專利名稱：人參二醇皂苷在制備與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
地塞米松(Dexamethasone，Dexa)等糖皮質(zhì)激素作用與副作用在藥理學(xué)教科書上 的記載(1)藥理學(xué)作用是Dexa具有抗炎、抗內(nèi)毒素、抑制免疫、抗休克及增強(qiáng)應(yīng)激反 應(yīng)等藥理作用，故廣泛應(yīng)用于各科治療多種疾病，如自身免疫性疾病，過敏，炎癥，哮 喘及皮膚科、眼科疾病等。近年來，地塞米松臨床用藥量逐年增加，至今我國(guó)已成為世 界上最大的地塞米松市場(chǎng)。(2)副作用的描述摘要如下①長(zhǎng)程或大量使用Dexa會(huì)發(fā)生 醫(yī)源性庫(kù)欣氏綜合征面容和體態(tài)、低血鉀綜合征，出血傾向；②創(chuàng)口愈合不良、骨質(zhì)疏 松以致發(fā)生股骨頭缺血性壞死，消化道應(yīng)激性出血等；③并發(fā)感染或陳舊性結(jié)核病灶復(fù) 發(fā)也是腎上腺皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)。地塞米松(Dexa)作為紫杉醇抗腫瘤作用的輔助藥已寫入藥物說明書在紫杉醇 注射液“用法用量”欄目中寫到《為了預(yù)防發(fā)生過敏反應(yīng)，在紫杉醇治療前12小時(shí)口 服地塞米松10mg，治療前6小時(shí)再口服地塞米松10mg，治療前30 60分鐘給予苯海拉 明肌注20mg》。Dexa作為紫杉醇和順鉬等的治療輔助藥已經(jīng)廣泛用于臨床的腫瘤治療 中，在預(yù)防患病機(jī)體對(duì)化療藥物的過敏和毒性反應(yīng)起到了重要的作用。從而使腫瘤的化 學(xué)治療能夠順利進(jìn)行。但是，糖皮質(zhì)激素所致的急性應(yīng)激性出血可引起危癥患者死亡并 成為隱形殺手。探索一種有糖皮質(zhì)激素樣作用，而無其副作用的藥物具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種人參二醇皂苷在制備與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合藥物中的應(yīng)用。目 的是揭示人參二醇皂苷PDS有Dexa樣作用的分子機(jī)制，為人參二醇皂苷開發(fā)成替代地塞 米松等糖皮質(zhì)激素的藥物提供理論依據(jù)。人參二醇皂苷在制備與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合藥物中的應(yīng)用。人參二醇皂苷(Panaxadiol Saponins, PDS)有地塞米松樣作用但無激素樣副作用
的實(shí)驗(yàn)研究(1)發(fā)現(xiàn)PDS有與Dexa樣的抗失血性休克作用，而無引起胃腸道應(yīng)激性出 血的副作用為揭示祖國(guó)醫(yī)學(xué)有關(guān)“人參湯有起死回生功效”的物質(zhì)基礎(chǔ)與機(jī)理，而做 了系列的研究，以Dexa為陽(yáng)性對(duì)照藥進(jìn)行了 PDS的抗失血休克作用的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，PDS有與Dexa類似的抗失血性休克作用，而無激素樣副作用。在實(shí)驗(yàn)中意外地 發(fā)現(xiàn)Dexa組犬在放血至平均動(dòng)脈壓下降至40mmHg后有2條犬(2/15)的平均血壓迅速 降至0，回輸全部血液后血壓仍然急劇下降而死亡，尸檢發(fā)現(xiàn)胃腸道充滿鮮血，診斷為胃 腸道應(yīng)激性潰瘍性出血。臨床上，在各種休克等危癥的搶救中，大量應(yīng)用Dexa時(shí)也會(huì)有 類似的意外發(fā)生，但無法與危癥引起的死亡鑒別，很難引起臨床專家們的重視。所以， 稱之為“隱形殺手”。為了進(jìn)一步肯定這種有意義的發(fā)現(xiàn)，我們又相繼完成了 PDS抗內(nèi) 毒素性休克、抗失血/內(nèi)毒素雙打擊的研究，其結(jié)果都證明人參二醇皂苷在抗各種休克的研究中，都顯示有優(yōu)于地塞米松類的作用。在用PDS與順鉬聯(lián)合抗前列腺癌移植瘤研究中，發(fā)現(xiàn)PDS有Dexa樣抗過敏和 減毒作用，但PDS組存活時(shí)間、脾臟指數(shù)和皮毛的光亮程度等均優(yōu)于Dexa組。特別是 Dexa和順鉬聯(lián)合用藥組小鼠在療程第13天以前全部死亡。因此，人參二醇皂苷在制備 與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合藥物中的應(yīng)用、闡明PDS有Dexa同樣作用的分子機(jī)制，對(duì)于開發(fā) PDS替代Dexa的新藥有重要意義。


