專利名稱：α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，涉及中藥中抑制α-葡萄糖苷酶活性組分的篩選方法，另 外還涉及中藥提取物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病患者迅速增加且呈低齡化趨 勢(shì)，糖尿病(Diabetes mellitus，DM)已成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要慢性病之一。糖尿病 檢測(cè)的兩個(gè)重要指標(biāo)是空腹血糖水平和餐后血糖水平，流行病學(xué)研究表明，糖尿病發(fā)病過 程中最先出現(xiàn)的癥狀往往是餐后高血糖，而且餐后高血糖較空腹血糖更容易引發(fā)各種并發(fā) 癥，也是葡萄糖耐受受損病人發(fā)展為II型糖尿病的重要因素，因此控制餐后高血糖是預(yù)防 和治療糖尿病的重要措施。α -葡萄糖苷酶抑制劑(α -glucosidase inhibitors, α -GI)通 過抑制小腸刷狀緣上各種α “葡萄糖苷酶的活性，控制低聚糖和雙糖的水解，降低餐后血 糖濃度，減少高血糖對(duì)胰腺的刺激，提高胰島素受體敏感性，且不導(dǎo)致低血糖，因此α -葡 萄糖苷酶抑制劑多次被亞太地區(qū)糖尿病藥物指南推薦為降低餐后血糖的一線藥物；另外， α-葡萄糖苷酶抑制劑還可以治療病毒感染、腫瘤、溶酶體貯積癥、肥胖、高三酰甘油血脂 癥、肝炎等多種疾病。目前，應(yīng)用于臨床的α -葡萄糖苷酶抑制劑都是生物合成或半合成藥，種類少、價(jià) 格貴、副作用大。我國有著豐富的中藥資源和數(shù)量龐大的中藥品種和處方，如李時(shí)珍的《本 草綱目》中記載的治療消渴常用的中藥有140余種，我國申報(bào)注冊(cè)的抗糖尿病中成藥有近 40種。然而，藥理明確的抑制α-葡萄糖苷酶活性的先導(dǎo)物或藥物卻很有限。因此，從傳統(tǒng) 中藥中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑具有重要的研究價(jià)值。高通量篩選(High Throughout Screening，HTS)是新藥發(fā)現(xiàn)的重要步驟。通過篩 選，可以發(fā)現(xiàn)中藥中起治療作用的活性成分，明確中藥的作用靶點(diǎn)，是發(fā)展傳統(tǒng)醫(yī)藥、實(shí)現(xiàn) 中藥現(xiàn)代化，推動(dòng)新藥研究的有效途徑。目前，α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選方法主要有 對(duì)-硝基苯基-a -D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)法、葡萄糖氧化酶法和固定化酶法，但是大多采 用分光光度法作為檢測(cè)手段，試劑消耗大、重現(xiàn)性差，尤其對(duì)于復(fù)雜樣品或有色素干擾樣品 的篩選，假陽性高，有的甚至在體內(nèi)完全沒有活性。目前公開的關(guān)于α -葡萄糖苷酶抑制劑篩選的專利，普遍應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)行酶活 的測(cè)定；組分庫的建立上一般只針對(duì)某味中藥的單一溶劑提取部位。例如，陳群等(申請(qǐng)?zhí)?200810162970. 6)通過微波加熱法，將地榆經(jīng)水提取后進(jìn)一步脫蛋白、離心后從上清液中提取 得到了具有α -葡萄糖苷酶抑制活性的提取物；黃新立等(申請(qǐng)?zhí)?2125869. 4)將桑葉的水、 醇或水醇混合液提取物通過陰陽離子交換樹脂或大孔樹脂得到了 α-葡萄糖苷酶抑制劑；吳 慧平等(200710131472. 0)對(duì)夏枯草水提取及流浸膏進(jìn)行了 α -葡萄糖苷酶抑制活性的篩選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種α -葡萄糖苷酶抑制劑的篩選方法，方法簡單合理，易于操作，篩
