專利名稱：表兒茶素沒食子酸酯及其衍生物在治療或預防心肌梗塞等缺血性心臟病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然藥物和醫(yī)學領(lǐng)域，涉及了來源于茶葉中的一類天然化合物表兒茶 素沒食子酸酯及其衍生物在治療或預防心肌梗塞等缺血性心臟病中的用途。
背景技術(shù)：
缺血性心臟病(ischemic heart disease, IHD)是由于冠狀動脈循環(huán)改變引起冠 狀動脈血流和心肌需求之間不平衡而導致的心肌損害，是當今世界威脅人類生命健康的首 敵。IHD包括冠心病、心絞痛、心肌梗塞(myocardial infarction,MI)等，其中由于冠狀動 脈粥樣硬化引起的冠狀動脈狹窄和閉塞，約占IHD的90%。缺血性心臟病患者在美國有數(shù) 百萬之眾。在我國，隨著人民生活水平的提高，缺血性心臟病也日益成為威脅國人健康的 “第一殺手”。目前用于缺血性心臟病治療藥物的藥效原理為降低心臟的負荷，而對由于缺血/ 再灌注(ischemia/r印erfusion，I/R)而造成的心臟損傷沒有起到保護作用；同時，無論是 體外循環(huán)下心內(nèi)直視手術(shù)，還是急性心肌梗塞后的溶栓術(shù)以及冠狀動脈旁路移植術(shù)都必然 經(jīng)歷心肌I/R過程，導致心肌缺血/再灌注損傷。I/R損傷會加重心肌細胞壞死、凋亡、心肌 頓抑及無復流現(xiàn)象，成為影響預后的一個重要因素。I/R損傷造成的最常見的后果是心力衰 竭。如何避免這種對缺血性心臟病患者的“額外”傷害即二次傷害是醫(yī)學界一直探索的問 題。近些年來，作為一種I/R損傷的防治手段，缺血后適應(ischemic postconditioning, ΙΡ0)和缺血預適應(ischemic preconditioning, IPC)因其強大的潛在臨床應用價值，一 直是人們研究的熱點。其中IPO在臨床實施上則具有更好的可預測性及可控性，因此具有 很好的臨床應用前景。IPO的概念在2003年由Zhao等提出，為一種新的心肌保護概念。心肌IPO指心 肌缺血后，在長時間的再灌注之前，進行一次或數(shù)次短暫重復心肌缺血/再灌注，以啟動機 體內(nèi)源性的保護機制，減輕心肌缺血再灌注損傷。IPO保護心肌的過程實際上是心肌細胞 對繼發(fā)性損傷耐受性的適應過程，它可以減少再灌注心律失常，減少心肌梗死面積，改善缺 血后心肌功能，減少心肌能量消耗，延緩心肌超微結(jié)構(gòu)變化，減少血管內(nèi)皮損傷，使心臟功 能學主要指標得到顯著改善，從而達到保護心臟的作用。IPC的概念于1986年由Murry首 次提出。心肌IPC是指利用心臟短暫的缺血/再灌注來激發(fā)機體內(nèi)源性保護機制，進而心 臟對隨后較長時間的缺血產(chǎn)生耐受，延遲并減輕心肌的損傷，產(chǎn)生心肌保護作用。近年來的 研究發(fā)現(xiàn)，IPO和IPC可能的內(nèi)源性保護機制主要包括減少自由基產(chǎn)生；抑制細胞內(nèi)及線粒 體鈣超載；激活腺苷受體；誘導蛋白激酶〔(protein kinase C，PKC)激活，啟動心臟保護信 號通路；誘導線粒體ATP敏感的鉀通道(mitochondrial KATPchannel，mKATP)開放；降低ATP 消耗；抑制心肌細胞中線粒體細胞色素C釋放；降低了心肌細胞凋亡率等等。其中mKATP通 道可能是IPO和IPC保護心肌的最終效應器官。近年來，尋求藥物來誘導心肌自身保護能力的研究即藥理性后適應(pharmacological postconditioning)禾口I^iHt生預適IS (pharmacoIogicalpreconditioni ng)，特別是前者藥理性后適應的研究與應用已成為一種趨勢。有研究表明，腺苷受體激動 劑、PKC活性誘導劑、Katp通道開放劑能模擬出預適應保護作用。但用腺苷受體激動劑極易 產(chǎn)生耐受性，PKC活性誘導劑均有明顯的致癌性，Katp通道開放劑易產(chǎn)生多種不良反應等。 