專利名稱：一種靈芝孢子粉多糖指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靈芝孢子粉多糖的HPLC指紋圖譜的建立方法，本發(fā)明還涉及 由此方法所得到的靈芝孢子粉多糖標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。屬于中藥及其制品和功能食品原料及 其制品的指紋圖譜技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
靈芝是屬于真菌門，擔(dān)子菌綱，多孔菌科，靈芝科，靈芝屬的真菌。我國(guó)藥典 規(guī)定可入藥的靈芝有赤芝[GhflOifem^ Λ/c/bfen iLeyss.exFr. ) X^rt1.]和紫芝 QGanoderma sinemeZhao，XuetZhang^ ；國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局公布的可用于保健食品的靈芝品 禾中有赤芝、紫芝禾口松衫靈芝(.Ganodeima tsugae Murr)。靈芝孢子(Ganodeima Iucidum spore)是靈芝(一般為赤芝)成熟期從菌蓋彈射出來的極其微小的卵形生殖細(xì)胞，生物 學(xué)上稱孢子，集中起來后呈粉末狀，通稱靈芝孢子粉。靈芝孢子具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫 瘤、調(diào)節(jié)血脂、降血糖等多種生理功效，故在近年來其市場(chǎng)甚為火熱。但因缺乏科學(xué)全 面的檢測(cè)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，靈芝孢子粉及其加工產(chǎn)品的質(zhì)量良莠不齊，難以有效控制和 鑒別。目前已有靈芝孢子脂溶性成分指紋圖譜分析方法的專利，但尚無水溶性成分的指 紋圖譜分析方法的報(bào)道。已有的靈芝粗多糖含量的測(cè)定方法不能表征和鑒別靈芝孢子粉 樣品中多糖的實(shí)際質(zhì)量?jī)?yōu)劣。為此，本發(fā)明首次針對(duì)靈芝孢子粉的主要功效成分多糖類 物質(zhì)，采用超聲波輔助熱水浸提-部分酸水解-PMP柱前衍生反相HPLC法，對(duì)不同靈芝 孢子粉樣品中多糖進(jìn)行分析表征和比較，確定共有特征峰，利用色譜指紋圖譜專用軟件 建立靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明可為我國(guó)靈芝孢子粉的質(zhì)量檢測(cè)方法和質(zhì) 量標(biāo)準(zhǔn)的提升及完善提供科學(xué)依據(jù)與參考，從而促進(jìn)我國(guó)靈芝孢子粉類產(chǎn)品的質(zhì)量提高 和穩(wěn)定，更好地規(guī)范靈芝市場(chǎng)，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，造福于國(guó)人的身體健康。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈芝孢子粉多糖指紋圖譜的構(gòu)建方法，借此可將靈芝 孢子粉多糖指紋圖譜作為靈芝孢子粉類產(chǎn)品的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別的主要指標(biāo)之一。本 發(fā)明還同時(shí)提供了靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明的技術(shù)方案靈芝孢子粉多糖指紋圖譜的建立方法包括下列步驟
1.靈芝孢子粉多糖的提取對(duì)于破壁靈芝孢子粉樣品，采用下述方法(1)；對(duì)于未 破壁靈芝孢子粉，采用下述方法(2)。(1)準(zhǔn)確稱取破壁靈芝孢子粉樣品0.5 l.Og于50mL離心管中，加入30mL超純 水，于水浴60 80°C超聲30 60min(功率300瓦)，冷卻后離心，殘?jiān)蒙倭砍兯?滌并離心后，將兩次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超純水透析12小時(shí)， 50 60°C真空濃縮近干，加超純水溶解并定容至5mL作為粗多糖水溶液，待測(cè)?；?2)準(zhǔn)確稱取未破壁靈芝孢子粉樣品0.5 l.Og于50mL離心管中，加入30mL超純水，于90 95°C水浴振蕩恒溫浸提2 3小時(shí)，再于水浴60 80°C超聲30 60min (功率 300瓦)，以下操作同(1)。2、靈芝孢子粉多糖部分酸水解吸取100 μ L所得的粗多糖水溶液于5mL的具 塞刻度試管中，加入10(^1^的0.511101/]^三氟乙酸(TFA)，充風(fēng)封管，100°C水解Ih; 冷卻后打開蓋，真空干燥或用N2吹干，以去除TFA，再加200 μ L超純水溶解殘?jiān)?水解 產(chǎn)物)，備用。3、靈芝孢子粉多糖部分酸水解產(chǎn)物的PMP衍生化反應(yīng)操作取部分水解后的 超純水溶解的水解產(chǎn)物(或混合單糖標(biāo)液)100 μ L,加100 μ L 0.6Μ的NaOH溶液，混 勻。