部)和NCI-H292肺癌細胞(底部)，用10 μ g/ml的 Gammagard對照抗體、本發(fā)明的嵌合抗Axl mAb chml 1B7 (IgGl/κ)或人源化抗AXL抗體 h#llB7-T2、h#llB7-T3、h#llB7_T4、h#llB7-T5 和 h#llB7-T6 預(yù)溫育所述細胞，隨后用或不用400ng/ml mGas6處理，然后進行裂解。利用SDS-PAGE分離全細胞裂解物，使用抗磷酸-P44/42MAP激酶(Thr202/Tyr204)抗體通過^festern印跡法分析。隨后，用抗p44/42MAP 激酶抗體抗體再探測相同的濾膜。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。與Gammagard對照抗體相比較，本發(fā)明的嵌合抗AXL抗體chml 1B7以及人源化抗AXL抗體h#llB7_T2、h#llB7_T3、 h#llB7-T4、h#llB7-T5和h#llB7-T6干擾Hs578T乳腺癌細胞中微弱的、Gas6_誘導(dǎo)的 ERK1/2激活的增加。然而由于ERK1/2在該細胞系中的高基礎(chǔ)活性，因此通過刺激的細胞中減少的ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化水平(相對于相應(yīng)的非刺激的細胞)顯示的這些作用僅顯得相對普通。相反地，在NCI-H292肺癌細胞中，嵌合抗AXL抗體chmllB7 以及人源化抗 AXL 抗體 h#llB7-T2、h#llB7_T3、h#llB7_T4、h#llB7-T5 或 h#llB7_T6 對 ERKl/2Thr202/Tyr204磷酸化的抑制作用得到清楚得多的反映。圖^B.研究人源化11B7抗AXL抗體對AKT磷酸化的作用的^festern印跡實驗。 饑餓Hs578T乳腺癌細胞(頂部)和NCI-H292肺癌細胞(底部)，用10 μ g/ml的Gammagard 對照抗體、本發(fā)明的嵌合抗Axl mAb chmllB7(IgGl/K)或人源化抗AXL抗體h#llB7-T2、 h#l 1B7-T3, h#l 1B7-T4, h#l 1B7-T5 和 h#llB7_T6 預(yù)溫育所述細胞，隨后用或不用 400ng/mlmGas6處理，然后進行裂解。利用SDS-PAGE分離全細胞裂解物，使用抗AKT1/2/3抗體通過 Western印跡法分析。隨后，用抗磷酸-AKT(Ser473)抗體再探測相同的濾膜。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。與Gammagard對照抗體相比較，本發(fā)明的嵌合抗AXL抗體chml 1B7以及人源化抗 AXL 抗體 h#llB7-T2、h#llB7-T3、h#llB7-T4、h#llB7-T5 和 h#llB7_T6 能夠在 Hs578T 乳腺癌細胞(頂部)和NCI-H292肺癌細胞(底部)中顯著減少誘導(dǎo)的AKT激活，如與相應(yīng)的非刺激的細胞相比，Gas6-刺激的細胞中降低的AKT Ser473磷酸化水平所顯示的。圖^C.研究人源化11B7抗AXL抗體對GSK-3 β磷酸化的作用的^festern印跡實驗。饑餓Hs578T乳腺癌細胞(頂部)和NCI-H292肺癌細胞(底部)，用10 μ g/ml的 Gammagard對照抗體、本發(fā)明的嵌合抗Axl mAb chml 1B7 (IgGl/κ)或人源化抗AXL抗體 h#llB7-T2、h#llB7-T3、h#llB7_T4、h#llB7-T5 和 h#llB7_T6 預(yù)溫育所述細胞，隨后用或不用400ng/ml mGas6處理，然后進行裂解。利用SDS-PAGE分離全細胞裂解物，使用抗磷酸 GSK-3 β (Ser9)抗體通過狗8切111印跡法分析。隨后，用抗GSK-3 β抗體再探測相同的濾膜。 關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。與Gammagard對照抗體相比較，本發(fā)明的嵌合抗AXL抗體chmllB7 以及人源化抗 AXL 抗體 h#l 1B7-T2、h#l 1B7-T3、h#l IBT-I^hiil 1B7-T5 和 h#l 1B7-T6 能夠在 Hs578T乳腺癌細胞(頂部)和肺癌細胞(底部)中顯著減少feis6誘導(dǎo)的GSK-3 β 激活，如與相應(yīng)的非刺激的細胞相比，Gas6-刺激的細胞中降低的GSK-3 β Ser9磷酸化水平所顯示的。圖觀0.研究人源化11B7抗AXL抗體對TCS2磷酸化的作用W^festern印跡實驗。 饑餓Hs578T乳腺癌細胞(頂部)和NCI-H292肺癌細胞(底部)，用10 μ g/ml的Gammagard 對照抗體、本發(fā)明的嵌合抗Axl mAb chmllB7(IgGl/K)或人源化抗AXL抗體h#llB7-T2、 h#llB7-T3、h#llB7-T4、h#llB7-T5 和 h#llB7_T6 預(yù)溫育所述細胞，隨后用或不用 400ng/ ml mGas6處理，然后進行裂解。利用SDS-PAGE分離全細胞裂解物，使用抗TSC2抗體通過 Western印跡法分析。隨后，用抗磷酸-TSC2 (Thrl46》再探測相同的濾膜。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。與Gammagard對照抗體相比較，本發(fā)明的嵌合抗AXL抗體chml 1B7以及人源化抗 AXL 抗體 h#l 1B7-T2、h#l 1B7-T3、h#l 1B7-T4、h#l 1B7-T5 和 h#l 1B7-T6 能夠顯著減少 Hs578T 乳腺癌細胞(頂部)和NCI-H292肺癌細胞(底部)中feis6誘導(dǎo)的TCS2在Thr 1462上的磷酸化，如與相應(yīng)的非刺激的細胞相比，Gas6-刺激的細胞中降低的該氨基酸殘基的磷酸化水平所顯示的。圖 E.研究人源化11B7抗AXL抗體對mTOR磷酸化的作用W^festern印跡實驗。 饑餓Hs578T乳腺癌細胞(頂部)和NCI-H292肺癌細胞(底部)，用10 μ g/ml的Gammaga rd對照抗體、本發(fā)明的嵌合抗Axl mAb chmllB7 (IgGl/κ )或人源化抗AXL抗體h#llB7_T2、 h#l 1B7-T3, h#l 1B7-T4, h#l 1B7-T5 和 h#llB7_T6 預(yù)溫育所述細胞，隨后用或不用 400ng/ml mGas6處理，然后進行裂解。利用SDS-PAGE分離全細胞裂解物，使用抗磷酸-mT0R(kr2448) 抗體通過Western印跡法分析。隨后，用抗mTOR抗體再探測相同的濾膜。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文?？笰XL抗體的抑制作用在Hs578T乳腺癌細胞(頂部)中相對微弱。然而，與 Gammagard對照抗體相比較，本發(fā)明的嵌合抗AXL抗體chmllB7以及人源化抗AXL抗體 h#llB7-T2、h#llB7-T3、h#llB7_T4、h#llB7-T5 和 h#llB7_T6 能夠干擾 NCI-H292 肺癌細胞中Gas6-誘導(dǎo)的mTOR激活，如與相應(yīng)的非刺激的細胞(底部)相比，Gas6-刺激的細胞中降低的mTOR Ser2448磷酸化水平所顯示的。
圖^F.研究人源化11B7抗AXL抗體對S6K1磷酸化的作用的^festern印跡實驗。 饑餓Hs578T乳腺癌細胞(頂部)和NCI-H292肺癌細胞(底部)，用10 μ g/ml的Gammagard 對照抗體、本發(fā)明的嵌合抗Axl mAb chmllB7(IgGl/K)或人源化抗AXL抗體h#llB7-T2、 h#llB7-T3、h#llB7-T4、h#llB7-T5 和 h#llB7_T6 預(yù)溫育所述細胞，隨后用或不用 400ng/ ml mGas6處理，然后進行裂解。利用SDS-PAGE分離全細胞裂解物，使用抗磷酸-p70 S6激酶l(Thr421/Ser424)抗體通過flfestern印跡法分析。隨后，用抗β-肌動蛋白抗體再探測相同的濾膜。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。與Gammagard對照抗體相比較，本發(fā)明的嵌合抗 AXL 抗體 chml 1B7 以及人源化抗 AXL 抗體 h#llB7_T2、h#llB7-T3、h#llB7-T4、h#llB7_T5 和 h#llB7-T6在Hs578T乳腺癌細胞中對誘導(dǎo)的S6K1激活顯示一定的抑制作用，如與相應(yīng)的非刺激的細胞相比，Gas6-刺激的細胞中降低的S6K1 Thr421/Ser424磷酸化水平所顯示的(頂部)。然而，可在NCI-H292肺癌細胞(底部)中觀察到，在用本發(fā)明的嵌合抗 AXL 抗體 chml 1B7 以及人源化抗 AXL 抗體 h#l lB7_T2、h#l lB7_T3、h#l lB7_T4、h#l 1B7-T5 或 h#llB7-T6預(yù)處理后，Gas6-誘導(dǎo)的S6K1 Thr421/Ser424磷酸化和激活的下降強得多。