3選出了具有顯著抑制效果的活性組分。本發(fā)明的另一目的是提供a-葡萄糖苷酶抑制劑的 應(yīng)用，將單個(gè)活性部位或多個(gè)活性部位組合應(yīng)用于以抑制a-葡萄糖苷酶為目的的藥品或 保健品的研發(fā)。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的采用的技術(shù)方案是a -葡萄糖苷酶抑制劑的篩選，具體 分三步
1)體外篩選模型的建立
建立a -葡萄糖苷酶和底物PNPG的體外反應(yīng)模型，應(yīng)用HPLC檢測(cè)水解產(chǎn)物PNP，通過 PNP的濃度變化，計(jì)算每個(gè)提取部位對(duì)a -葡萄糖苷酶的抑制率；
(2)組分庫的建立
選取一定數(shù)量的對(duì)糖尿病治療有顯著效果的中藥，根據(jù)“相似相容”原理，按照極性由 小到大，用多種2)溶劑對(duì)每味中藥進(jìn)行系統(tǒng)提取，采用這種方法，每味中藥獲得多個(gè)提 取部位，本發(fā)明優(yōu)選5種溶劑，分別是正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、水；
(3)篩選
將中藥的各個(gè)提取部位配成一定濃度的溶液，加入到反應(yīng)模型中反應(yīng)并計(jì)算抑制率； 由于不同中藥組分的抑制活性相差較大，對(duì)于抑制活性較高的組分，濃度稀釋后按照相同 的方法進(jìn)行復(fù)篩，直到篩選出抑制活性較高的活性部位；
本發(fā)明a-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用，所選中藥提取部位在制備對(duì)a-葡萄糖苷酶有 抑制效果的中藥或食品中的應(yīng)用；特別是在制備降低餐后血糖、治療或預(yù)防糖尿病及糖尿 病并發(fā)癥的藥物或食品中的應(yīng)用。所述a -葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用，所選中藥提取部位是指篩選得到的對(duì)a -葡 萄糖苷酶有顯著抑制效果的中藥提取部位是指地榆、肉桂、雞血藤、丁香、榧子、金蕎麥、西 青果、石榴皮、赤芍、鎖陽的水提取部位；中藥榧子、金蕎麥、五倍子、地榆、西青果、石榴皮、 雞血藤、肉桂、大黃、鬼箭羽的甲醇提取部位；中藥五倍子、肉桂、大黃、知母、雞血藤、桑枝、 赤芍、金石斛、山藥、鎖陽的乙酸乙酯提取部位；中藥大黃、五倍子、甘草、茯苓、牛膝、知母、 雞血藤、地骨皮、黃精、五爪龍的二氯甲烷提取部位；中藥五倍子、牛膝、牛蒡子、茯苓、甘草、 大黃、黃精、夏枯球、金蕎麥、玉竹的正己烷提取部位。所述制備對(duì)a-葡萄糖苷酶有顯著抑制效果的藥物，可以采用片劑、顆粒劑、膠 囊、口服液、滴丸、注射劑、氣霧劑等劑型，還可以采用現(xiàn)代醫(yī)藥界所公知的控釋或緩釋劑型 或納米制劑。本發(fā)明篩選方法簡單合理，易于操作，可以對(duì)中藥進(jìn)行a -葡萄糖苷酶抑制劑的 篩選，應(yīng)用HPLC建立了體外篩選a _葡萄糖苷酶抑制劑的模型，模型建立原理a _葡萄糖 苷酶為鍵專一性酶，能夠?qū)NPG水解為葡萄糖和PNP，如圖4所示，通過HPLC對(duì)產(chǎn)物PNP定 量分析，若中藥樣品對(duì)葡萄糖苷酶有抑制活性，產(chǎn)物PNP的量相應(yīng)減少，通過PNP的濃 度變化，計(jì)算樣品抑制率。最終篩選出對(duì)a-葡萄糖苷酶有顯著抑制效果的中藥和中藥組 分。另外本發(fā)明篩選出的中藥和中藥組分可用于以抑制a-葡萄糖苷酶為目的的產(chǎn)品的研 發(fā)，尤其可用于降糖藥物的開發(fā)，具有產(chǎn)業(yè)化意義。


圖1是本發(fā)明建立中藥組分庫系統(tǒng)提取流程4圖2是本發(fā)明PNPG和PNP的HPLC圖。圖3是本發(fā)明PNP的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過以下具體實(shí)施進(jìn)行詳細(xì)說明，但并不僅僅局限于以下實(shí)施例。1、a -葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選模型的建立
