專利名稱：合歡皮中抑制血管生成的一種高效低毒的有效部位的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
合歡皮中抑制血管生成的有效部位的制備工藝和應(yīng)用。本發(fā)明涉及從中藥合歡皮 中提取、分離得到的一種有效部位，具有抑制血管生成的活性。闡明了其制備方法，及其在 醫(yī)藥、食品、化妝品方面的新用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤直徑大于1毫米呈腫瘤轉(zhuǎn)移趨勢時，必需先形成新的腫瘤血管。抑制腫 瘤內(nèi)部和周圍新血管形成便可有效減少，甚至消除腫瘤。近年來，腫瘤血管生成已成為腫 瘤治療中一個很有吸引力的熱點。目前開發(fā)出許多血管生成抑制劑在進行I III期臨 床試驗研究，例如血管生成抑素(Angiostatin)、內(nèi)皮抑素(Endostatin)、煙曲霉素類似物 及金屬蛋白酶抑制因子和尿激酶、白介素-12、血小板因子、Bufotanine等20多種。美國 Genentech 公司以血管內(nèi)皮生長因子(vessel endothelial growth factor, VEGF)為靴標 的抗新生血管形成藥Avastin近年用于治療晚期轉(zhuǎn)移的直腸癌和乳腺癌等，延長病人生命 4-6個月。2007年Avastin的年銷售量已超過24. 5億美元，2009年第一季度銷售額達到13 億美元。Avasitin成為近年抗癌新藥的一枝獨秀。此外，幾種針對不同靶標的抗新生血管 形成的藥物已進入 Π、ΙΙΙ 期臨床試驗[l、Ellis LM, Hicklin DJ. VEGF-targeted therapy mechanisms of anti-tumour activity. Nat Rev Cancer. 2008,8 :579_591.]。但目前上市的抑制腫瘤血管新生的藥物只能靜脈給藥，且用藥劑量較大、治療時 間長。因此開發(fā)口服、高效低毒、價廉的血管生成抑制劑成為該領(lǐng)域的熱點?！岸喑煞帧⒍喟悬c、多途徑”是中藥治療疾病的特點，發(fā)揮祖國醫(yī)學(xué)特色，從多途徑、 多層次、多環(huán)節(jié)，研究中藥直接地或間接地影響血管新生，有著重要的臨床意義和應(yīng)用前 景。通過建立體內(nèi)、體外血管生成篩選模型，尋找到目的中藥合歡皮等，并對其進行提取分 離，獲得若干有效部位。進一步通過藥效與毒性評價，得到一高效低毒有效部位。合歡皮是中國藥典一部收錄的一味常用中藥，為豆科植物合歡Albizia julibrissin Durazz.的干燥樹皮，具有解郁安神，活血消腫的功能，用于心神不安，憂郁 失眠，肺癰瘡腫，跌撲傷痛等癥[2、國家藥典委員會。中國藥典第一部，中國醫(yī)藥科技出版 社，北京，PP34]。合歡屬植物樹皮、莖皮、葉、花、種子的主要的化學(xué)成分有三萜及其苷類 化合物、黃酮及其苷類化合物、生物堿、有機酸、留醇類化合物、木脂素、鞣質(zhì)及揮發(fā)性成分 等。現(xiàn)代藥理實驗表明，合歡屬植物具有廣泛的抗癌、鎮(zhèn)靜、抗生育、PAF受體拮抗和抗炎 等作用[3、喬善義，蔚冬紅，郭繼芬。組合LC2MS2MS鑒定技術(shù)的生物活性導(dǎo)向研究合歡皮 抗炎活性部位。中國中藥雜志，2007,32(19) =2021-2024] 0也有研究發(fā)現(xiàn)合歡皮提取物具 有廣泛的體內(nèi)、體外抑制腫瘤細胞增殖的活性，但由于其抗癌作用機制還不明確，限制了其 抗癌作用的臨床應(yīng)用[4λ Tsuyoshi Ikeda，Tetsuya Kajimoto, Toshihiro Nohara, Jun-ei Kinjo,Chi-Huey Wong. Preparation of a neoglycolipid carrying theoligosaccharide component of saponin from Albizzia julibrissin. Tetrahedron Letters. 1995,36(9)1509-1510. 5、Kun Zou, Yuying Zhao, Guangzhong Tu, Jingrong Cui, Zhonghua Jia and Ruyi Zhang. Two diastereomericsaponins with cytotoxic activity from Albizia julibrissin. Carbohydrate Research. 2000,324(3) : 182-188. 6、KunZou, Yuying Zhao, Guangzhong Tu, Junhua Zheng, Ruyi Zhang. A New Isomer of Julibroside J2 from Albiziajulibrissin. J Asian Natural Products Research. 1998,1 (1) :59_66. 7、芻^坤， 趙玉英，李德宇，徐鋒，鄭俊華，張如意.合歡皮的脂溶性成分.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1999， 31(1) 32-34.]