圖29.研究人源化11D5抗AXL抗體對Axl受體磷酸化的作用的ELISA實驗。 饑餓Hs578T乳腺癌細胞，用10 μ g/ml的Gammagard對照抗體、本發(fā)明的嵌合抗Axl mAb chmllD5(IgGl/K )以及人源化抗 AXL 抗體 h#llD5_T2、h#llD5_T3、h#llD5_T4、h#llD5-T5 和h#llD5-T6預(yù)溫育所述細胞，用或不用400ng/ml mGas6處理細胞，然后進行裂解。將裂解物轉(zhuǎn)移至抗磷酸-酪氨酸抗體4G10包被的Maxi-Sorp 96孔板，之后，清洗板，用0. 125g/ ml生物素化的大鼠抗AXL抗體12B7、AP綴合的鏈霉抗生物素蛋白和AttoWlos底物溶液進行溫育以收集熒光強度。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。與Gammagard對照抗體相比較，本發(fā)明的嵌合抗AXL抗體chml 1D5以及人源化抗AXL抗體h#llD5_T2、h#llD5_T3、h#llD5_T4、 h#llD5-T5和h#llD5-T6能夠阻止或顯著減少Gas6_介導(dǎo)的Axl激活，如與相應(yīng)的非刺激的細胞相比，Gas6-刺激的細胞中降低的Axl酪氨酸磷酸化水平所顯示的。圖30A 人AXL，NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的登錄號P_30530的氨基酸序列。圖30B 大鼠抗人AXL單克隆抗體11B7的輕鏈的可變區(qū)的氨基酸序列。圖30C 大鼠抗人AXL單克隆抗體11B7的重鏈的可變區(qū)的氨基酸序列。圖30D 大鼠抗人AXL單克隆抗體11D5的輕鏈的可變區(qū)的氨基酸序列。圖30E 大鼠抗人AXL單克隆抗體11D5的重鏈的可變區(qū)的氨基酸序列。圖31.比較大鼠和嵌合抗AXL抗體對Axl磷酸化的作用的ELISA實驗。饑餓CaSki 宮頸癌細胞，用 50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、750ng/ml、ly g/ml 和 10 μ g/ml 的大鼠抗AXL 抗體11B7(A)或嵌合抗AXL抗體chl 1B7 (B)預(yù)溫育細胞，用或不用400ng/ml mGas6處理細胞，然后進行裂解。將裂解物轉(zhuǎn)移至抗磷酸-酪氨酸抗體4G10包被的Maxi-Sorp 96孔板。 之后，清洗板，用0. 5 μ g/ml生物素化的大鼠抗AXL抗體12B7、AP綴合的鏈霉抗生物素蛋白和AttoWlos底物溶液進行溫育以收集熒光強度。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。如通過宮頸癌細胞系CaSki中相對Axl磷酸化的濃度依賴性減少所顯示的，大鼠抗AXL抗體11B7(A)和本發(fā)明的嵌合抗AXL抗體chllB7(B)能夠阻止配體誘導(dǎo)的受體酪氨酸激酶Axl的激活至相似的程度。圖32A 本圖描述了分別命名為h#llB7-T15L和h#llB7-T18L的大鼠抗人AXL單克隆抗體#11B7的輕鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。
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圖32B 本圖描述了分別命名為h#llB7-TllH和h#llB7-T12H的大鼠抗人AXL單克隆抗體#11B7的重鏈的人源化可變區(qū)的氨基酸序列。圖33 本圖描述了使用人AXL-Fc包被的板(ELISA)通過ELISA測定的大鼠抗人 AXL人源化抗體h#llB7-I^8至h#llB7_T31的結(jié)合活性。圖34 本圖描述了利用HPLC測定法測定的大鼠抗人AXL人源化抗體h#llB7-D8 至h#llB7-T31的蛋白質(zhì)濃度(參見實施例24)。圖35(1)至35(3 這些圖描述了通過差示掃描量熱法(DSC)測定的大鼠抗人 AXL人源化抗體h#llB7-Tl至h#llB7_T31和嵌合h#llB7抗體的iTm的測定。圖36.研究人源化的11B7抗AXL抗體對Axl受體磷酸化的作用的ELISA實驗。 饑餓Hs578T乳腺癌細胞(頂部)和NCI-H292肺癌細胞(底部)，不用抗體或用IOyg/ ml的Gammagard對照抗體以及本發(fā)明的人源化抗AXL抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、 11B7-T23和11B7-T25預(yù)溫育細胞，隨后用或不用400ng/ml mGas6處理細胞，然后進行裂解。將裂解物轉(zhuǎn)移至抗磷酸-酪氨酸抗體4G10包被的Maxi-Sorp 96孔板，之后，清洗板， 用0. 125μ g/ml生物素化的大鼠抗AXL抗體12B7、AP綴合的鏈霉抗生物素蛋白和AttoWios 底物溶液進行溫育以收集熒光強度。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。與Gammagard對照抗體相比較，本發(fā)明的人源化抗AXL抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25在兩個細胞系中都顯著減少(ias6-介導(dǎo)的Axl激活，如與相應(yīng)的非刺激的細胞相比，Gas6-刺激的細胞中降低的Axl酪氨酸磷酸化水平所顯示的。圖37.研究人源化的11B7抗AXL抗體對Akt激酶磷酸化的作用的ELISA實驗。 饑餓Hs578T乳腺癌細胞(頂部)和NCI-H292肺癌細胞(底部)，不用抗體或用IOyg/ ml的Gammagard對照抗體以及本發(fā)明的人源化抗AXL抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、 11B7-T23和11B7-T25進行預(yù)溫育，隨后用或不用400ng/ml mGas6進行處理，然后用甲醛進行固定。清洗細胞，進行猝滅，并用抗磷酸-Akt (Ser47;3) —抗、HRP綴合的抗兔二抗和四甲基聯(lián)苯胺溶液進行溫育以測量吸光度強度。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。與Gammagard對照抗體相比較，本發(fā)明的人源化抗AXL抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25 能夠在兩個細胞系中阻止或減少介導(dǎo)的Akt激酶的激活，如與相應(yīng)的非刺激的細胞相比，Gas6-刺激的細胞中降低的Akt (Ser473)磷酸水平所顯示的。圖38.研究人源化的11B7抗AXL抗體對Axl受體內(nèi)化的作用的FACS分析。饑餓 Hs578T乳腺癌細胞，不用抗體或用10μ g/ml的Gammagard對照抗體以及本發(fā)明的人源化抗 AXL 抗體 11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23 和 11B7-T25 溫育細胞，進行指定的時間，用甲醛固定細胞。用大鼠抗Axl mAb 2A1—抗和PE-綴合的驢抗大鼠IgG 二抗將細胞染色， 然后進行FACS分析。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。與Gammagard對照抗體相比較，用人源化抗 AXL 抗體 11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23 和 11B7-T25 處理 Hs 578 乳腺癌細胞導(dǎo)致 Ax 1受體的內(nèi)化。顯示了各個處理時期的以％ (定義為抗Axl mAb處理的樣品相對于未處理的樣品的平均熒光強度)表示的相對Axl表達水平。圖39A+B.研究人源化的11B7抗AXL抗體對fets6誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞出芽的作用的基于球狀體的(Spheroid-based)細胞血管生成測定。將VEGF-A預(yù)處理的HUVEC球狀體包埋在3D膠原凝膠中，用1 μ g/ml人進行刺激，并用指定濃度的Gammagard對照抗體以及本發(fā)明的人源化抗 AXL 抗體 11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23 和 11B7-T25 處理 MCN 102421802 A