(1) a-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定實(shí)驗(yàn)在1.5 mL離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為160 U L 10 u L 0. 067 mol I71，pH 6. 8 的磷酸鹽緩沖溶液、30 u L 濃度 0. 2 U .mL-1 a -葡萄 糖苷酶，震蕩混勻，37 °C孵育20 min，加入40 y L濃度8. 0 mM PNPG開啟反應(yīng)，震蕩混勻， 37 °C反應(yīng)30 min后，加入80 yL濃度0. 2 M Na2C03終止反應(yīng)，加超純水稀釋至500 u L, 振蕩混勻，經(jīng)0.45 ym膜過濾后，用HPLC檢測(cè)，通過產(chǎn)物PNP的濃度變化，計(jì)算a -葡萄糖 苷酶的活性。a “葡萄糖苷酶水解底物PNPG的原理
oh
V
no2
發(fā)明以一定濃度的提取樣品代替磷酸鹽緩沖溶液，進(jìn)行抑制活性的測(cè)定；以相同濃度 的Acarbose代替磷酸鹽緩沖溶液為陽性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)底物PNPG易自發(fā)水解，因此 以等體積的緩沖溶液代替提取物和酶液為空白對(duì)照。抑制率的計(jì)算如下
抑制率(%)=^z^xloo%
A
式中，J為不加待測(cè)樣品時(shí)PNP的濃度(扣除相應(yīng)空白，mmoL/L) ^為加入待測(cè)樣品后 PNP的濃度(扣除相應(yīng)空白，mmoL/L)。(2) PNP 的 HPLC 檢測(cè)條件
色譜柱Sino Chrom 0DS-BP (5 um,4. 6 mmX250 mm);流動(dòng)相A 是乙腈，B 是含 0. 1% 甲酸的水溶液，梯度洗脫條件為0 8 min，20% 30% A ;8 13 min，30% 80% A;13 18 min, 80% 20% A ； 18 28 min, 20% A ；流速1. OmL mirT1 ；進(jìn)樣量20 u L ；柱溫常 溫；檢測(cè)波長314 nm。在上述檢測(cè)條件下，通過外標(biāo)法對(duì)照，確定pnp的保留時(shí)間為14. 467 min，如圖2所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精確稱取0.020 9 g PNP標(biāo)準(zhǔn)品，用磷酸鹽緩沖溶液超聲溶 解，定容于25 mL容量瓶中，配置成6 mmol/L的PNP母液，將母液稀釋成0.002 5、0. 005、 0. 01,0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 8 mmol/L。按照上述色譜條件測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為 縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖3所示，求得回歸方程為_7=197. 4x+0. 819 3，R2=0. 999 8， 說明PNP在0.002 5^0.8 mmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2、組分庫的建立
首先選擇50味對(duì)糖尿病的治療有顯著效果的中藥，見表1，依次選擇正己烷、二氯甲 烷、乙酸乙酯、甲醇和水5種溶劑對(duì)每味中藥進(jìn)行系統(tǒng)提取稱取中藥原料，烘干，粉碎，準(zhǔn)
ch3oh J—^0、
wr>
otr葡萄糖苷fc確稱量粉碎原料200 g，按照中藥溶劑(m:v)=l :4超聲提取1 h，濾紙過濾，浸膏用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀濃縮得中藥得取部位，浸渣用下一溶劑繼續(xù)提取，具體流程如圖1所示；
