專利名稱：一種治療高致病性禽流感病毒h5n1引發(fā)疾病的多肽疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是一種關(guān)于高致病性禽流感病毒引發(fā)疾病的 多肽疫苗。
背景技術(shù)：
禽流行性感冒(Avian influenza)簡(jiǎn)稱禽流感，是由A型流感病毒(AIV)引起的 禽類廣泛發(fā)生的傳染病。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球禽流感疫情已波及47個(gè)國(guó)家和地區(qū)，人發(fā) 禽流感病例已達(dá)195起以上，其中死亡至少110人，死亡率高達(dá)56.4%。1997年在香港 發(fā)生的禽流感引起了人的發(fā)病和死亡，從而引起了全世界的高度重視。AIV依據(jù)其血凝素 (Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)抗原性的差異目前可分為16個(gè)H 亞型(Hl H16)和 10 個(gè) N 亞型(Ni N10) [AlexanderDJ. A review of avian influenza in different bird species. VetMicrobiol, 2000, 74 (1-2) :3-13]。根據(jù)禽流感病毒毒力 和致病性的不同，可以將其分為高致病性、低致病性和無致病性三類。H7、H5亞型所致禽 類疾病具有傳播快、危害大、病情兇險(xiǎn)等特征，除急性呼吸道炎癥外，常伴有全身出血性改 變，心、肺、腎等多臟器衰竭，死亡率達(dá)100%，故稱為高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza),目前將H5m歸為高致病性禽流感病毒。對(duì)于人類而言，最大的威脅在于，如果同時(shí)感染人類流感病毒和禽流感病毒，就有 可能在體內(nèi)重組成可以在人類之間互相傳播的新型病毒，而人們對(duì)此幾乎沒有免疫力，那 勢(shì)必將導(dǎo)致又一次的流感大流行。由于水禽和飛禽是AIV的天然宿主，這種病毒的長(zhǎng)期存 在，將為其與感染人或其他哺乳動(dòng)物的流感病毒混合、產(chǎn)生新毒株提供條件。目前針對(duì)AIV的疫苗或者藥物主要有以下幾種1、質(zhì)粒疫苗Lalor PA等對(duì)比了分別構(gòu)建的HA、NP (核蛋白)、M2基因的質(zhì)粒疫苗 的免疫效果。三種疫苗都對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠和雪貂有明顯的保護(hù)效果，而同時(shí)構(gòu)建了 NP和M2基因 的疫苗效果最佳Lalor PA, Webby RJ, Morrow J. Plasmid DNA-based vaccines protect mice and ferrets againstlethal challenge with A/Vietnam/1203/04(H5N1)influenza virus. J InfectDis. 2008 ；197 (12) :1643_1652。Li C 等構(gòu)建了優(yōu)化后的質(zhì)粒疫苗H5N1/ PR8-5B19。該疫苗包括H5m病毒的HA和NA基因。并對(duì)HA和NA基因做了修飾-修改了 HA切割位點(diǎn)使其和低致病性情流感相似、將NA的莖區(qū)用鼠肝炎病毒的S2糖蛋白的5B19表 位代替，以降低其致病性和增強(qiáng)其免疫原性。最后該疫苗表現(xiàn)出較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，對(duì)實(shí) 驗(yàn)雞產(chǎn)生了較好的免疫保護(hù)Li C, Ping J, Jing B. H5N1 influenzamarker vaccine for serological differentiation between vaccinated andinfected chickens. Biochem Biophys Res Commun. 2008 ；372 (2) :293-297.。2、重組體疫苗Wei CJ等系統(tǒng)分析了幾種不同形式的重組體HA蛋白應(yīng)用為疫苗的潛力。單體、 三聚體和低聚體的H5W HA蛋白從細(xì)胞分理處分離出，采用中和抗體反應(yīng)對(duì)其免疫原性 進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果高分子量的低聚體HA蛋白疫苗引發(fā)的抗體反應(yīng)最強(qiáng)烈，三聚體次之，單體最i看Wei CJ, Xu L, KongffP. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited byrecombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. JVirol. 2008 Jul ；82(13) :6200-6208 。Watanabe 等研究發(fā)現(xiàn)，將 H5m 病毒 M2 羥基端切除 11個(gè)氨基酸后，該病毒與野生型相比有相似的生長(zhǎng)能力，但在小鼠體內(nèi)的復(fù)制效率大大降 低。作者構(gòu)建了重組體病毒-VN1203M2del 11，該重組病毒HA的切割位點(diǎn)由切除11個(gè)氨基酸 后的突變體代替。結(jié)果該疫苗對(duì)小鼠產(chǎn)生了較好的保護(hù)性。M2胞質(zhì)尾部突變體有發(fā)展成 為 H5N1 病毒減毒活疫苗的潛力Watanabe Τ, Watanabe S, Kim JH. Novel approach to the development of effective H5N1 infIuenzaA virus vaccines :use of M2 cytoplasmic tail mutants. J Virol. 2008Mar ；82 (5) :2486_92。3、病毒載體疫苗Rmer等利用新城疫病毒作載體，表達(dá)HA免疫原作為疫苗。結(jié)果 顯示這種疫苗(NDVNDVH5m)在一次免疫后就對(duì)雞有了較好的效果。由新城疫病毒做載體 的減毒疫苗對(duì)感染H5禽流感的保護(hù)水平由該疫苗與感染H5W病毒的H5序列的同源性大 小決定Rmer-Oberd, rfer A, Veits J. Level of protection of chickens againsthighly pathogenic H5 avian influenza virus with Newcastle disease virusbased live attenuated vector vaccine depends on homology of H5sequence between vaccine and challenge virus. Vaccine. 2008 ；26 (19) :2307_13。Mar 等用 HIV 病毒顆粒作載體， 包被H5m的ΗΑ、ΝΑ、M2基因，構(gòu)建成為H5m HaNaM-pseudotyped HIV載體系統(tǒng)。該載 體系統(tǒng)可以較精確的模擬禽流感病毒在體內(nèi)的反應(yīng)，可代替禽流感病毒，用來評(píng)估疫苗、 藥物。特別在是安全性較低的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用該系統(tǒng)有實(shí)用意義Mar Ao Ζ, Patel A, Tran K. Characterization of atrypsin-dependent avian influenza H5Nl-pseudotyped HIV vector systemfor high throughput screening of inhibitory molecules. Antiviral Res. 2008Jul ；79(1) :12_8。Singh等將牛腺病毒AD的一個(gè)亞型(BAdiB)作為載體表達(dá)H5m 的HA基因，構(gòu)建成BAd-H5NA疫苗，有較好的免疫效果SinghN，Pandey A, Jayashankar L. Bovine adenoviral vector-based H5Nlinfluenza vaccine overcomes exceptionally high levels of pre-existingimmunity against human adenovirus. Singh Mol Ther. 2008 ； 16 (5) :965-71。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種治療高致病性禽流感病毒H5m引發(fā)疾病的多肽疫 苗，它可以專門針對(duì)高致病性禽流感病毒H5m型感染的細(xì)胞進(jìn)行有效地破壞，而且對(duì)人體 無毒副作用。本發(fā)明的目的是通過這樣的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，它的氨基酸序列為氨基 端-QIGNISIWV-羧基端；以賴氨酸為接頭，將多個(gè)該氨基酸序列組成多拷貝的串聯(lián)結(jié)構(gòu)。正常人體的外周血單核細(xì)胞(簡(jiǎn)稱PBMC) —般不具有特異性溶破受到高致病性禽 流感病毒H5m感染的細(xì)胞的功能，本發(fā)明提供的多肽在體外與HLA-A*0201陽性人體的外 周血單核細(xì)胞共同孵育，可以增加這些外周血單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(簡(jiǎn)稱 CTL)的數(shù)量45% _80%，還可以誘導(dǎo)激活CTL溶破受高致病性禽流感病毒H5W感染的陽性 細(xì)胞，溶破率為60% -88%。本發(fā)明的基本的氨基酸序列來源于GENBANK報(bào)道的高致病性禽流感病毒H5m的m蛋白的氨基酸序列，采用蛋白質(zhì)表位分子設(shè)計(jì)的原理和方法，高致病性禽流感病毒H5m 的m蛋白序列進(jìn)行CTL表位分析，主要是基于量化基序法確定m蛋白的CTL表位，具體做 法是從m蛋白第ι位氨基酸殘基開始，逐個(gè)截取九肽段或十肽段，共獲得6條九肽段。對(duì) 于每一條肽段，在結(jié)合矩陣中查找各位點(diǎn)氨基酸殘基的結(jié)合系數(shù)，這九肽結(jié)合系數(shù)相乘后 再乘以標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)，即為該九肽或十肽與HLA-A*0201的結(jié)合系數(shù)。最后，選取結(jié)合系數(shù)最高 的幾條肽段作為候選CTL表位。以此方法找到了具有功能的本發(fā)明所述的氨基酸序列，即 氨基端-QIGNISIWV-羧基端。合成本發(fā)明所述的氨基酸序列方法均是現(xiàn)有的成熟技術(shù)，它是按照如下的方法制 成的采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，起始選用0. 0125mmol, PSC樹脂(ABI公司生產(chǎn)，批號(hào) A5F013)，分別按照權(quán)利要求1、2、3或4所述的序列特征，使肽鏈從C端逐個(gè)向N端延伸，各 氨基酸原料(美國(guó)ABI公司生產(chǎn))的用量為0. Immol0各種氨基酸保護(hù)基團(tuán)是各氨基酸 的 alpha 氨基為 Pmoc 保護(hù)，其余側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，Arg (Mtr)、tyr (tBu)、Thr (tBu)、Tyr (tBu)、 Asp(OtBu)0每步縮合都加入HoBt/Dcc活化保護(hù)氨基酸的羧基。每步縮合用含有20%六 氫吡啶的NMP溶液去除Fmoc保護(hù)基，肽鏈合成后，按照ABI公司推薦的步驟，將含樹脂的 肽鏈加入處于冰浴條件下的混合反應(yīng)液中，反應(yīng)液的成分結(jié)晶苯酸0. 75g、酒石酸乙二胺 (EDT)0. 25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole)O. 5ml、去離子水0. 5ml、三氟乙酸10ml。在室溫條 件下持續(xù)攪拌，反應(yīng)時(shí)間為4. 5小時(shí)，把肽鏈從樹脂上裂解下來，同時(shí)去除多種保護(hù)基。將 混合液經(jīng)4G的玻璃濾器過濾，以濾掉切下的樹脂及保護(hù)基團(tuán)，并用三氟乙酸沖洗反應(yīng)瓶和 濾器，將濾液在常溫下低壓蒸發(fā)至1 anl，加乙醚50ml使多肽沉淀后，經(jīng)6G濾器過濾后， 冷凍干燥，所得便是肽產(chǎn)品。以上過程都是在ABI-431A固相自動(dòng)肽合成儀(美國(guó)生產(chǎn))上 完成。本發(fā)明涉及的合成多肽藥物或疫苗可以室溫保存、運(yùn)輸，也可以自動(dòng)化批量生產(chǎn)。 使用現(xiàn)有的成熟技術(shù)，制備表達(dá)高致病性禽流感病毒H5m之m轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞，叫HEK293 細(xì)胞；按照本領(lǐng)域公知的方法獲得HLA-A*0201陽性人體的外周血單核細(xì)胞(簡(jiǎn)稱PBMC)； 培養(yǎng)上述PBMC細(xì)胞M小時(shí)后，取懸液OX106/ml)4瓶。加入本發(fā)明所述的氨基酸序列多 肽(20yg/ml)，加入等量完全培養(yǎng)基作為對(duì)照組，37°C，5%C02環(huán)境下孵育。7天后重復(fù)該 刺激過程，共反復(fù)刺激3次。最末一次刺激后第3天收集懸浮細(xì)胞，這些細(xì)胞具有針對(duì)高致 病性禽流感病毒H5W之m蛋白的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性CTL細(xì)胞，計(jì)數(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)使用本發(fā)明 涉及的合成多肽藥物或疫苗可以使CTL細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組增加45 % -88 %。將轉(zhuǎn)染了高致病性禽流感病毒H5m之m基因的HEK293細(xì)胞與上述CTL細(xì)胞共 同孵育，發(fā)現(xiàn)該CTL細(xì)胞可以溶破轉(zhuǎn)染了高致病性禽流感病毒H5m之m基因的HEK293細(xì) 胞，溶破率得到60% -88%。由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有便于運(yùn)輸保存和自動(dòng)化批量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)， 它具有激活特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力，該特異性CTL細(xì)胞具有殺傷、溶破具 有高致病性禽流感病毒H5m之m基因的靶細(xì)胞，效果明顯，而且無毒副作用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明
本發(fā)明的氨基酸序列為氨基端-QIGOTSIWV-羧基端；利用賴氨酸具有兩個(gè)氨基、 一個(gè)羧基的特點(diǎn)，以賴氨酸為接頭，將多個(gè)氨基酸序列連接的特殊方式。該多肽可以體外刺激HLA_A*0201陽性人體的外周血單核細(xì)胞，可以增加這些外 周血單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(簡(jiǎn)稱CTL)的數(shù)量提高50%-80%，還可以激活 CTL溶破高致病性禽流感病毒H5m之m基因的細(xì)胞，溶破率為60% -88%。實(shí)施例1 它的氨基酸序列可以為該多肽可以體外刺激HLA_A*0201陽性人體的外周血單核細(xì)胞，可以增加這些外 周血單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(簡(jiǎn)稱CTL)的數(shù)量提高60%，還可以激活CTL溶 破對(duì)高致病性禽流感病毒H5m之m基因的細(xì)胞，溶破率為83. 10%。實(shí)施例2 它的氨基酸序列也可以為
權(quán)利要求
1.一種治療高致病性禽流感病毒H5m引發(fā)疾病的多肽疫苗，其特征在于它的氨基酸 序列為氨基-QIGNISIWV-羧基。
2.如權(quán)利要求1所述的治療高致病性禽流感病毒H5W引發(fā)疾病的多肽疫苗，利用賴氨 酸具有兩個(gè)氨基、一個(gè)羧基的特點(diǎn)，以賴氨酸為接頭，所形成的特殊連接方式，其特征在于 它的氨基酸序列的連接形式為
3.如權(quán)利要求1所述的治療高致病性禽流感病毒H5m引發(fā)疾病的多肽疫苗，利用賴氨 酸具有兩個(gè)氨基、一個(gè)羧基的特點(diǎn)，以賴氨酸為接頭，所形成的特殊連接方式，其特征在于 它的氨基酸序列的連接形式為
4.如權(quán)利要求1所述的治療高致病性禽流感病毒H5m引發(fā)疾病的多肽疫苗，利用賴氨酸具有兩個(gè)氨基、一個(gè)羧基的特點(diǎn)，以賴氨酸為接頭，所形成的特殊連接方式，其特征在于它的氨基酸序列的連接形式為 nT<T\TT<2TW/K-LMLQIGNML
全文摘要
一種治療高致病性禽流感病毒H5N1引發(fā)疾病的多肽疫苗，涉及一種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是一種關(guān)于高致病性禽流感病毒引發(fā)疾病的多肽疫苗。其特征在于它的氨基酸序列為氨基-QIGNISIWV-羧基；利用賴氨酸具有兩個(gè)氨基、一個(gè)羧基的特點(diǎn)，以賴氨酸為接頭，所形成的特殊連接方式。本發(fā)明具有便于運(yùn)輸保存和自動(dòng)化批量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，它具有激活特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力，該特異性CTL細(xì)胞具有殺傷、溶破具有高致病性禽流感病毒H5N1之N1蛋白的靶細(xì)胞，效果明顯，而且無毒副作用。
文檔編號(hào)A61K38/08GK102085362SQ20101061663
公開日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者呂鳳林, 楊力, 田菲菲 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)