小時。每數(shù)據(jù)點分析10個隨機選擇的球狀體的累積出芽長度的平均值士SEM(左圖)，并測定抗體的相對抑制作用(右圖)。用GraphPad Prism 4. 03進行IC5tl曲線的擬合和IC5tl值的計算。關(guān)于詳細內(nèi)容參見正文。序列說明[SEQ ID NO 1]用于擴增片段A的命名為引物EFFl的引物的核苷酸序列[SEQ ID NO 2]用于擴增片段A的命名為引物EFsmaR的引物的核苷酸序列[SEQ ID NO 3]包含人κ鏈的分泌信號和恒定區(qū)以及用于添加poly (A)的信號的片段B的核苷酸序列[SEQ ID NO :4]包含編碼信號序列和人IgGl恒定區(qū)的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列[SEQ ID NO 5]編碼h#llB7_TlL的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_60)、 可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO 6]編碼h#llB7_T2L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_60)、 可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO 7]編碼h#llB7_T3L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1-60)、 可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO 8]編碼h#llB7_T4L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_60)、 可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO 9]編碼h#llB7_T5L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1-60)、 可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO 10]編碼h#llB7_T6L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1-60)、 可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO=Il]編碼h#llB7_T7L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_60)、 可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO 12]編碼h#llB7_T8L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1-60)、 可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO 13]編碼h#llB7_T9L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1-60)、 可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO 14]編碼h#l 1B7-T10L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列 (1-60)、可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO 15]編碼h#l 1B7-T1IL的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列 (1-60)、可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO 16]編碼h#l 1B7-T12L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列 (1-60)、可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO 17]編碼h#l 1B7-T13L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列 (1-60)、可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO :18]h#llB7-TlL 的氨基酸序列，信號序列(1-20)、可變區(qū) 01-129)、 恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :19]h#llB7_T2L 的氨基酸序列，信號序列(1-20)、可變區(qū) Ql-129)、恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :20]h#llB7_T3L的氨基酸序列，信號序列恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :21]h#llB7_T4L的氨基酸序列，信號序列恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :22]h#llB7_T5L的氨基酸序列，信號序列恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :23]h#llB7_T6L的氨基酸序列，信號序列恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :24]h#llB7_T7L的氨基酸序列，信號序列恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :25]h#llB7_T8L的氨基酸序列，信號序列恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :26]h#llB7_T9L的氨基酸序列，信號序列恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :27]h#llB7-T10L的氨基酸序列，信號序列恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :28]h#llB7-TllL的氨基酸序列，信號序列恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :29]h#llB7_T12L的氨基酸序列，信號序列恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :30]h#llB7_T13L的氨基酸序列，信號序列恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO 31]編碼h#llB7_TlH的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57)、 可變區(qū)(58-396)、恒定區(qū)(397-1386)[SEQ ID NO 32]編碼h#llB7_T2H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57)、 可變區(qū)(58-396)、恒定區(qū)(397-1386)[SEQ ID NO 33]編碼h#llB7_T3H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57)、 可變區(qū)(58-396)、恒定區(qū)(397-1386)[SEQ ID NO 34]編碼h#llB7_T4H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57)、 可變區(qū)(58-396)、恒定區(qū)(397-1386)[SEQ ID NO 35]編碼h#llB7_T5H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57)、 可變區(qū)(58-396)、恒定區(qū)(397-1386)[SEQ ID NO :362]編碼h#l 1B7-T6H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列 (1-57)、可變區(qū)(58-396)、恒定區(qū)(397-1386)[SEQ ID NO 37]編碼h#llB7_T7H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57)、 可變區(qū)(58-396)、恒定區(qū)(397-1386)[SEQ ID NO 38]編碼h#llB7_T8H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57)、 可變區(qū)(58-396)、恒定區(qū)(397-1386)