通過以上提取，每種中藥按照極性大小被截成5份，分別是正己烷提取部位、二氯甲烷 提取部位、乙酸乙酯提取部位、甲醇提取部位和水提取部位，由此建立了含有250個(gè)中藥提 取部位的組分庫。
3、水提取部位的篩選
將水提取部位配成64 mg mL—1水溶液，加入到反應(yīng)模型中反應(yīng)并計(jì)算抑制率，對(duì)抑制 率為100%的組分，稀釋10倍復(fù)篩，直到比較出每個(gè)組分的抑制率大小。按照這個(gè)篩選方案， 發(fā)明在樣品濃度0. 64 mg mr1下篩選出了抑制活性較強(qiáng)的10個(gè)組分地榆 > 肉桂 > 雞血 藤〉丁香〉榧子〉金蕎麥 > 西青果 > 石榴皮 > 赤芍 > 鎖陽 > 阿卡波糖。具體抑制活性如表 2所示
表2水提取部位對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制活性
水提取部分抑制濃度(mg.ml/1)抑制率(％)水提取部分抑制濃度(mg ml/1)抑制率(％)地榆0. 64100.00西青果0. 6495. 26肉桂0. 6499. 72石榴皮0. 6495. 19雞血藤0. 6499. 60赤芍0. 6475. 88丁香0. 6499. 05鎖陽0. 6474. 52榧子0. 6496. 84金蕎麥0. 6495. 36Acarbose0. 648. 73
4、甲醇提取部位的篩選
考慮到有機(jī)溶劑對(duì)a-葡萄糖苷酶活性的影響，將甲醇提取部位配成甲醇溶液，濃度 較水提取部位增加一倍(128 mg mL1)，取5 P L加入到反應(yīng)模型中；同時(shí)以5 u L甲醇代 替相同體積的磷酸鹽緩沖溶液為陰性對(duì)照，其余操作步驟同水提取部位的篩選。發(fā)明在樣 品濃度0. 64 mg mL"1下篩選出了抑制活性較強(qiáng)的10個(gè)組分榧子 > 金蕎麥 > 五倍子 > 地 榆 > 西青果 > 石榴皮 > 雞血藤 > 肉桂 > 大黃 > 鬼箭羽 > 阿卡波糖。具體抑制活性如表3所 示
表3甲醇提取部位對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制活性
甲醇提取部分抑制濃度(mg .MP1)抑制率(％)甲醇提取部分抑制濃度(mg .Mr1)抑制率(％)榧子0. 6499. 69雞血藤0. 6492.45金蕎麥0. 6499. 59肉桂0. 6490. 73五倍子0. 6493. 39大黃0. 6488. 37地榆0. 6493. 23鬼箭羽0. 6481. 28西青果0. 6492. 66石榴皮0. 6492.46Acarbose0. 648. 73
5、乙酸乙酯提取部位的篩選
丙酮和二甲基亞砜(DMS0)對(duì)提取物均有較好的溶解性，但丙酮對(duì)酶活性存在明顯的 抑制，發(fā)明選擇DMS0為溶劑，同時(shí)設(shè)置DMS0的陰性對(duì)照，具體操作步驟同甲醇提取物。發(fā) 明在樣品濃度0. 64 mg mL"1下篩選出了抑制活性較強(qiáng)的10個(gè)組分五倍子 > 肉桂 > 大黃 >知母 > 雞血藤 > 阿卡波糖 > 桑枝 > 赤芍 > 金石斛 > 山藥〉鎖陽。具體抑制活性如表4所 示
表4乙酸乙酯提取部位對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制活性
權(quán)利要求
α 葡萄糖苷酶抑制劑的篩選方法，其特征是篩選具體分三步(1)體外篩選模型的建立建立α 葡萄糖苷酶和底物PNPG的體外反應(yīng)模型，應(yīng)用HPLC檢測(cè)水解產(chǎn)物PNP，通過PNP的濃度變化，計(jì)算每個(gè)提取部位對(duì)α 