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能抑制her2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽的制作方法

文檔序號:1112411閱讀:299來源:國知局
專利名稱:能抑制her2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)中生物治療藥物范圍,特別涉及一種能抑制HER2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽。
背景技術(shù)
HER2(c-erbB2或HER2/neu,人表皮生長因子受體家族成員2)是I型跨膜酪氨酸激酶受體家族的成員。該家族通過與各種配體相互反應(yīng)及家族成員間的相互作用介導(dǎo)細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。迄今為止,尚未發(fā)現(xiàn)能與HER2高親和力結(jié)合的特異性配體,但HER受體家族其他成員及配體可與HER2形成復(fù)合物,介導(dǎo)細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在文獻“Wang S,Saboorian MH,F(xiàn)renkel E,et al.Laboratoryassessment of the status of HER-2/neu protein and oncogene in breast cancerspecimenscomparison of immunohistochemistry assay with fluorescence insitu hybridisation assays[J].J Clin Pathol,2000,53(5)374-381”、“Scheurle D,Jahanzeb M,Aronsohn RS,et al.HER-2/neu expression inarchival non-small cell lung carcinomas using FDA-approved Hercep test[J].Anticancer Res,2000,20(6)2091-2096.”和“Seliger B,Rongcun Y,Atkins D,et al.HER-2/neu is expressed in human renal cell carcinoma atheterogeneous levels independently of tumor grading and staging and canbe recognized by HLA-A2.1-restricted cytotoxic T lymphocytes[J].Int JCancer,2000,87(3)349-359.”中報道,HER2在許多上皮來源的惡性腫瘤中過表達,如乳腺癌(25%~30%)、卵巢癌(25%~32%)、原發(fā)性腎細胞癌(30%~40%)等。免疫組化染色可見乳腺癌細胞的HER2水平較正常乳腺細胞高10~100倍,使HER2成為理想的抗腫瘤免疫治療的靶標。1998年,美國Genentech公司開發(fā)的靶向HER2的治療性抗體Herceptin(trastuzumab,人源化單克隆抗體)已被FDA批準上市,應(yīng)用于HER2過表達的乳腺癌患者的臨床治療(Ross JS,Gray K,Gray GS,et al.Anticancer antibodies.Am J Clin Pathol,2003,119(4)472-485.)。臨床試驗結(jié)果表明,單獨應(yīng)用Herceptin的總反應(yīng)率為11.6-16%,而與化療藥物聯(lián)合治療的總反應(yīng)率可達50%。與單獨化療相比,抗體與化療聯(lián)合治療使進展期復(fù)發(fā)乳腺癌患者的生存期延長,死亡率降低。目前,研究者正在拓展Herceptin的應(yīng)用范圍,嘗試將其用于其他HER2過表達腫瘤的臨床治療,探索新的聯(lián)合治療方案(Schneider JW,Chang AY,Garratt A,et al.Trastuzumab cardio-toxicityspeculations regarding pathophysiology andtargets for further study.Semin Oncolr,2002,29(3 suppl 11)22-28.Jahanzeb M.Trastuzunab-based combinations in metastatic breast cancerhow to make a choice.Clin Breast Cancer.2003,4(1)28-38.)。
