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一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針及其制備方法

文檔序號:1185747閱讀:292來源:國知局
專利名稱:一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于熒光探針技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針 及其制備方法。
背景技術(shù)
目前,腫瘤已經(jīng)成為當(dāng)今世界危害人類健康的重大疾病,抗腫瘤藥物的研究越來 越受到人們的重視。近年來,隨著分子腫瘤學(xué)、分子藥理學(xué)的發(fā)展,腫瘤疾病的本質(zhì)已逐步 被揭示。在藥物研究中,氣相色譜、液相色譜以及紫外光譜是進(jìn)行藥物分析的基本技術(shù)。20 世紀(jì)70年代以來,特別是近年來相繼出現(xiàn)的各種靈敏度高的熒光分析法已有效地用于藥 物制劑以及生物體液中藥物的分析。如同步掃描熒光技術(shù)可用于違禁品中苯丙胺和嗎啡加 奎寧的測定;熒光偏振免疫分析法可用于血清中的慶大霉素、地答新、茶葉堿、戊巴比妥、苯 巴比妥等多種藥物的檢測,還可進(jìn)行燒傷患者體內(nèi)萘替米星的藥代動力學(xué)研究;特異性熒 光偏振免疫法可用來監(jiān)測腎移植后環(huán)孢素A的全血濃度;熒光猝滅法用來測定苦參堿和氧 化苦參堿的含量;固體表面熒光測定法用于血清中茶葉堿,以及其它多種抗菌藥、抗氣喘病 藥、抗驚風(fēng)病藥等的臨床熒光分析;電解熒光光度法測定片劑中卡馬西平的含量等等。其 中,熒光探針技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為借助熒光顯微鏡在分子水平上進(jìn)行實時檢測的重要手段。 這種技術(shù)靈敏度高,可視性強(qiáng),而且對研究的生物大分子或細(xì)胞干擾少,因此得到廣泛應(yīng) 用。分子熒光探針對金屬離子、生物小分子和生物大分子的響應(yīng),使得人們能夠用熒 光顯微鏡、熒光光譜,特別是熒光成像技術(shù)來實時檢測活細(xì)胞內(nèi)分子或離子濃度以及生物 大分子結(jié)構(gòu)的變化過程。其中,應(yīng)用綠色熒光蛋白(GFP)及其變體(如CFP、YEP等)或者小 分子熒光染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)探針在各種細(xì)胞事件的實時可視化及示蹤細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá) 和定位等方面已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。由于綠色熒光蛋白具有分子小、熒光穩(wěn)定、檢測方便、 對活細(xì)胞無傷害等優(yōu)點,因此用其對目的物進(jìn)行標(biāo)記,分析目的物在細(xì)胞中的變化情況,如 酶分子分布狀態(tài)、生物活性、受體、離子通道等變化,從而,在眾多的化合物中篩選出與體內(nèi) 信號分子功能相似的“潛力”化合物,這樣的方法簡便易行。因此綠色熒光蛋白作為一種熒 光探針成為了藥物篩選及藥物作用機(jī)制研究中的有力工具。實際上,許多藥物或具有藥物 活性的小分子自身都是受體的外源性配體。因此,它們也理所當(dāng)然地可被用作探針的配體 部分,從而對藥物在體內(nèi)的代謝過程進(jìn)行跟蹤,而且也可以通過實時成像技術(shù)來監(jiān)測病變 組織。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性及熒光特性的 雙功能探針的制備方法,該熒光探針可作為一種靶向工具分子,與腫瘤細(xì)胞直接作用,通過 其熒光性能的變化,進(jìn)行藥物作用機(jī)制和作用效果研究。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)—種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針,是在聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個或兩 個酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán);所述的聯(lián)苯衍生物Ta-dD的結(jié)構(gòu)式為
所述的熒光發(fā)色團(tuán)為香豆素類、吲哚類、羅丹明類或熒光素類,其結(jié)構(gòu)式分別為 香豆素類
COOH羅丹明類熒光素類其中,R1為羥基或氨基;R2為氫原子、甲基或乙基;R3為氯原子、溴原子或氟原子。所述的熒光發(fā)色團(tuán)是含有羥基的熒光發(fā)色團(tuán),通過碳原子數(shù)為2 6的直鏈烴基 與Ta-dD連接;或者是含有羧基的熒光發(fā)色團(tuán),通過?;cTa-dD連接或者是含有氨基的熒 光發(fā)色團(tuán),通過酰亞胺基與Ta-dD連接。所述在聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個或兩個酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán)得到的熒光探 針為 F-Ta-dD-OH、F-Ta_dD-NH2、F-Ta-dD-Rod、F-Ta-dD-Fluo 或 F-Ta-dD-indo。 所述的聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個酚羥基與熒光發(fā)色團(tuán)連接,另一個酚羥基與 2-氯-N-(3-氯-4-氟苯)乙酰胺連接。所述在聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán)得到的熒光探針為 F-Ta-dD-dOH 或 F-Ta-dD_dNH2。一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的制備方法,包括以下步驟a、聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成1) 3-羥基-4-甲氧基苯甲醛在鐵粉催化作用下,與液溴在醋酸緩沖液中反應(yīng)得到2-溴3-羥基-4-甲氧基苯甲醛;2)以氯化芐作為保護(hù)試劑,對2-溴3-羥基-4-甲氧基苯甲醛的酚羥基進(jìn)行保護(hù), 得到3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛;3)以過氧化氫-亞氯酸鈉體系作為氧化劑,將3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛 氧化得到3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸;4)先將3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸溶解在無水二氯甲烷中,通過酰化 反應(yīng)制成3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酰氯,然后再與甲胺水溶液反應(yīng)得到3-芐氧 基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺;5) 3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基_N_甲基甲酰胺通過UlImarm反應(yīng)制得芐基保護(hù)的 