當前，許多制藥公司從正在尋求新的藥物靶點和新型藥物特別是有藥理性后適應的藥物， 用以防治由于缺血性心臟病所引起的心肌損傷，在對于缺血性心臟病的臨床應用將具有重 要的意義。在I/R損傷，除了使用藥物誘導產(chǎn)生IPO和IPC保護外。一旦在I/R損傷造成心 力衰竭后，還極有必要去開發(fā)一種對胞內(nèi)鈣濃度無影響但具有增強心肌收縮功能的新型心 臟藥物，以應用到冠心病的治療和預防之中，用于治療心肌梗塞或由于心肌梗塞所引起的 心臟I/R的二次損傷。茶葉作為世界上廣泛飲用的飲料，在中國已有飲用數(shù)千年的歷史，而在世界其它 國家飲用也有數(shù)百年的歷史，業(yè)已被中醫(yī)和西方科學認為是一種天然的、安全的、且有益于 健康的飲品。茶葉含有以多酚類物質(zhì)、咖啡堿和茶氨酸等為主的活性成分。其中多酚類物 質(zhì)占茶葉干重的10-40%。在茶鮮葉和綠茶中，多酚類物質(zhì)中80%以上為兒茶素類化合物， 主要包括表兒茶素沒食子酸酯(印iCatechin3-0-gallate，ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸 酯(印igallocatechin gal late, EGCG)、表沒食子兒茶素和表兒茶素，分別占兒茶素總量的 15%、50%、15%、10%。在紅茶中，多酚類主要為兒茶素的氧化產(chǎn)物茶黃素類和茶紅素類 化合物，以及一定量的兒茶素類化合物。，這些成分業(yè)已被證明與茶葉的預防心血管系統(tǒng)疾 病、防癌、防衰老、抗菌殺菌等功效有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
為了從天然活性成分中尋找一類具有治療或預防心肌梗塞等缺血性心臟病的藥 物，本發(fā)明公開了來源于茶葉中的表兒茶素沒食子酸酯及其衍生物具有治療或預防心肌梗 塞等缺血性心臟病的用途，這些成分有可能被開發(fā)成一類新型防治心臟病的藥物，通過后 適應可用于治療包括心肌梗塞在內(nèi)的缺血性心臟病患者的缺血再灌注損傷，又可用于治療 充血性心衰；還可通過預適應預防心肌梗塞病人愈后再次遭遇I/R損傷的風險。本發(fā)明為來源于茶葉中的一類天然化合物表沒食子兒茶素沒食子酸酯及其衍生 物在用于治療和(或)預防心肌梗塞等缺血性心臟病中的用途。其中所說的缺血性心臟病包括急性心肌梗塞，以及具有二次心肌梗塞風險的心肌梗塞。其中所說的缺血性心臟病包括充血性心衰、冠心病。其中所說的缺血性心臟病還包括在器官移植、中風和手術(shù)性缺血中所造成的心臟缺血。在心臟缺血后或者缺血前，表兒茶素沒食子酸酯及其衍生物均能夠減小心肌梗死 的面積和減少I/R引起的心臟損傷標志物乳酸脫氫酶的釋放，顯著改善左心室發(fā)展壓和左 室終末舒張壓；其對心肌保護作用的機制是與激活PKC ε和線粒體mKATP通道相關(guān)。在心臟 再灌注損傷中具有預適應和后適應的保護功能。本發(fā)明還包括用于防治缺血性心臟病的藥物組合，其特征在于其中包括表兒茶素沒食子酸酯以及藥用的賦型劑或載體。用于防治缺血性心臟病的藥物組合，其特征在于其中還包括以表兒茶素沒食子酸 酯為基本結(jié)構(gòu)，經(jīng)過適當結(jié)構(gòu)修飾所產(chǎn)生的衍生物，如茶黃素雙沒食子酸酯，EGCG, ECG或 EGCG的甲基化、乙?；蚱咸烟擒盏鹊妊苌?，以及這些衍生物藥用的賦型劑或載體本發(fā)明人經(jīng)過前期研究表明，來源于茶葉中兒茶素類物質(zhì)ECG通過激活PKC ε通 路增加心臟收縮的功能，且不增加胞內(nèi)鈣離子的濃度，此結(jié)果發(fā)表在American Journal of Physiology :heart and circulatory physiology, 2008, 294 (1) :H345_353。在本發(fā)明中的 研究進一步表明，ECG還能夠?qū)π呐K缺血/再灌注損傷產(chǎn)生保護作用。