葡萄糖苷酶的抑制率；(2)組分庫的建立選取一定數(shù)量的對(duì)糖尿病治療有顯著效果的中藥，根據(jù)“相似相容”原理，按照極性由小到大，用多種(≥2種)溶劑對(duì)每味中藥進(jìn)行系統(tǒng)提取，采用這種方法，每味中藥獲得多個(gè)提取部位；(3)篩選將中藥的各個(gè)提取部位配成一定濃度的溶液，加入到反應(yīng)模型中反應(yīng)并計(jì)算抑制率；由于不同中藥組分的抑制活性相差較大，對(duì)于抑制活性較高的組分，濃度稀釋后按照相同的方法進(jìn)行復(fù)篩，直到篩選出抑制活性較高的活性部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選方法，其特征是(2)組分庫的建 立用多種5種溶劑溶劑對(duì)每味中藥進(jìn)行系統(tǒng)提取，分別是正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲 醇、水。
3.α-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用，其特征是所選中藥的提取部位在制備以抑制α-葡 萄糖苷酶活性為目的的中藥或食品中的應(yīng)用。
4.α-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用，其特征是所選中藥提取部位在制備降低餐后血糖、 治療或預(yù)防糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的藥物或食品中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的α-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用，其特征是制備對(duì)α-葡 萄糖苷酶有抑制效果的藥物，采用片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、滴丸、注射劑、氣霧劑等劑 型，或控釋或緩釋劑型或納米制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的α-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用，其特征是篩選得到的對(duì) α -葡萄糖苷酶有顯著抑制效果的中藥提取部位是指地榆、肉桂、雞血藤、丁香、榧子、金蕎 麥、西青果、石榴皮、赤芍、鎖陽的水提取部位；中藥榧子、金蕎麥、五倍子、地榆、西青果、石 榴皮、雞血藤、肉桂、大黃、鬼箭羽的甲醇提取部位；中藥五倍子、肉桂、大黃、知母、雞血藤、 桑枝、赤芍、金石斛、山藥、鎖陽的乙酸乙酯提取部位；中藥大黃、五倍子、甘草、茯苓、牛膝、 知母、雞血藤、地骨皮、黃精、五爪龍的二氯甲烷提取部位；中藥五倍子、牛膝、牛蒡子、茯苓、 甘草、大黃、黃精、夏枯球、金蕎麥、玉竹的正己烷提取部位。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域。α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選方法，分三步(1)體外篩選模型的建立建立α-葡萄糖苷酶和底物PNPG的體外反應(yīng)模型；(2)組分庫的建立選取中藥，根據(jù)“相似相容”原理，按照極性由小到大，用多種(≥2種)溶劑對(duì)每味中藥進(jìn)行系統(tǒng)提取，采用這種方法，每味中藥獲得多個(gè)提取部位；(3)篩選將中藥的各個(gè)提取部位配成一定濃度的溶液，加入到反應(yīng)模型中反應(yīng)并計(jì)算抑制率。本發(fā)明篩選方法簡單合理，易于操作，最終篩選出對(duì)α-葡萄糖苷酶有顯著抑制效果的中藥和中藥組分。另外本發(fā)明篩選出的中藥和中藥組分可用于以抑制α-葡萄糖苷酶為目的的產(chǎn)品的研發(fā)，尤其可用于降糖藥物的開發(fā)，具有產(chǎn)業(yè)化意義。
文檔編號(hào)A61K36/486GK101975829SQ201010520030
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者付紹平, 朱文佳, 朱靖博, 許芹永 申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué)