專利名稱：一種鏈球菌重組亞單位疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程重組蛋白疫苗，具體地說，涉及一種預(yù)防豬鏈球菌病的 基因工程重組亞單位疫苗。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌(Streptococcus suis)是一種重要的豬致病菌，目前已知的血清型有 35個(gè)，其中血清2型(Str印tococcus suis type 2，SS2)為全球范圍的優(yōu)勢(shì)流行株，能夠 引發(fā)豬的急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、支氣管肺炎等疾病以及急性死亡；同時(shí)，SS2是一種 重要的人畜共患傳染病病原菌，并感染人，導(dǎo)致嚴(yán)重疾患甚至致死。豬鏈球菌2型目前尚無用于臨床的基因工程疫苗。本研究對(duì)豬鏈球菌某些免疫原 性蛋白進(jìn)行分析，將某個(gè)免疫原性蛋白基因進(jìn)行表達(dá)或多個(gè)免疫原性蛋白基因進(jìn)行串連表 達(dá)，將獲得的產(chǎn)物用于免疫預(yù)防。本發(fā)明通過串聯(lián)表達(dá)豬鏈球菌2型的毒力因子溶菌酶釋 放蛋白(MRP)、甘油醛脫氫酶(GAPDH)以及新發(fā)現(xiàn)的膜蛋白吡啶二硫酸核苷酸氧化還原酶 (HM6)，通過免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)研究其免疫原性和保護(hù)效果，探討研制新一代亞單位疫苗的 可能性。溶菌酶釋放蛋白(MRP)是豬鏈球菌2型菌體表面重要的菌體蛋白，分子量 為136000，是該菌重要的保護(hù)性抗原，其結(jié)構(gòu)和分布復(fù)雜(Smith Hilde Ε, Vecht Uri， Gielkens Arno L J, et al. Cloning and Nucleotide Sequence of the Gene Encoding the 136-KD Surface Protein (Muramidase-Released Protein)of Streptococcus suis Type 2.Infect Immun，1992，60 :2361 2367)。甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)與黏附 有關(guān)[Brassard, J. , Μ. Gottschalk, et al. (2004). " Cloning and purification of the Streptococcus suis serotype 2glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and its involvement as an adhesin. " Vet Microbiol 102 (1-2) 87~94 ；Wang, K. and C. Lu(2007). " Adhesion activity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in a Chinese Streptococcus suis type 2strain. " Berl Munch Tierarztl Wochenschrl20(5-6) :207_9。王楷歲(王楷歲.豬鏈球菌2型甘油醛脫氫酶的基因檢測(cè)及 其黏附作用[D],南京南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006)在SS1、2、7、9中均檢測(cè)到gapdh基因，而SS2 無毒株T15則缺少該基因，并證實(shí)該蛋白具有免疫原性。膜蛋白吡啶二硫酸核苷酸氧化還原酶(HM6)為張煒等[Zhang，W. and C.P.Lu (2007). “ Immunoproteomic assay of membrane-associated proteins of Streptococcus suis type 2 Chinavaccine strain HA9801. " Zoonoses Public Health 54(6-7) :253-9]在2007年通過免疫蛋白組學(xué)的方發(fā)法篩選得到，是一種具有免疫原性的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過串聯(lián)表達(dá)豬鏈球菌2型的免疫原性蛋白，研制新一代亞單 位疫苗。具體而言通過串聯(lián)表達(dá)豬鏈球菌2型的3種免疫原性蛋白，即溶菌酶釋放蛋白 (MRP)、甘油酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、吡啶二硫酸 核苷酸氧化還原酶(HM6)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼本發(fā)明所述融合蛋白的基因。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，在本發(fā)明中對(duì)豬鏈球菌2型的免疫原性蛋白 MRP,GAPDH以及HM6進(jìn)行原核表達(dá)，再將MRP與HM6進(jìn)行串聯(lián)原核表達(dá)，最終將GAPDH、MRP、 HM6三者串聯(lián)原核表達(dá)。一方面，本發(fā)明提供了一種具有免疫原性的融合蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，其 中GAPDH片段位于該融合蛋白的氨基端，MRP片段位于該融合蛋白的中部，HM6片段位于該 融合蛋白的羧基端，所述融合蛋白GAPDH-MRP-HM6具有SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用本發(fā)明所述的融合蛋白GAPDH-MRP-HM6免疫接種斑馬魚，所述融合 蛋白進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)以后，刺激斑馬魚體內(nèi)外周免疫器官的B淋巴細(xì)胞，使其活化、增生、 分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生針對(duì)豬鏈球菌MRP、GAPDH和HM6特異性抗體分子，借助于ADCC、補(bǔ)體活 化以及粘附抑制等途徑清除進(jìn)入體內(nèi)的豬鏈球菌2型，因而對(duì)豬鏈球菌病有預(yù)防作用。另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼本發(fā)明所述融合蛋白的嵌合基因。該嵌合基因 由MRP、HM6和GAPDH蛋白基因的多核苷酸片段融合形成的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，該嵌 合基因具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。所示的核苷酸序列，克隆自HA9801株。該菌 系姚火春等1998年從江蘇爆發(fā)豬鏈球菌病的病豬中分離獲得的，具體分離過程及該菌株 特征參見文獻(xiàn)姚火春等，豬鏈球菌1998分離株病原特性鑒定，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999， 22(2) :67 70，該文獻(xiàn)在此全文引入作為參考。本發(fā)明中的HA9801菌株已于2005年8月 22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號(hào)為CGMCC NO. 1446，該菌株的保藏證明已隨申請(qǐng)?zhí)枮?00610075969. 0的中國發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)峤?。另一方面，本發(fā)明還提供了一種重組構(gòu)建體，其中包括上述編碼本發(fā)明所述融合 蛋白的基因，該基因被可操作地連接于表達(dá)調(diào)控區(qū)域。另一方面，本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞已被上述重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。 另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明所述融合蛋白的方法，該方法包括(a)擴(kuò)增得 到融合基因；(b)獲得含融合基因的重組構(gòu)建體；(c)用所述重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(d) 將轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞置于足以表達(dá)該融合蛋白的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。另一方面，本發(fā)明還提供了所述融合蛋白在制備用于預(yù)防或治療豬鏈球菌疾病藥 物中的用途，其中所述的豬鏈球菌病是由豬鏈球菌2型引發(fā)的。另一方面，本發(fā)明還提供了一種疫苗組合物，其中包括本發(fā)明所述的具有免疫原 性的融合蛋白，以及藥物學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。本發(fā)明提供的免疫保護(hù)力 試驗(yàn)證明該疫苗組合物能夠有效預(yù)防和/或治療豬鏈球菌疾病。另一方面，本發(fā)明還提供了用于制備所述融合基因的試劑，其中包含核苷酸序列 如 SEQID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11、 SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 13 所示的引物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
4[OOl 9] 本發(fā)明所述的融合蛋白GAPDH—MRP—HM6具有下述優(yōu)點(diǎn)
(1)具有良好的免疫原性，實(shí)驗(yàn)證實(shí)施用本發(fā)明所述融合蛋白GAPDH—MRP—HM6刺激產(chǎn)生的免疫應(yīng)答明顯強(qiáng)于單獨(dú)施用MRP、HM6和GAPDH時(shí)激發(fā)的免疫應(yīng)答，顯然三者之間產(chǎn)生了協(xié)同作用，融合蛋白的保護(hù)作用明顯增強(qiáng)。
(2)使用方便，施用含該融合蛋白的疫苗組合物后，即能提供對(duì)豬鏈球菌2型的免疫保護(hù)；
下列實(shí)施例的給出是為了更好地理解和闡述本發(fā)明，而決不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的任何限制。
1．1獲取豬鏈球菌2型MRP—HM6融合抗原表位的編碼基因
豬鏈球菌2型HA980l株系姚火春等[南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22(2)67—70]1998年從江蘇爆發(fā)豬鏈球菌病的病豬中分離、鑒定，已于2005年8月22曰保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號(hào)為CGMCC NO．1446。挑取兔血瓊脂平板上HA980l株單菌落接種至含5％犢牛血清(購自衛(wèi)崗血清廠)的Todd—Hewittbroth(／HB)肉湯中，37℃靜置培養(yǎng)過夜，取0．5mL菌液離心，提取染色體DNA，溶于PH8．0TE緩沖液中，凍存?zhèn)溆谩?br> AG／AACGAA／G／A 3’ (SEQ工D N。7)
AAGG／CG／AGCA／C 3’ (SEQ工D N。8)
hm6下游引物P4 5'AACTCGAGGAACATCAAGAAAGGC 3'。(SEQ ID NO 9)
所述PCR操作程序是在一 500 μ L微量離心管中加入下列試劑
模板DNA2μ L
IOx PCR buffer10 μ L
25mM MgCl28μ L
2. 5mM dNTPs8μ L
引物各 0. 25 μ L
ddH2070 μ L
Tag酶3μ L
混勻后，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)94°C變性4min后，進(jìn)入循環(huán)，94°C 30s,
55°C 30s, 72°C 60s，共 30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin。1. 2目的片斷的回收和純化PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖電泳后，切下目的條帶，用DNA快速純化試劑盒提取凝膠中 目的片段，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。即瓊脂糖電泳后割下含DNA的瓊脂糖塊， 使體積盡可能小，放入1. 5mL印endoff管中；按每IOOmg瓊脂糖塊加入300 μ L結(jié)合緩沖液 的比例加入結(jié)合緩沖液，將ependoff管渦旋振蕩15 30s，置50°C水浴lOmin，使瓊脂塊 完全溶化，每2 3min渦旋振蕩一次；按每IOOmg瓊脂糖塊加入150 μ L異戊醇的比例加入 異戊醇，渦旋振蕩徹底混勻；將溶化后的溶液移入吸附柱中，12000g、15 25°C離心lmin， 倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；在吸附柱中加入500 μ L洗脫緩沖 液，12000g、15 25°C離心lmin，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；在 吸附柱中再次加入200 μ L洗脫緩沖液，靜置Imin后，12000g、15 25°C離心lmin，倒掉收 集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；12000rpm、15 25°C離心lmin，徹底除去吸 附柱中的洗脫液；將吸附柱放入一只干凈的1. 5mL印endoff管中，在吸附膜中央加入50 100 μ L溶解緩沖液，靜置Imin后，12000g、15 25°C離心lmin，回收產(chǎn)物即為純化的目的 片段，回收產(chǎn)物-20°C凍存?zhèn)溆谩?. 3含mrp基因重組質(zhì)粒酶切
在0. 5mL的印pendorf管依次加入
重組質(zhì)粒8μ L
10X buffer 12μ L
BamHI1 μ L
SaclIuL
ddH208μ L
混勻，37 °C水浴酶切2h，65°C 15min終止反應(yīng)。
按Roche DNA快速回收試劑盒說明書回收酶切產(chǎn)物
1.4基因融合
0. 5mL ependorff管中依次加入
載體DNA0. 5μ L
PCR回收產(chǎn)物4μ L
10X 連接 buffer2μ L
6
T4DNA 連接酶dd H2O
1 μ L 12. 5μ L16 °C連接過夜。將含融合基因的的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，感受態(tài)購自天為公司，用限制性內(nèi) 切酶酶切的方法及重組質(zhì)粒測(cè)序的方法鑒定重組克隆。重組質(zhì)粒冰凍保存于_20°C，重組菌在含20 50%甘油培養(yǎng)液中保存于-20°C 或-70°C。融合基因的序列測(cè)定采用雙脫氧末端終止法，對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，所 得到的融合基因的序列與設(shè)計(jì)的完全一致。1. 5質(zhì)粒pET_28a(+)的擴(kuò)增、提取接種含pET_28a(+)空質(zhì)粒的宿主菌DH5a至LB肉湯(含AmplOO μ g/ml)中，37°C 搖振培養(yǎng)12 14h。按QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行。取3mL 菌液至 1. 5mL ependoff 管中，4 °C、8000rpm 離心 3min，徹底棄上清； 加250 μ Lpl緩沖液至印endoff管中，重新溶解菌泥沉淀，混勻；加250 μ Lp2緩沖液至 ependoff管中，輕輕顛倒混勻4 6次，靜置4min，可見溶液變澄清；加350 μ LN3緩沖液至 印endoff管中，立即輕輕顛倒混勻4 6次；4°C、12000rpm離心lOmin，將上清吸至QIApr印 柱中；4°C、12000rpm離心lmin，甩去離心柱內(nèi)的棄液；加0. 5mL PB緩沖液至QIA prep ft 中，4°C、12000rpm離心lmin，甩去柱內(nèi)的棄液；加0. 75mLPE緩沖液至柱中，4°C、12000rpm 離心lmin，甩去離心柱內(nèi)的棄液；再次離心Imin ；徹底棄去柱內(nèi)的液體；將離心柱安置干凈 的 1.5mL 印endoff 管中，加入 50 μ L EB 緩沖液(IOmM Tris-HCl，ρΗ8. 5)至柱子中央，37°C 靜置1 2min，4°C、12000rpm離心lmin，收集洗脫液，即為提取的質(zhì)粒，_20°C凍存?zhèn)溆谩?. 6 質(zhì)粒 pET_28a (+)酶切在0. 5mL的印pendorf管依次加入質(zhì)粒8yL10X buffer12 μ LEcoR I1 μ LXho I1 μ LddH208 μ L混勻，37 °C水浴酶切2h，65°C 15min終止反應(yīng)。按Roche DNA快速回收試劑盒說明書回收酶切產(chǎn)物。1. 7重組質(zhì)粒的構(gòu)建0. 5mL ependorff 管中依次加入載體DNA0. 5 μ LMRP-HM6 基因 PCR 回收產(chǎn)物 4 μ L10Χ 連接 buffer2 μ LT4DNA 連接酶1 μ LddH2012. 5μ L16 °C連接過夜實(shí)施例2
2. 1獲取豬鏈球菌2型GAPDH-MRP-HM6融合抗原表位的編碼基因豬鏈球菌2型HA9801株系姚火春等(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22⑵67 70) 1998年從江蘇爆發(fā)豬鏈球菌病的病豬中分離、鑒定，已于2005年8月22日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號(hào)為CGMCC NO. 1446。挑取兔 血瓊脂平板上HA9801株單菌落接種至含5%犢牛血清(購自衛(wèi)崗血清廠)的Todd-Hewitt broth (THB)肉湯中，37°C靜置培養(yǎng)過夜，取0. 5mL菌液離心，提取染色體DNA，溶于PH8. OTE 緩沖液中，凍存?zhèn)溆?。提取豬鏈球菌2型HA9801株基因組DNA的方法參照按Michael W Lema等 (Michael W L,Brown A,Collins A. A general method foe the extraction of DNA from bacterial. J Microbiol Methods，1994，19 :167-172)的方法稍加改進(jìn)，步驟如下分別挑 取兔血平板上HA9801菌落接種到Todd-Hewit肉湯，37°C靜止培養(yǎng)過夜；取0. 5mL菌液離 心沉淀，TE緩沖液(1 OmMo 1/LTris-Hc 1，ImMol/L EDTA, pH7. 