取其混合液50yL于5mL具塞試管中，再加50 μ L 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩 渦混勻，同樣在70°C的烘箱中反應(yīng)30 100 min,取出放置IOmin冷卻至室溫；力卩60 μ L 0.3mol/L的HCl中和，加超純水至lmL，再加等體積ImL的氯仿，振搖，靜置，棄去氯 仿相，重復(fù)萃取共3次。將水相用0.45 μ m微孔膜過濾后供HPLC進(jìn)樣分析。4、PMP衍生化產(chǎn)物的反相高效液相色譜分析其條件為色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18, 250mmX4.6 mm i.d., 5 μ m ；流動(dòng)相0.1 mol/L 磷酸鹽(pH 6.7)緩沖 液-乙腈(體積比為78 83 22 17)；柱溫20 35°C;檢測(cè)波長(zhǎng)245 254 nm ；流速 0.8-1 mL /min ；進(jìn)樣體積10 50 μ L。在此條件下分別進(jìn)樣分析單糖混合標(biāo)樣及樣品的 PMP衍生化產(chǎn)物，得到混合標(biāo)樣的色譜圖和靈芝孢子粉多糖的色譜指紋圖譜。以葡萄糖 峰為參照，計(jì)算標(biāo)樣和樣品中各峰的相對(duì)保留時(shí)間；根據(jù)標(biāo)樣和樣品的相對(duì)保留時(shí)間對(duì) 照定性靈芝孢子多糖樣品的相關(guān)色譜峰；并以峰面積歸一化法計(jì)算樣品圖譜各峰的相對(duì) 峰面積。5、標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立通過對(duì)15個(gè)不同產(chǎn)地的靈芝孢子粉樣品中多糖成分 水解產(chǎn)物的PMP衍生物的高效液相色譜圖進(jìn)行比較，確定共有特征峰，并將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo) 入指紋圖譜專用軟件得到由其共有特征峰構(gòu)成的靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準(zhǔn)色譜指紋圖譜。 待測(cè)樣品指紋圖譜可與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對(duì)比，區(qū)別其異同。共有特征峰有19個(gè)，它們的相對(duì)保留時(shí)間RT(以葡萄糖峰為參照)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn) 偏差RSD均小于2 % ；即
1號(hào)峰平均RT為0.468， 2號(hào)峰平均RT為0.490， 3號(hào)峰平均RT為0.508， 4號(hào)峰平均RT為0.523， 5號(hào)峰平均RT為0.544， 6號(hào)峰平均RT為0.577， 7號(hào)峰平均RT為0.603， 8號(hào)峰平均RT為0.647， 9號(hào)峰平均RT為0.669， 10號(hào)峰平均RT為0.725，
RSD 為 0.40% RSD 為 0.10% RSD 為 0.31% RSD 為 0.23% RSD 為 0.10% RSD 為 0.12% RSD 為 1.05% RSD 為 0.77% RSD 為 0.10% RSD 為 0.19% 11號(hào)峰平均RT為0.774，RSD為0.08% 12號(hào)峰平均RT為0.842，RSD為0.07% 13號(hào)峰平均RT為0.876，RSD為0.21%14 號(hào)峰平均 RT 為 0.912，RSD 為 0.08% ； 15號(hào)峰平均RT為1.000，RSD為0 ； 16號(hào)峰平均RT為1.131，RSD為0.06% 17號(hào)峰平均RT為1.215，RSD為0.09% 18號(hào)峰平均RT為1.256，RSD為0.09% 19號(hào)峰平均RT為1.482，RSD為0.07% 其中超過總峰面積5%的指紋峰有4個(gè)，分別為2號(hào)峰甘露糖，相對(duì)峰面積 5.12% 9.11%; 15號(hào)峰葡萄糖，相對(duì)峰面積20.94% 48.47% ； 16號(hào)峰半乳糖，相對(duì)峰面 積10.38% 54.41% ； 19號(hào)峰巖藻糖，相對(duì)峰面積5.19% 14.31%。靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如圖3所示。2號(hào)峰、7號(hào)峰、8號(hào)峰、10號(hào)峰、14號(hào)峰、15號(hào)峰、16號(hào)峰、17號(hào)峰、18號(hào)
峰、19號(hào)峰分別為甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半 乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖；這些糖均依據(jù)與靈芝孢子粉樣品分析同樣的色譜條件 下測(cè)定的單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的PMP衍生物的保留時(shí)間對(duì)照定性；單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的 PMP衍生化反應(yīng)操作同上所述，將“取部分水解后超純水溶解的水解產(chǎn)物”，改為“取單 糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液”，該單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各種單糖濃度均準(zhǔn)確配制為4mg/mL左右。本發(fā)明的有益效果
(1)大量的藥理和臨床研究結(jié)果表明靈芝孢子粉中的多糖類物質(zhì)是其重要的功效 成分，故用靈芝孢子粉的多糖成分作為監(jiān)控指標(biāo)具有代表性。而孢子粉中多糖是由多種 不同多糖組分構(gòu)成的混合物，它們的極性較強(qiáng)，結(jié)構(gòu)相近，呈多分散性，故難以像小分 子那樣可以高分辨、高選擇性地進(jìn)行直接色譜分離分析。本發(fā)明將靈芝孢子粉多糖部分 水解后在反相HPLC柱上分離，分離度和峰形均較好，因而可以有效地進(jìn)行指紋圖譜分 析?？筛鶕?jù)各個(gè)指紋特征峰的相對(duì)保留值、相對(duì)峰面積及相似度，從色譜的整體特征面 貌上把握靈芝孢子粉多糖的質(zhì)量情況及產(chǎn)地來源，為靈芝孢子粉的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別 提供一種科學(xué)的新方法。(2)因多糖的活性與其單糖組成、糖苷鍵連接方式、分枝狀況等一級(jí)結(jié)構(gòu)特征 有關(guān)，而在一定條件下，多糖的部分水解產(chǎn)物即單糖和寡糖碎片的種類及相對(duì)量均隨一 級(jí)結(jié)構(gòu)的不同而有所差異，故通過檢測(cè)靈芝孢子粉多糖的部分水解產(chǎn)物的HPLC指紋圖 譜，能有效地表征不同靈芝孢子粉樣品中的多糖的組成結(jié)構(gòu)及其生物活性的差異，因而 從一重要方面有效地表征靈芝孢子粉的質(zhì)量，從而彌補(bǔ)目前靈芝孢子粉產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 和檢測(cè)方法中，對(duì)于多糖僅測(cè)定粗多糖含量而無法鑒別其質(zhì)量?jī)?yōu)劣和真?zhèn)蔚膰?yán)重缺陷。(3)本發(fā)明將靈芝孢子粉多糖的部分水解產(chǎn)物進(jìn)行PMP衍生化反應(yīng)后上反相 HPLC分析，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，靈敏度較高，非糖類物質(zhì)干擾較小。本發(fā)明具有方法穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好，易于掌握的特點(diǎn)。作為一種生物 大分子的分析方法，避免了傳統(tǒng)方法因必須進(jìn)行多步分離純化和多種波譜手段分析而帶 來的耗時(shí)、費(fèi)力、成本高、無法快速檢測(cè)的缺陷。


圖1 12種單糖-PMP衍生物的HPLC圖譜圖2 15個(gè)產(chǎn)地孢子粉多糖的HPLC指紋圖譜 圖3靈芝孢子粉多糖的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜
圖4山東某產(chǎn)地破壁靈芝孢子粉樣品的多糖指紋圖譜。各峰保留時(shí)間(min)分別 為1 號(hào)峰-15.344; 2 號(hào)峰-16.142; 3 號(hào)峰-16.685 ； 4 號(hào)峰-17.164; 5 號(hào)峰-17.902 ； 6 號(hào)峰-18.998 ； 7 號(hào)峰-20.087 ； 8 號(hào)峰-21.368 ； 9 號(hào)峰-22.021 ； 10 號(hào)峰-23.949 ； 11 號(hào)峰-25.485; 12 號(hào)峰-27.751; 13 號(hào)峰-28.994; 14 號(hào)峰-30.008; 15 號(hào)峰-32.962; 16 號(hào)峰-37.295; 17 號(hào)峰-40.049; 18 號(hào)峰-41.387; 19 號(hào)峰-48.868。圖5吉林某產(chǎn)地未破壁靈芝孢子粉樣品的多糖指紋圖譜。各峰保留時(shí)間 (min)分別為1 號(hào)峰-15.464; 2 號(hào)峰-16.169; 3 號(hào)峰-16.737; 4 號(hào)峰-17.279; 5
號(hào)峰-17.977; 6 號(hào)峰-19.004; 7 號(hào)峰-19.616; 8 號(hào)峰-21.536; 9 號(hào)峰-22.086; 10 號(hào) 峰-23.828; 11 號(hào)峰-25.534; 12 號(hào)峰-27.779 ； 13 號(hào)峰-28.979; 14 號(hào)峰-30.092 ； 15 號(hào)峰-33.013; 16 號(hào)峰-37.369; 17 號(hào)峰-40.149 ； 18 號(hào)峰-41.407 ； 19 號(hào)峰-48.927。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非對(duì) 本發(fā)明的限制。實(shí)施例1、靈芝孢子粉多糖標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立方法 1、儀器、試劑及樣品
1.1儀器
安捷倫1100高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和安捷倫色譜工作站。1.2試劑及樣品
單糖標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖(Glc，99%)、甘露糖(Man，99 %),半乳糖(Gal, >99%)均購(gòu)于上海化學(xué)試劑公司；鼠李糖(Rha，>99%)、巖藻糖(Fuc，>99%)、 葡萄糖醛酸(GlcUA，>99%)、半乳糖醛酸(GalUA，>97%)均為美國(guó)Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品；木糖(Xyl，98%)、氨基葡萄糖(GlcN，98%)、氨基半乳糖(GalN， 99%)均為美國(guó)ACROS ORGANICS公司產(chǎn)品；核糖(Rib，> 99.0%)、阿拉伯糖 (Ara, 99%)均購(gòu)于廈門星隆達(dá)生化試劑有限公司。衍生化試劑:1_苯基_3_甲基-5-吡 唑琳酮(PMP)，純度99% (美國(guó)Acros Organics公司)；乙腈，HPLC級(jí)(美國(guó)Tedia公 司)；三氟乙酸(TFA)，純度不低于99% (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。水，超純 級(jí)；其它試劑均為分析純。靈芝孢子粉樣品15個(gè)批號(hào)分別采自山東、安徽、福建、吉林、湖北、廣東等 不同產(chǎn)地。2、靈芝孢子粉多糖的提取
準(zhǔn)確稱取破壁靈芝孢子粉樣品900mg于50mL離心管中，加入30mL超純水，于水浴 80°C超聲30min(功率300瓦)，冷卻后離心，殘?jiān)蒙倭砍兯礈觳㈦x心后，將兩次 上清液合并，超純水透析12小時(shí)，50°C真空濃縮后，加超純水定容至5mL作為粗多糖水 溶液，待測(cè)。3、靈芝孢子粉多糖部分酸水解吸取100 μ L所得的粗多糖水溶液于5mL的具塞刻度試管中，加入100 μ L的0.5mol/ L TFA,充N2封管，100°C水解Ih;冷卻后打開蓋，力Π 200 μ L甲醇后用N2吹干，如此重 復(fù)加甲醇并用N2吹3次，去除TFA，再加200 μ L超純水溶解殘?jiān)?水解產(chǎn)物)，備用。4、靈芝孢子粉多糖部分酸水解產(chǎn)物的PMP衍生化反應(yīng)操作
取水解后的樣品液(或混合單糖標(biāo)液)100 μ L，力卩100 μ L 0.6Μ的NaOH溶液，混 勻。取其混合液50yL于5mL具塞試管中，再加50 μ L 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩 渦混勻，同樣在70°C的烘箱中反應(yīng)30min，取出放置冷卻至室溫；力Π 60 μ L 0.3mol/L的 HCl中和，加超純水至lmL，再加等體積ImL的氯仿，振搖，靜置，棄去氯仿相，如此 萃取3次。將水相用0.45 μ m微孔膜過濾后供HPLC進(jìn)樣分析。5、PMP衍生化產(chǎn)物的反相高效液相色譜分析
色譜條件為色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18, 250mmX 4.6 mm i.d.，5 μ m ； 流動(dòng)相O.lmol/L磷酸鹽(pH6.7)緩沖液-乙腈(體積比為82 18)；柱溫30°C; 檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm;流速0.8mL/min;進(jìn)樣體積20 μ L。在此條件下分別進(jìn)樣分析 單糖混合標(biāo)樣及樣品的PMP衍生化產(chǎn)物，得到混合標(biāo)樣色譜圖和靈芝孢子粉多糖樣品的 指紋譜圖，見附圖2。以葡萄糖峰為參照，計(jì)算標(biāo)樣和樣品中各峰的相對(duì)保留時(shí)間；根 據(jù)標(biāo)樣和樣品的相對(duì)保留時(shí)間對(duì)照定性靈芝孢子粉多糖樣品的相關(guān)色譜峰；并以峰面積 歸一化法計(jì)算樣品圖譜各峰的相對(duì)峰面積。6、標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立及共有指紋峰特征
通過15個(gè)不同產(chǎn)地的靈芝孢子粉樣品中的多糖成分水解產(chǎn)物的PMP衍生物的高效液 相色譜測(cè)定，比較其色譜圖，確定共有特征峰19個(gè)，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RT (以葡萄 糖峰為參照)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于2%;其中超過總峰面積5%的指紋特征峰有4 個(gè)，分別為2號(hào)峰(甘露糖，相對(duì)峰面積5.12% 9.11%)、15號(hào)峰(葡萄糖，相對(duì)峰面 積20.94% 48.47%)、16號(hào)峰(半乳糖，相對(duì)峰面積10.38% 54.41%)及19號(hào)峰(巖藻 糖，相對(duì)峰面積5.19% 14.31%)。靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如圖3所示。15個(gè)不同產(chǎn)地的靈芝孢子粉樣品的共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積范圍見表 1。 表1靈芝孢子粉多糖部分酸水解產(chǎn)物的PMP衍生物 特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積范圍
權(quán)利要求
1. 一種靈芝孢子粉多糖指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于包括靈芝孢子粉多糖的 提取、靈芝孢子粉多糖的部分水解、靈芝孢子粉多糖部分水解產(chǎn)物的1-苯基-3-甲 基-5-吡唑琳酮PMP衍生化反應(yīng)、反相高效液相色譜的指紋分析及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確 定；步驟為(1)靈芝孢子粉多糖的提取(a)對(duì)于破壁靈芝孢子粉準(zhǔn)確稱取破壁靈芝孢子粉樣品0.5 l.Og于50mL離心管 中，加入30mL超純水，于水浴60 80°C功率300瓦超聲30 60min，冷卻后離心，殘?jiān)?少量超純水洗滌并離心后，將兩次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超純水 透析12小時(shí)，50 60°C真空濃縮近干，加超純水溶解并定容至5mL作為粗多糖水溶液， 待測(cè)；或(b)對(duì)于未破壁靈芝孢子粉準(zhǔn)確稱取未破壁靈芝孢子粉樣品0.5 l.Og于50mL離 心管中，加入30mL超純水，于90 95°C水浴振蕩恒溫浸提2 3小時(shí)，再于水浴60 80°C 功率300瓦超聲30 60min，以下操作同(a)；(2)靈芝孢子粉多糖的部分水解吸取100 μ L步驟(1)所得的粗多糖水溶液于5mL的具塞刻度試管中，加入100 μ L 的0.5mol/L三氟乙酸TFA，充風(fēng)封管，100°C水解Ih;冷卻后打開蓋，真空干燥或用N2 吹干，以去除TFA，再加200 μ L超純水溶解水解產(chǎn)物，備用；(3)靈芝孢子粉多糖部分水解產(chǎn)物的PMP衍生化反應(yīng)取步驟(2)部分水解后超純水溶解的水解產(chǎn)物100 μ L,加100 μ L 0.6Μ NaOH溶 液，混勻；取其混合液50 yL于5mL具塞試管中，再加等體積50 μ L的0.5 mol/L的PMP 甲醇溶液，漩渦混勻，在70°C的烘箱中反應(yīng)30 lOOmin，取出放置IOmin冷卻至室溫； 加60 μ L 0.3mol/L的HCl中和，加超純水至lmL，再加等體積ImL的氯仿，振搖，靜 置，棄去氯仿相，重復(fù)萃取共3次；將水相用0.45 μ m微孔膜過濾后供HPLC進(jìn)樣分析；(4)反相高效液相色譜的指紋分析反相高效液相色譜分析條件為色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mmX 4.6 mm i.d., 5 μ m ；流動(dòng)相pH 6.7的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液_乙腈，磷酸鹽緩沖液乙腈 體積比為78 83 22-17 ；柱溫20 35°C ；檢測(cè)波長(zhǎng)245 254 nm ；流速0.8 1 mL /min；進(jìn)樣體積10 50yL;在此條件下進(jìn)樣分析步驟(3)過濾后的PMP衍生化產(chǎn) 物，得到靈芝孢子粉多糖的高效液相色譜指紋圖譜；(5)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定通過15個(gè)不同產(chǎn)地的靈芝孢子粉樣品中的多糖水解產(chǎn)物的PMP衍生物的高效液相色 譜測(cè)定，比較其色譜圖，確定共有特征峰為19個(gè)；所述的19個(gè)共有特征峰以葡萄糖峰 為參照的相對(duì)保留時(shí)間RT的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于2 % ；即1號(hào)峰平均RT為0.468， 2號(hào)峰平均RT為0.490， 3號(hào)峰平均RT為0.508， 4號(hào)峰平均RT為0.523， 5號(hào)峰平均RT為0.544， 6號(hào)峰平均RT為0.577，RSD 為 0.40% RSD 為 0.10% RSD 為 0.31% RSD 為 0.23% RSD 為 0.10% RSD 為 0.12%7號(hào)峰平均RT為0.603，RSD為1.05% 8號(hào)峰平均RT為0.647，RSD為0.77% 9號(hào)峰平均RT為0.669，RSD為0.10%10號(hào)峰平均RT為0.725， 11號(hào)峰平均RT為0.774， 12號(hào)峰平均RT為0.842， 13號(hào)峰平均RT為0.876， 14號(hào)峰平均RT為0.912， 15號(hào)峰平均RT為1.000， 16號(hào)峰平均RT為1.131， 17號(hào)峰平均RT為1.215， 18號(hào)峰平均RT為1.256， 19號(hào)峰平均RT為1.482，RSD 為 0.19% RSD 為 0.08% RSD 為 0.07% RSD 為 0.21% RSD 為 0.08% RSD 為 0 ； RSD 為 0.06% RSD 為 0.09% RSD 為 0.09%其中超過總峰面積5 %的指紋峰有4個(gè)，RSD 為 0.07%分別為2號(hào)峰甘露糖，相對(duì)峰面積 5.12% 9.11%; 15號(hào)峰葡萄糖，相對(duì)峰面積20.94% 48.47% ； 16號(hào)峰半乳糖，相對(duì)峰面 積10.38% 54.41% ； 19號(hào)峰巖藻糖，相對(duì)峰面積5.19% 14.31%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈芝孢子粉多糖指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于2號(hào)峰、 7號(hào)峰、8號(hào)峰、10號(hào)峰、14號(hào)峰、15號(hào)峰、16號(hào)峰、17號(hào)峰、18號(hào)峰、19號(hào)峰分別對(duì) 應(yīng)為甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、 阿拉伯糖、巖藻糖；這些糖均依據(jù)如權(quán)利要求1步驟(4)所述與靈芝孢子粉樣品分析同 樣的色譜條件測(cè)定的單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的PMP衍生物的保留時(shí)間對(duì)照定性；單糖混合標(biāo) 準(zhǔn)溶液的PMP衍生化反應(yīng)操作同權(quán)利要求1步驟(3)所述，將“取步驟(2)部分水 解后超純水溶解的水解產(chǎn)物”改為“取單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液”，該單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各 種單糖濃度均配制為4mg/mL。
全文摘要
一種靈芝孢子粉多糖指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，屬于中藥及其制品和功能食品原料及其制品的指紋圖譜技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括靈芝孢子粉多糖的提取、靈芝多糖的部分水解、靈芝多糖部分水解產(chǎn)物的PMP衍生化反應(yīng)、反相HPLC指紋分析及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定。通過對(duì)15個(gè)不同產(chǎn)地的靈芝孢子粉樣品的多糖成分的HPLC分析及其指紋圖譜的比較，確定了其共有指紋特征，得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。指紋圖譜中共有峰19個(gè)，共有峰峰面積之和占總峰面積的98%，峰面積超過總峰面積5%的指紋峰4個(gè)。本方法穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握，能從色譜的整體特征面貌上把握靈芝孢子粉多糖質(zhì)量情況及產(chǎn)地來源，為靈芝孢子粉的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供了一種新的科學(xué)方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102008515SQ20101056118
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者戴軍, 朱松, 王浩豪, 陳尚衛(wèi) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)