圖1是熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)圖。圖中1.GRE-Iuciferase 與 Glucocorticoid Receptor 結(jié)合產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。2.加入Dexa后熒光強(qiáng)度增加36倍。3.加入PDS 25 μ g/ml熒光強(qiáng)度無影響。4.加入PDS 50 μ g/ml熒光強(qiáng)度增加5倍。5.加入PDS100 μ g/ml熒光強(qiáng)度增加12倍。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)例不同劑量PDS對(duì)糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄活性的影響。應(yīng)用糖皮質(zhì)激素受體反應(yīng)元件啟動(dòng)的報(bào)告基因(GRE-Luciferase)與糖皮質(zhì)激素 受體(Glucocorticoid Receptor)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞中。觀察在加入地塞米松后對(duì)糖皮質(zhì)激素 受體轉(zhuǎn)錄活性的影響；再用PDS取代地塞米松，觀察不同劑量PDS是否對(duì)糖皮質(zhì)激素受 體轉(zhuǎn)錄活性有影響，是否呈劑量依賴性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。材料與方法1.293細(xì)胞系，購(gòu)自美國(guó)ATCC。置含5 % (V/V)小牛血清及抗生素的RPMI 1640 (GIBCO BRL公司)培養(yǎng)液中，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.藥物人參莖葉二醇組皂苷(PDS)由吉林大學(xué)天然藥物研究室提供，是專利 (ZL 98100070.3)產(chǎn)品，使用時(shí)用生理鹽水或5%葡萄糖溶解；順鉬和地塞米松都是臨床
醫(yī)院藥房提供。3.熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法3.1將293細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度約為1 X IO5/孔，培養(yǎng)24小 時(shí)待細(xì)胞生長(zhǎng)到90%融合時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)?？偭繛?00ng/孔，包括 IOOng GRE-Luciferase/孔和200ng/孔糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)質(zhì)粒。所用的轉(zhuǎn)染試劑為 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 公司)，轉(zhuǎn)染 24 48 小時(shí)，分別加入Dexamethasone 或PDS
處理細(xì)胞。3.2Dexa組加Dexamethasone的濃度為100 μ mol/L,藥物處理后12小時(shí)后，收 集細(xì)胞，并按照 STRATAGENE 公司的 Luciferase Assay Kit Instruction manual 的要求進(jìn)行 Luciferase活性分析。3.3PDS 組分別加入 Ιμ 、2μ1, 4μ 1(25 μ g/ml, 50 μ g/ml, 100 μ g/ml)。藥物 處理12小時(shí)后，收集細(xì)胞，并按照STRATAGENE公司的Luciferase Assay Kit Instruction manual的要求進(jìn)行Luciferase活性分析。
結(jié)果結(jié)果如圖1所示，在糖皮質(zhì)激素受體反應(yīng)元件啟動(dòng)的報(bào)告基因(GRE-Luciferase) 與糖皮質(zhì)激素受體(GlucocorticoidReceptor)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，熒光強(qiáng)度很低。在加入地 塞米松(DexamethasonelOO μ mol/L)時(shí)，糖皮質(zhì)激素受體的轉(zhuǎn)錄活性增加36.5倍。在用 不同劑量PDS取代地塞米松時(shí)對(duì)糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄活性的影響如下①加入25 μ g/ml PDS時(shí)，對(duì)糖皮質(zhì)激素受體的轉(zhuǎn)錄活性沒有影響；②加入PDS為50 μ g/ml時(shí)糖皮質(zhì)激 素的轉(zhuǎn)錄活性增加5.5倍；③當(dāng)加入PDS為100 μ g/ml時(shí)糖皮質(zhì)激素的轉(zhuǎn)錄活性增加12 倍?？梢?，人參二醇皂苷與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，具有與地塞米松類似的生物學(xué)效應(yīng)， 并且表現(xiàn)為有明顯的劑量依賴關(guān)系。實(shí)驗(yàn)例PDS> Dexa與順鉬聯(lián)合用藥對(duì)小鼠移植瘤生長(zhǎng)與淋巴細(xì)胞功能的影響臨床上在用順鉬、紫三醇等抗腫瘤治療之前，常規(guī)地口服地塞米松用以預(yù)防機(jī) 體的過敏反應(yīng)。