4)洗滌菌體；以冷丙酮懸浮菌 體6000g離心5min,并干燥；37 °C用溶菌酶(2mg/mL) 200 μ L處理菌體lh，加TESN裂解液 (IOmMol/LTris-Hcl, ImMol/L EDTA, 1% Sarkosyl，6mol/LNaI，ρΗ7· 4)裂解；加等體積異丙 醇沉淀DNA，IOOOOg離心IOmin ；沉淀懸浮于200uL40%異丙醇中，離心洗滌；70%乙醇洗滌 沉淀；干燥的沉淀溶于 100 μ LTE 緩沖液(10mM/LTris-HCl，ImM/LEDTA, pH8. 0)，4°C備用。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法自豬鏈球菌2型HA9801株染色體DNA中分離 GAPDH全基因去除起始與終止密碼子后的1005bp的片段(P5和P6)及重組重組質(zhì)粒 mrp-hm6-Pet28a的mrp_hm6片段(P7和P8)。采用的引物序列分別是gapdh上游引物P5 5‘CAGGATCCGTAGTTAAAGTTGGTA 3' (SEQ ID NO 10)
gapdh下游引物P6 5'TCCACCTCCACCTCCTTTAGCGATTTTTGCG 3' (SEQ IDNO 11)
mrp-hm6上游引物P75 ‘ GGAGGTGGAGGTGGAGAACAGGTAACA
TCAGA 3' (SEQ ID N0:12)
mrp-hm6下游引物P85' AACTCGAGGAACATCAAGAAAGGC 3' (SEQ ID NO 13)
所述PCR操作程序是在一 500 μ L微量離心管中加入下列試劑
模板DNA10 μ L
模板重組質(zhì)粒10 μ L
IOx PCR buffer10 μ L
25mM MgCl28μ L
2. 5mM dNTPs8μ L
引物各 0. 25 μ L
ddH2070 μ L
Tag酶3μ L
混勻后，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)94°C變性4min后，進(jìn)入循環(huán)，94°C 30s,
550C 30s, 720C 60s，共 30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin。2. 2目的片斷的回收和純化將PCR擴(kuò)增的串聯(lián)片段GAPDH-MRP-HM6融合基因片段用膠回收試劑盒回收，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖電泳后，切下目的條帶，用DNA快速純化試劑盒提取凝膠中目的片段，具 體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作，即瓊脂糖電泳后割下含DNA的瓊脂糖塊，使體積盡可能
8小，放入1. 5mL ependoff管中；按每IOOmg瓊脂糖塊加入300 μ L結(jié)合緩沖液的比例加入 結(jié)合緩沖液，將^endoff管渦旋振蕩15 30s，置50°C水浴lOmin，使瓊脂塊完全溶化，每 2 3min渦旋振蕩一次；按每IOOmg瓊脂糖塊加入150 μ L異戊醇的比例加入異戊醇，渦旋 振蕩徹底混勻；將溶化后的溶液移入吸附柱中，12000g、15 25°C離心lmin，倒掉收集管 中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；在吸附柱中加入500 μ L洗脫緩沖液，12000g、 15 25°C離心lmin，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；在吸附柱中再 次加入200 μ L洗脫緩沖液，靜置Imin后，12000g、15 25°C離心lmin，倒掉收集管中的液 體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；12000rpm、15 25°C離心lmin，徹底除去吸附柱中的洗 脫液；將吸附柱放入一只干凈的1. 5mL ependoff管中，在吸附膜中央加入50 100 μ L溶 解緩沖液，靜置Imin后，12000g、15 25°C離心lmin，回收產(chǎn)物即為純化的目的片段，回收 產(chǎn)物-20°C凍存?zhèn)溆谩?. 3目的片段的連接和轉(zhuǎn)化連接pMD18T Simple Vector (TAKAR公司)，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞T0P10 (天為公司) 中。通過藍(lán)白斑篩選陽性菌落，命名為mrp-hm6-pMD18T Simple，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶 切鑒定。EcoR I與Xho I雙酶切mrp-hm6-pMD18T Simple，瓊脂糖電泳后回收目的串聯(lián)片 段，與EcoR I與Xho I雙酶切過的載體pET-28a連接，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌BL21中，PCR 以及酶切反應(yīng)進(jìn)行克隆的鑒定。陽性質(zhì)粒命名為MRP-HM6-pET28a，對(duì)鑒定的陽性克隆測(cè)序 (由上海英駿生物有限公司完成)。