ECG產(chǎn)生上述保護作 用的機制是通過激活PKC ε后，打開線粒體mKATP通道以增強心肌收縮具有保護心臟缺血再 灌注所引起的損傷。本發(fā)明實驗研究結(jié)論本發(fā)明應用Langendorff體外離體大鼠心臟灌注系統(tǒng)，研究了 ECG前適應或后 適應對心臟缺血再灌注所引起損傷的保護作用。結(jié)果表明，無論是在缺血后還是缺血前， 使用ECG進行處理均能夠減小心肌梗死的面積和減少I/R引起的心臟損傷標志物乳酸脫 氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)的釋放,顯著改善左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure, LVDP)禾口左室終末舒張壓(leftventricular developed end-diastolic pressure，LVEDP)。而ECG這種降低心肌損傷的作用可被PKC ε的特異性 抑制劑 TIP (PKC^ translocation inhibitor peptide)和線粒體 ATP 敏感的鉀通道 mKATP 阻斷劑5-羥基癸酸(5-hydroxydecanoate，5-HD)所阻斷，說明ECG對心肌保護作用的機制 是與激活PKC ε和線粒體mKATP通道打開有關(guān)。因此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種源自茶葉的天然化 合物，它既有藥理性后適應作用，又有藥理性前適應功能。而且此化合物還可以增加心臟收 縮力的功能。據(jù)我們所知，這是至目前為止發(fā)現(xiàn)的既具有藥理性后適應功能又具有藥理性 前適應功能的唯一的一種化合物。因此，本發(fā)明的一個方面涉及來源于茶葉中的表兒茶素沒食子酸酯具有治療或預 防心肌梗塞等缺血性心臟病的用途。既可用于防治充血性心衰病人和冠心病病人的缺血再 灌注損傷，又可用于治療充血性心衰。本發(fā)明的另一方面涉及治療或預防心肌梗塞等缺血性心臟病的藥物，它包括作為 活性成分ECG經(jīng)修飾的ECG衍生物以及藥用的賦型劑或載體。作為一種治療心肌梗塞等缺血性心臟病的藥物，可以采用賦型劑或載體將ECG制 成針劑，在急性心肌梗塞診治中可以通過靜脈注射的方式對心臟缺血產(chǎn)生保護作用。并且， 還可以采用口服的方式進行缺血性心臟病的預防，特別是面臨二次心肌梗塞風險病人的預 防。作為一種治療或預防心肌梗塞等缺血性心臟病的藥物，可以以ECG的分子結(jié)構(gòu)為 基本結(jié)構(gòu)，經(jīng)過適當結(jié)構(gòu)修飾所產(chǎn)生的衍生物，如ECG和EGCG所產(chǎn)生的茶黃素雙沒食子酸 酯(theaflavin 3，3，-digallate，TF4)，EGCG、以及 EGCG 或 ECG 的甲基化、乙?；⑵咸烟?苷化等所產(chǎn)生的衍生物，并將它們用于治療或預防心肌梗塞等缺血性心臟病的藥物。本發(fā)明的有益效果ECG作為茶葉中來源的兒茶素類化合物中的一種，而茶葉中兒茶素類化合物中含 量最為豐富的EGCG。EGCG是近些年來清除自由基、抗癌、防治心血管疾病等研究中的“明
5星”化合物，由于ECG的抗氧化活性弱于EGCG，因此有關(guān)專門針對ECG的生物學活性研究甚 少。本發(fā)明不僅首次發(fā)現(xiàn)了 ECG及其衍生物不僅具有藥理性前適應功能，而且更具有藥理 性后適應功能，因此有可能作為一種治療或預防心肌梗塞等缺血性心臟病的新型藥物。這 是至目前為止發(fā)現(xiàn)的既具有藥理性后適應功能又具有藥理性前適應功能且能夠改善心臟 收縮力功能的唯一的一類化合物。ECG及其衍生物在臨床上不僅可以通過藥理性后適應用于充血性心臟病的治療， 而且還可以通過藥理性前適應應用于面臨二次心肌梗塞風險病人的預防性藥物治療。此外，本發(fā)明還為ECG及其衍生物的開發(fā)提供了新用途，有助于茶葉中天然成分 的綜合開發(fā)利用。


圖1為ECG及其衍生物的化學結(jié)構(gòu)圖。A，ECG及其衍生物；B，ECG的一種衍生物 茶黃素雙沒食子酸酯TF4。圖2為技術(shù)方案具體實施方式
設計圖。第1組，I/R對照組；第2、3、4組ECG預適 應的處理組；第5組ECG后適應處理組；第6組ECG預適應和TIP聯(lián)合處理 組；第7組ECG 預適應和5-HD聯(lián)合處理組。圖3為ECG預適應處理對心臟功能指標LVDP和LVEDP的影響。A，ECG預適應處 理對LVDP的影響；B，ECG預適應處理對LVEDP的影響。圖4為ECG對心臟LVDP影響的量效關(guān)系圖。 圖5為ECG預適應和后適應對心臟LDH釋放的影響。圖6為ECG預適應和后適應對心臟心肌梗死面積的影響。圖7為ECG后適應對心臟功能指標LVDP和LVEDP的影響。A，ECG后適應處理對 心臟收縮舒張影響的記錄圖；B，ECG后適應處理對LVDP的影響；C，ECG后適應處理對LVEDP 的影響。圖8為TIP或5-HD對ECG在LVDP恢復和LDH釋放作用上的阻斷作用。A，TIP或 5-HD聯(lián)合ECG預適應處理對心臟LVDP恢復的影響；B，TIP或5-HD聯(lián)合ECG預適應處理對 心臟LDH釋放的影響。
具體實施例方式實施例1 :ECG對心臟缺血/再灌注損傷的保護作用目的發(fā)明人前期研究表明，ECG具有激活PKC ε的功能并增加離體大鼠心肌收縮 力的作用。本發(fā)明在前期基礎(chǔ)上，利用Langendorff體外離體大鼠心臟灌注系統(tǒng)，研究ECG 在心臟缺血/再灌注中是否仍然具有激活PKC ε的功效，并檢測其在缺血再灌注損傷中是 否具有預適應和后適應的保護功能。材料和方法1)試劑PKC ε的特異性抑制劑TIP購自Calbiochem公司，線粒體ATP敏感的鉀 通道m(xù)KATP阻斷劑5-HD購自Sigma公司。2)實驗分組ECG的缺血/再灌注預適應和后適應的組別設計如圖2所示，分別作 為實驗處理組和對照組。每組為5 7只11 12周齡SD大鼠。
3) Langendorff體外大鼠心臟的缺血/再灌注大鼠腹腔注射2000USP的肝素 鈉30min后，再腹腔注射戊巴比妥鈉(60mg/Kg)。待大鼠完全昏迷后，進行外側(cè)胸部切口， 快速取出心臟，置于預冷的 Krebs-Henseleit (K-H，mmol · Γ1 :118NaCl，4. 7KC1,1. 3CaCl2, 0. 8MgS04,1. 2KH2P04,0. 3EGTA, 25. ONaHCO3,11. OD-Glucose)緩沖液中，再將心臟懸掛在 Langendorff灌流裝置上，以O2 CO2 (95 5)平衡的K-H緩沖液在37°C經(jīng)主動脈逆行灌 流，灌注壓維持在IOOmmHg左右。將連有一乳膠球(內(nèi)裝0. 2CC蒸餾水)的聚乙烯管經(jīng)二尖 瓣環(huán)插入左心室，并調(diào)節(jié)LVEDP在5mmHg左右。同時，心臟外加4. 5Hz刺激電極。用P23XL BectonDickinson壓力傳感器系統(tǒng)記錄心臟LVDP、左室壓發(fā)展速率(士dp/dtmax)曲線等。 待心臟穩(wěn)定20min后，再按照圖2的方法進行實驗操作，其中用停止K-H液灌注制造缺血模 型。4)檢測指標收集缺血后再灌注過程中前30min冠狀動脈流出液。當再灌注結(jié)束 后，取下心臟_20°C冰箱冷凍2h后，測定心肌梗死面積。冠狀動脈流出液中LDH的濃度利用 Sigma公司的試劑盒進行測定，心肌梗死面積用TTC染色法進行測量。5)統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)用mean士 SE表示。多組間的比較采用單因素方差分析(One-way AN0VA)并結(jié)合Tukey事后檢驗(Tukey post hoc test)，組間數(shù)據(jù)的比較采用Student，s t-檢驗。