然而，地塞米松等糖皮質(zhì)激素的副作用，特別是對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用 會(huì)明顯減弱機(jī)體的抗擊腫瘤作用。PDS有與地塞米松等糖皮質(zhì)激素的受體結(jié)合的作用， 但無地塞米松樣副作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比觀察了 PDS和Dexa分別作為順鉬的輔助藥在抗小鼠 前列腺癌移植瘤中的作用與副作用。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性C57小鼠60只，體重18_20克，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院北京實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室繁殖與飼養(yǎng)。1.2鼠源性前列腺癌細(xì)胞株RM-I細(xì)胞移植前準(zhǔn)備培養(yǎng)在含10%小牛血清的 IMDM培養(yǎng)液中，置37°C，5% CO2濕化的培養(yǎng)箱中，待RM-I細(xì)胞長(zhǎng)至95%培養(yǎng)瓶時(shí)用 PBS沖洗培養(yǎng)瓶2次，加入0.125%胰酶消化，將消化好的細(xì)胞吸入離心管內(nèi)，950rpm/ min離心5min，棄上清，加入不含小牛血清的IMDM培養(yǎng)液，吸管吹打混勻(細(xì)胞計(jì) 數(shù))，再離心，棄上清，將RM-I細(xì)胞密度調(diào)至IXlO7Anl備用。1.3小鼠移植瘤模型的復(fù)制與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組1.3.1小鼠皮下移植瘤模型的復(fù)制取RM-I細(xì)胞IX 107ml，接種于小鼠背部近 前肢側(cè)皮下，每個(gè)接種點(diǎn)注射RM-I細(xì)胞0.1ml (IX IO6/點(diǎn))。觀察移植腫瘤成功率，每 隔2天測(cè)腫瘤的各徑線，記錄動(dòng)物的一般狀態(tài)。在腫瘤細(xì)胞體積長(zhǎng)至約2.5X3.0時(shí)，進(jìn) 行動(dòng)物分組。1.3.2動(dòng)物分組與給藥在接種RM-I細(xì)胞第7天的C57小鼠成瘤率高達(dá)100%， 腫瘤體積長(zhǎng)至11.7(2.5X32X0.52)mm3時(shí)隨機(jī)分成6組，每組10只。①模型組只給生 理鹽水lOOul，②順鉬組給以用生理鹽水稀釋的順鉬(1.5mg/kg)，③Dexa組只給以 Dexa 2.0mg/kg，④順鉬+Dexa 組(1.5mg/kg+2.0mg/kg)，⑤ PDS 組(12.5mg/kg)⑥順 鉬+PDS組(1.5mg/kg+12.5mg/kg)，以上各組，隔天腹腔注射給藥1次，療程為14d。末 次給藥后24h，麻醉下經(jīng)眼球采血處死動(dòng)物，稱量心、肝、脾、肺、腎及瘤重量，并計(jì)算 系數(shù)。1.3.3腫瘤體積與抑瘤率的計(jì)算①腫瘤體積的測(cè)量與計(jì)算用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮 下移植瘤長(zhǎng)短徑，按通用公式[V(mm3) =LX W2X0.52]計(jì)算腫瘤體積V。②計(jì)算抑瘤 率，抑瘤率[1-(實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)]X100%。③臟器系數(shù)，臟器系數(shù)％=臟器重量/體重X 100%。1.4MTT法檢測(cè)ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)性1.4.1脾細(xì)胞制備與細(xì)胞的前處理①滅菌條件下取各組小鼠脾臟，置于預(yù)先加 入5mlHank' S液的平皿-略傾斜放置)用鑷子將脾搗碎，并用紗布過濾細(xì)胞懸液除掉 組織塊，濾液移至離心管中，洗滌1次(lOOOr/min)，5分鐘。②用含10%小牛血清的 IMDM重新懸浮細(xì)胞，并取100 μ 1細(xì)胞懸液加入900 μ 1的細(xì)胞計(jì)數(shù)液中，顯微鏡下進(jìn)行 細(xì)胞計(jì)數(shù)。③用含10%小牛血清的IMDM將各組脾細(xì)胞細(xì)胞濃度調(diào)至5Χ 106/ml，加入 96孔培養(yǎng)板，100 μ 1細(xì)胞懸液/孔。④ConA儲(chǔ)備液的配制用1 XPBS配制成ConA含 量為200 μ 1/ml的儲(chǔ)備液；⑤取載有100 μ 1細(xì)胞懸液/孔的96孔培養(yǎng)板，每孔加入ConA IOOyl/孔，每組3復(fù)孔，另設(shè)3復(fù)孔只加培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組。⑥經(jīng)ConA處理的96 孔板置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)40-48h。1.4.2MTT比色法檢測(cè)并計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率①?gòu)呐囵B(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，每孔 加入MTTlO μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4h ；②1000r/min離心5分鐘，小心吸棄上清，再加入二甲基 亞楓100 μ 1/well,于微量震蕩器上緩慢作用lOmin。③在酶標(biāo)儀上于570nm處測(cè)光吸收 值(A)。④淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率計(jì)算如下所示