(1-20)、可變區(qū)(21-129), (1-20)、可變區(qū)(21-129), (1-20)、可變區(qū)(21-129), (1-20)、可變區(qū)(21-129), (1-20)、可變區(qū)(21-129), (1-20)、可變區(qū)(21-129), (1-20)、可變區(qū)(21-129), (1-20)、可變區(qū)(21-129), (1-20)、可變區(qū)(21-129), (1-20)、可變區(qū)(21-129), (1-20)、可變區(qū)(21-129),[SEQ ID N0:39]編碼h#llB7-T9H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1-57) 58-396)、恒定區(qū)(397-1386)h#llB7-TlH的氨基酸序列，信號序列(1-19)、可變區(qū)(20-132) 133-462)h#llB7-T2H的氨基酸序列，信號序列(1-19)、可變區(qū)(20-132) 133-462)h#llB7-T 3H的氨基酸序列，信號序列(1-19)、可變區(qū)(20-132) 133-462)h#llB7-T4H的氨基酸序列，信號序列(1-19)、可變區(qū)(20-132) 133-462) [SEQ ID NO 133-462) [SEQ ID NO 133-462) [SEQ ID NO 133-462) [SEQ ID NO 133-462) [SEQ ID NO
44]h#llB7-T5H的氨基酸序列，信號序列(1-19)、可變區(qū)Q0-132)
45]h#llB7-T6H的氨基酸序列，信號序列(1_19)、可變區(qū)Q0-132)
46]h#llB7-T7H的氨基酸序列，信號序列(1_19)、可變區(qū)Q0-132)
47]h#llB7-T8H的氨基酸序列，信號序列(1_19)、可變區(qū)Q0-132)
48]h#llB7-T9H的氨基酸序列，信號序列(1_19)、可變區(qū)Q0-132) 133-462)編碼1!#1105-1^的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1-60) 61-387)、恒定區(qū)(388-702)編碼1!#1105121^的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1-60) 61-387)、恒定區(qū)(388-702)編碼11#1105131^的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1-60) 61-387)、恒定區(qū)(388-702)編碼11#11051札的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1-60) 61-387)、恒定區(qū)(388-702)編碼h#llD5-T5L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1-60) 61-387)、恒定區(qū)(388-702)編碼h#llD5-T6L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1-60) 61-387)、恒定區(qū)(388-702)h#llD5-TlL的氨基酸序列，信號序列(1-20)、可變區(qū)(21-129) 130-234)h#llD5-T2L的氨基酸序列，信號序列(1-20)、可變區(qū)(21-129) 130-234)h#llD5-T3L的氨基酸序列，信號序列(1-20)、可變區(qū)(21-129) 130-234)h#llD5-T4L的氨基酸序列，信號序列(1-20)、可變區(qū)(21-129)恒定區(qū)(130-234)
[SEQ ID恒定區(qū)(130-234)
[SEQ ID恒定區(qū)(130-234)
[SEQ ID可變區(qū)(58-396)、
[SEQ ID可變區(qū)(58-396)、
[SEQ ID可變區(qū)(58-396)、
[SEQ ID可變區(qū)(58-396)、
[SEQ ID可變區(qū)(58-396)、
[SEQ ID可變區(qū)(58-396)、
[SEQ ID恒定區(qū)(133-462)
[SEQ ID恒定區(qū)(133-462)
[SEQ ID恒定區(qū)(133-462)
[SEQ ID恒定區(qū)(133-462)
[SEQ ID恒定區(qū)(133-462)
[SEQ ID恒定區(qū)(133-462)
[SEQ ID
[SEQ ID
[SEQ ID
[SEQ ID
[SEQ ID
[SEQ ID
[SEQ ID
[SEQ ID
[SEQ ID
[SEQ ID
NO :59]h#llD5-T5L的氨基酸序列，信號序列(1_20)、可變區(qū)(21-129)
NO :60]h#llD5-T6L的氨基酸序列，信號序列(1_20)、可變區(qū)(21-129)
NO 61]編碼h#llD5-TlH的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57) 恒定區(qū)097-1386)
NO 62]編碼h#llD5-T2H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57) 恒定區(qū)097-1386)
NO 63]編碼h#llD5-T3H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57) 恒定區(qū)097-1386)
NO 64]編碼h#llD5-T4H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57) 恒定區(qū)097-1386)
NO 65]編碼h#llD5-T5H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57) 恒定區(qū)097-1386)
NO 66]編碼h#llD5-T6H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列(1_57) 恒定區(qū)097-1386) NO :67]h#llD5-TlH的氨基酸序列，信號序列
NO :68]h#llD5-T2H的氨基酸序列，信號序列 NO :69]h#llD5-T3H的氨基酸序列，信號序列 NO :70]h#llD5-T4H的氨基酸序列，信號序列 NO :71]h#llD5-T5H的氨基酸序列，信號序列
NO :72]h#llD5-T6H的氨基酸序列，信號序列(1-19)、可變區(qū)(20-132)
1-19)、可變區(qū)(20-132) 1-19)、可變區(qū)(20-132) 1-19)、可變區(qū)(20-132) 1-19)、可變區(qū)(20-132) 1-19)、可變區(qū)(20-132)
NO :73]h#llB7-T14L, NO :74]h#llB7-T15L, NO :75]h#llB7-T16L, NO :76]h#llB7-T17L, NO :77]h#llB7-T18L, NO :78]h#llB7-T19L, NO :79]h#llB7-T20L, NO :80]h#llB7-T10H, NO :81]h#llB7-TllH, NO :82]h#llB7-T12H,
可變區(qū)的氨基酸序列可變區(qū)的氨基酸序列可變區(qū)的氨基酸序列可變區(qū)的氨基酸序列可變區(qū)的氨基酸序列可變區(qū)的氨基酸序列可變區(qū)的氨基酸序列可變區(qū)的氨基酸序列可變區(qū)的氨基酸序列可變區(qū)的氨基酸序列
[SEQIDNO83] h#l 1D5-T7L，可變區(qū)的氨基酸序列
[SEQIDNO84] h#l 1D5-T8L，可變區(qū)的氨基酸序列
[SEQIDNO85] h#l 1D5-T9L，可變區(qū)的氨基酸序列