表1 應(yīng)用Herceptin臨床治療的觀察結(jié)果

但是,Herceptin為完整抗體,分子量高達150kDa,不能通過血腦屏障,更難以穿透腫瘤組織,深入瘤體內(nèi)部發(fā)揮作用。因此,單獨應(yīng)用Herceptin治療的有效率十分有限。此外,全抗體的生產(chǎn)必須采用哺乳動物細胞表達系統(tǒng),而我國應(yīng)用哺乳動物細胞表達重組蛋白的技術(shù)水平較低,因而生產(chǎn)成本高。目前,國內(nèi)治療性抗體的大規(guī)模生產(chǎn)正面臨重重困難。
為克服大分子抗體組織滲透性差的缺陷,為繞開哺乳動物細胞表達的技術(shù)瓶頸,國內(nèi)外正在開發(fā)各種靶向HER2的小分子多肽類抑制劑。這些小分子抑制劑雖然副作用小,但由于半壽期短,發(fā)揮有效作用的時間很短暫,因而需要重復(fù)給藥,用藥劑量較大,難免給患者帶來經(jīng)濟上的負擔(dān)。
本發(fā)明試圖研制開發(fā)靶向HER2的新型小分子多肽。該多肽分子具有如下特點1、分子量小,穿透性能好;2、可在原核表達系統(tǒng)中表達,生產(chǎn)成本低;3、具有很好的穩(wěn)定性,能在一定范圍內(nèi)耐受酸堿度及溫度的變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能抑制HER2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽。其特征在于所述小分子多肽是自行設(shè)計的靶向HER2受體分子的小分子拮抗肽,并采用人細胞中天然存在的跨膜蛋白為骨架,與拮抗肽相融合,應(yīng)用原核表達體系表達;所述小分子多肽由自行設(shè)計的基因編碼,經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成后插入表達質(zhì)粒pET-22b(Novagen公司);同時將TrxA基因(編碼硫氧還蛋白,Genebank)插入pET-22b,以輔助目的蛋白折疊,實現(xiàn)可溶性共表達。將表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21/DE3(Novagen公司),在含有1mmol·L-1IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),25-28℃下誘導(dǎo)表達。破菌取上清,應(yīng)用Ni離子親合層析柱純化,咪唑緩沖液洗脫獲得純化的目的蛋白,命名為PL45;其序列為MNTSGDTGFDGYSGQNSGGGGSMDLAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKEITFLKNTVMECDAC。
本發(fā)明的有益效果是通過體外實驗證實1.采用人細胞中天然存在的跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白作為骨架,顯著提高了小分子多肽的穩(wěn)定性;2.所產(chǎn)生的小分子肽在骨架蛋白的作用下,可形成五聚體,與線性肽相比,抑制高表達HER2的腫瘤細胞生長的作用明顯增強,其作用具有特異性。3.由于采用的是人源天然結(jié)構(gòu)域蛋白作為骨架,該小分子肽將不會導(dǎo)致異源性;4.該小分子多肽可應(yīng)用原核表達體系制備,可極大地提高表達量,從而大大降低成本。


圖1為重疊PCR合成PL45基因。
圖2為含有目的基因的表達載體的鑒定。
圖3SDS-PAGE電泳分析見純化蛋白為單一條帶,還原條件下分子量為9kDa。
圖4在不同溫度及pH變化的條件下,PL45的性質(zhì)十分穩(wěn)定,不發(fā)生解聚。
圖5在37℃下孵育,隨時間的延長,PL45的聚合狀態(tài)不變。
圖6示PL45能特異性地抑制HER2過表達的SKBR3細胞增殖,而對低表達HER2的MCF7細胞則無明顯抑制作用。
圖7熒光標記的PL45與高表達HER2的SKBR3細胞結(jié)合活性較強,而與低表達HER2的MCF7細胞結(jié)合較弱。
圖8為采用重迭延伸拼接法重疊PCR合成PL45基因示意圖。