聯(lián)苯雙酰胺化合物6’ 6- 二芐氧基-5’ 5- 二甲氧基聯(lián)苯-2’ 2- 二 N-甲基甲酰胺;6)5,5’ - 二甲氧基_6,6’ - 二芐氧基聯(lián)苯_2,2’ - 二苯甲酰甲胺通過催化氫化脫 去芐基保護(hù)基,得到帶有兩個酚羥基的聯(lián)苯衍生物Ta-dD ;b、熒光發(fā)色團(tuán)衍生物的合成利用熒光發(fā)色團(tuán)中含有的羥基與二鹵代烷發(fā)生醚化反應(yīng),生成帶有鹵代直鏈烴的 熒光發(fā)色團(tuán)衍生物;或者利用熒光發(fā)色團(tuán)中含有的羧基發(fā)生酰氯化反應(yīng),生成帶有酰氯結(jié)構(gòu)的熒光發(fā) 色團(tuán)衍生物;或者利用熒光發(fā)色團(tuán)中含有的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng),生成帶有酰胺結(jié)構(gòu)的熒光發(fā) 色團(tuán)衍生物;C、熒光探針的合成向有機(jī)溶劑中按照聯(lián)苯衍生物Ta-dD:熒光發(fā)色團(tuán)衍生物無水碳酸鉀= 1 (1 2) (3 6)的摩爾比,首先加入聯(lián)苯衍生物Ta-dD和無水碳酸鉀,60 80°C充 分混合后,然后加入熒光發(fā)色團(tuán)衍生物,60 80°C回流充分反應(yīng);反應(yīng)完成后轉(zhuǎn)移到冰水 中,待固體完全析出后,抽濾,并將所得固體物干燥后,進(jìn)行硅膠柱層析,以乙酸乙酯和甲醇 的混合溶劑,或者乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑進(jìn)行洗脫,得到具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活 性的熒光探針。所述的二鹵代烷為碳原子個數(shù)為2 6的直鏈鹵代烴,兩個鹵原子分別連接于首 位碳原子上,含羥基的熒光發(fā)色團(tuán)與二鹵代烷的摩爾比為1 1;含羧基的熒光發(fā)色團(tuán)與氯化亞砜發(fā)生酰氯化反應(yīng),兩者的摩爾比為1 1;含氨基的熒光發(fā)色團(tuán)與氯乙酰氯發(fā)生酰胺化反應(yīng),兩者的摩爾比為1 1。所述的熒光發(fā)色團(tuán)衍生物為7-(2_溴乙氧基)-4_甲基香豆素、2-氯-N_(4-甲 基-2-氧雜-2-氫-苯并吡喃-7-基)-乙酰胺、2-氯-N-(5-氯-1-氫-吲哚-6-基)乙 酰胺、羅丹明B酰氯或熒光素酰氯;所述的有機(jī)溶劑為N,N- 二甲基甲酰胺或丙酮。所述的用于柱分離的洗脫溶劑,以體積比計,乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑為乙酸 乙酯甲醇=30 1 10 1,乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑為乙酸乙酯石油醚= 1 3。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明構(gòu)建的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針,以聯(lián)苯衍生物Ta-dD作為基礎(chǔ)分子結(jié)構(gòu),在其酚羥基上通過醚化或者酰胺化與熒光發(fā)色團(tuán)進(jìn)行連接;而由于聯(lián)苯衍 生物Ta-dD具有兩個酚羥基,那么其中的一個酚羥基連接熒光發(fā)色團(tuán),而另外一個酚羥基 還可以連接其他具有特定功能的分子結(jié)構(gòu)?,F(xiàn)有的熒光示蹤劑,以綠色熒光蛋白為例,僅僅作為一種報告基因,轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞 后,通過判斷腫瘤細(xì)胞熒光消失與否,來確定腫瘤細(xì)胞是否死亡,從而達(dá)到對抗癌藥物療效 的評價。而與現(xiàn)有的熒光示蹤劑相比,本發(fā)明公開的熒光探針既保持了對腫瘤細(xì)胞增殖抑 制活性,又具有一定的熒光性能。作為一種靶向工具分子,可與腫瘤細(xì)胞直接作用,通過其 熒光性能的變化,來進(jìn)行藥物作用機(jī)制和作用效果研究。聯(lián)苯衍生物Ta-dD和酚羥基連接的功能分子保持對腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性,而指 示性的熒光是由熒光發(fā)色團(tuán)發(fā)出的。在制備熒光探針的時候熒光發(fā)色團(tuán)是以熒光發(fā)色團(tuán)衍 生物的形式與聯(lián)苯衍生物Ta-dD的酚羥基醚化或者酰胺化,從而形成連接,這就要求熒光 發(fā)色團(tuán)具有活性的羥基、羧基或者氨基。聯(lián)苯衍生物Ta-dD是由本發(fā)明公開的方法合成, 熒光發(fā)色團(tuán)可以是合成的或者是購買的,具體可以為香豆素類、吲哚類、羅丹明類和熒光素 類。


圖1為熒光探針F-Ta-dD-OH的熒光吸收圖譜;圖2為熒光探針F-Ta-ClD-NH2的熒光吸收圖譜;圖3為熒光探針F-Ta-dD-dOH的熒光吸收圖譜;圖4為熒光探針F-Ta-dD-dNH2的熒光吸收圖譜;圖5為熒光探針F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD_NH2對乳腺腫瘤細(xì)胞細(xì)胞株MCF-7、 MDA-MB-231增殖抑制率直方圖;圖6為熒光探針F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD_NH2對乳腺腫瘤細(xì)胞細(xì)胞株ZR-75-30、 SK-BR-3增殖抑制率直方圖;圖7為熒光探針F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD_dNH2對乳腺腫瘤細(xì)胞胞株MCF-7、 MDA-MB-231增殖抑制率直方圖;圖8為熒光探針F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD_NH2對乳腺腫瘤細(xì)胞細(xì)胞株ZR-75-30、 SK-BR-3增殖抑制率直方圖。
具體實施例方式下面具體結(jié)合實例和其制備方法對具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的合 成、熒光性能及對乳腺腫瘤細(xì)胞不同細(xì)胞株增殖抑制作用,對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明, 所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明提供的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針,是在聯(lián)苯衍生物Ta-dD的
一個或兩個酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán),其結(jié)構(gòu)通式表示為 其中,熒光發(fā)色團(tuán)通過三種方式與Ta-dD連接,也即^\;\1\;\]~\選自以下三種 連接結(jié)構(gòu)1)碳原子數(shù)為2 6的直鏈烴基-(CH2)n-,n = 2、3、4、5、6 ;熒光發(fā)色團(tuán)的羥基通 過取代連接帶有鹵素取代的直鏈烴基,再與Ta-dD的酚羥基發(fā)生鹵素取代而連接,兩者形 成醚的結(jié)構(gòu);2)?;鵆 = 0,熒光發(fā)色團(tuán)的羧基生成酰氯結(jié)構(gòu),再與Ta-dD的酚羥基發(fā)生鹵素 取代而連接,兩者形成酯的結(jié)構(gòu);3)酰亞胺基-NH-C = 0,熒光發(fā)色團(tuán)的氨基生成酰胺結(jié)構(gòu),再與Ta_dD的酚羥基 發(fā)生取代而連接,兩者形成酰胺的結(jié)構(gòu)。實施例1具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的合成1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成,其合成路線圖如下 其具體的合成步驟為