[SEQIDNO86]h#llD5-T10L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO87]h#llD5-TllL，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO88]h#llD5-T12L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO89]h#llD5-T13L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO90]h#llD5-T14L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO91]h#llD5-T15L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO92]h#llD5-T16L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO93]h#llD5-T17L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO94]h#llD5-T18L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO95]h#llD5-T19L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO96] h#l 1D5-T20L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO97]h#llD5-T21L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO98] h#l 1D5-T22L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO99] h#l 1D5-T23L，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO100] h#llD5-T24L,可變區(qū)的氨基!酸序列
[SEQIDNO101]h#llD5-T25L，可變區(qū)的氨基丨酸序列
[SEQIDNO102]h#llD5-I^6L，可變區(qū)的氨基丨酸序列
[SEQIDNO103]h#llD5-T27L，可變區(qū)的氨基!酸序列
[SEQIDNO104] h#llD5-T28L,可變區(qū)的氨基丨酸序列
[SEQIDNO105]h#llD5-I^9L，可變區(qū)的氨基丨酸序列
[SEQIDNO106] h#l 1D5-T30L，可變區(qū)的氨基丨酸序列
[SEQIDNO107]h#llD5-T31L，可變區(qū)的氨基!酸序列
[SEQIDNO108]h#llD5-T32L，可變區(qū)的氨基丨酸序列
[SEQIDNO109]h#llD5-T33L，可變區(qū)的氨基丨酸序列
[SEQIDNO110] h#llD5-T34L,可變區(qū)的氨基丨酸序列
[SEQIDNOlll]h#llD5-T35L，可變區(qū)的氨基丨酸序列
[SEQIDNO112]h#llD5-T36L，可變區(qū)的氨基!酸序列
[SEQIDNO113]h#llD5-T37L，可變區(qū)的氨基!酸序列
[SEQIDNO114] h#l 1D5-T7H，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO115] h#l 1D5-T8H，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO116] h#l 1D5-T9H，可變區(qū)的氨基畫？序列
[SEQIDNO117]h#llD5-T10H，可變區(qū)的氨基丨酸序列
[SEQIDNO118]h#llD5-TllH，可變區(qū)的氨基丨酸序列
[SEQIDNO119]h#llD5-T12H，可變區(qū)的氨基丨酸序列
[SEQIDNO120]h#llD5-T13H，可變區(qū)的氨基!酸序列
[SEQIDNO121] 11B7輕鏈⑶RL4的氨基酸序列
[SEQIDNO:122] 11B7輕鏈CDRL5的氨基·I序列
[SEQIDNO:123] 11B7輕鏈CDRL6的氨基·I序列
[SEQIDNO:124] 11B7重鏈CDRHl的氨基·I序列
[SEQIDNO:125] 11B7重鏈CDRH2的氨基·I序列
[SEQIDNO:126] 11B7重鏈CDRH3的氨基·I序列
[SEQIDNO:127] 11D5輕鏈CDRL4的氨基·I序列
[SEQIDNO:128] 11D5輕鏈CDRL5的氨基·I序列
[SEQIDNO:129] 11D5輕鏈CDRL6的氨基·I序列
[SEQIDNO:130] 11D5重鏈CDRHl的氨基·I序列
[SEQIDNO:131] 11D5重鏈CDRH2的氨基·I序列
[SEQIDNO:132] 11D5重鏈CDRH3的氨基·I序列
[SEQIDNO133]前導(dǎo)序列的核苷酸序列
[SEQIDNO134]前導(dǎo)序列的氨基酸序列
[SEQIDNO:135]#11B7-嵌合輕鏈的氨基·I序列
[SEQIDNO:136]#11B7-嵌合重鏈的氨基·I序列
[SEQIDNO:137]#11D5-嵌合輕鏈的氨基·I序列
[SEQIDNO:138]#11D5-嵌合重鏈的氨基·I序列
[SEQIDNO139]人AXL的氨基酸序列，NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的登錄號P_30530，其
也描述于圖30A中[SEQ ID NO :140]大鼠抗人AXL單克隆抗體11B7的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，其也描述于圖30B中，并且其與由#11B7-嵌合輕鏈(SEQID NO :135)的氨基酸No. 1至108組成的氨基酸序列同一[SEQ ID NO :141]大鼠抗人AXL單克隆抗體11B7的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，其也描述于圖30C中，并且其與由#11B7-嵌合重鏈(SEQID NO :136)的氨基酸No. 1至113組成的氨基酸序列同一[SEQ ID NO :142]大鼠抗人AXL單克隆抗體11D5的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，其也描述于圖30D中，并且其與由#11D5-嵌合輕鏈(SEQID NO :137)的氨基酸No. 1至108組成的氨基酸序列同一[SEQ ID NO :143]大鼠抗人AXL單克隆抗體11D5的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，其也描述于圖30E中，并且其與由#11D5-嵌合重鏈(SEQID NO :138)的氨基酸No. 1至113組成的氨基酸序列同一[SEQ ID NO :144]編碼h#llB7_T15L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列 (1-60)、可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO :145]編碼h#llB7_T18L的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列 (1-60)、可變區(qū)(61-387)、恒定區(qū)(388-702)[SEQ ID NO :146]h#llB7_T15L的氨基酸序列，信號序列(1_20)、可變區(qū) (21-1 )、恒定區(qū)(130-234)[SEQ ID NO :147]h#llB7_T18L的氨基酸序列，信號序列(1-20)、可變區(qū) (21-1 )、恒定區(qū)(130-234)
[SEQ ID NO 148]編碼h#l 1B7-T1IH的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列 (1-57)、可變區(qū)(58-396)、恒定區(qū)(397-1386)[SEQ ID NO 149]編碼h#l 1B7-T12H的氨基酸序列的核苷酸序列，信號序列 (1-57)、可變區(qū)(58-396)、恒定區(qū)(397-1386)[SEQ ID NO :150]h#llB7_TllH的氨基酸序列，信號序列(1_19)、可變區(qū) (20-132)、恒定區(qū)(133-462)[SEQ ID NO :151]h#llB7_T12H的氨基酸序列，信號序列(1-19)、可變區(qū) (20-132)、恒定區(qū)(133-462)