ConA刺激后W-對(duì)照空 U值
淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(％)=------------------------------------------
對(duì)照？U值1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料X士SD表示，采用SPSS Windows for 11軟件，單因素 方差分析，并進(jìn)行樣本均數(shù)的組間比較。2 結(jié)果2.1藥物對(duì)荷瘤小鼠生存率與一般狀況的影響2.1.1生存率各用藥組在給藥第14天，均未見死亡，生存率為100%。2.1.2順鉬+PDS組一般狀態(tài)明顯優(yōu)于順鉬+Dexa組用藥期間順鉬組，順鉬 +Dexa組，活動(dòng)量明顯減少，攝食量顯著下降，飲水減少，消瘦及皮毛無光等表現(xiàn)。但 是，順鉬+PDS組的活動(dòng)量，飲食及飲水量，皮毛的光亮程度均優(yōu)于好于順鉬組及順鉬 +Dexa 組。2.2小鼠體重變化百分?jǐn)?shù)與腫瘤指數(shù)的組間比較2.2.1單獨(dú)應(yīng)用Dexa和PDS對(duì)體重?zé)o明顯影響①在隔天應(yīng)用Dexa和PDS的情
況下，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的體重都呈正增長(zhǎng)，見表1。②單純應(yīng)用Dexa和PDS組的腫瘤重量與 模型組比較沒有顯著差異，證明無論Dexa，還是PDS單獨(dú)應(yīng)用對(duì)移植瘤都無治療作用， 見表2。2.2.2PDS作為順鉬的輔助藥優(yōu)于地塞米松①對(duì)于體重變化百分?jǐn)?shù)的影響(表 1) PDS順鉬組，實(shí)驗(yàn)前后動(dòng)物平均體重變化百分?jǐn)?shù)顯示減輕27%。而單用順鉬組和 Dexa順鉬組，實(shí)驗(yàn)前后動(dòng)物平均體重變化百分?jǐn)?shù)顯示分別減輕36%和39%。比較PDS順 鉬組和Dexa順鉬組可以清楚的看出，PDS可增加順鉬組的體重，改善機(jī)體的機(jī)能狀態(tài)， 而Dexa則無這種作用。②對(duì)腫瘤體積與重量的影響(表2所示)如表2所見，PDS順 鉬聯(lián)用組腫瘤體積明顯小于順鉬組和Dexa順鉬組。
表IPDS和Dexa與順鉬聯(lián)合用藥對(duì)移植瘤小鼠體重的影響
權(quán)利要求
1.人參二醇皂苷在制備與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合藥物中的應(yīng)用。
2.人參二醇皂苷與順鉬聯(lián)合應(yīng)用在抗腫瘤中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的人參二醇皂苷與順鉬聯(lián)合應(yīng)用在抗腫瘤中的應(yīng)用，其特征在 于人參二醇皂苷與順鉬的質(zhì)量比是25 3。
全文摘要
本發(fā)明涉及人參二醇皂苷在制備與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。人參二醇皂苷在制備與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合藥物中的應(yīng)用；人參二醇皂苷與順鉑聯(lián)合應(yīng)用在抗腫瘤中的應(yīng)用；在用PDS與順鉑聯(lián)合抗前列腺癌移植瘤研究中，發(fā)現(xiàn)PDS有Dexa樣抗過敏和減毒作用，但PDS組存活時(shí)間、脾臟指數(shù)和皮毛的光亮程度等均優(yōu)于Dexa組。特別是Dexa和順鉑聯(lián)合用藥組小鼠在療程第13天以前全部死亡。因此，闡明PDS有Dexa同樣作用的分子機(jī)制，對(duì)于開發(fā)PDS替代Dexa的新藥有重要意義。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102008493SQ201010520369
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者劉艷波, 孟艷, 張靈, 李揚(yáng), 李璐, 梁作文, 程金科, 趙丹, 趙麗娟, 趙雪儉 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)