①化合物2-溴3-羥基-4-甲氧基苯甲醛(中間產(chǎn)物2)的合成向裝有滴液漏斗、溫度計的三頸瓶中加入25g(0. 164mol)3-羥基-4-甲氧基苯甲 醛(化合物1)、26. 94g(0. 325mol)醋酸鈉及0. 75g (0. 015mol)鐵粉,用150mL冰醋酸溶解, 室溫攪拌30min ;將9mLBr2與40mL冰醋酸混合,滴入到上述混合液中,控溫23°C 25 V。 滴加完畢,將混合液室溫攪拌,TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程,3h后倒入冰水混合液中,繼續(xù)攪拌lh。靜 置后抽濾、洗滌沉淀,粗品用乙醇重結(jié)晶,得灰白色固體。產(chǎn)率為81%,m. p. 214 215°C。核磁1H NMR (300MHz, CDCl3) δ (ppm) :10. 26 (s,1H),7. 58 (d,J = 8·5Ηζ,1Η),
6.93 (d, J = 8. 5Hz,lH),6. 07(s,lH),4. 01(s,3H).紅外 FT-IR(KBr),υ /cm1 :3235,2890, 1669,1593.②化合物3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛(中間產(chǎn)物3)的合成將15. Og (0. 065mol) 2_溴3_羥基_4_甲氧基苯甲醛加入到250mL圓底燒 瓶中,用150mL無水乙醇溶解,加入27g(0. 196mol)無水K2C03。攪拌30min后,加入 11. 3mL(0. 098mol)氯化芐,回流攪拌4h。冷卻,蒸除部分溶劑(1/4 1/2體積)后,倒入 冰水混合物中,有黃色固體析出。靜置后抽濾、洗滌沉淀,粗品用乙醇重結(jié)晶,得淡黃色針狀 固體。產(chǎn)率 72%,m. ρ· 82 83°C。核磁IH NMR (300MHz, CDC13) δ (ppm) :10· 27 (s,1H),7· 76 (d,J = 8·4Ηζ,1Η),
7.54 7. 35(m,5H),6· 98 (d, J = 9. 2Hz, 1H),5. 03(s,2H),3· 96(s,3H).紅外 FT-IR(KBr), υ/cm-1 2940,2839,1626. 9,1713,1593.③化合物3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸(中間產(chǎn)物4)的合成20. 87g(0. 065mol)3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛加入到200mL四氫呋喃中, 再加入60mL蒸餾水和4. 68g(0. 039mol)NaH2PO4,混合液室溫攪拌IOmin后,向上述混合液 中緩慢滴加含19. 40g(0. 215mol) NaClO2的30% H2O2溶液。滴加完畢,室溫繼續(xù)攪拌3h后, 減壓蒸除四氫呋喃,殘渣用乙酸乙酯(150mLX2)萃取,萃取所得有機(jī)相再用水(50mLX3) 洗滌,然后再用2mOl/LNa0H(50mLX5)萃取,所得水相用鹽酸酸化,收集產(chǎn)生的固體。產(chǎn)率 78%, m. ρ· 172 173°C。核磁1H NMR (300MHz,CDCl3) δ (ppm) 7. 87 (d,J = 9. IHz,1H),7. 56 7. 37 (m,5H), 6. 93 (d, J = 9. 2Hz, 1H), 5. 03 (s, 1H), 3. 94(s,3H).紅外 FT-IR(KBr),υ /cm1 2940,2639, 1695.④化合物3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酰氯(中間產(chǎn)物5)的合成3. 37g(0. Olmol) 3-芐氧基_2_溴_4_甲氧基苯甲酸溶于60mL無水二氯甲烷中, 將3mL SOCl2溶于20mL無水二氯甲烷中,于20min內(nèi)滴加到上述混合液中。室溫攪拌4h, 蒸除溶劑后,得到液體產(chǎn)物。⑤化合物3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺(中間產(chǎn)物6)的合成50mL甲胺水溶液置于冰浴中冷卻,將步驟④合成的3_芐氧基_2_溴_4_甲氧基 苯甲酰氯溶于35mL無水二氯甲烷中,緩慢滴入甲胺水溶液中,滴加完后,冰浴攪拌,TLC監(jiān) 測反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢,產(chǎn)物用二氯甲烷稀釋,并依次用2mol/L HCl、H20、飽和Na2CO3、飽 和NaCl萃取,有機(jī)相用無水Na2SO4干燥。蒸除溶劑后,收集產(chǎn)生的白色固體。產(chǎn)率77%, m. ρ· 147 148°C。核磁1H NMR (300MHz, CDCl3) δ (ppm) :7· 55 (d, J = 7. OHz,1H),7. 37-7. 56 (m, 5H),6. 91 (d, J = 7. 2Ηζ,1Η),6· 13 (br, 1Η), 5. 01 (s, 2Η), 3. 89(s,3H),3. 00 (d, J = 4. 3Hz,3H). 紅外 FT-IR(KBr),υ /cm1 :3272,1635,1295,1029,977,695.⑥化合物6’ 6- 二芐氧基-5’ 5- 二甲氧基聯(lián)苯_2’ 2_ 二 N-甲基甲酰胺(中間產(chǎn) 物7)的合成22. 34g(0. 064mol) 3_芐氧基_2_溴_4_甲氧基-N-甲基甲酰胺溶于150mL干燥的 N,N- 二甲基甲酰胺中,加入40. 96g(0. 64mol)活化的銅粉,氮氣保護(hù)下,150 160°C,回流 4小時。待反應(yīng)液冷卻至室溫后,過濾,濾液傾倒入冰水中,收集產(chǎn)生的固體,干燥。粗品經(jīng) 硅膠柱分離,5cmX40cm色譜柱,石油醚裝柱。采用乙酸乙酯石油醚=1 3進(jìn)行洗脫,收 集產(chǎn)生的白色固體。產(chǎn)率62%,m.p. 174 175°C。核磁1HNMR(300MHz, CDCl3) δ (ppm) :7· 33(d, J = 8. 4Hz,2H),6· 94-7. 19 (m, 12H), 4. 82 (d, J = 10. 8Hz, 1H),4· 73 (d, J = 10. 9Hz, 1H),3. 87(s,6H),2· 65 (d, J = 4. 6Hz,6H). 紅外 FT-IR(KBr),υ /cm1 =3269,2935,1628,1561,1324,989.⑦taspine聯(lián)苯衍生物Ta_dD的合成10. 53g(0. 019mol)6,6_ 二芐氧基 _5,5_ 二甲氧基聯(lián)苯 _2,2-二 N-甲基甲酰胺 溶于300mL無水甲醇中,加入0. Ig 10%Pd/C作為催化劑。在H2氛圍下,室溫攪拌,TLC監(jiān) 測反應(yīng)進(jìn)程,直至無初始原料。過濾除去Pd/C,并反復(fù)用甲醇洗滌,收集濾液,蒸除溶劑,收 集產(chǎn)生的白色固體。產(chǎn)率93%,m. p. 143 144°C。