實施例實施例1.作為免疫原的過表達AXL的Rati成纖維細胞的產(chǎn)生通過側(cè)翼連接限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和BamHI的識別元件將根據(jù)National Center for Biotechnology Information (NCBI)參照序列(NM_021913)的人受體酪氨酸激酶A)(L轉(zhuǎn)錄物變體1的全長編碼序列亞克隆入pLXSN，從而產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體 pLXSN-hAXL。為了產(chǎn)生特異性結(jié)合人受體酪氨酸激酶AXL的抗體，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移產(chǎn)生穩(wěn)定地過表達人AXL的Rati成纖維細胞。簡而言之，將3xl05個Phoenix-E細胞接種在 60mm培養(yǎng)皿中，然后使用磷酸鈣法用2 μ g/ml pLXSN載體或pLXSN-hAXL轉(zhuǎn)染細胞。M小時后，用新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，并且將Phoenix-E細胞在其中溫育4小時。收獲釋放pLXSN 或pLXSN-hAXL親嗜性病毒的Wioenix-E細胞的上清液，在聚凝胺(％ig/ml ；Aldrich)存在的情況下將其用于溫育亞匯合的Rati細胞OxlO5個細胞/6cm皿)，進行3小時。同時，用新鮮培養(yǎng)基再溫育Wioenix-E細胞，在進行另外3小時之后在聚凝胺(％ig/ml ；Aldrich)存在的情況下將其用于Rati成纖維細胞的第二次感染。同樣地，進行第三個感染循環(huán)。在替換培養(yǎng)基后，開始用G418選擇Rati細胞。通常，在選擇21天后挑選穩(wěn)定的克隆。繁殖一組穩(wěn)定的克隆，并且通過FACS分析就膜定位的人AXL表達對其進行定量。 具體地，用IOmM的于PBS中的EDTA收獲IxlO5個細胞，用FACS緩沖液(PBS，3% FCS, 0.4% 疊氮化鈉)清洗細胞一次，將其接種在96孔圓底板中。以1，OOOrpm將細胞離心3分鐘以除去上清液，然后用小鼠抗AXL—抗MAB154 (R&D Systems, 3 μ g/ml)進行重懸浮。將細胞懸浮液在冰上溫育1小時，用FACS緩沖液清洗2次，然后以ΙΟΟμΙ/孔重懸浮于以1 50稀釋于FACS緩沖液中的PE-綴合的驢抗小鼠二抗(Jackson)中。將細胞懸浮液在冰上于黑暗中溫育30分鐘，用FACS緩沖液清洗2次，使用Epics XL-MCL流式細胞儀(BeckmanCoulter) 進行分析。圖15A顯示用pLXSN空載體穩(wěn)定感染的多克隆Rati-模擬群體和用pLXSN-hAXL 穩(wěn)定感染的RatI-AXL cl. 2的FACS分析，并且證明AXL在該代表性克隆的細胞表面上過表達。此外，為了產(chǎn)生用于實驗?zāi)康牡暮线m的細胞模型系統(tǒng)，以類似于對于Rati所描述的方法產(chǎn)生穩(wěn)定地過表達AXL的NIH3T3成纖維細胞。簡而言之，將3xl05個Phoenix-E細胞接種在60mm培養(yǎng)皿中，然后使用磷酸鈣法用2 μ g/ml pLXSN載體或pLXSN_AXL cDNA轉(zhuǎn)染細胞。M小時后，用新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，并將Wioenix-E細胞在其中溫育4小時。收獲釋放pLXSN或pLXSN-hAXL親嗜性病毒的Phoenix-E細胞的上清液，在聚凝胺(％ig/ml ； Aldrich)存在的情況下將其用于溫育亞匯合的NIH3T3細胞OxlO5個細胞/6cm皿)，進行 3小時。同時，用新鮮培養(yǎng)基再溫育Wioenix-E細胞，在進行另外3小時之后在聚凝胺(^ig/ ml ；Aldrich)存在的情況下將其用于NIH3T3成纖維細胞的第二次感染。同樣地，進行第三個感染循環(huán)。在替換培養(yǎng)基后，開始用G418選擇NIH3T3細胞。通常，在選擇21天后挑選穩(wěn)定的克隆。繁殖一組穩(wěn)定的克隆，并且通過FACS分析就膜定位的AXL表達對其進行定量。具體地，用IOmM的在PBS中的EDTA收獲IxlO5個細胞，用FACS緩沖液(PBS，3% FCS, 0. 4%疊氮化鈉)清洗細胞一次，將其接種在96孔圓底板中。以1，OOOrpm將細胞離心3分鐘以除去上清液，然后用小鼠抗AXL—抗MAB154 (R&D Systems，3 μ g/ml)進行重懸浮。將細胞懸浮液在冰上溫育1小時，用FACS緩沖液清洗2次，然后以ΙΟΟμΙ/孔重懸浮于以1 50稀釋于FACS緩沖液中的PE-綴合的驢抗小鼠二抗(Jackson)中。將細胞懸浮液在冰上于黑暗中溫育30分鐘，用FACS緩沖液清洗2次，使用Epics XL-MCL流式細胞儀(BeckmanCoulter) 進行分析。圖15B顯示用pLXSN空載體穩(wěn)定感染的多克隆NIH3T3-模擬群體和用pLXSN_hAXL 穩(wěn)定感染的NIH3T3-AXL cl. 7的FACS分析，并且證明AXL在該代表性克隆的細胞表面上過表達。實施例2.大鼠抗AXL單克隆抗體的產(chǎn)生通過將大約IOxlO6個RatI-AXL cl. 2的冷凍細胞注射(腹膜內(nèi)和皮下)入Lou/C 或Long Evans大鼠來產(chǎn)生單克隆大鼠抗AXL抗體。在8周間隔后，在融合前3天腹膜內(nèi)和皮下給予最終的加強。根據(jù)標準方法進行骨髓瘤細胞系P3)(63-Ag8. 653與大鼠免疫脾細胞的融合，產(chǎn)生105個雜交瘤。2周后，收集來自雜交瘤的第一懸浮液，并且就與NIH3T3-AXL cl. 7成纖維細胞(對OTH3T3-模擬對照細胞)的結(jié)合在初步的FACS篩選中對其進行檢測。 進一步培養(yǎng)對于AXL結(jié)合呈陽性的克隆。從50ml這些克隆的上清液純化抗體，并且就與 NIH3T3-AXL cl. 7成纖維細胞(對NIH3T3-模擬對照細胞)上的AXL的特異性結(jié)合對其進行再分析。在Akt-激酶磷酸化ELISA中進一步檢測特異性結(jié)合NIH3T3-AXL cl. 7成纖維細胞但不結(jié)合NIH3T3-模擬對照細胞的純化的抗體，并進行確定同種型的ELISA。為了純化大鼠抗體，以5，OOOg離心上清液20分鐘，然后進行無菌過濾。加入500 μ 1蛋白G瓊脂糖 (s印haroSe)FF，在4°C下于旋轉(zhuǎn)輪(spinning wheel)上溫育至少1小時。將瓊脂糖離心， 棄去上清液，在使用檸檬酸鹽緩沖液(100mM)pH2. 1進行蛋白質(zhì)洗脫之前用PBS清洗蛋白G 基質(zhì)2次。立即通過加入IM Tris pH 8. 0將洗脫級分再緩沖至中性pH，然后對PBS進行透析。在測試的寡克隆抗體中，91個特異性結(jié)合NIH3T3-AXL cl. 7成纖維細胞但不結(jié)合 NIH3T3-模擬對照細胞，9個在相同的細胞中抑制feise誘導(dǎo)的Akt磷酸化，然而71個刺激 Akt磷酸化。冷凍保存(kryoconserve)和亞克隆4個拮抗型抗體(I11B7、I10D12、I6E7和 III11D5，在下列實施例中分別稱為11B7、10D12、6E7禾口 11D5)、兩個激動型抗體(I11D7和 III2A1 ；在下列實施例中稱為11D7和2A1)和1個對照抗體(III1D5 ；在下列實施例中稱為 1D5)。實施例3.抗AXL抗體的結(jié)構(gòu)和表征
3. 1.大鼠抗體可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列從雜交瘤細胞克隆大鼠抗AXL抗體可變結(jié)構(gòu)域。使用RNA提取試劑盒 RNeasy(RNeasy midi-kit，Qiagen)制備RNA。按照廠商的說明書使用5' RACE試劑盒 (Invitrogen)制備編碼抗體基因的cDNA。簡而言之，使用基因特異性GSPl引物和Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶從總RNA合成第一鏈cDNA。在第一鏈cDNA合成后，通過用RNA酶混合物(RNase Mix)處理除去原始mRNA 模板。然后向cDNA的3'末端添加同聚體尾。使用Taq DNA聚合酶、與位于cDNA分子內(nèi)的位點退火的嵌套基因特異性引物(GSP》和試劑盒提供的錨定引物進行PCR擴增。在擴增后，將5' RACE產(chǎn)物克隆入pLXSN-ESK載體以進行測序。為了促進克隆，錨定引物(AP)包含Sal I的識別序列，GSP2引物包含Xho I位點。GSPl 引物:kappa_GSPl GATGGATGCATTGGTGCAGCnew_kappa_GSP1 :atagatacagttggtgcagcheavy_GSPl CAGGGTCACCATGGAGTTAGSP2 引物Xhol-hGSP2 :CCGCTCGAGCGGGCCAGTGGATAGACAGATGGXhol-kGSP2 :CCGCTCGAGCGGCCGTTTCAGCTCCAGCTTGG將GSP引物用于大鼠抗AXL Mab克隆11B7 kappa GSPl；Xhol-kGSP2heavy GSPl ；Xhol_hGSP2IOD12 :kappa_GSPl, new_kappa_GSPl ；Xhol_kGSP2heavy GSPl ；Xhol_hGSP211D5 new_kappa_GSPl ;Xhol_kGSP2heavy GSPl ；Xhol_hGSP23. 2.大鼠抗AXL抗體可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列從克隆入pLXSN-ESK載體的經(jīng)測序的基因翻譯大鼠抗體可變結(jié)構(gòu)域序列。給出的氨基酸序列始于可變結(jié)構(gòu)域的位點1。根據(jù)Kabat (Kabat等人kquences of Proteins of Immunological hterest，第 5 版.NIH Publication No. 91-3242，1991)定義抗體特異性結(jié)合其靶所需的互補決定區(qū)(CDR)。Kabat定義基于可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)的序列變異性?？贵w的抗AXL特異性CDR區(qū)域列于圖14和SEQ ID NO :121至SEQ ID NO :132中。單獨的CDR包括下列位點CDR--Ll:24--34
