專利名稱：多孔組織工程支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于材料加工制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多孔組織工程支架的制備方法。
背景技術(shù)：
組織工程支架起了引導(dǎo)細(xì)胞到預(yù)定位置、給工程化組織限定一定的空間的作用， 它不僅為特定的細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐作用，以抗擊壓力等外力，在體內(nèi)維持組織形狀和骨架 完整性，而且還起到一定的模板作用，為細(xì)胞提供附著場(chǎng)所，減少細(xì)胞失活，并能引導(dǎo)特殊 的細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)細(xì)胞間的相互作用；支架材料還能夠引導(dǎo)組織再生和控制組織結(jié)構(gòu)以及 可構(gòu)成宿主免疫系統(tǒng)分子的物理障礙，避免人體免疫反應(yīng)。將具有良好生物相容性和生物 降解吸收性能的生物材料制成具有特定形狀和孔結(jié)構(gòu)的三維多孔細(xì)胞支架是組織工程的 技術(shù)關(guān)鍵之一。組織工程支架一般應(yīng)具備以下要求(1)良好的生物相容性，即無明顯的細(xì)胞毒 性、炎癥反應(yīng)和免疫排斥；(2)良好的可生物降解吸收性，即在體外以及植入體內(nèi)后降解和 吸收的速度應(yīng)與細(xì)胞組織生長(zhǎng)的速度相匹配；(3)合適的孔尺寸、高孔隙率(一般要求孔隙 率50% -90% )和相互連通的孔壁結(jié)構(gòu)，以利于大量細(xì)胞的種植及細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)、細(xì)胞 外基質(zhì)的形成、氧和營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸、代謝物的排泄以及血管和神經(jīng)的內(nèi)生長(zhǎng)；(4)必須具 有足夠的力學(xué)強(qiáng)度，在組織工程研究與臨床應(yīng)用中不會(huì)塌陷，以在體內(nèi)生物力學(xué)微環(huán)境中 保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和完整性，并為植入細(xì)胞提高合適的微應(yīng)力環(huán)境；(5)高的表面積和適宜 的表面理化性質(zhì)以利于細(xì)胞粘附、增殖和分化以及負(fù)載生長(zhǎng)因子等生物信號(hào)分子；(7)由 于所用的材料與人體直接接觸，為了防止感染，材料還必須易于消毒。不同的組織或不同的解剖部位對(duì)細(xì)胞支架的形狀和結(jié)構(gòu)的要求不同，不同組織和 器官的細(xì)胞的形狀和大小不同，對(duì)支架要求也不同。在制備組織工程支架時(shí)，不但要考慮材 料的生物相容性、降解速度和力學(xué)性能，還要考慮支架的表面理化性質(zhì)和支架的表面積、孔 隙率以及孔尺寸等因素。支架的生物相容性取決于所用材料的生物相容性和支架的表面性 質(zhì)，支架的力學(xué)性質(zhì)和降解速率則由材料的分子量及其分布、組成、結(jié)晶性、親疏水性和支 架的孔隙率、孔尺寸、孔形態(tài)等因素決定，植入體內(nèi)后還與植入部位的微環(huán)境有關(guān)。其多孔 結(jié)構(gòu)和外形主要由支架制備方法決定，其表面理化性質(zhì)和形態(tài)則主要取決于所用材料的性 質(zhì)和制備方法，也可通過其它方法加以改進(jìn)。在組織工程中，支架往往要求具有多孔和開放的孔結(jié)構(gòu)，這樣有利于促進(jìn)細(xì)胞的 種植、粘附、增殖和分化、細(xì)胞外基質(zhì)的形成、血管化和組織在體內(nèi)的生長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備多孔組織工程支架的方法，采用該方法，脫模容 易，浙濾造孔劑粒子所用時(shí)間短，大大縮短了制作支架的時(shí)間，可以比較準(zhǔn)確地準(zhǔn)確控制支 架的孔隙率和大孔的尺寸，制備的多孔組織工程支架具有高孔隙率和相互連通的、開放的孔壁結(jié)構(gòu)。本發(fā)明多孔組織工程支架的制備方法如下稱取高分子生物材料，加入溶劑二 氯甲烷或三氯甲烷進(jìn)行溶解；然后加入造孔劑NaHCO3或Na2CO3的水合物粒子(NaHCO3或 Na2CO3的水合物粒子即含有1，7或10個(gè)水分子的Na2CO3或NaHCO3)或兩者的混合粒子并攪 拌均勻，再將混合物倒在平鋪的玻璃上，流延成膜，在半干狀態(tài)下將膜加入到模具中，壓制 成型；將成型的樣品通風(fēng)干燥；再將樣品用強(qiáng)酸浸泡，然后用去離子水水洗、浸泡，真空干 燥即得聚合物支架。所述的高分子生物材料包括所有能溶解于二氯甲烷或三氯甲烷的高分子生物 材料，包括但不限于聚乳酸(PLA)及其共聚物、聚乙醇酸(PGA)、聚(丙交酯-乙交酯) (PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、殼聚糖、膠原等中的一種或幾種。所述的高分子生物材料與二氯甲烷或三氯甲烷的用量比例為1. 0g/10ml。所述的NaHCO3或Na2CO3水合物粒子或兩者的混合粒子的添加量占高分子生物材 料和造孔劑的總質(zhì)量的30% -95%。所述的NaHCO3或Na2CO3或兩者的混合粒子的粒徑范圍0. 10-0. 45mm。所述的膜厚度為0. 1-0. 2mm。所述的半干狀態(tài)為溶劑的含量為最初的10% -30%。所述的強(qiáng)酸浸泡是指在1. 0-5. Omol/L鹽酸、硫酸、硝酸或醋酸中浸泡3_5小時(shí)。所述的成型樣品通風(fēng)干燥4-6小時(shí)；再用強(qiáng)酸浸泡3-5小時(shí)，然后用去離子水水洗 3次，再用去離子水浸泡12小時(shí)，每4小時(shí)換一次水；在40°C，-0. IMPa下干燥4_8小時(shí)真 空干燥即得聚合物支架。本發(fā)明的特點(diǎn)1、采用NaHCO3或Na2CO3的水合物作造孔劑，由于NaHCO3或Na2CO3的水合物顆粒 大，研磨時(shí)不分解，便于研磨，容易制得各粒徑范圍的造孔劑粒子，從而可通過控制造孔劑 粒子的粒徑范圍和添加量來控制支架中大孔的尺寸和支架的孔隙率。2、NaHCO3或Na2CO3的水合物易溶于水，可與強(qiáng)酸反應(yīng)而快速除去，從而大大加快 了浙濾造孔劑時(shí)間，大大縮短了制作支架的時(shí)間，而傳統(tǒng)的NaCl粒子浙濾需要3到5天時(shí) 間，本發(fā)明的浙濾時(shí)間只有15小時(shí)。3』&!10)3或Na2CO3的水合物與強(qiáng)酸反應(yīng)生成CO2，有利于形成開放的孔壁結(jié)構(gòu)，這 更有利于細(xì)胞的種植、粘附、增殖和分化、細(xì)胞外基質(zhì)的形成。4、將混合物流延成膜，干燥快，將半干的薄膜常溫壓制成型后，由于小量溶劑的存 在，有潤滑作用，有利于支架的脫模。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)脫模容易，浙濾造孔劑粒子所用時(shí)間短，大大縮短了制作支架的時(shí) 間(傳統(tǒng)的NaCl粒子浙濾需要3到5天時(shí)間，本發(fā)明的浙濾時(shí)間只有15小時(shí))，可以比較 準(zhǔn)確地控制支架的孔隙率和大孔的尺寸，孔隙均勻，無殘留物體，制備的多孔組織工程支架 具有高孔隙率和相互連通的、開放的孔墻結(jié)構(gòu)。


圖1為實(shí)施例1的P (LLA-CL) 75/25多孔泡沫支架外觀形貌圖；圖2為實(shí)施例1中NaHC03/Na2C03水合物的質(zhì)量百分比與支架孔隙率之間的關(guān)系圖；圖3為實(shí)施例1中以不同粒徑范圍的NaHC03/Na2C03顆粒作造孔劑制得的 P (LLA-CL) 75/25多孔泡沫支架外觀形貌圖；a. 0. 30-0. 45mm ；b. 0. 20-0. 30mm ；c. 0. 15-0. 20mm ；d. 0. 12-0. 15mm ；e. < 0. 125mm圖4為實(shí)施例2的PLGA支架橫斷面掃描電鏡形貌；圖5為實(shí)施例2的細(xì)胞與支架復(fù)合物的掃描電鏡圖；圖6為實(shí)施例3的PLGA/殼聚糖導(dǎo)管形貌圖；圖7為實(shí)施例3的PLGA/殼聚糖導(dǎo)管支架表面的掃描電鏡圖(a)200X ； (b)2000X ；圖8為實(shí)施例3的修復(fù)24周時(shí)的SD大鼠坐骨神經(jīng)斷裂帶再生照片。
具體實(shí)施例方式根據(jù)所制備的組織工程支架的形狀及要求不同，本發(fā)明可以有多種實(shí)施方案。通過下列實(shí)施實(shí)例可以更好的理解本發(fā)明，但這些實(shí)施實(shí)例并不是用來限制本發(fā) 明。實(shí)施例1聚(L-丙交酯-co-己內(nèi)酯)75/25 (P (LLA-CL) 75/25)多孔泡沫支架的制 備首先，用玻璃小瓶稱取P (LLA-CL) 75/25，溶入適量的二氯甲烷中。把NaHC03/Na2C03 水合物粒子研磨、篩分為不同直徑范圍的粒子。第二，把一定重量一定直徑范圍的NaHCO3/ Na2CO3水合物粒子加入聚合物溶液中，以超聲波振蕩攪拌均勻，再將其傾斜倒在干凈的玻璃 上，流延成膜，在半干狀態(tài)下將膜加入到模具中，壓制成型。第三，將樣品放置通風(fēng)櫥中，室 溫下干燥6小時(shí)。第四，樣品先用4. Omol/L鹽酸浸泡3小時(shí)，再用蒸餾水洗三次，然后用蒸 餾水浸泡12小時(shí)，每4小時(shí)換一次水，都是在室溫下進(jìn)行。第五，將樣品放在真空干燥箱中， 在40°C、_0. IMPa下干燥6小時(shí)。干燥后即得多孔支架，如圖1所示。以P (LLA-CL) 75/25為原料，造孔劑NaHC03/Na2C03水合物顆粒直徑都是 0. 125-0. 300mm，但造孔劑的質(zhì)量百分比(指造孔劑占聚合物和造孔劑質(zhì)量總和的百分比， 以下同)不同，制備多孔支架，支架孔隙率與造孔劑的質(zhì)量百分比之間的關(guān)系如圖2所示。 從圖上可以看出，支架的孔隙率隨著造孔劑與聚合物的質(zhì)量比增大而增大，幾乎成正關(guān)系， 當(dāng)造孔劑的質(zhì)量百分比增大到90%時(shí)，支架的孔隙率可達(dá)90%，但是當(dāng)造孔劑的質(zhì)量百分 比進(jìn)一步增大到95%時(shí)，支架的孔隙率為94%。以P (LLA-CL) 75/25為原料，以直徑范圍不同的NaHC03/Na2C03水合物顆粒作造孔 劑，而造孔劑占P (LLA-CL) 75/25和造孔劑總重量的質(zhì)量百分比均是90 %，制備多孔支架。 以不同粒徑范圍的NaHC03/Na2C03顆粒作造孔劑制得的支架的表面形貌掃描電鏡圖如圖3 所示。從圖3可看出，支架的多孔結(jié)構(gòu)相互連通，孔的尺寸隨著造孔劑尺寸的增大而增大。實(shí)施例2PLGA多孔泡沫支架的制備首先，用玻璃小瓶稱取PLGA，溶入適量的二氯甲烷中。把NaHC03/Na2C03水合物 粒子研磨、篩分為不同直徑范圍的粒子。第二，把直徑范圍為0. 125 0. 300mm的NaHCO3/ Na2CO3粒子加入聚合物溶液中，NaHC03/Na2C03粒子的添加量為占高分子材料和造孔劑總重 量的90%，以超聲波振蕩攪拌均勻，再將其傾斜倒在干凈的玻璃上，流延成膜，在半干狀態(tài)下將膜加入到模具中，壓制成型。第三，將樣品放置通風(fēng)櫥中，室溫下干燥6小時(shí)。第四，樣 品先用4. Omol/L鹽酸浸泡3小時(shí)，再用蒸餾水洗三次，然后用蒸餾水浸泡12小時(shí)，每4小 時(shí)換一次水，都是在室溫下進(jìn)行。第五，將樣品放在真空干燥箱中，在40°C、-0. IMPa下干燥 6小時(shí)。干燥后即得多孔支架，支架的孔隙率為89. 8%，大孔的范圍是100-300 μ m，如圖4。 將其用于人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)體外誘導(dǎo)成軟骨培養(yǎng)，培養(yǎng)2周時(shí)的細(xì)胞與支架復(fù) 合物的掃描電鏡圖如圖5，從圖上可以看出，復(fù)合物表面出現(xiàn)網(wǎng)狀白色組織，細(xì)胞分泌大量 細(xì)胞外基質(zhì)，表明細(xì)胞生長(zhǎng)活躍。實(shí)施例3多孔導(dǎo)管支架的制備第一，用玻璃小瓶分別稱取一定量的PLGA和殼聚糖，制成10%的二氯甲烷溶液。 PLGA與殼聚糖的質(zhì)量比為65/35。第二，把直徑范圍小于0. 125mm的NaHC03/Na2C03水合物 顆粒加入高分子溶液中，高分子材料與造孔劑的質(zhì)量比為4 6，攪拌均勻，再將其傾斜倒 在干凈的玻璃上，流延成膜，在半干狀態(tài)下將膜加入到模具中，壓制成型。第三，把樣品從模 具上取出，室溫下，在通風(fēng)櫥中干燥4h。第四，把樣品放入2. Omol/L鹽酸溶液中浸泡3h，再 換用去離子水浸泡12h，每4h換一次水。第五，放入真空干燥箱中，在40°C、_0. IMPa下干燥 4h即得聚合物導(dǎo)管支架，支架的孔隙率為58. 9%，大孔約50-100 μ m，如6和7。將其用于 SD大鼠坐骨神經(jīng)斷裂帶修復(fù)再生，修復(fù)24周時(shí)的SD大鼠坐骨神經(jīng)斷裂帶再生照片如圖8 所示，從圖可以看出，在結(jié)合點(diǎn)附近沒有出現(xiàn)導(dǎo)管的脫落，也沒有出現(xiàn)神經(jīng)瘤；結(jié)合處周圍 的肌肉組織顏色紅潤，沒有炎癥和壞死現(xiàn)象；坐骨神經(jīng)斷裂帶已再生。
權(quán)利要求
一種多孔組織工程支架的制備方法，其特征在于，稱取高分子生物材料，加入溶劑二氯甲烷或三氯甲烷進(jìn)行溶解；然后加入造孔劑NaHCO3或Na2CO3的水合物粒子或兩者的混合粒子并攪拌均勻，再將混合物倒在平鋪的玻璃上，流延成膜，在半干狀態(tài)下將膜加入到模具中，壓制成型；將成型的樣品通風(fēng)干燥；再將樣品用強(qiáng)酸浸泡，然后用去離子水水洗、浸泡，真空干燥即得聚合物支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述的高分子 生物材料包括所有能溶解于二氯甲烷或三氯甲烷的高分子生物材料，包括聚乳酸及其共 聚物、聚乙醇酸、聚(丙交酯_乙交酯)、聚己內(nèi)酯、殼聚糖、膠原中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多孔組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述的高分 子生物材料與二氯甲烷或三氯甲烷的用量比例為1. 0g/10ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述的NaHCO3 或Na2CO3水合物粒子或兩者的混合粒子的添加量占高分子生物材料和造孔劑的總質(zhì)量的 30% -95%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的多孔組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述的 NaHCO3或Na2CO3或兩者的混合粒子的粒徑范圍0. 10-0. 45mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述的膜厚度 為 0. 1-0. 2mm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述的半干狀 態(tài)為溶劑的含量為最初溶劑的10% -30%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述的強(qiáng)酸浸 泡是指在1. 0-5. Omol/L鹽酸、硫酸、硝酸或醋酸中浸泡3_5小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的多孔組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述的成型 樣品通風(fēng)干燥4-6小時(shí)；再用強(qiáng)酸浸泡3-5小時(shí)，然后用去離子水水洗3次，再用去離子水 浸泡12小時(shí)，每4小時(shí)換一次水；在40°C，-0. IMPa下干燥4_8小時(shí)真空干燥即得聚合物支^K O
全文摘要
本發(fā)明公開一種多孔組織工程支架的制備方法，該方法通過用NaHCO3/Na2CO3水合物粒子作造孔劑，將聚合物溶液/造孔劑粒子的混合物先流延成膜，在半干狀態(tài)下將膜加入到模具中，常溫下壓制成型，然后先用強(qiáng)酸浸泡，再用水瀝濾。采用該方法，脫模容易，瀝濾時(shí)間短，大大縮短了制作支架的時(shí)間，制備的支架具有相互連通的、開放的孔壁結(jié)構(gòu)，孔隙率和大孔尺寸可調(diào)控，通過設(shè)計(jì)模具，可制備形狀復(fù)雜的支架，可操作性強(qiáng)。
文檔編號(hào)A61L27/18GK101979103SQ20101052037
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者申雄軍, 阮建明 申請(qǐng)人:中南大學(xué)