核磁1HNMR(300MHz, CDCl3) δ (ppm) :7. 16 (d,J = 8. 5Hz,2H),6. 89 (d,J = 8. 4Hz, 2H),3. 92(s,6H),2. 74(d,J = 4. 2Hz,6H).紅夕卜 FT-IR(KBr),u/cm—1 :3370,3114,1622, 1552,1479,1276,1230,1019.在上述合成方法中,所述TLC監(jiān)測所用溶劑為石油醚、乙酸乙酯、甲醇或三氯甲焼。2)熒光發(fā)色團(tuán)及其衍生物的合成根據(jù)熒光發(fā)色團(tuán)種類及活性位點不同,選取不同鏈接結(jié)構(gòu),采用不同方法進(jìn)行合 成。①熒光發(fā)色衍生物含碳鏈結(jié)構(gòu)的合成向無水丙酮中,加入含活性羥基的熒光發(fā)色團(tuán)、無水K2CO3,加熱至回流后,加入二 鹵代烷,其中含活性羥基的熒光發(fā)色團(tuán)無水K2CO3:二鹵代烷的反應(yīng)摩爾比為1 3 1.2。 繼續(xù)回流攪拌12h,倒入冰水中,待固體完全析出,抽濾,干燥。干燥所得粗品進(jìn)行柱分離得 到帶有鹵代直鏈烴的熒光發(fā)色團(tuán)衍生物。②熒光發(fā)色衍生物含酰氯結(jié)構(gòu)的合成向無水二氯甲烷中,加入含活性羧基的熒光發(fā)色團(tuán),將其置于冰浴中冷卻待用。與 熒光發(fā)色團(tuán)摩爾比為1 1的氯化亞砜溶于適量的無水二氯甲烷中,于20min內(nèi)滴加到上 述混合液中。室溫攪拌4h,蒸除溶劑后,得帶有酰氯結(jié)構(gòu)的熒光發(fā)色團(tuán)衍生物。③熒光發(fā)色衍生物含酰胺結(jié)構(gòu)的合成向無水二氯甲烷中,加入含活性氨基的熒光發(fā)色團(tuán),將其置于冰浴中冷卻待用。與 熒光發(fā)色團(tuán)摩爾比為1 1的氯乙酰氯溶于適量的無水二氯甲烷中,緩慢滴入上述冷卻液 中。滴完后,冰浴攪拌,TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢,產(chǎn)物用二氯甲烷稀釋,并依次用2mol/ L HC1、H20、飽和Na2CO3、飽和NaCl萃取,有機(jī)相用無水Na2SO4干燥。蒸除溶劑后,收集產(chǎn)生的灰白色固體,得到帶有酰胺結(jié)構(gòu)的熒光發(fā)色團(tuán)衍生物。3)功能性探針化合物的合成向有機(jī)溶劑中按照聯(lián)苯衍生物Ta-dD:熒光發(fā)色團(tuán)衍生物無水碳酸鉀= 1 (1 3) (3 6)的摩爾比,首先加入聯(lián)苯衍生物Ta-dD和無水碳酸鉀,60 80°C充 分混合后,然后加入熒光發(fā)色團(tuán)衍生物,60 80°C回流充分反應(yīng);反應(yīng)完成后轉(zhuǎn)移到冰水 中,待固體完全析出后,抽濾,并將所得固體物干燥后,進(jìn)行硅膠柱層析(53 75 μ m的柱層 析硅膠),以乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑,或者乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑進(jìn)行洗脫,得 到具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針。實施例2香豆素型功能性探針化合物F-Ta-dD-OH的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為香豆素 類結(jié)構(gòu),其中R1為0H,R2為CH3 ;熒光發(fā)色團(tuán)通過碳原子為2的直鏈烷烴與Ta-dD連接)1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成與實施例1相同。2)熒光發(fā)色團(tuán)7-羥基-4-甲基香豆素的合成步驟如下 5. 5g (0. 05mol)間苯二酚溶于50mL濃硫酸中,待完全溶解后,緩慢滴入 6. 4mL(0. 05mol)乙酰乙酸乙酯,室溫攪拌30min,然后轉(zhuǎn)移冰水中,抽濾收集形成的固體。 粗品用95%乙醇重結(jié)晶,得白色針狀晶體。產(chǎn)率85%,m. p. 184 185°C。3)熒光發(fā)色團(tuán)衍生物7-(2-溴乙氧基)-4-甲基香豆素的合成,合成步驟如下 3. 53g(0. 02mol)7-羥基-4-甲基香豆素溶于 50mL 丙酮中,加入 8. 34g(0. 06mol) 無水K2CO3,60°C回流30min后,加入3mL(0. 03mol) 1,2- 二溴乙烷,繼續(xù)回流攪拌12h,倒 入冰水中,待固體完全析出,靜置后抽濾,真空干燥。將干燥所得的粗品進(jìn)行硅膠柱分離, 5cmX40cm色譜柱,石油醚裝柱。采用乙酸乙酯石油醚=1 3進(jìn)行洗脫,得白色固體,產(chǎn) 率 75%。m. ρ· 117 118°C。核磁1H NMR(400MHz, CDCl3) δ (ppm) 7. 522 (d, J = 8. 4Hz, 1H) ,6. 895 (d, J = 9. 2Hz, 1H) ,6. 822 (d, J = 2. 4Hz,1H),6· 164 (s,1H),4· 374 4· 344 (t,J = 6Ηζ,2Η), 3. 696 3. 666 (t,J = 6Hz,2H),2. 411 (s,3H) ·紅外 FT-IR(KBr),υ /cm1 :3412,1716,1614, 1388,1263,1067,850.4)香豆素型功能性探針化合物F-Ta-dD-OH的合成,合成步驟如下3. 60g(0. 0Imo 1)Ta-dD 溶于 IOOmL 丙酮中,加入 4. 17g(0. 03mol)無水 K2CO3,60°C 回流30min后,再加入6. 77g(0. 024mol) 7-(2-溴乙氧基)_4_甲基香豆素,60°C繼續(xù)回流 攪拌反應(yīng)18h,然后轉(zhuǎn)移倒入冰水中,待固體完全析出,靜置后抽濾,真空干燥。將干燥所得的粗品進(jìn)行硅膠柱分離,5cmX40cm色譜柱,乙酸乙酯裝柱。采用乙酸乙酯與甲醇按體積比
30 1
-10 1進(jìn)行梯度洗脫,得淡黃色固體,產(chǎn)率58%。m.p.212 上述合成反應(yīng)式表示如下 所得熒光探針的鑒定為核磁1HNMR(400MHz, CDCl3) δ (ppm) 7. 408 (d, J = 8. 8Ηζ,2Η),7· 299 (d,J = 8. 4Hz,2H),6· 899 (d,J = 8. 4Hz,2H),6· 715 (d,J = 6. 8Hz,2H), 6. 599(s,2H),6. 113(s,2H),4. 251 3. 848 (m,12H),2. 681 (d,J = 4. 8Hz,4H),2. 379 (s, 4H),1. 586(s,6H).紅夕卜 FT-IR(KBr),υ/cm—1 :3414,2938,1721,1617,1294,1264,1145, 1068.實施例3香豆素型熒光探針化合物F-Ta-ClD-NH2的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為香豆素類 結(jié)構(gòu),其中R1為NH2, R2為CH3 ;熒光發(fā)色團(tuán)通過酰胺結(jié)構(gòu)與Ta-dD連接)1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成與實施例1相同。2)熒光發(fā)色團(tuán)為7-氨基-4-甲基香豆素,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行化合物2-氯-N- (4_甲 基-2-氧雜-2-氫-苯并吡喃-7-基)乙酰胺的合成,合成步驟如下 3. 60g (0. 02mol) 7~氨基_4_甲基香豆素溶于50mL無水二氯甲烷中,置于冰浴中 冷卻,然后緩慢滴入溶解有IOmL氯乙酰氯的無水二氯甲烷溶液(IOmL氯乙酰氯溶于35mL 無水二氯甲烷)滴完后,冰浴攪拌,TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢,產(chǎn)物用二氯甲烷稀釋,并 依次用2mol/L HC1、H20、飽和Na2CO3、飽和NaCl萃取,有機(jī)相用無水Na2SO4干燥。蒸除溶劑 后,收集產(chǎn)生的灰白色固體。產(chǎn)率62%,m. p. 283 284°C。
