胎菊毛細(xì)管電泳指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種胎菊毛細(xì)管電泳指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，包括水、醇兩種方法先后提取胎菊樣品制備供試品溶液，自制碳電極和銅電極作為檢測電極，選擇優(yōu)化毛細(xì)管電泳分析條件，測定供試品溶液，確定胎菊的指紋圖譜等步驟。本發(fā)明分析了10種來源于不同產(chǎn)地和批次胎菊產(chǎn)品的圖譜，通過相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法分析，確定了24個(gè)共有的特征峰，得到了標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明提取方法簡便，分析方法嚴(yán)謹(jǐn)，特征峰多，能全面的表達(dá)胎菊中活性成分的信息，可以作為胎菊質(zhì)量的有效表征。
【專利說明】胎菊毛細(xì)管電泳指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法，尤其是胎菊毛細(xì)管電泳指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。屬于中草藥物分析【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]中藥中含有多種化學(xué)成分，指紋圖譜技術(shù)能對(duì)中藥進(jìn)行整體、宏觀和全面的分析表達(dá)，已被公認(rèn)為天然藥物質(zhì)量控制最有效的方法之一。1996年，美國食品藥品管理局在制定的《FDA關(guān)于植物制品的指南》中，要求對(duì)植物原料、植物藥中間品和植物藥產(chǎn)品提供相應(yīng)的指紋圖譜。2000年，中國國家藥品監(jiān)督管理部門明確要求對(duì)新申報(bào)的中藥注射劑和已上市的中藥注射劑實(shí)行指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)。從中藥全面質(zhì)量控制的角度看，需要能有效地反映和控制中藥整體質(zhì)量的技術(shù)手段。
[0003]毛細(xì)管電泳技術(shù)分離效率高、使用試樣少，已被用于繪制指紋圖譜，為中藥的質(zhì)量鑒定提供準(zhǔn)繩。專利(ZL200810079790.1)利用毛細(xì)管電泳-紫外檢測技術(shù)為原產(chǎn)地人參建立了指紋圖譜。孫國祥等(色譜，2007年第I期)報(bào)道了毛細(xì)管電泳法建立金銀花的指紋圖譜。安培檢測法靈敏度高，選擇性強(qiáng)，檢測精確可靠。聯(lián)合使用毛細(xì)管電泳和安培檢測技術(shù)為中藥材建立相應(yīng)的指紋圖譜，可望成為控制中藥內(nèi)在質(zhì)量的有效方法。
[0004]胎菊是在菊花剛出現(xiàn)花骨朵的時(shí)候被摘下，烘干，消毒，選優(yōu)后制成，是菊花中最上品的一種。胎菊廣泛的產(chǎn)于我國的江蘇鹽城、浙江、福建等地，對(duì)中樞神經(jīng)有鎮(zhèn)靜作用，有解熱、增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抑菌等作用。胎菊中含有多種化學(xué)成分，主要包含有糖類、黃酮類活性成分、揮發(fā)油類和氨基酸等。目前尚無胎菊的國際推薦鑒別標(biāo)準(zhǔn)。王彬輝等(2011年浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)臨床藥學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編)綜述了菊花的指紋圖譜研究現(xiàn)狀，高效液相色譜法是經(jīng)典的指紋圖譜應(yīng)用技術(shù)，但其樣品前期處理，操作復(fù)雜，往往受到了光分析局限性的影響，提取物很難表達(dá)菊花的全貌信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種步驟簡單、操作便捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的毛細(xì)管電泳技術(shù)，建立胎菊指紋圖譜的構(gòu)建方法，并獲得胎菊的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0006]為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明的技術(shù)方式是依托如下關(guān)鍵點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的。