2.4質(zhì)粒pET_28a (+)的擴(kuò)增、提取接種含pET_28a(+)空質(zhì)粒的宿主菌DH5a至LB肉湯(含Amp 100 μ L/mL)中， 37°C搖振培養(yǎng)12 14h。按QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行。取3mL 菌液至 1. 5mL ependoff 管中，4 °C、8000rpm 離心 3min，徹底棄上清； 加250 μ Lpl緩沖液至印endoff管中，重新溶解菌泥沉淀，混勻；加250 μ Lp2緩沖液至 ependoff管中，輕輕顛倒混勻4 6次，靜置4min，可見溶液變澄清；加350 μ LN3緩沖液至 印endoff管中，立即輕輕顛倒混勻4 6次；4°C、12000rpm離心lOmin，將上清吸至QIApr印 柱中；4°C、12000rpm離心lmin，甩去離心柱內(nèi)的棄液；加0. 5mL PB緩沖液至QIAprep柱中， 4°C、12000rpm離心lmin，甩去柱內(nèi)的棄液；加0. 75mLPE緩沖液至柱中，4°C、12000rpm離 心lmin，甩去離心柱內(nèi)的棄液；再次離心Imin ；徹底棄去柱內(nèi)的液體；將離心柱安置干凈的 1. 5mL 印endoff 管中，加入 50 μ L EB 緩沖液(IOmM Tris-HCl，ρΗ8. 5)至柱子中央，37°C靜 置1 2min，4°C、12000rpm離心lmin，收集洗脫液，即為提取的質(zhì)粒，_20°C凍存?zhèn)溆谩?.5 質(zhì)粒 pET-28a (+)酶切在0. 5mL的印pendorf管依次加入質(zhì)粒8μ L10Χ buffer12 μ LEcoR I1 μ LXho I1 μ LddH208 μ L混勻，37 °C水浴酶切2h，65°C 15min終止反應(yīng)。按Roche DNA快速回收試劑盒說明書回收酶切產(chǎn)物。
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2. 6重組質(zhì)粒的構(gòu)建0. 5mL印endorff管中依次加入載體DNAMrp_HM6基因PCR回收產(chǎn)物IOX 連接 bufferT4DNA 連接酶dd H20
0. 5μ L 4μ L 2μ L 1 μ L 12. 5μ L16 °C連接過夜2. 7感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化從新鮮LB平板挑取單菌落的DH5 α接種IOmLLB肉湯，37°C劇烈搖振培養(yǎng)3 4h 后，冰上放置IOmin ；4°C、6000rpm離心4min，以冰預(yù)冷的0. Imol/mL CaCl2懸浮沉淀，置冰 浴 IOmin ；4°C、6000rpm 離心 4min，力口 400 μ L 冰預(yù)冷的 0. Imol/mL CaCl2 重新懸浮沉淀，4°C 放置待用；取200 μ L感受態(tài)細(xì)胞至印pendorff管中，加入10 μ L的連接產(chǎn)物，立即混勻，冰 上放置30min ；42°C熱休克90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴2min，然后加入800 μ L 37°C預(yù)熱的LB培 養(yǎng)基，37°C緩慢搖振2h ；取100 μ L培養(yǎng)液涂布LB平板(含Amp 100 μ g/mL) 37°C培養(yǎng)14 16h。2. 8含mrp基因重組質(zhì)粒酶切在0. 5mL的印pendorf管依次加入重組質(zhì)粒8yL10X buffer 12μ LBamHI1 μ LSacl1 μ LddH208 μ L混勻，37 °C水浴酶切2h，65°C 15min終止反應(yīng)。按Roche DNA快速回收試劑盒說明書回收酶切產(chǎn)物2. 9基因融合0. 5mL印endorff管中依次加入載體DNA0. 5μ LPCR回收產(chǎn)物4yL10X 連接 buffer2μ LT4DNA 連接酶IyLddH2012. 5μ L16 °C連接過夜。將含融合基因的的重組質(zhì)粒pET-S-M轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，感受態(tài)制備的方法及細(xì) 菌的轉(zhuǎn)化同上，用限制性內(nèi)切酶酶切的方法及重組質(zhì)粒測(cè)序的方法鑒定重組克隆。重組質(zhì)粒冰凍保存于_20°C，重組菌在含20 50%甘油培養(yǎng)液中保存于-20°C 或-70°C。融合基因的序列測(cè)定采用雙脫氧末端終止法，對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序，核苷酸序列 如SEQ IDNO :4所示。結(jié)果表明，所得到的融合基因的序列與設(shè)計(jì)的完全一致。
實(shí)施例3豬鏈球菌2型GAPDH-MRP-HM6融合基因的表達(dá)將重組融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (TaKaRa公司產(chǎn)品)，以氨芐平板篩選。 挑取單菌落接種含Amp的LB肉湯5mL，28°C搖振4 5h，接種含Amp的LB肉湯I(xiàn)OOOmL, 28°C 劇烈搖振4 5h，當(dāng)OD600達(dá)0. 6時(shí)，加IPTG (Sigma公司產(chǎn)品)誘導(dǎo)，37°C劇烈搖振2 4h。 三角燒瓶于冰上5分鐘，4°C 5000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)菌，立即使用或凍存。實(shí)施例4豬鏈球菌2型GAPDH-MRP-HM6基因片段融合蛋白的純化重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，離心，菌體沉淀以pH7. 2、濃度為IOm Mol的PBS溶液洗滌 2次后，加入50mL pH7. 2、濃度為IOmMol的PBS溶液重新懸浮沉淀，以超聲波儀進(jìn)行破碎， 破碎功率設(shè)定為800瓦、共破碎100次，每次破碎IOs鐘，間隔15s。破碎完畢后IOOOOrpm 離心lOmin，收集上清。取20 μ L離心后的上清，加等量SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5min， BL21S宿主菌亦經(jīng)同樣的處理作為對(duì)照，后進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)果如

圖1所示。電泳后凝 膠經(jīng)染色、脫色后，以薄層掃描測(cè)定融合蛋白占菌體總蛋白的含量，同時(shí)以BIO-RAD(Smart Spec 3000)測(cè)定上清內(nèi)菌體蛋白的總量。破碎上清以Hi s親和層析柱層析(QIAGEN公司產(chǎn)品)，純化重組蛋白，并 以BIO-RAD (Smart Spec 3000)測(cè)定收集蛋白的濃度。采用常規(guī)的SDS-PAGE方法 (J. Sambrook, Polyacrylamide gel electrophoresis 6.36-6. 49, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Molecular cloning, 1989)測(cè)定蛋白的純度,蛋白純度為 99%。實(shí)施例5重組蛋白疫苗對(duì)仔豬的免疫保護(hù)效力試驗(yàn)5.1菌株和質(zhì)粒豬鏈球菌2型HA9801株系姚火春等從江蘇1998年爆發(fā)豬鏈球菌病的病豬中分
罔、鑒定ο5. 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年野生斑馬魚AB系斑馬魚，體長(zhǎng)4-5cm，免疫前飼養(yǎng)1周，確證無疫病。試驗(yàn)魚 共350尾，50尾/組。5. 3試驗(yàn)方法5. 3. 1免疫用亞單位疫苗的制備將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的mrp-pET28a、hm6_pET28a、gapdh_pET28a 重組菌以及 gapdh-mrp-hm6-pET28a分別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，以His親和層析柱層析(QIAGEN公司產(chǎn)品) 純化，將蛋白濃度調(diào)整至2. 0mg/mL。5. 3. 2融合蛋白免疫原的制備將重組菌的純化融合蛋白調(diào)整濃度至2. 0mg/mL，直接用作免疫原。5. 3. 3疫苗動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)及攻擊將300尾魚分成6組，每組50尾。第一組用純化的MRP融合蛋白亞單位疫苗免 疫，第二組純化的HM6融合蛋白亞單位疫苗免疫，第四組用純化的GAPDH融合蛋白亞單位 疫苗免疫，第五組用純化的GAPDH-MRP-HM6融合蛋白免疫，第六組為對(duì)照組。經(jīng)魚類麻醉 劑MS-222(杭州動(dòng)物藥品廠生產(chǎn)，批號(hào)080610)麻醉后腹腔注射，每尾25 μ L。融合蛋白、 ΗΑ9801滅活苗及PBS對(duì)照組注射劑量分別為50 μ g、1 X IO7CFU及25 μ L，首免14d后同樣 劑量、途徑進(jìn)行二免。免疫期間水溫控制在25士 1°C。免疫保護(hù)性評(píng)價(jià)
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二免兩周后以50LD5(1SS2江蘇分離株HA9801通過腹腔注射進(jìn)行攻毒，連續(xù)觀察7d。 攻毒期間水溫控制在29士 1°C。測(cè)定相對(duì)保護(hù)率(RPS)，計(jì)算公式[17]為相對(duì)保護(hù)率(％ ) =[1_(免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)]X100%。5. 4試驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論二免兩周后以 50LD5(i SS2HA9801 腹腔注射攻毒。MRP、HM6、GAPDH、MRP-HM6 及GAPDH-MRP-HM6融合蛋白免疫組的相對(duì)保護(hù)率分別為38 %、38 %、32 %、50 %、48 %， SS2HA9801全菌滅活苗組的相對(duì)保護(hù)率達(dá)到62%，PBS對(duì)照組從12h魚陸續(xù)出現(xiàn)腹腔出血 癥狀并死亡，5d內(nèi)對(duì)照組魚全部死亡。具體見表表1融合蛋白的免疫保護(hù)效力試驗(yàn) 結(jié)論是重組融合蛋白對(duì)豬有48%的免疫保護(hù)率，經(jīng)過優(yōu)化和添加適當(dāng)佐劑，其免 疫保護(hù)效力會(huì)更高，其可作為預(yù)防豬鏈球菌亞單位疫苗。
權(quán)利要求
一種具有免疫原性的融合蛋白，其由豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2)溶菌酶釋放蛋白(MRP)、甘油醛脫氫酶(GAPDH)、吡啶二硫酸核苷酸氧化還原酶(HM6)融合而形成。
2.權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中GAPDH片段位于該融合蛋白的氨基端，MRP片段位 于該融合蛋白的中部，HM6片段位于該融合蛋白的羧基端。
3.權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其中所述的融合蛋白具有SEQID NO :5所示的氨基酸 序列。
4.一種用于預(yù)防和/或治療豬鏈球菌疾病的重組蛋白疫苗，其中含有權(quán)利要求1至4 中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，以及藥物學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。
5.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的融合蛋白在制備用于預(yù)防和/或治療豬鏈球菌疾病 藥物中的用途。
6.一種融合基因，其具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
7.—種重組構(gòu)建體，其中包含權(quán)利要求6所述的融合基因，該基因被可操作地連接于 表達(dá)調(diào)控區(qū)域。
8.一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞已被權(quán)利要求7所述的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。
9.用于制備權(quán)利要求6所述融合基因的試劑，其中包含核苷酸序列如SEQID NO :6、 SEQ IDN0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:12 禾口 SEQ ID NO 13所示的引物。
10.一種制備權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的方法，該方法包括(a)使用 權(quán)利要求7所述試劑擴(kuò)增得到融合基因SEQ ID NO 4 ； (b)獲得含融合基因SEQ ID NO :4的 重組構(gòu)建體；(c)用所述重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(d)將轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞置于足以表達(dá) 該融合蛋白的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種疫苗組合物及其制備方法，其中所述疫苗組合物中包括將豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2)毒力因子溶菌酶釋放蛋白(MRP)、甘油醛脫氫酶(GAPDH)以及新發(fā)現(xiàn)的膜蛋白吡啶二硫酸核苷酸氧化還原酶(HM6)基因融合表達(dá)而形成的融合蛋白，該融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)率。本發(fā)明還提供了編碼該融合蛋白的基因及擴(kuò)增該基因用的試劑和方法。
文檔編號(hào)A61K39/09GK101906166SQ201010230110
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者姚火春, 孫建和, 張煒, 梁陽秋, 范紅結(jié), 陸承平 申請(qǐng)人:陸承平