核磁1H NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm) :7. 692 (s,1H),7. 591 7. 538 (m,2H), 6. 235(s,1H),4. 245(s,2H),1. 582(s,3H).紅外 FT-IR(KBr),υ/cm—1 3430,2979,2947, 2603,2495,1686,1478,1395,1174,1037.3)香豆素型功能性探針化合物F-Ta-ClD-NH2的合成,合成步驟如下
3. 60g(0. 01mol)Ta-dD 溶于 IOOmL 丙酮中,加入 4. 17g(0. 03mol)無水 K2CO3,60°C
回流30min后,再加入6. Og (0. 024mol) 2-氯-N- (4-甲基-2-氧雜-2-氫-苯并吡喃_7_基) 乙酰胺,60°C繼續(xù)回流攪拌20h,然后轉(zhuǎn)移倒入冰水中,待固體完全析出,靜置后抽濾,真空 干燥。將干燥所得的粗品進(jìn)行硅色譜分離,5cmX40cm色譜柱,乙酸乙酯裝柱。采用采用乙酸 乙酯與甲醇按體積比30 1 10 1進(jìn)行梯度洗脫,得白色固體,產(chǎn)率55%。m. p. 152 153°C。核磁1H NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm) :9· 022 (s,2H),7· 733 (s,2H),7· 602 7. 523 (m, 6H),7. 346 (d, J = 8. 4Hz,2H),6. 892 (d, J = 8. 8Hz,2H),4. 462 (d,J = 14. 8Hz, 4H),4· 214 (d,J = 14. 4Ηζ,4Η),3· 861(s,6H),2· 768 (d, J = 4. 8Hz,6H),2· 418(s,6H).紅外 FT-IR(KBr),υ /cm1 =3342,2939,1731,1692,1617,1526,1147,1064,1025.實施例4香豆素型功能性探針化合物F-Ta-dD-dOH的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為香豆素 類結(jié)構(gòu),其中R1為0H,R2為CH3 ;熒光發(fā)色團(tuán)與Ta-dD通過碳原子為2的碳鏈連接)1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD、化合物7-(2_溴乙氧基)-4_甲基香豆素的合成,與實施例 2相同;2) 2-氯-N-(3-氯-4-氟苯)乙酰胺的合成,合成步驟如下 2. 91g(0. 02mol)3-氯_4_氟苯胺溶于50mL無水二氯甲烷中,置于冰浴中冷卻。 1.92mL氯乙酰氯溶于IOmL無水二氯甲烷中,緩慢滴入上述溶液中,滴完后,室溫攪拌過夜, TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢,產(chǎn)物用二氯甲烷稀釋,并依次用2mo 1/L HCl、H20、飽和Na2C03、 飽和NaCl萃取,有機(jī)相用無水Na2SO4干燥。蒸除溶劑后,收集產(chǎn)生的黃白色固體。產(chǎn)率 76%, m. ρ· 95 96°C。核磁1H NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm) :8. 219 (s,1H),7. 753 7. 732 (m, 1H), 7. 399 7. 368 (m, 1H), 7. 155 7. 112 (m, 1H) ,4. 200(s,2H).紅外 FT-IR(KBr), υ /cm1 3459,3311,2927,1670,1614,1557,1497,1398.3)6-(2-(3_氯-4-氟-苯胺)-2_羰乙氧基)_6,-羥基_5,5,- 二甲氧基-2,
2’ - 二甲酰甲胺的合成,合成步驟如下
3. 60g (0. Olmol) Ta-dD 溶于 IOOmL 干燥的 N, N-
甲基甲
酰胺中,加入2.08g(0.015mol)無水K2CO3,80 °C攪拌30min后,加入 2. 65g(0. 012mol)2-氯-N-(3-氯-4-氟苯)乙酰胺,保持80°C溫度,繼續(xù)攪拌24h,然后轉(zhuǎn) 移倒入冰水中,待固體完全析出,靜置后抽濾,真空干燥。將干燥所得粗品進(jìn)行硅膠柱色譜 分離,5cmX40cm色譜柱,乙酸乙酯裝柱。采用乙酸乙酯甲醇=15 1進(jìn)行洗脫,得淡黃 色固體,產(chǎn)率72%。m. p. 110 112°C。核磁 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ (ppm) :8· 92 (s,1H),8· 00 (d,J = 6·3Ηζ,1Η), 7. 26-7. 29 (m, 3Η),7. 08 (d, J = 8. 7Hz, 1Η),6. 95 (d, J = 7. 9Hz, 1Η),6. 72 (d, J = 7. 8Hz,1H),6. 33 (br, 1H),5. 72 (br, 1H),4. 64 (s, 1H),4. 59 (s, 1H),3. 91 (s,3H),3. 83 (s,3H), 2. 84 (s,3H),2. 63 (s, 3H) ·紅外 FT-IR(KBr),υ /cm1 :3332,2938,1680,1635,1268,1024.4)香豆素型功能性探針化合物F-Ta-dD-dOH的合成,合成步驟如下 5.458(0.0111101)6-(2-(3-氯-4-氟-苯胺)-2-羰乙氧基)-6,-羥基 _5,5,-二 甲氧基-2,2’_二甲酰甲胺溶于IOOmL干燥的Ν,Ν-二甲基甲酰胺中,加入2. 08g(0. 015mol) 無水K2CO3,80°C攪拌30min后,加入3. 38g (0. 012mol) 7- (2-溴乙氧基)_4_甲基香豆素。保 持80°C繼續(xù)攪拌24h,然后轉(zhuǎn)移倒入冰水中,待固體完全析出,靜置后抽濾,真空干燥。粗品 進(jìn)行柱色譜分離,5cmX40cm色譜柱,乙酸乙酯裝柱。采用乙酸乙酯甲醇=20 1進(jìn)行洗 脫,得白色固體,產(chǎn)率61%。m.p. 108 109°C。核磁1H NMR(400MHz, CDCl3) δ (ppm) :7. 683 (s,2H),7. 477 (d,J = 8. 8Ηζ,1Η), 7. 306 (d, J = 8. 8Hz, 1H),7. 195 (d, J = 8. 4Hz, 1H),7. 106 7. 062 (t, J = 8. 8Hz, 1H), 6. 842 6. 820 (m, 1H),6. 728 (d, J = 8. 4Hz, 1H),6. 640 (s, 1H),6. 425 (d, J = 4. 8Hz, 1H),
6.168 (s,1H),4. 132 (s, 2H),4. 132 4. 095 (d, J = 7. 6Hz,2H),4. 006 3. 970 (d, J =