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從合歡皮中提取分離得到的高效低毒的有效部位，具有 抑制血管生成的作用。本發(fā)明的技術(shù)方案一種用于抑制血管生成的高效低毒的合歡皮有效部位。所述有效部位的制備方法，用70%乙醇加熱回流提取合歡皮的干燥樹皮、莖皮、 葉、花、種子、豆莢或根，并將提取液過濾、濃縮成浸膏。所得的浸膏用水飽和正丁醇萃取，收 集萃取相有效部位，回收溶劑成浸膏，冷凍干燥制成干粉。所述有效部位，體內(nèi)、體外均有抑制血管生成的作用。所述有效部位經(jīng)Molish反應(yīng)、Libermann-Buchard反應(yīng)、三氯化銻反應(yīng)均呈陽性， 說明上述這些有效部位均含有至少一種以上苷類成分。所述合歡皮有效部位在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用，其特征是該抑制血管生 成藥物中含有幾種有效劑量的合歡皮有效部位，以及常規(guī)藥用載體和/或賦形劑。所述合歡皮有效部位在制成抑制血管生成藥物時，可以加入一種或多種藥學(xué)上可 接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑，賦形劑、填充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解 齊U、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、乳化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑，必要時還可以加入 香味劑、甜味劑等。所述合歡皮有效部位在制成抑制血管生成藥物時，可以按常規(guī)的制劑工藝，單獨 使用或與其它藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物，例如注射液、片 劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、膏劑、霜劑或乳劑等多種形式。所述的應(yīng)用，為所述有效部位是用于預(yù)防和/或治療至少一種選自下述之一的疾 病癌癥和/或癌癥轉(zhuǎn)移，血管瘤，血管纖維瘤，新生血管性青光眼，糖尿病視網(wǎng)膜病變，早 熟視網(wǎng)膜病及視網(wǎng)膜靜脈閉塞，視網(wǎng)膜變性，晶體后纖維組織增生，顆粒性結(jié)膜炎，血管生 成引起的角膜疾病，更年期黃斑和黃斑變性，牛皮癬，老年盤狀斑變性及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀 屑病，毛細管擴張，膿性肉芽腫，傷口愈合中抑制斑痕形成，動脈粥樣便化，脂溢性皮炎和痤 瘡。所述的應(yīng)用，為所述有效部位有抗腫瘤血管生成及其它與血管生成有關(guān)疾病治 療、預(yù)防的用途。所述的應(yīng)用，為所述有效部位還有用于腫瘤化療和/或輔助化療的用途。所述有效部位在制備抑制血管生成的保健食品中的應(yīng)用，是上述有效部位用于抑 制血管生成的保健食品組合物。
所述有效部位在制備抑制血管生成的化妝品中的應(yīng)用，是上述有效部位用于抑制 血管生成的化妝品組合物。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以血管生成作為治療疾病的靶點，首次明確合歡皮中具有抑制血管生成活 性的高效低毒有效部位的制備工藝方法，并將其作為用于腫瘤血管生成及其它與血管生成 有關(guān)的疾病預(yù)防、治療的藥物，其特點是劑量小，療效高，副作用小。且以血管生成理論為研 究背景，為今后闡述中藥有效部位的作用機制，發(fā)展中醫(yī)藥理論新的方向，發(fā)現(xiàn)新的藥物作 用靶點提供重要的科學(xué)依據(jù)。


圖1合歡皮有效部位對HMEC和3B11細胞體外增殖的抑制作用圖2合歡皮有效部位對體外HMEC細胞遷移的抑制作用圖3合歡皮有效部位對體外3B11細胞遷移的抑制作用圖4合歡皮有效部位對體外HMEC成管的抑制作用圖5合歡皮有效部位對體外3B11成管的抑制作用圖6合歡皮有效部位對小鼠H22體內(nèi)腫瘤的抑制作用圖7合歡皮有效部位對小鼠H22實體瘤的病理改變 圖注·Λ模型組，B高劑量組，C中劑量組，D低劑量組圖8致毒劑量合歡皮有效部位對小鼠主要臟器的損傷 圖注=AB心肌，CD肺，EF肝，GH脾，IJ腎