[0007]1、胎菊樣品采用水溶、醇溶兩步驟逐步提取，保證提取充分性，體現(xiàn)樣品的全貌。
[0008]2、采用毛細(xì)管電泳技術(shù)和自制的碳電極、銅電極聯(lián)用，組成雙檢測分離體系，確保分離度高、檢測限低、信息表達(dá)全面，彌補(bǔ)了現(xiàn)有質(zhì)量控制技術(shù)的不足，完善了胎菊的質(zhì)量控制的方法。
[0009]胎菊毛細(xì)管電泳指紋圖譜的構(gòu)建包括以下步驟。
[0010](I)供試品的制備:取胎菊樣品，粉碎后置于水溶液中，超聲，再在90°C下恒溫水浴30min，取出離心，過濾，上層清液作為供試品I備用；濾渣中加入乙醇溶液，超聲后，離心，過濾，上層清液作為供試品2備用。[0011](2)電極的制備:其包括銅、碳兩種電極的制作方法。
[0012]銅電極制作:廢棄銅絲用砂紙打磨，并將其置于去膠管的滴管中，用膠固定即得。
[0013]碳電極制作:用砂紙打磨0.3mm鉛筆芯和細(xì)銅絲，并將細(xì)銅絲纏繞在鉛筆芯上，用電烙鍍錫后，固定即得。
[0014](3)電泳條件:其包括步驟一中制得的兩種供試品的分離檢測條件。
[0015]供試品I的毛細(xì)管電泳分離檢測條件:緩沖液:pH9.24硼砂為分離緩沖液，
0.lmol/1氫氧化鈉為最佳檢測緩沖液；分離電壓:20kv ;檢測電極:自制的銅電極；檢測電位:0.67V ;進(jìn)樣時(shí)間:8s。
[0016]供試品2毛細(xì)管電泳分離檢測條件:運(yùn)行緩沖液:ρΗ11.25的硼砂一氫氧化鈉溶液；分離電壓:14kV ;檢測電極:自制的碳電極，檢測電位:0.95 V ;進(jìn)樣時(shí)間:8s。
[0017](4)指紋圖譜的構(gòu)建:按照前述的方法對(duì)10批不同產(chǎn)地和批次的胎菊進(jìn)行毛細(xì)管電泳圖譜分析，運(yùn)用相關(guān)系數(shù)和夾角余弦法，通過比較，以相對(duì)保留時(shí)間RSD相差小于5%為選擇標(biāo)準(zhǔn)，確定了 24個(gè)共有特征峰，其中供試品I中有12個(gè)共有特征峰(見圖1)，供試品2中有12個(gè)共有峰(見圖2)，這些特征峰反應(yīng)了胎菊的指紋特征，共同作為胎菊的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于以下幾個(gè)方面。
[0019]胎菊的預(yù)處理經(jīng)過了超聲輔助水解和超聲輔助醇解兩個(gè)步驟，有利于提取出胎菊中水溶性和脂溶性的全部物質(zhì)，體現(xiàn)了整體性。
[0020]針對(duì)胎菊中化合物的特性，采用自制的銅電極和碳電極兩種方式來檢測不同的提取液，有利于全面的表達(dá)胎菊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
[0021]銅電極檢測體系中，使用了不同的分離緩沖液和檢測緩沖液，既增加了分離效能，又同時(shí)提高了檢測靈敏度，突破了在毛細(xì)管去帶電泳技術(shù)中進(jìn)樣端和檢測端需實(shí)用同一緩沖液的限制。
[0022]本發(fā)明適用于胎菊品質(zhì)的鑒別與控制。
[0023]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1是供試品I的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；圖2是供試品2的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。圖中從左到右分別標(biāo)出了共有特征峰。
[0024]【具體實(shí)施方式】
實(shí)施案例
Cl)儀器與藥品:安培檢測器(美國BAS-3C)，毛細(xì)管(內(nèi)徑25μπι，河北永年)；胎菊10種，購于江蘇射陽、浙江和安徽等地；其他試劑均為分析純。
[0025](2)樣品預(yù)處理:精密稱取胎菊Ig粉碎于40ml水中溶解，用超聲波儀超聲30min后，再利用恒溫水浴槽在90°C下恒溫水浴30min，取出溶液，采用離心機(jī)離心頻率14800轉(zhuǎn)，時(shí)間2min，使用0.22 μ m濾膜過濾，上層清液作為供試品I備用；濾渣中加入95%的乙醇溶解后，超聲30min，再利用恒溫水浴槽在90°C下恒溫水浴30min，取出溶液，離心2min (頻率14800轉(zhuǎn))，0.22 μ m濾膜過濾，上層清液作為供試品2備用。
[0026](3)制作銅電極:用砂紙打磨廢棄銅絲，去除其表層的氧化物后置于去膠皮頭的滴管中，用萬能膠固定，并保證銅絲露在細(xì)管口外Icm左右。制成的電極以丙三醇為氧化對(duì)象，考察自制銅電極的效能。[0027](4)制作碳電極:用砂紙打磨0.3mm鉛筆芯，將打磨過的細(xì)銅絲纏繞在鉛筆芯上，用電烙鐵在銅絲上鍍錫，用萬能膠固定，并保證鉛芯露在細(xì)管口外Icm左右。制成的電極以苯酹為氧化對(duì)象，考察自制碳電極的效能。
[0028](5)分析檢測供試品1:緩沖液:pH9.24硼砂為分離緩沖液，0.lmol/1 NaOH為最佳檢測緩沖液；分離電壓:20kv ;檢測電極:銅電極；檢測電位:0.67V ;進(jìn)樣時(shí)間:8s。
[0029](6)分析檢測供試品2:運(yùn)行緩沖液:ρΗ11.25的硼砂一氫氧化鈉溶液；分離電壓:14kV ;檢測電極:碳電極,檢測電位:0.95 V ;進(jìn)樣時(shí)間:8s。
[0030](7)繪制胎菊指紋圖譜:按照上述方法，對(duì)10種不同產(chǎn)地和批次的胎菊建立了指紋圖譜，運(yùn)用相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法，通過分析比較，以相對(duì)保留時(shí)間RSD相差小于5%為選擇標(biāo)準(zhǔn)，確定24個(gè)共有特征峰。這些特征峰構(gòu)成了胎菊的指紋特征，可作為胎菊的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，如圖1、圖2所示。
【權(quán)利要求】
1.一種胎菊毛細(xì)管電泳指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其特征在于包括以下步驟: (1)供試品的制備取胎菊樣品，粉碎后置于水溶液中，超聲，再在90°C下恒溫水浴30min，取出離心，過濾，上層清液作為供試品I備用；濾渣中加入乙醇溶液，超聲后，離心，過濾，上層清液作為供試品2備用； (2)電極的制備銅電極制作:廢棄銅絲用砂紙打磨，并將其置于去膠皮帽的滴管中，用膠固定即得；碳電極制作:用砂紙打磨0.3mm鉛筆芯和細(xì)銅絲，并將細(xì)銅絲纏繞在鉛筆芯上，電烙鍍錫后，置于去膠皮帽的滴管中，膠固定即得； (3)毛細(xì)管電泳分析條件 ①供試品I的毛細(xì)管電泳分離檢測條件:緩沖液:pH9.24硼砂為分離緩沖液，0.1mol/l氫氧化鈉為最佳檢測緩沖液；分離電壓:20kv ;檢測電極:自制的銅電極；檢測電位:.0.67V ;進(jìn)樣時(shí)間:8s ； ②供試品2毛細(xì)管電泳分離檢測條件:運(yùn)行緩沖液:ρΗ11.25的硼砂一氫氧化鈉溶液；分離電壓:14kV ;檢測電極:自制的碳電極，檢測電位:0.95 V ;進(jìn)樣時(shí)間:8s ； (4)構(gòu)建指紋圖譜按照前述的方法分析10種來源于不同產(chǎn)地和批次的胎菊樣品，運(yùn)用相關(guān)系數(shù)和夾角余弦法，通過比較，以相對(duì)保留時(shí)間RSD相差小于5%為選擇標(biāo)準(zhǔn)，確定了24個(gè)共有特征峰，其中供試品I中有12個(gè)共有特征峰，供試品2中有12個(gè)共有特征峰，這些特征峰反應(yīng)了胎菊的指紋特征，共同作為胎菊的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
【文檔編號(hào)】G01N27/447GK103575793SQ201310510622
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月26日
【發(fā)明者】邢曉平, 劉愛祥, 李丹 申請人:鹽城工學(xué)院, 鹽城市瑞智生物技術(shù)有限公司