7.2Hz,2H),3. 816(s,3H),3. 759(s,3H),2· 803 (d, J = 4. 8Ηζ,3Η),2· 629 (d, J = 4. 8Hz,3H), 1. 602 (s,3H).紅外 FT-IR(KBr),υ /cm1 =3326,2938,1723,1618,1294,1263,1145,1021.實施例5香豆素型功能性探針化合物F-Ta-dD-dNH2的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為香豆 素結(jié)構(gòu),其中R1為0H,R2為CH3 ;鏈接結(jié)構(gòu)為酰胺結(jié)構(gòu))1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD、化合物2_氯_N_ (4-甲基_2_氧雜_2_氫-苯并吡 喃-7-基)_乙酰胺的合成與實施例3相同。2)化合物2-氯-N_(3-氯_4_氟苯)乙酰胺、化合物6-(2_(3_氯_4_氟-苯 胺)-2_羰乙氧基)-6’ -羥基_5,5’ - 二甲氧基_2,2’ - 二甲酰甲胺的合成與實施例4相 同。
3)香豆素型功能性探針化合物F-Ta-dD-dNH2的合成,合成步驟如下 5.458(0.0111101)6-(2-(3-氯-4-氟-苯胺)-2-羰乙氧基)-6,-羥基 _5,5,-二 甲氧基-2,2’_二甲酰甲胺溶于IOOmL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中,加入2. 08g(0. 015mol) 無水 K2CO3,80°C攪拌 30min 后,加入 3. Olg (0. 012mol) 2-氯-N- (4-甲基-2-氧雜 _2_ 氫-苯 并吡喃-7-基)乙酰胺;保持80°C溫度,繼續(xù)攪拌24h,然后轉(zhuǎn)移倒入冰水中,待固體完全析 出,靜置后抽濾,真空干燥。將干燥所得粗品進(jìn)行硅膠柱色譜分離,5cmX40cm色譜柱,乙酸 乙酯裝柱。采用乙酸乙酯甲醇=25 1進(jìn)行洗脫,得灰白色固體,產(chǎn)率56%。m. p. 179 180 "C。核磁1HNMR(400MHz, CDCl3) δ (ppm) :7. 765 7. 717 (m,1H),7. 617 7. 524 (m, 2H),7. 343 7. 306 (m, 2H),7. 129 7. 068 (m, 3H),6. 888 (d, J = 8. 4Hz,2H),6. 211 (s,1H), 4. 457 4. 405 (m, 2H), 4. 204 (d, J = 14. 8Hz,2H),3. 872(s,6H),2. 761 (d, J = 3. 2Hz,6H), 2.420(s,3H).紅外 FT-IR(KBr),υ/cm—1 :3373,2935,1703,1621,1528,1499,1407,1146, 1020.實施例6吲哚型功能性探針化合物F-Ta-dD-indo的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為吲哚類 結(jié)構(gòu),其中R1為NH2, R3為氯原子;鏈接結(jié)構(gòu)為酰胺結(jié)構(gòu))1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成與實施例1相同。2) 2-氯-N-(5-氯-1-氫-吲哚_6_基)乙酰胺的合成,合成步驟如下 3. 32g(0. 02mol)5_氯-6-氨基吲哚溶于30mL無水二氯甲烷中,置于冰浴中冷卻; 2mL氯乙酰氯溶于IOmL無水二氯甲烷中,緩慢滴入到上述冷卻后的溶液中,滴完后,室溫攪 拌過夜,TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢后,產(chǎn)物用二氯甲烷稀釋,并依次用2mol/L HCUH2O, 飽和Na2CO3、飽和NaCl萃取,有機(jī)相用無水Na2SO4干燥。蒸除溶劑后,收集所得固體產(chǎn)物。3)吲哚型功能性探針化合物F-Ta-dD-indo的合成,合成步驟如下 3. 60g(0. 01mol)Ta-dD 溶于 IOOmL 丙酮中,加入 4. 17g(0. 03mol)無水 K2CO3,60°C 回流30min后,再加入5. 8g (0. 024mol) 2-氯-N- (5-氯-1-氫-吲哚-6-基)乙酰胺,60°C 繼續(xù)回流攪拌20h,然后轉(zhuǎn)移倒入冰水中,待固體完全析出,靜置后抽濾,真空干燥,粗品進(jìn) 行硅膠柱色譜分離后得到熒光探針F-Ta-dD-indo。實施例7羅丹明型功能性探針化合物F-Ta-dD-Rod的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為羅丹明 B結(jié)構(gòu),其中R2為甲基,R3為氫原子;鏈接結(jié)構(gòu)為酰氯結(jié)構(gòu))1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成與實施例1相同。2)羅丹明B酰氯的合成,合成步驟如下 4. 42g(0. Olmol)羅丹明B溶于IOOmL無水三氯甲烷中,將3mL SOCl2溶于20mL無 水三氯甲烷中,于20min內(nèi)滴加到羅丹明B混合液中。室溫攪拌4h,蒸除溶劑后,收集所得 固體產(chǎn)物。3)羅丹明型功能性探針化合物F-Ta-dD-Rod的合成,合成步驟如下1. 80g(0. Olmol) Ta-dD溶于IOOmL干燥的N,N- 二甲基甲酰胺中,加入 2. IOg(0. 15mol)無水 K2CO3,80°C攪拌 30min 后,加入 9. 08g(0. 02mol)羅丹明 B 酰氯,80°C 下繼續(xù)攪拌36h,TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程,反應(yīng)完畢,將混合液倒入冰水中,待固體完全析出后, 抽濾,將固體產(chǎn)物干燥,將干燥所得粗品進(jìn)行硅膠柱色譜分離得到熒光探針F-Ta-dD-Rod。上述合成反應(yīng)式表示如下
實施例8熒光素型功能性探針化合物F-Ta-dD-Fluo的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為熒光
素結(jié)構(gòu),其中R3為氫原子;鏈接結(jié)構(gòu)為酰氯結(jié)構(gòu))1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成與實施例1相同。2)熒光素酰氯的合成,合成步驟如下 3. 32g(0. Olmol)熒光素溶于60mL無水四氫呋喃中,將3mL SOCl2溶于20mL無水 四氫呋喃中,于20min內(nèi)滴加到上述熒光素混合液中。室溫攪拌4h,蒸除溶劑后,收集所得 固體產(chǎn)物。3)熒光素型功能性探針化合物F-Ta-dD-Fluo的合成,合成步驟如下 1. 80g(0. Olmol) Ta-dD溶于IOOmL干燥的N,N- 二甲基甲酰胺中,加入 2. IOg (0. 15mol)無水 K2CO3,80°C攪拌 30min 后,加入 5. 25g(0. 015mol)熒光素酰氯,80°C下 繼續(xù)攪拌36h,TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程,反應(yīng)完畢,將混合液倒入冰水中,待固體完全析出后,抽 濾,真空干燥,將干燥所得粗品進(jìn)行硅膠柱色譜分離得到熒光探針F-Ta-dD-Fluo。具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性與熒光特性的功能性熒光探針熒光光譜測定的具體 步驟如下1)待測物儲備液的配制分別準(zhǔn)確稱取上述制備的F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD_NH2、F-Ta-dD-dOH 和 F-Ta-dD-dNH2作為待測物,用甲醇或DMSO溶解,以甲醇為溶劑,配成1. 