具體實施例方式實施例1 合歡皮的有效部位提取分離工藝與理化性質(zhì)的鑒定IOOg合歡皮用1L70%乙醇回流兩次，每次2-2. 5h，冷卻后，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干， 去離子水復(fù)溶，凍干，后取凍干粉lg，IOOml水溶解，水飽和正丁醇萃取三次，收集正丁醇相。所得正丁醇組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，水復(fù)溶，冷凍干燥，得率為原藥材的1. 25%。 有效部位的Molish反應(yīng)呈紫紅色，Libermann-Buchard反應(yīng)呈紫紅色，三氯化銻顯色為紅 色。此結(jié)果說明這一有效部位含有至少一種以上苷類化合物。實施例2 合歡皮的有效部位對HMEC和3B11細胞增殖的抑制作用將HMEC用含lmmol/L谷氨酰胺、lmg/L氫化可的松、10 μ g/L EGF和150ml/L小牛 血清的MCDB-131培養(yǎng)液，于37°C，50ml/L C02培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期HMEC細 胞，按每孔8000個細胞接種于96孔板中，放置于37°C、50ml/LC02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，加 入不同濃度藥物作用時間48h，以不加藥組為陰性對照組，每組同時設(shè)3個復(fù)孔，每批樣品 重復(fù)3次試驗。加藥后培養(yǎng)至72h，去上清液，每孔輕輕加入100g/L三氯醋酸100 μ 1固定， 靜置5min后移到4°C再放置至40min，傾掉固定液，用去離子水洗5遍，空氣干燥。每孔加 入 4g/L SRB 100μ 1 室溫放置 30min，用 10ml/L 醋酸液洗 5 遍，加入 150μ ll(kimol/L Tris 堿液(PH 10. 5)溶解，用MK3型酶標儀在波長A540處測定每孔A值。計算抑制率(％ )，求 出半數(shù)細胞抑制濃度(IC5(I)。抑制率=[(對照組的A值-藥物組的A值)/(對照組的A值-空白組的A值)]X 100 %。3B11細胞用含lmmol/L谷氨酰胺、lmg/L青霉素/鏈霉素 雙抗和100ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37°C，50ml/L C02培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，其余同 HMEC0根據(jù)所得的結(jié)果計算，對HEMC和3B11細胞半數(shù)抑制量IC5tl分別為 4. 181 士0. 37 μ g/ml 和 7. 74士0. 54 μ g/ml 圖 1 所示。3B11細胞是來源于惡性淋巴瘤的一株血管內(nèi)皮細胞，本有效部位對其有明顯的抑 制作用IC50 = 12. 83 μ g/ml。圖1所示。實施例3 合歡皮的有效部位對體外HMEC和3B11遷移的抑制作用分別取對數(shù)生長期HMEC和3B11細胞，用劃線灼傷法研究細胞遷移。將常規(guī)培養(yǎng) 的HMEC或3B11消化懸浮，以每孔6X IO4個細胞加到24孔板中，置37°C、5% CO2及飽和濕 度的培養(yǎng)箱中孵育24h，待細胞貼壁后用移液塑料槍頭于每孔中心位置劃一條Imm寬的灼 傷帶，然后用PBS洗去脫落細胞，并加入含不同藥物濃度的細胞培養(yǎng)基以及對照組。然后 在100X顯微鏡下拍照，此刻為Oh細胞遷移圖，接著在12h、24h、48h分別于同一視野處拍， 所得圖片用圖象軟件進行處理，測量灼傷帶距離，每個視野隨機取6個位點，所得數(shù)據(jù)進行 統(tǒng)計處理，并計算其遷移率[8、Eun-Sun H, Gun-Hee K. Allyl isothiocyanateinfIuences in vitro invasion, adhesion and gene expression in SK-Hepl cells. Journal of NutritionalBiochemistry, 2006,10 (4) :105_111.]。陰性對照組細胞的空白帶的寬度較 小，說明細胞遷移數(shù)量較高，而加入藥物加以干預(yù)后，細胞遷移數(shù)明顯減少。結(jié)果說明有效 部位有抑制內(nèi)皮細胞遷移的作用。它們可能通過抑制血管內(nèi)皮細胞的遷移而抑制新生血管 的生成。結(jié)果見圖2、3所示。實施例4 合歡皮的有效部位對體外HMEC和3B11成管的抑制作用參照文獻方法進行[9、ThaloorD, Singh AK, Sidhu GS, et al. Inhibition of angiogenic differenti-ation ofhuman umbilical vein endothelial cells by curcumin[J]. CellGrowth Diff, 1998,9 :305-312. 10> Zhou Q, Kiosses, WB, Liu J, et al. Tumor endothelial cell tube formation model for determining anti-angiogenic activity ofa tRNA synthetase cytokine [J] · 2008，44 :190_195]。于 4°C下在 24 孔培養(yǎng) 板的底部，加入150 μ L/孔Matrigel，鋪平合于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱30min。將藥物按不同濃 度與細胞懸液等體積混勻，每孔體積為200 μ 1總懸液，并設(shè)置對照組，370C ,5% CO2,4_16h， 在倒置顯微鏡下，每隔一段時間進行拍照。結(jié)果顯示此有效部位對HMEC-I和3B11細胞體 外Matrigel小管的形成均有明顯的抑制作用。結(jié)果見圖4、5所示。實施例5 合歡皮的有效部位對小鼠體內(nèi)H22實體瘤的抑制作用取對數(shù)生長期H22細胞，消化，用0. 9%生理鹽水稀釋調(diào)整濃度至鏡下瘤細胞 1 X IO7個/ml，將細胞懸液置于冰上，用Iml無菌注射器分別于每只小鼠右腋皮下接種 0. 2ml，整個過程在半小時內(nèi)完成。動物造模右腋下接種作為實體瘤小鼠。接種后的實體瘤 小鼠隨機分為四組，模型組及給藥高劑量組8mg/kg、中劑量組4mg/kg、低劑量組2mg/kg三 個劑量組，每組各10只。于24小時合準時給藥，灌胃1/日，連續(xù)10天。結(jié)果表明各劑量 組明顯抑制腫瘤生長，抑制率在30-70%之間，有明顯的量效關(guān)系。HE染色病理鏡下觀治 療組新生血管密度減少，有不同程度的壞死區(qū)。圖6、7所示。實施例6 合歡皮有效部位小鼠急性毒性
6
ICR小鼠，雌雄各半，體重18_25g。禁食4h后一次性灌胃給藥，給藥后再禁食2h， 連續(xù)觀察14d。6. 1近似致死量和最小致毒量的探究以臨床人用原藥的最大劑量為依據(jù)，折算有效部位含量，折算后相當(dāng)于小鼠用量 3. 75mg/kg，并以此量(3. 75mg/kg)高于其 4 倍(15mg/kg)、10 倍(37. 5mg/kg)、20 倍(75mg/ kg)、50 倍(187. 5mg/kg)、100 倍 375mg/kg)、200 倍(750mg/kg)、500 倍(1875mg/kg)、1000 倍(3750mg/kg)劑量分組給藥，每組動物3只，同時設(shè)生理鹽水對照組。隨劑量增至IOOmg/ kg時，出現(xiàn)毒性反應(yīng)。其一般表現(xiàn)輕度飲食減少、體重減輕。病理報告肝、腎均有輕度變 性樣損傷。4000mg/kg時出現(xiàn)小鼠死亡，尸解情況心、肺、肝、脾均有明顯淤血征，心肌松 弛，肺片狀出血，肝質(zhì)脆、邊緣變鈍、表面顆粒粗大，胃內(nèi)少量軟食糜，膀胱無充盈，其余肉眼 觀無明顯異常。病理報告心肌大片變性壞死灶，肝彌漫性損傷，脾淤血，腎小管上皮細胞變 性壞死，部分腸粘膜脫落。6. 2重要臟器形態(tài)學(xué)觀察小鼠灌胃14天時，脫頸致死，速取心、腦、肺、肝、脾、腎新鮮組織，于10%福爾馬林 固定，常規(guī)浸蠟包埋，5 μ m切片。切片脫水脫蠟，蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosir^HE)染 色。心淤血、變性、壞死。肺片狀出血。肝呈彌漫性變性損傷。脾淤血且有大量巨噬 細胞浸潤。腎腎小管上皮細胞水樣變性。圖8所示。本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng) 域技術(shù)人員能領(lǐng)會在公開的實施例中作許多改變也可獲得相同或類似的結(jié)果，而不超出本 發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍。更具體地說，顯然有些化學(xué)和生理性的相關(guān)試劑可替代本文所公 開的試劑而得到相同或類似的結(jié)果。所有類似的取代和修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然 都認為是本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思及權(quán)利要求范圍內(nèi)的，即所有上述這些等價形式都同 樣落于本發(fā)明的權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種權(quán)利要求合歡皮中具有抑制血管生成作用的一種高效低毒的有效部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有效部位，其特征是所述有效部位來源于合歡皮Albizzia Julibrissin Durazz0
3.權(quán)利要求1或2所述有效部位的提取方法，其特征是，用有機溶劑、含水有機溶劑或 水來提取合歡皮的干燥樹皮、莖皮、葉、花、種子、豆莢或根，并將提取液過濾、濃縮成浸膏。
4.權(quán)利要求1或2所述有效部位的制備方法，其特征是將權(quán)利要求3所得的浸膏經(jīng)水 飽和正丁醇萃取，收集有效部位，回收溶劑成浸膏，冷凍干燥制成干粉。
5.一種權(quán)利要求3，4所述的有效部位在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用，其特征是該 抑制血管生成藥物中含有有效劑量的幾種合歡皮有效部位和/或有效成分，以及常規(guī)藥用 載體和/或賦形劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物被制成注射液、片劑、粉劑、顆粒 劑、膠囊劑、口服液、膏劑、霜劑或乳劑等劑型。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是用于預(yù)防和/或治療至少一 種選自下述之一的疾病癌癥和/或癌癥轉(zhuǎn)移，血管瘤，血管纖維瘤，新生血管性青光眼，糖 尿病視網(wǎng)膜病變，早熟視網(wǎng)膜病及視網(wǎng)膜靜脈閉塞，視網(wǎng)膜變性，晶體后纖維組織增生，顆 粒性結(jié)膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黃斑和黃斑變性，牛皮癬，老年盤狀斑變性 及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，毛細管擴張，膿性肉芽腫，傷口愈合中抑制斑痕形成，動脈粥樣硬 化，脂溢性皮炎和痤瘡。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是該藥物有抗腫瘤血管生成及其它與血管生成 有關(guān)疾病治療、預(yù)防的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是該藥用組合物還有用于腫瘤化療和/或輔助 化療的用途。
10.一種權(quán)利要求3，4所述的一種有效部位體在制備抑制血管生成的保健食品中的應(yīng) 用，其特征是該有效部位用于抑制血管生成的保健食品組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及合歡皮中抑制血管生成的有效部位的制備方法及實際應(yīng)用。其制備方法為合歡皮用70％乙醇加熱提取，提取物經(jīng)水飽和正丁醇萃取，得到合歡皮中抑制血管生成的有效部位，其藥效較高且毒性較小。本發(fā)明以血管生成作為治療疾病的靶點，研究并闡明合歡皮有效部位的藥用療效和機制，為其新用途開發(fā)和發(fā)現(xiàn)藥物作用新的靶點提供科學(xué)依據(jù)和重要信息。本發(fā)明的有效部位可與藥學(xué)上適用載體混合制成各種制劑。它可用于治療或預(yù)防與血管生成相關(guān)的疾病，還可用于腫瘤化療和/或輔助化療方面的治療。
文檔編號A61K133/00GK102068485SQ20101057781
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者馮磊, 劉玲艷, 杜斌, 邱麗穎, 金堅, 錢建瑛 申請人:江南大學(xué)