CDR--L2:50--56
CDR--L3:89--97
CDR--Hl:31--35b
CDR--H2:50--65
CDR--H3:95--102 大鼠11B7抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別由SEQ IDNO :140和141表示。大鼠11B7抗體的輕鏈和重鏈的亞類分別為κ和IgGl。
大鼠11D5抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別由SEQ IDNO :142和143表示。大鼠11D5抗體的輕鏈和重鏈的亞類分別為κ和IgGh。3. 3大鼠抗體的表達和純化在CellineCL 1000生物反應(yīng)器 Qntegra Biosciences)中使用DMEM(含有4. 5g/ L葡萄糖；1 %谷氨酰胺，1 %丙酮酸鹽，1 %青霉素/鏈霉素)在37°C，5-7 % CO2下培養(yǎng)雜交瘤。FCS補充物是用于營養(yǎng)小室的1%FCS和用于細胞小室的5%的低IgG FCS。每周2次進行收獲和培養(yǎng)基替換。細胞分離1/1->1/3取決于細胞生長。每周1次通過SDS-PAGE 分析檢測生產(chǎn)率。將上清液貯存于-20°C下直至進行純化。每周1次進行工作培養(yǎng)物的支原體(Mycoplasma)檢查。通過Akta Explorer 100 系統(tǒng)(GE-Healthcare)使用蛋白 A 或 G 瓊脂糖 FF(GE-Healthcare)純化抗體。對于各純化，單獨地填充柱子。將柱子大小調(diào)整至各批次的預(yù)期的生產(chǎn)率和大小(通常50-500mg)。在可能的情況下將含有蛋白質(zhì)的溶液保持在冰上或4°C下。在整個過程中使用無菌緩沖液和雙蒸水。將上清液解凍，用50mM TRIS pH 8. 5進行緩沖，離心，通過0. 22 μ m膜過濾，然后將其裝載至柱子上。在用8倍柱體積(CV)的50mM P04，pH8. 5清洗后，將抗體洗脫在10 CV IOOmM甘氨酸，pH 3. 3中。立即通過加入1/5 1 M Tris pH 8.0 (lml Tris/^il洗脫級分) 將洗脫級分再緩沖至中性PH，然后利用rSDS-PAGE進行分析?；旌虾屑兛贵w的級分，在 4°C下對PBS進行透析，然后無菌過濾。根據(jù)各抗體的單獨的性質(zhì)調(diào)整緩沖系統(tǒng)的要求。特別地，將大鼠IgGh抗體11D5 結(jié)合至ftOteinG 4FF基質(zhì)(GE-Healthcare)，在高鹽QM NaCl)條件下進行清洗。在根據(jù) 11D5的高鹽條件下通過rProteinA (GE-Healthcare)純化大鼠抗體IgGl 11B7。在pH 5.5 下進行抗體洗脫。大鼠抗體純化的流速必須保持較低以增加結(jié)合效率。作為第二純化步驟，可進行離子交換層析(在單獨的、合適的條件下)或制備型尺寸排阻層析(PBS, pH 7. 4)。用于純化的抗體的質(zhì)量控制的標準方案包括rSDS-PAGE凝膠分析；考馬斯染色或銀染BCA 檢測(Pierce #23227 BCA Protein Assay Kit ；大鼠 IgG 標準 #31233)分析型尺寸排阻(Superdex200 Tricorn 10/300GL, 250mg 于 250 μ 1 中； 0. 5ml/分鐘，Akta Explorer 100)內(nèi)毒素檢測(LAL, Cambrex QCL- 1000 Chromogenic LAL EndpointAssay#US50-648U)基于細胞的活性測定(FACS結(jié)合；pAkt ；pAXL)取決于它們的穩(wěn)定性，在無菌條件下在4°C或_20°C下將純化的抗體貯存在PBS， pH 7. 4 中。將獲得的大鼠抗體之一 11B7用于實施例5、6和16。3.4.通過FACS scatchard進行的抗體親和力測定通過用IOmM的在PBS中的EDTA溫育來收獲過表達人AXL的NIH3T3細胞，以6 百萬個細胞/ml將其重懸浮于FACS緩沖液(PBS pH7. 4,3% FCS,0. 1 % NaN3)中。在圓底微量滴定板中，向100 μ 1的在FACS緩沖液中以40至0. 002 μ g/ml (266至0. OlnM)的濃度含有抗體 11B7、11D5、chllB7-IgGl、chllB7_IgG2、chllD5_IgGl 或 chllD5_IgG2 的抗體溶液中加入100 μ 1細胞懸浮液。讓抗體結(jié)合在冰上進行2小時。然后，用250 μ 1 FACS緩沖液/孔清洗細胞2次，將其重懸浮于200μ1以1 50稀釋于FACS緩沖液中的二抗(抗大鼠-PE Jackson)中。在溫育45分鐘后，在FACS緩沖液中再清洗細胞2次，然后重懸浮于 500ml PBS中以用于FACS分析。在Beckman-CoulterFACS FC500上進行分析。為了測定表觀親和常數(shù)KDapp，將平均熒光值針對平均熒光與相應(yīng)抗體濃度([M])的比作圖。由直線的斜率倒數(shù)(inverse slope)計算的KDapp列于下面
克隆KD值(nM)上文中所列的KD值包括實施例4中獲得的嵌合抗體的KD值。實施例4 大鼠抗AXL抗體嵌合化(chimerization)如下所述從人志愿者的外周血單核細胞(PBMC)克隆人κ輕鏈和重鏈IgG 1/2基因從全血制備PBMC。將血液在室溫下于具有10U/ml肝素的PBS/2mMEDTA中稀釋 1/2，5，在由膈膜(diaphragm)覆蓋的 15ml Biocoll 溶液(35ml/管)[來自 Biochrom #L6115的Biocoll]的上方分層。以400xg在室溫下離心樣品30分鐘，棄去血清(約15ml)。 使用Pasteur移液器小心地回收含有PBMC的界面。將PBMC在PBS/2mM EDTA中清洗2 次(第一次清洗100ml，第二次清洗50ml)，以300xg離心10分鐘。將細胞沉淀重懸浮于 RPMI/10% FCS (25ml)中，產(chǎn)生 5· 5xl07 個 PBMC。根據(jù)廠商的說明書，使用來自Qiagen (#75142)的RNeasy試劑盒從PBMC制備RNA。 將純化的RNA(30 μ g)以等分在-80°C下貯存。按照廠商的說明書，使用下列引物，利用Superskript III逆轉(zhuǎn)錄酶 (invitrogen#18080-93)通過RT-PCR從分離的RNA制備抗體IgG γ 1和2以及κ鏈的 cDNA
權(quán)利要求
1.結(jié)合AXL的細胞外結(jié)構(gòu)域并且至少部分抑制AXL活性的單克隆人源化抗體。
2.權(quán)利要求1的單克隆人源化抗體，其減少和/或阻止AXL介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、AXL磷酸化、細胞增殖、血管生成、細胞遷移、腫瘤轉(zhuǎn)移和/或AXL介導(dǎo)的抗細胞凋亡。
3.權(quán)利要求1或2的單克隆人源化抗體，其減少和/或阻止配體誘導(dǎo)的AXL下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子例如ERK1/2、AKT、GSK-3 β、TSC2、mTOR和/或S6K1的磷酸化。
4.權(quán)利要求1-3的任一項的單克隆人源化抗體，其來源于嵌合抗AXL抗體11B7(SEQ ID NO :135，136)或11D5(SEQ ID NO =137,138)之一并且在11B7或11D5的至少一個可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)中包含至少一個突變。
5.權(quán)利要求1-4的單克隆人源化抗體，其包含選自SEQID NO 40至SEQ ID NO 48的重鏈氨基酸序列，或至少其可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，或選自SEQ ID N0:80至SEQ ID NO :82的重鏈氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，和/或選自SEQ ID N0:18至SEQ ID NO :30的輕鏈氨基酸序列，或至少其可變結(jié)構(gòu)域， 或與其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，或選自SEQ ID NO 73至SEQ ID NO 79的輕鏈氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，或其識別AXL細胞外結(jié)構(gòu)域上的相同表位的片段。
6.權(quán)利要求5的單克隆人源化抗體，其選自人源化h#llB7抗體，所述人源化h#llB7 抗體選自 h#llB7-Tl、h#llB7-T2、h#llB7-T3、h#llB7-T4、h#llB7-T5、h#llB7-T6、 h#llB7-T7、h#llB7-T8、h#llB7_T9、h#llB7_T10、h#llB7_Tll、h#llB7_T12、h#llB7_T13、 h#llB7-T14、h#llB7-T15、h#llB7-T16、h#llB7-T17、h#llB7-T18、h#llB7-T19、h#llB7-T20、 h#llB7-T21、h#llB7-T22、h#llB7-T23、h#llB7-T24、h#llB7-T25、h#llB7-T26、h#llB7-T27 或 h#llB7-D8。
7.權(quán)利要求1-4的單克隆人源化抗體，其包含選自SEQID NO 67至SEQ ID NO 72的重鏈氨基酸序列，或至少其可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，或選自SEQ ID NO :114至SEQ ID NO :120的重鏈氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，和/或選自SEQ ID N0:55至SEQ ID NO :60的輕鏈氨基酸序列，或至少其可變結(jié)構(gòu)域， 或與其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，或選自SEQ ID N0:83至SEQ ID NO :113的輕鏈氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，或其識別AXL細胞外結(jié)構(gòu)域上的相同表位的片段。
8.權(quán)利要求7的單克隆人源化抗體，其選自人源化h#l1D5抗體，所述人源化h#l 1D5抗體選自 h#l 1D5-T1、h#l 1D5-T2、h#l 1D5-T3、h#l 1D5-T4、h#l 1D5-T5 或 h#l 1D5-T6。
9.權(quán)利要求1-8的任一項的單克隆人源化抗體，其被偶聯(lián)至標記基團。
10.權(quán)利要求1-9的任一項的單克隆人源化抗體，其被偶聯(lián)至效應(yīng)物基團。
11.分離的核酸分子，其選自下列(a)編碼權(quán)利要求1-10的任一項的單克隆抗體、其抗體片段或衍生物的核酸序列，(b)選自SEQ ID NO 5 至 SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 31 至 SEQ IDNO 39, SEQ ID NO ·49 至 SEQ ID N0:54 禾口 SEQ ID NO :61 至 SEQ ID NO 66 的 SEQ ID NO 之一中所示的核酸序列，(c)編碼選自SEQ ID NO 18 至 SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 40 至 SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 55 至 SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :66 至 SEQID NO 73,SEQ ID NO 73 至 SEQ ID NO 120和SEQ ID NO :121至SEQID NO :132的多肽的核酸序列，(d)與(a)至(c)中的任何序列互補的核酸，或(e)能夠在嚴格條件下與(a)、(b)、(c)或(d)雜交并且編碼多肽的核酸序列，其中包含所述多肽的抗體或其功能性片段結(jié)合AXL的細胞外結(jié)構(gòu)域。
12.包含權(quán)利要求11的核酸序列的載體。
13.權(quán)利要求12的載體，其為表達載體并且所述核酸序列可操作地連接至控制序列。
14.包含權(quán)利要求12或13的載體的宿主。
15.權(quán)利要求14的宿主，其為人、細菌、動物、真菌、兩棲動物或植物細胞。
16.權(quán)利要求14的宿主，其為非人轉(zhuǎn)基因動物。
17.制造權(quán)利要求1-12的任一項的單克隆人源化抗體的方法，其包括從權(quán)利要求14、 15或16的宿主獲得所述多肽的步驟。
18.一種藥物組合物，其包含人源化抗AXL抗體，優(yōu)選權(quán)利要求1-10的任一項的單克隆人源化抗體、權(quán)利要求11的核酸分子、權(quán)利要求12或13的載體、權(quán)利要求14、15或16的宿主，或通過權(quán)利要求17的方法產(chǎn)生的多肽。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，其包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。
20.權(quán)利要求18或19的藥物組合物，其包含另外的活性劑。
21.權(quán)利要求18-20的任一項的藥物組合物，其用于過度增殖性疾病的診斷、預(yù)防或治療。
22.權(quán)利要求18-21的任一項的藥物組合物，其中所述過度增殖性疾病與AXL表達、過表達和/或過度活躍相關(guān)。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述過度增殖性疾病選自乳腺癌、肺癌和其他表達或過表達AXL的癌癥以及腫瘤轉(zhuǎn)移的形成。
24.權(quán)利要求1-10的任一項的單克隆人源化抗體，其用于過度增殖性疾病的診斷、預(yù)防或治療。
25.權(quán)利要求1-10的任一項的單克隆人源化抗體在制造用于過度增殖性疾病的診斷、 預(yù)防或治療的藥物組合物中的用途。
26.權(quán)利要求M或25的用途，其中所述過度增殖性疾病為權(quán)利要求22或23的任一項中定義的過度增殖性疾病。
27.用于診斷與AXL的表達相關(guān)的狀況的方法，其包括將樣品與權(quán)利要求1-10的任一項的單克隆人源化抗體接觸，和檢測AXL的存在。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述狀況是權(quán)利要求22或23的任一項中定義的過度增殖性疾病。
29.用于預(yù)防或治療患者的與AXL的表達相關(guān)的狀況的方法，其包括給有此需要的患者施用有效量的至少權(quán)利要求1-10的任一項的單克隆人源化抗體。
30.權(quán)利要求四的方法，其中所述狀況是權(quán)利要求27或四的任一項中定義的過度增殖性疾病。
31.權(quán)利要求四或30的方法，其中所述患者是哺乳動物患者，特別是人患者。
32.試劑盒，其包含抗AXL抗體，優(yōu)選權(quán)利要求1-10的任一項的單克隆抗體、權(quán)利要求 11的核酸序列或權(quán)利要求12或13的載體。
33.權(quán)利要求32的試劑盒，其還包含另外的抗腫瘤劑。
34.權(quán)利要求1-10的任一項的人源化抗AXL抗體用于制造藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于治療抗藥性癌癥。
35.權(quán)利要求1-9的任一項的人源化抗AXL抗體用于制造藥劑的用途，所述藥劑用于與抗腫瘤劑共施用，以治療過度增殖性疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及單克隆人源化抗體，其結(jié)合AXL受體酪氨酸激酶的細胞外結(jié)構(gòu)域并且至少部分抑制AXL活性。
文檔編號A61P35/00GK102421802SQ201080020597
公開日2012年4月18日 申請日期2010年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日
發(fā)明者J·魯赫, P·沃特斯, 瀧澤剛, 高山知子 申請人:U3制藥有限公司