0 X lO^mol/L的儲備 液。2)待測物熒光光譜的測定應(yīng)用F-4500型分光光度計對上述儲備液做熒光光譜的測量,同時以Ta_dD、 Coumarin-NH2, Coumarin-NH2-Cl作為比較。測試條件室溫,調(diào)整激發(fā)波長λ ex(275 375nm),樣品池為IcmX IcmX4cm石英比色皿,狹縫寬度10nm,靈敏度為2。F-Ta-dD-0H, F-Ta-dD-NH2、F-Ta-dD-d0H、和F-Ta-dD_dNH2的熒光光譜圖分別如圖1 4所示,其中橫坐 標(biāo)為波長、縱坐標(biāo)為相對熒光強(qiáng)度??梢悦黠@看出,助色團(tuán)不同的兩種香豆素型熒光發(fā)色團(tuán)的引入使功能型探針化合 物具有相同的變化趨勢香豆素類熒光基團(tuán)7-羥基-4-甲基香豆素(Coumarin-OH)、7_氨 基-4-甲基香豆素(Coumarin-NH2)本身具有優(yōu)良的熒光性能,衍生化后所的產(chǎn)物7-(2-溴乙氧基)-4_甲基香豆素(Coumarin-OH-Br)、2-氯-N-(4-甲基_2_氧雜-2-氫-苯并吡 喃-7-基)乙酰胺(Coumarin-NH2-Cl),熒光強(qiáng)度有所降低。當(dāng)將其衍生物引入到不具有 熒光特性的聯(lián)苯衍生物Ta-dD的結(jié)構(gòu)中后,所得探針化合物F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD-NH2、 F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD-dNH2均衍生具有了一定的熒光特性,其最大吸收波長分別為410nm、 408nm、403nm、408nm。而其他熒光發(fā)生團(tuán)的衍生物引入不具有熒光特性的聯(lián)苯衍生物Ta-dD 的結(jié)構(gòu)中后,所得探針化合物也相應(yīng)的具有一定的熒光特性。具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性與熒光特性的功能性熒光探針對乳腺腫瘤細(xì)胞不同 細(xì)胞株增殖的抑制作用,方法采用MTT比色法,具體步驟如下1)將適宜濃度的乳腺腫瘤細(xì)胞的懸液混勻后以每孔180 μ 1接種于96孔板中, 其中,各細(xì)胞株的具體濃度為 MCF-7 = 3Χ1(Γ4Μ、MDA-MB-231 = 4Χ1(Γ4Μ、ZR-75-30 = 3 X 1(Γ4Μ、SK-BR-3 = 5 X 1(Γ4Μ。2)將乳腺腫瘤細(xì)胞在37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24h,加入功能性熒光探 針,使每種熒光探針的終濃度分別為5 χ 10_5Μ、1 X 10_5M、1 X 10_6M。3)繼續(xù)培養(yǎng)48h后,換無血清的培養(yǎng)基(具體為MCF-7 :PRMI1640, MDA-MB-231 PRMI1640, ZR-75-30 =RPMI 1640, SK-BR-3 :DMEM)。各孔中加入 5mg/mL 的 MTT 工作液 20 μ L, 繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄培養(yǎng)液,每孔加入150 μ L 二甲基亞砜(DMSO),在室溫下震蕩溶解15min后, 酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長490nm時各孔的紫外吸收值(0D值),每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。4)與陽性藥吉非替尼進(jìn)行對照比較上述合成得到的功能性探針F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD_NH2 與 F-Ta-dD-dOH、 F-Ta-dD-dNH2不同濃度時(5X 1(Γ5Μ、1 X 1(Γ5Μ、1 X I(T6M)對乳腺腫瘤細(xì)胞細(xì)胞株MCF-7、 MDA-MB-231、ZR-75-30、SK-BR-3增殖的抑制率的直方圖如圖5 6、圖7 8所示,其中橫坐 標(biāo)表示應(yīng)用的陽性對照吉非替尼、熒光探針及所選的乳腺腫瘤細(xì)胞不同的細(xì)胞株,縱坐標(biāo) 表示抑制率??梢钥闯鰺晒馓结?F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD-NH2、F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD-dNH2 對 不同乳腺腫瘤細(xì)胞細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、ZR-75-30、SK-BR-3的增殖均有不同程度的 抑制作用;并且隨著熒光探針化合物的濃度增加,熒光探針對乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率 也相應(yīng)的增加,針對不同的細(xì)胞株增加程度會存在區(qū)別;而當(dāng)熒光探針化合物的濃度達(dá)到 5X ICT5M的濃度時,都對乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖表現(xiàn)了明顯的抑制,抑制率最高達(dá)到了 60%, 除了 F-Ta-dD-dNH2對ZR-75-30細(xì)胞株的抑制率,最低也達(dá)到了 10 % ;但是F-Ta-dD_dNH2對 ZR-75-30細(xì)胞株的抑制率在1 X IO-6M低濃度時,甚至超過了陽性對照吉非替尼的抑制率。
權(quán)利要求
一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針,其特征在于,是在聯(lián)苯衍生物Ta dD的一個或兩個酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán);所述的聯(lián)苯衍生物Ta dD的結(jié)構(gòu)式為FDA0000023450340000011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針,其特征在于,所述的熒光發(fā)色團(tuán)為香豆素類、吲哚類、羅丹明類或熒光素類,其結(jié)構(gòu)式分別為 羅丹明類熒光素類 其中,R1為羥基或氨基;R2為氫原子、甲基或乙基;R3為氯原子、溴原子或氟原子。
3.如權(quán)利要求1所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針,其特征在于,所述的 熒光發(fā)色團(tuán)為含有羥基的熒光發(fā)色團(tuán),通過碳原子數(shù)為2 6的直鏈烴基與Ta-dD連接;或者為含有羧基的熒光發(fā)色團(tuán),通過?;cTa-dD連接;或者為含有氨基的熒光發(fā)色團(tuán),通過酰亞胺基與Ta-dD連接。
4.如權(quán)利要求1所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針,其特征在于,在聯(lián) 苯衍生物Ta-dD的一個或兩個酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán)得到的熒光探針為F-Ta-dD-OH、 F-Ta-dD-NH2、F-Ta-dD-Rod、F-Ta-dD-Fluo 或 F-Ta-dD-indo。