結(jié)果和討論1) ECG預適應處理對I/R損傷的保護作用在I/R損傷中，用ECG (500ng/ml)進行預適應處理后，主要的心功能指標如表1所 示。ECG進行預適應處理30min后的心臟與對照相比，LVDP得到顯著性恢復，幾乎恢復至I/ R前的正常值(如表1、圖3A、圖4所示)，而I/R損傷所造成的LVEDP升高也得到顯著性抑 制(如表1，圖3B所示)。同時，ECG預適應處理對心臟影響的量效關(guān)系如圖4所示，即使 ECG在低至lOng/ml時，I/R損傷所造成的LVDP也得到顯著性改善。表1表兒茶素沒食子酸酯(ECG)前適應和后適應處理對離體大鼠心臟在缺血再灌 注(I/R)過程中心臟收縮力的影響
權(quán)利要求
來源于茶葉中的一類天然化合物表兒茶素沒食子酸酯及其衍生物在用于治療或預防心肌梗塞等缺血性心臟病中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于其中所說的缺血性心臟病包括急性心肌梗 塞，以及具有二次心肌梗塞風險的心肌梗塞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于其中所說的缺血性心臟病包括充血性心 衰、冠心病。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于其中所說的缺血性心臟病還包括在器官移 植、中風和手術(shù)性缺血中所造成的心臟缺血。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于在心臟缺血后或者缺血前，表兒茶素沒食 子酸酯及其衍生物均能夠減小心肌梗死的面積和減少IR引起的心臟損傷標志物乳酸脫氫 酶(LDH)的釋放，顯著改善左心室發(fā)展壓(LVDP)和左室終術(shù)舒張壓(LVEDP)；其對心肌保 護作用的機制是與激活PKC ε和線粒體mKATP通道相關(guān)；在心臟缺血再灌注損傷中具有預適 應和后適應的保護功能。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，用于防治缺血性心臟病的藥物組合，其特征在于其中 包括表兒茶素沒食子酸酯以及藥用的賦型劑或載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，用于防治缺血性心臟病的藥物組合，其特征在于其中 還包括以表兒茶素沒食子酸酯為基本結(jié)構(gòu)，經(jīng)過適當結(jié)構(gòu)修飾所產(chǎn)生的衍生物，如茶黃素 雙沒食子酸酯，EGCG, ECG或EGCG的甲基化、乙?；蚱咸烟擒栈鹊妊苌?，以及這些衍 生物藥用的賦型劑或載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及來源于茶葉中的一類天然化合物表兒茶素沒食子酸酯及其衍生物在治療或預防心肌梗塞等缺血性心臟病中的用途，保護心臟免受缺血再灌注而引起的心肌損傷，是一種潛在的治療或預防心臟缺血/再灌注損傷的藥物。特別值得一提的是，該類化合物對心臟的保護作用新穎，還有不依賴于心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加而增強心肌收縮力的功能。本發(fā)明不僅首次發(fā)現(xiàn)了ECG及其衍生物具有藥理性前適應功能，而且更具有藥理性后適應功能，可能是一種治療或預防心肌梗塞等缺血性心臟病的新型藥物。它們在臨床上不僅可以通過藥理性后適應用于充血性心臟病的治療，而且還可以通過藥理性前適應應用于預防心肌梗塞病人愈后再次遭遇心肌梗塞風險的預防性藥物治療。
文檔編號A61P9/04GK101984965SQ201010558539
公開日2011年3月16日 申請日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月18日
發(fā)明者宛曉春, 李大祥, 楊昌軍, 謝子建 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學