圖9為經(jīng)CR拼接而成目的基因的結(jié)構(gòu)框圖。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種能抑制HER2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽。所述小分子多肽由自行設(shè)計的基因編碼,經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成后插入表達質(zhì)粒pET-22b(Novagen公司);同時將TrxA基因(編碼硫氧還蛋白,Genebank)插入pET-22b,以輔助目的蛋白折疊,實現(xiàn)可溶性共表達。將表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21/DE3(Novagen公司),在含有1mmol·L-1IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),25-28℃下誘導(dǎo)表達。破菌取上清,應(yīng)用Ni離子親合層析柱純化,咪唑緩沖液洗脫獲得純化的目的蛋白,命名為PL45;其序列為MNTSGDTGFDGYSGQNSGGGGSMDLAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKEITFLKNTVMECDAC。
具體構(gòu)建如下1.表達載體的構(gòu)建目的基因分7段由賽百盛公司合成,經(jīng)重疊PCR法拼接;通過限制性內(nèi)切酶Sac I和HindIII雙酶切后,插入pET-22b質(zhì)粒(Novagen),見圖1。構(gòu)建的表達載體經(jīng)酶切鑒定正確(見圖2),基因序列送上海申能博彩生物技術(shù)公司測序鑒定。
2.在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/DE3,挑取單菌落接種于含100mg/L氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4,加入IPTG 1mmol/L,在25-28℃下,130r/min,繼續(xù)培養(yǎng)8h誘導(dǎo)表達。
3.純化收集轉(zhuǎn)化菌,重懸于磷酸鹽緩沖液,超聲破菌獲取上清,應(yīng)用Ni離子親合層析柱(本元正陽公司)純化蛋白,咪唑(北京化學(xué)試劑公司)緩沖液洗脫,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,所獲目的蛋白的純度超過90%,分子量為9kDa,見圖3。
4.純化蛋白的鑒定委托國家生物醫(yī)學(xué)分析測試中心色譜室完成純化PL45的N端測序,證實氨基酸序列與設(shè)計的相符。
5.穩(wěn)定性常規(guī)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時,PL45表現(xiàn)為分子量為9kDa的單一條帶;而在不含SDS的條件下,分子量為45kDa,表明PL45在溶液中是以五聚體的形式存在。將樣品分別置于pH 6.4、pH 7.4、pH 8.4的緩沖液中,36℃、39℃、42℃下孵育8小時以及37℃下孵育4小時、8小時、12小時、24小時、36小時、72小時、96小時后取出,PAGE電泳分析,可見PL45分子量仍為45kDa,表明其在溫度及酸堿度變化的一定范圍內(nèi),性質(zhì)十分穩(wěn)定,無解聚現(xiàn)象(見圖4、圖5)。
6.功能試驗樣品透析除去咪唑后,經(jīng)孔徑0.22μm的微孔濾膜過濾除菌,BCA法定量。選用過表達HER2的乳腺癌細胞系SKBR3細胞作為靶細胞,用低表達HER2抗原的乳腺癌細胞系MCF7細胞作為對照細胞,接種于96孔培養(yǎng)板(每孔4×103個細胞),接種的同時加入純化的PL45(濃度分別為10和40μg/ml),給藥后分別于24小時、48小時、72小時、96小時加入MTT 10μl(5mg/ml),孵育4小時后,加入120μl DMSO,振蕩20分鐘后,測A570。結(jié)果顯示,PL45具有抑制HER2過表達的SKBR3細胞增殖的作用,而對低表達HER2的MCF7細胞則無明顯的細胞毒性(見圖6)。
7.與HER2分子的結(jié)合活性FITC標記純化的PL45,應(yīng)用流式細胞儀檢測PL45與高表達HER2分子的SKBR3細胞的結(jié)合活性。圖7顯示,熒光標記的PL45可以與SKBR3細胞結(jié)合,而與低表達HER2的乳腺癌細胞系MDA231細胞的結(jié)合活性較弱。
本發(fā)明的重要意義在于1、采用人細胞中天然存在的跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白作為骨架,顯著提高了小分子多肽的穩(wěn)定性;2、所產(chǎn)生的小分子肽在骨架蛋白的作用下,可形成五聚體,與線性肽相比,抑瘤作用明顯增強。3、由于采用的是人源天然結(jié)構(gòu)域蛋白作為骨架,該小分子肽將不會導(dǎo)致異源性;4、該小分子多肽可應(yīng)用原核表達體系制備,可極大地提高表達量,從而大大地降低成本。