5.如權(quán)利要求1所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針,其特征在于,所述的 聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個酚羥基與熒光發(fā)色團(tuán)連接,另一個酚羥基與2-氯-N- (3-氯-4-氟 苯)乙酰胺連接。
6.如權(quán)利要求1所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針,其特征在于,在 聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán)得到的熒光探針為F-Ta-dD-dOH或 F-Ta-dD-dNH2。
7.一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的制備方法,其特征在于,包括以下步驟a、聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成1)3-羥基-4-甲氧基苯甲醛在鐵粉催化作用下,與液溴在醋酸緩沖液中反應(yīng)得到2-溴 3-羥基-4-甲氧基苯甲醛;2)以氯化芐作為保護(hù)試劑,對2-溴3-羥基-4-甲氧基苯甲醛的酚羥基進(jìn)行保護(hù),得到 3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛;3)以過氧化氫-亞氯酸鈉體系作為氧化劑,將3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛氧化 得到3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸;4)先將3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸溶解在無水二氯甲烷中,通過?;?應(yīng)制成3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酰氯,然后再與甲胺水溶液反應(yīng)得到3-芐氧 基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺;5)3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺通過Ullmarm反應(yīng)制得芐基保護(hù)的聯(lián)苯 雙酰胺化合物6’ 6- 二芐氧基-5’ 5- 二甲氧基聯(lián)苯-2’ 2- 二 N-甲基甲酰胺;6)5,5’- 二甲氧基_6,6’ - 二芐氧基聯(lián)苯_2,2’ - 二苯甲酰甲胺通過催化氫化脫去芐 基保護(hù)基,得到帶有兩個酚羥基的聯(lián)苯衍生物Ta-dD ;b、熒光發(fā)色團(tuán)衍生物的合成利用熒光發(fā)色團(tuán)中含有的羥基與二鹵代烷發(fā)生醚化反應(yīng),生成帶有鹵代直鏈烴的熒光 發(fā)色團(tuán)衍生物;或者利用熒光發(fā)色團(tuán)中含有的羧基發(fā)生酰氯化反應(yīng),生成帶有酰氯結(jié)構(gòu)的熒光發(fā)色團(tuán) 衍生物;或者利用熒光發(fā)色團(tuán)中含有的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng),生成帶有酰胺結(jié)構(gòu)的熒光發(fā)色團(tuán) 衍生物;c、熒光探針的合成向有機(jī)溶劑中按照聯(lián)苯衍生物Ta-dD 熒光發(fā)色團(tuán)衍生物無水碳酸鉀=1 (1 3) (3 6)的摩爾比,首先加入聯(lián)苯衍生物Ta-dD和無水碳酸鉀,60 80°C充分混合 后,然后加入熒光發(fā)色團(tuán)衍生物,60 80°C回流充分反應(yīng);反應(yīng)完成后轉(zhuǎn)移到冰水中,待固 體完全析出后,將固體物分離并干燥,然后進(jìn)行硅膠柱層析分離,以乙酸乙酯和甲醇的混合 溶劑或乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑進(jìn)行洗脫,得到具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探 針。
8.如權(quán)利要求7所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的制備方法,其特征在 于,所述的二鹵代烷為碳原子個數(shù)為2 6的直鏈鹵代烴,兩個鹵原子分別連接于首位碳原 子上,含羥基的熒光發(fā)色團(tuán)與二鹵代烷的摩爾比為1 1;含羧基的熒光發(fā)色團(tuán)與氯化亞砜發(fā)生酰氯化反應(yīng),兩者的摩爾比為1 1;含氨基的熒光發(fā)色團(tuán)與氯乙酰氯發(fā)生酰胺化反應(yīng),兩者的摩爾比為1 1。
9.如權(quán)利要求7所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的制備方法,其特征在 于,所述的熒光發(fā)色團(tuán)衍生物為7- (2-溴乙氧基)-4-甲基香豆素、2-氯-N- (4-甲基-2-氧 雜-2-氫-苯并吡喃-7-基)-乙酰胺、2-氯-N- (5-氯-1-氫-吲哚-6-基)乙酰胺、羅丹 明B酰氯或熒光素酰氯;所述的有機(jī)溶劑為N,N- 二甲基甲酰胺或丙酮。
10.如權(quán)利要求7所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的制備方法,其特征 在于,所述的用于柱分離的洗脫溶劑,以體積比計,乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑為乙酸乙 酯甲醇=30 1 10 1,乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑為乙酸乙酯石油醚=1 3。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針及其制備方法。所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針,是在聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個或兩個酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán),所述的熒光發(fā)色團(tuán)為香豆素型、吲哚型、羅丹明型或熒光素型。聯(lián)苯衍生物Ta-dD和酚羥基連接的功能分子保持對腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性,而指示性的熒光是由熒光發(fā)色團(tuán)發(fā)出的。本發(fā)明公開的熒光探針既保持了對腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性,又具有一定的熒光性能。作為一種靶向工具分子,可與腫瘤細(xì)胞直接作用,通過其熒光性能的變化,來進(jìn)行藥物作用機(jī)制和作用效果研究。
文檔編號A61P35/00GK101921587SQ20101023020
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者盧聞, 展穎轉(zhuǎn), 張彥民, 張 杰, 李西玲, 王嗣岑, 賀懷貞, 賀浪沖 申請人:西安交通大學(xué)
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