實施例1材料E.coli JM109、E.coli BL21/DE3工程菌株為本室凍存;T4 DNA連接酶為Gibco BRL公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶為Biolab公司產(chǎn)品;Taq DNA聚合酶、克隆載體pGEM-T Easy為Promega公司產(chǎn)品;Ex Taq DNA聚合酶為TaKaRa公司產(chǎn)品;表達載體pET-22b(Novagen公司)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院八所趙志虎博士惠贈;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒購自北京博大泰克生物技術(shù)公司;IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)為Calbiochem公司產(chǎn)品;Ni離子親合層析介質(zhì)購自本元正陽公司;咪唑購自北京化學(xué)試劑公司;胎牛血清(FCS)、DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基為HyClone公司產(chǎn)品;MTT(四噻唑藍)為Sigma公司產(chǎn)品。
2方法2.1表達載體的構(gòu)建基因片段由賽百盛公司合成,七段序列如下[1]5’cgagctcatgaacacctctggtgacaccggtttcgac[2]5’gtgacaccggtttcgacggttactctggtcagaactc[3]5’tactctggtcagaactctggtggtggtggttctatggatctggctcct[4]5’ctgaaggctactctacaggctctggtggtccgatggatctggctcct caaatg[5]5’gctcctcaaatgcttcgtgagcttcaggaaaccaatgctgctctgca ggacgt[6]5’tctgcaggacgttcgtgaactgctgcgtcagcaggttaaagaaatca ccttcc[7]5’cccaagcttgcaagcgtcgcattccataacggtgtttttcaggaaggt gattt用H2O將各引物稀釋至終濃度為20mM的工作液。各片段之間有部分重復(fù)序列,以引物[7]為3’端引物,采用重迭延伸拼接法(Splicing by overlap extension,SOE),第一次PCR將[6]與[7]拼接起來,產(chǎn)物作為第二次PCR反應(yīng)的模板;第二次PCR仍以[7]為3’端引物,將[5]加入,產(chǎn)物作為第三次PCR反應(yīng)的模板,依次類推。使用保真性能好的Ex Taq DNA聚合酶,經(jīng)六次PCR拼接而成目的基因(見圖8);經(jīng)CR拼接而成目的基因的結(jié)構(gòu)框圖如圖9所示。
PCR反應(yīng)體系為 反應(yīng)條件為H2O 37μl 95.5℃2’Ex Taq Buffer(10×)5μldNTP(2.5mM) 4μlprimer 5’2μlprimer 3’2μlEx TaqDNA聚合酶0.25μl終產(chǎn)物全長217bp,序列為cgagctcatgaacacctctggtgacaccggtttcgacggttactctggtcagaactctggtggtggtggttctatggacctggctccgcagatgctgcgtgaactgcaggaaaccaacgctgctctgcaggacgttcgtgaactgctgcgtcagcaggttaaagaaatcaccttcctgaaaaacaccgttatggaatgcgacgcttgcaagcttggg在基因片段兩端設(shè)計了Sac I(gagctc)和HindIII(aagctt)兩個限制性酶切位點,雙酶切連入pET-22b質(zhì)粒。
連接體系為H2O 3μlBuffer(2×)7.5μlFragment3μlpGEM-T Easy0.8μl連接酶0.7μl另設(shè)對照組,不加Fragment,以H2O補足體積。16℃水浴過夜。
用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌。轉(zhuǎn)化步驟為1)100μl感受態(tài)菌置于冰水,加入DNA 0.5μl,靜置30分鐘;2)42℃水浴2分鐘;3)冰浴5分鐘;4)加入不含抗生素的LB培養(yǎng)基,37℃下,150rpm振蕩培養(yǎng)50分鐘。
5)將轉(zhuǎn)化菌接種于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板,置37℃孵箱培養(yǎng)過夜。
6)挑選陽性克隆4個,分別接種于LB液體培養(yǎng)基,置37℃搖床震蕩培養(yǎng)。
2.2載體的鑒定1)用試劑盒提取陽性克隆質(zhì)粒DNA。
2)用Sac I和HindIII雙酶切鑒定質(zhì)粒DNA,送上海申能博彩生物技術(shù)公司測序。
雙酶切體系為H2O 18μlBuffer(10×)4μlDNA 16μlSac I 1μlHindIII 0.9μl。
37℃水浴4小時。
2.3誘導(dǎo)表達將測序結(jié)果正確的菌株擴增,提取質(zhì)粒DNA,轉(zhuǎn)化BL21/DE3菌。在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6時,加入IPTG,將搖床轉(zhuǎn)速降至約130rpm,誘導(dǎo)8小時。
2.4表達產(chǎn)物的鑒定將誘導(dǎo)后的菌液收集至離心管,4℃,6000rpm離心5分鐘,棄上清。以原菌液15%體積的冷PBS(磷酸鹽)緩沖液重懸沉淀,置于液氮中速凍,然后取出在室溫下融化。反復(fù)凍融9次后,在4℃下、12000rpm離心10分鐘,分別收集上清和沉淀。
在沉淀和上清中加入SDS-PAGE的上樣緩沖液,煮沸10分鐘后,15%SDS-PAGE電泳,常規(guī)考馬斯亮藍染色。
2.5純化應(yīng)用Ni離子親合層析柱純化,咪唑緩沖液洗脫。純化中使用了平衡緩沖液(A)和系列濃度梯度的洗脫緩沖液(B)。
A液0.15mol/L NaCl
0.09mol/L Na2HPO40.01mol/L NaH2PO4在A液中加入不同濃度的咪唑即配成不同濃度的B液,系列為B20(20mmol/L咪唑);B50(50mmol/L咪唑);B100(100mmol/L咪唑);B170(170mmol/L咪唑);B300(300mmol/L咪唑);B500(500mmol/L咪唑)。所有液體均用HCl/NaOH調(diào)至pH 7.8。
純化步驟如下1).用A液重懸菌體沉淀,凍融破菌。
2).10000g×10min、4℃下離心,去除沉淀,用0.45μm微孔濾膜過濾。
3).用A液平衡親和層析柱,以60ml/h速度上樣;用A液充分洗柱再平衡至檢測器指示平穩(wěn)。
4).B液梯度洗脫結(jié)合蛋白,分別收集洗脫液。B20和B50洗下大量蛋白,B100和B170洗脫的蛋白很少,B300和B500再次洗下較多蛋白。各濃度B液均使用5倍柱床體積。
純化產(chǎn)物經(jīng)Tris-Tricine-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色檢測,所獲目的蛋白分子量正確,純度超過90%。
2.6鑒定委托國家生物醫(yī)學(xué)分析中心色譜室完成目的蛋白的N端測序,由N端11個氨基酸殘基的測序結(jié)果知表達正確。完整表達的產(chǎn)物全長序列應(yīng)為MELMNTSGDTGFDGYSGQNSGGGGSMDLAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKEITFLKNTVMECDACKLAAALEHHHHHH2.7穩(wěn)定性試驗2.7.1聚合性1)非變性電泳可見表達產(chǎn)物為單一條帶,分子量為45kDa,而常規(guī)SDS-聚丙烯酰胺變性凝膠電泳時亦為單一條帶,其分子量為9kDa。
2)質(zhì)譜分析委托國家生物醫(yī)學(xué)分析中心質(zhì)譜室完成。MALDI-TOF-MS結(jié)果顯示,溶液中單體、二聚體、三聚體、四聚體和五聚體同時存在,但占優(yōu)勢的組分的分子量為45kDa,質(zhì)譜分析時的電離過程可能影響蛋白的結(jié)構(gòu)。
3)目的蛋白不能通過孔徑為10kDa的超濾膜。
2.7.2熱、酸、堿穩(wěn)定性目的蛋白在含咪唑的磷酸鹽溶液中表現(xiàn)出了極強的穩(wěn)定性。在37℃水浴時,分別于4小時、8小時、12小時、24小時、36小時、48小時、72小時及96小時后取出,電泳分析各組與對照組(4℃)幾乎無差別,即蛋白不發(fā)生解聚。再設(shè)多個不同溫度組,8小時后電泳分析發(fā)現(xiàn),各組與對照組(4℃)幾乎無差別。
耐酸、堿實驗設(shè)不同pH組,8小時后電泳分析,各組蛋白仍以五聚體形式存在。
2.8功能實驗純化后的蛋白經(jīng)透析除去咪唑,正壓超濾濃縮后,經(jīng)孔徑0.22μm的HT微孔濾膜過濾除菌。BCA法定量。MTT法驗證其抑制腫瘤細胞增殖的作用。
1)選用過表達HER2抗原的乳腺癌細胞系SKBR3細胞作為靶細胞,用低表達HER2抗原的乳腺癌細胞系MCF7細胞及低表達HER2抗原的鼠成纖維細胞系NIH3T3和L929作為對照細胞。
2)使用源自相同表達體系的TrxA作為陰性對照蛋白,治療性抗體Herceptin作為陽性對照蛋白,實驗組為PL45,設(shè)4μg·ml-1(五聚分子100nmol·L-1)和40μg·ml-1(1μmol·L-1)兩個劑量組,另設(shè)不經(jīng)處理的細胞對照組。
3)細胞生長狀態(tài)良好時接種96孔培養(yǎng)板,每孔4-5×103個細胞,接種的同時給藥,置于37℃孵箱,5%CO2條件下培養(yǎng)。
4)給藥后分別于24小時、48小時、72小時、96小時加入MTT(5mg·ml-1)10μl,孵育7小時后拍干,加入120μl DMSO,振蕩20分鐘后測A570。
實驗證實,PL45具有類似Herceptin的抑制過表達HER2的SKBR3細胞增殖的作用,且其作用特異,對于多種低表達或不表達HER2的細胞(MCF7、NIH3T3、L929)無明顯的細胞毒性。
權(quán)利要求
1.一種能抑制HER2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽,其特征在于所述小分子多肽是自行設(shè)計的靶向HER2受體分子的小分子拮抗肽,采用人細胞中天然存在的跨膜蛋白為骨架,與拮抗肽相融合,其編碼基因經(jīng)重疊PCR拼接合成,插入表達質(zhì)粒pET-22b;應(yīng)用Ni離子親合層析柱純化,咪唑緩沖液洗脫獲得純化蛋白,命名為PL45,其氨基酸序列為MNTSGDTGFDGYSGQNSGGGGSMDLAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKEITFLKNTVMECDAC。
2.權(quán)利要求1的能抑制HER2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽,其特征在于基因表達的全長氨基酸序列為MELMNTSGDTGFDGYSGQNSGGGGSMDLAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKEITFLKNTVMECDACKLAAALE。
3.權(quán)利要求1的能抑制HER2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽,其特征在于單體分子量為9kDa。
4.權(quán)利要求1的能抑制HER2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽,其特征在于所述小分子多肽形成五聚體,分子量為45kDa。
5.權(quán)利要求1的能抑制HER2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽,其特征在于目的基因分7段合成,經(jīng)重疊PCR法拼接;通過限制性內(nèi)切酶Sac I和Hind III雙切后插入pET-22b質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求1的能抑制HER2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽,其特征在于所述表達載體的轉(zhuǎn)化細胞為大腸桿菌BL21/DE3。
7.權(quán)利要求1的能抑制HER2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽,其特征在于通過原核表達系統(tǒng)表達。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于生物醫(yī)學(xué)中生物治療范圍的一種能抑制HER2高表達腫瘤細胞增殖的穩(wěn)定的小分子多肽PL45。該小分子多肽PL45為自行設(shè)計的靶向HER2S1-L2功能域的拮抗分子,由全合成的基因編碼,克隆入表達質(zhì)粒pET-22b;同時將TrxA插入pET-22b,以輔助PL45折疊,實現(xiàn)可溶性共表達。用表達載體轉(zhuǎn)化BL21/DE3宿主菌,在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),1mmol·L
文檔編號A61P35/00GK1908015SQ20061000752
公開日2007年2月7日 申請日期2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者郭寧, 王嘉寧, 馮健男, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
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