專(zhuān)利名稱(chēng)：一種尖頂羊肚菌胞外多糖提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及具有藥用價(jià)值的真菌提取物，尤其涉及一種 尖頂羊肚菌(Morchella conica)胞外多糖提取物的制備方法及其抗氧化和延緩衰老的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對(duì)于食用菌多糖的提取和生物活性研究，目前已有報(bào)道大多是從食用菌子實(shí)體中 提取多糖，如方一泓等人用茶樹(shù)菇(Agrocybe aegerita)子實(shí)體經(jīng)熱水提取，Sevage法脫 蛋自質(zhì)，乙醇沉淀得到的茶樹(shù)菇多糖(食用菌學(xué)報(bào)，2006，13 (4) 63-68)；又如賈建會(huì)等人 用半合成培養(yǎng)基深層發(fā)酵產(chǎn)生的羊肚菌菌絲體和發(fā)酵液為主要原料提取羊肚菌多糖(食 品科學(xué)，2002，23 (4) :59-62)。一方面利用子實(shí)體獲得的多糖，需耗費(fèi)大量資源，目前尖頂羊 肚菌子實(shí)體較難進(jìn)行人工栽培，自然環(huán)境生長(zhǎng)采集的野生子實(shí)體數(shù)量稀少，用來(lái)提取多糖 成本高；另一方面利用半合成培養(yǎng)基深層發(fā)酵對(duì)所得的多糖成分及含量影響較大，不利于 分離純化和生理功效鑒定。研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、降血脂及抗菌等 作用，具有重要的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值(陳彥等，2008 ；張利平等，2009 ；明建等，2009)，但目前 還未見(jiàn)有關(guān)尖頂羊肚菌胞外多糖抗氧化和延緩衰老作用的相關(guān)報(bào)道。發(fā)明的內(nèi)容為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種培養(yǎng)容易、 提取方法簡(jiǎn)單可靠、成本低的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供上述尖頂羊肚菌胞外多糖提取物在制備抗氧化和 延緩衰老作用藥物或保健食品中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的一種尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法，包括如下步驟(1)將尖頂羊肚菌液體發(fā)酵液濃縮至原體積的1/3 1/6，得到濃縮液，濃縮溫度 為 50 70°C ；(2)濃縮液采用Sevage法去蛋白、離心，得到去蛋白后的活性提取液；(3)去蛋白后的活性提取液用1 5倍體積的95%乙醇在0 10°C透析沉降濃縮 液中的多糖12 25小時(shí)，pH值為4 8，靜置析出絮狀白色物質(zhì)，再離心分離得到白色沉 淀，冷凍干燥，制得尖頂羊肚菌胞外多糖提取物。所述步驟(2)SerVge法去蛋白、離心在濃縮液中加入0. 2倍體積的氯仿正丁醇混 合液(氯仿、正丁醇體積比為5 1)，在恒溫磁力攪拌器上劇烈攪拌30分鐘，溫度25°C，用 Sigma臺(tái)式冷凍離心機(jī)，溫度4°C，以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，回收上清液，棄去蛋白層 及有機(jī)溶液。所述步驟(3)離心條件為轉(zhuǎn)速4000-5000rpm、時(shí)間20-30min，其中優(yōu)選轉(zhuǎn)速 4000rpm、時(shí)間 20min。
進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)以確定最佳條件①取等量濃縮多糖提取液5份，每組30mL，分裝 于5個(gè)燒杯中，分別加入1 5倍體積的95%乙醇進(jìn)行醇析，離心收集沉淀，然后測(cè)定胞外 多糖提取率。②醇析時(shí)間選取5h、12h、15h、25h。③分別濃縮至原體積的1/3、1/4、1/5、1/6。 ④濃縮溫度為50°C、60°C、7(rC。⑤醇提pH值選取自然、4、5、6、7、8。按以上五方面進(jìn)行單 因素實(shí)驗(yàn)，獲得最佳醇提條件發(fā)酵液濃縮至原體積的1/5，濃縮溫度為60°C，用4倍體積的 95%乙醇進(jìn)行醇析，醇析時(shí)間25小時(shí)，pH值為6。所述尖頂羊肚菌液體發(fā)酵液是經(jīng)過(guò)尖頂羊肚菌(Morchella conica)液體發(fā)酵培 養(yǎng)，得到發(fā)酵物，再通過(guò)離心和真空抽濾分離菌絲體，獲得的發(fā)酵液。所述離心條件優(yōu)選轉(zhuǎn) 速 4000rpm、時(shí)間 IOmin。所述尖頂羊肚菌(Morchella conica)液體發(fā)酵培養(yǎng)是將尖頂羊肚菌(Morchella conica)接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，其液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖150g，硝酸 銨 6g，ΚΗ2Ρ043· Og, MgSO4 · 7Η20 3. Og，維生素 BIO. 3g，加蒸餾水定容至 3000ml。 所述發(fā)酵培養(yǎng)的步驟是(1)取100ml所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌后，在其中接 入3個(gè)直徑約為4mm的尖頂羊肚菌菌絲塊，在25 28°C，轉(zhuǎn)速130 160rpm，避光恒溫振 蕩培養(yǎng)6 8天，得到液體菌種；(2)將上述液體菌種接入3L滅菌后的所述液體發(fā)酵培養(yǎng) 基中，培養(yǎng)溫度為25 28°C，轉(zhuǎn)速為130 160rpm，培養(yǎng)5 9天，得到發(fā)酵物，備用。由上述方法制備得到的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物，經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定含總糖 84.0%左右，經(jīng)DNS比色法測(cè)定含還原糖25. 7%左右，經(jīng)考馬斯亮蘭法測(cè)定含蛋白5. 07% 左右ο本發(fā)明對(duì)上述制備所得尖頂羊肚菌胞外多糖提取物進(jìn)行體外抗氧化測(cè)試，以Vc 為陽(yáng)性對(duì)照，并對(duì)其清除ABTS自由基、羥基自由基以及超氧陰離子的作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明lmg/mL的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)超氧陰離 子的抑制率為20. 81% ；對(duì)羥基自由基的抑制率為72. 4% ；0. lmg/mL尖頂羊肚菌胞外多糖 提取物對(duì)ABTS自由基的抑制率可達(dá)77. 43%。此尖頂羊肚菌胞外多糖提取物具有良好的抗 氧化能力。本發(fā)明對(duì)上述制備所得尖頂羊肚菌胞外多糖提取物進(jìn)行果蠅壽命測(cè)試。首先配制 果蠅基本培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入尖頂羊肚菌胞外多糖提取物然后觀察果蠅的平均壽 命延長(zhǎng)率、半數(shù)死亡時(shí)間和最高壽命。結(jié)果表明尖頂羊肚菌胞外多糖提取物可明顯延長(zhǎng) 果蠅的壽命。濃度為0. 2g/L的尖頂羊肚菌多糖提取物可使雌雄果蠅的平均壽命分別延長(zhǎng) 22. 18%和30. 27% ；使雌雄果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間分別延長(zhǎng)20. 55%和32. 35% ；使雌雄果蠅 的最高壽命分別延長(zhǎng)20. 39%和31. 52%。它對(duì)果蠅壽命的影響存在著性別差異，對(duì)雄性果 蠅的延壽效果優(yōu)于對(duì)雌性果蠅。本發(fā)明對(duì)上述制備所得尖頂羊肚菌胞外多糖提取物進(jìn)行小鼠延緩衰老功效測(cè)試。 用該提取物對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠進(jìn)行灌胃，觀察其對(duì)小鼠大腦超氧化物歧化酶 (SOD)活性、脂褐素(LF)和丙二醛(MDA)含量的影響。結(jié)果表明，50mg/kg · d的尖頂羊肚 菌胞外多糖提取物能使雄性、雌性小鼠腦SOD活性分別提高20. 70% (p< 0. 05)、21. 13% (ρ < 0. 05)，LF 含量分別降低 35. 14% (ρ < 0. 01)、44. 79% (ρ < 0.01), MDA 含量分別減 少15. 10%、15. 61%，表明尖頂羊肚菌胞外多糖提取物具有良好的延緩衰老作用，且具有性 別的差異，對(duì)雌性小鼠延緩衰老效果略?xún)?yōu)于對(duì)雄性小鼠。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明所得尖頂羊肚菌胞外多糖提取物具有良好的抗氧化，延壽和延 緩衰老作用，可作為生產(chǎn)尖頂羊肚菌胞外多糖提取物單體、抗氧化和延緩衰老藥物與保 健食品開(kāi)發(fā)的原料，該提取物在抗氧化和延緩衰老藥物與保健食品應(yīng)用中的使用劑量為 50mg/kg d0與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)本發(fā)明的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物，可采用發(fā)酵罐生產(chǎn)，從發(fā)酵液中提取， 不但制備過(guò)程簡(jiǎn)單，條件易控制，而且可大批量工廠化生產(chǎn)。(2)本發(fā)明使用合成培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，不但培養(yǎng)基成分精確，重復(fù)性強(qiáng)，而且多糖 易于分離純化。(3)本發(fā)明所得胞外多糖提取物，來(lái)源于尖頂羊肚菌液體發(fā)酵液，而且提取過(guò)程中 沒(méi)有加入任何有害成分，具有對(duì)人體無(wú)毒害的優(yōu)點(diǎn)。(4)本發(fā)明所得尖頂羊肚菌胞外多糖提取物溶解性好，具有良好的抗氧化、延壽和 延緩衰老作用。


圖1為尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)超氧陰離子自由基的抑制作用圖；圖2為尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)羥基自由基的抑制率圖；圖3為尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)ABTS+自由基的抑制作用圖；圖4為尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)小鼠S0D、LF、MDA生化指標(biāo)的影響圖(注Y 軸表示各組與模型組比較，SOD增加的百分比以及LF、MDA減少的百分比)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此，對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。實(shí)施例1一種尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法，步驟如下(1)尖頂羊肚菌GIM5. 70 (Morchella conica)(從廣東省微生物菌種保藏中心購(gòu) 買(mǎi)。)經(jīng)斜面或平板菌種培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。具體的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件如下①斜面或平板菌種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為，馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨lg， (NH4)2S042g，MgS04 7H20 lg, KH2P04lg，瓊脂 20g，加蒸餾水定容至 1000ml, pH 調(diào)至 6. 5 ；然 后接入1個(gè)直徑約為4mm的尖頂羊肚菌菌絲塊，26°C培養(yǎng)14天，置于4°C保存?zhèn)溆谩＂谝后w振蕩培養(yǎng)以NH4N03作為氮源，葡萄糖或可溶性淀粉作為碳源，以及初始pH 和接種量作為考察因素最終確定合成培養(yǎng)基配方為葡萄糖50g，硝酸銨2g，KH2P041. 0g, MgS04 7H20 l.Og，維生素B10. lg，加蒸餾水定容至lOOOmL,自然pH值；培養(yǎng)條件為取 100mL上述合成培養(yǎng)基裝入250mL三角瓶，在121°C滅菌30分鐘，并接入3個(gè)直徑約為4mm 的尖頂羊肚菌菌絲塊在25°C，轉(zhuǎn)速160rpm，避光恒溫振蕩培養(yǎng)7天，得到液體菌種。③液體發(fā)酵培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基3L (葡萄糖150g，硝酸銨6g，KH2P043. 0g， MgS04 7H20 3. Og,維生素B10. 3g，加蒸餾水定容至3000ml)轉(zhuǎn)入5L發(fā)酵罐培養(yǎng)，再接入IOOmL上述液體菌種，培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為130rpm，培養(yǎng)7天，即可得到菌絲體豐富，菌球豐富、均勻，顏色微黃的發(fā)酵物，備用。(2)將發(fā)酵物通過(guò)離心和真空抽濾分離菌絲體，獲得澄清的發(fā)酵液。①離心Sigma臺(tái)式冷凍離心機(jī)，以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘。②真空抽濾真空抽濾，使菌絲體與發(fā)酵液分離，得發(fā)酵液，備用。(3)濃縮發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將發(fā)酵液在60°C的恒溫水浴鍋中減壓濃縮至原體 積的1/5。(4)去蛋白、離心=Sevage法去蛋白，加入0. 2倍體積的氯仿正丁醇混合液(氯仿、 正丁醇體積比為5 1)，在恒溫磁力攪拌器上劇烈攪拌30分鐘，溫度25°C ；用Sigma臺(tái)式 冷凍離心機(jī)，溫度4°C，以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，回收上清液，棄去蛋白層及有機(jī)溶
液，重復(fù)多次。(5)將去蛋白后的活性提取液加入其4倍體積的95%乙醇在4°C透析沉降25h，調(diào) PH值為6，靜置過(guò)夜，析出絮狀白色物質(zhì)，以4000rpm、20分鐘離心分離得到白色沉淀，冷凍 干燥，即制得目標(biāo)產(chǎn)物尖頂羊肚菌胞外多糖提取物。尖頂羊肚菌GIM5. 70胞外多糖提取物，經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定含總糖84. 0%，經(jīng)DNS比 色法測(cè)定含還原糖25. 7%，經(jīng)考馬斯亮蘭法測(cè)定含蛋白5. 07%。實(shí)施例2一種尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法，步驟如下(1)將尖頂羊肚菌經(jīng)斜面或平板菌種培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)。具體的 培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件同實(shí)施例1。(2)將發(fā)酵物通過(guò)離心和真空抽濾分離菌絲體，獲得澄清的發(fā)酵液。具體方法同實(shí) 施例1。(3)濃縮發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50°C的恒溫水浴鍋中減壓濃縮至原體積的1/3。(4)去蛋白、離心同實(shí)施例1。(5)將去蛋白后的活性提取液加入其1倍體積的95%乙醇在0°C透析沉降15h，pH 值為4，靜置過(guò)夜，析出絮狀白色物質(zhì)，以5000rpm、30分鐘離心分離得到白色沉淀，冷凍干 燥，即制得目標(biāo)產(chǎn)物尖頂羊肚菌胞外多糖提取物。尖頂羊肚菌GIM5. 70胞外多糖提取物，經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定含總糖84. 0%，經(jīng)DNS比 色法測(cè)定含還原糖25. 7%，經(jīng)考馬斯亮蘭法測(cè)定含蛋白5. 07%。實(shí)施例3一種尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法，步驟如下(1)將尖頂羊肚菌經(jīng)斜面或平板菌種培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)。具體的 培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件同實(shí)施例1。(2)將發(fā)酵物通過(guò)離心和真空抽濾分離菌絲體，獲得澄清的發(fā)酵液。具體方法同實(shí) 施例1。(3)濃縮發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70°C的恒溫水浴鍋中減壓濃縮至原體積的1/6。(4)去蛋白、離心同實(shí)施例1。(5)將去蛋白后的活性提取液加入其5倍體積的95%乙醇在10°C透析沉降25h， PH值為8，靜置過(guò)夜，析出絮狀白色物質(zhì)，以4500rpm、25分鐘離心分離得到白色沉淀，冷凍干燥，即制得目標(biāo)產(chǎn)物尖頂羊肚菌胞外多糖提取物。尖頂羊肚菌GIM5. 70胞外多糖提取物，經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定含總糖84. 0%，經(jīng)DNS比色法測(cè)定含還原糖25. 7%，經(jīng)考馬斯亮蘭法測(cè)定含蛋白5. 07%。實(shí)施例4—種尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法，步驟如下(1)將尖頂羊肚菌經(jīng)斜面或平板菌種培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)。具體的 培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件同實(shí)施例1。(2)將發(fā)酵物通過(guò)離心和真空抽濾分離菌絲體，獲得澄清的發(fā)酵液。具體方法同實(shí) 施例1。(3)濃縮發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60°C的恒溫水浴鍋中減壓濃縮至原體積的1/4。(4)去蛋白、離心同實(shí)施例1。(5)將去蛋白后的活性提取液加入其3倍體積的95%乙醇在5°C透析沉降12h，pH 值為自然，靜置過(guò)夜，析出絮狀白色物質(zhì)，以4000rpm、20分鐘離心分離得到白色沉淀，冷凍 干燥，即制得目標(biāo)產(chǎn)物尖頂羊肚菌胞外多糖提取物。尖頂羊肚菌GIM5. 70胞外多糖提取物，經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定含總糖84. 0%，經(jīng)DNS比 色法測(cè)定含還原糖25. 7%，經(jīng)考馬斯亮蘭法測(cè)定含蛋白5. 07%。實(shí)施例5尖頂羊肚菌胞外多糖提取物(實(shí)施例1制備的)體外抗氧化試驗(yàn)尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基和ABTS+自由基的 清除作用A、胞外多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用按抗超氧陰離子自由基試劑盒(購(gòu) 買(mǎi)于南京建成生物工程研究所)配制試劑，設(shè)對(duì)照組、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管。各按順序加入試劑 一 1. OmL，三管分別加蒸餾水、0. 5mg/mL的Vc標(biāo)準(zhǔn)品和樣品0. 05mL，試劑二(ml)、試劑三 (ml)、試劑四(ml)各0. lmL，用旋渦混勻器充分混勻，置37°C恒溫水浴40分鐘后加顯色劑 2. OmL,混勻，10分鐘后于550nm比色。計(jì)算公式樣品中抗超氧陰離子活力單位(U/g) = (Α對(duì)-A測(cè))/(A對(duì)-A標(biāo))X標(biāo)準(zhǔn)濃度 (0. 15mg/ml) XlOOOmlX樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)B、胞外多糖對(duì)羥基自由基的清除作用空白管取pH7. 4，0. 2mol/L的磷酸緩沖液1. OmL和4. OmL蒸餾水于試管中，混勻； 未損傷管(A未損傷)取1. OmL的磷酸緩沖液，0. 75mL鄰二氮菲、0. 5mLFeS04和2. 75mL蒸 餾水于試管中，混勻；損傷管(A損傷)同上，把未損傷管的蒸餾水改為2.25mL蒸餾水和 0. 5mL H202 (0. 1 %)的混合液；樣品管(A樣品)把未損傷管的蒸餾水改為0. 5mL H2O2和 1.25mL蒸餾水的混合液。37°C保溫60min，于波長(zhǎng)510nm處，測(cè)吸光度(A)值。計(jì)算公式抑制率= [A(樣)-A(損)]/[A(未)-A(損)]X100%C、胞外多糖對(duì)ABTS+自由基清除作用將5mL的7mmolPL ABTS和88 μ L的140mmol/L高硫酸鉀混合，在室溫、避光的條 件下靜置過(guò)夜，形成ABTS+自由基儲(chǔ)備液，用無(wú)水乙醇稀釋成工作液，要求當(dāng)在200 μ L工 作液中加入無(wú)水乙醇時(shí)其在30°C、734nm波長(zhǎng)下的吸光度為0.51 士0. 02，取不同濃度的各 樣品20 μ L，加入300 μ L的ABTS+工作液，以無(wú)水乙醇為空白，混合10s，30°C靜置7min，在734nm下測(cè)吸光度記為A，同法20 μ L無(wú)水乙醇中加入300 μ 1 ABTS+工作液混勻，測(cè)吸光度 記為Al ；不加ABTS+工作液的不同濃度的各樣品吸光度記為B。以Vc為陽(yáng)性對(duì)照組。計(jì)算 公式抑制率[Al-(A-B)]/Al X 100%試驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖1、圖2和圖3所示。從圖1可見(jiàn)，多糖對(duì)02_·自由基的清除能力以抑制率表示，抑制率越高，說(shuō)明多糖 抗氧化作用越強(qiáng)。2mg/mL的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物和Vc對(duì)02_ ·自由基抑制率分別為 43.06%、50.02%，兩者的抑制率接近。對(duì)02_·自由基的清除效率與多糖濃度呈一定的量 效關(guān)系，抑制作用隨著反應(yīng)體系中多糖濃度的增大而增強(qiáng)。由圖2可見(jiàn)，lmg/mL的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)羥基自由基的抑制率為 72. 4%，抑制率為50%對(duì)應(yīng)的濃度Vc為0. 58mgg/mL，此多糖的濃度為0. 81mg/mL。低濃度 時(shí)，Vc對(duì)清除羥基自由基作用的效果較佳，但隨著濃度的增加，多糖的作用也不斷加強(qiáng)，說(shuō) 明尖頂羊肚菌胞外多糖在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)羥基自由基具有一定的清除活性。從圖3可知，0. lmg/mL的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)ABTS自由基的抑制率為 77.43%。抑制率為50%對(duì)應(yīng)的濃度Vc為0. 027mg g/mL，多糖濃度為0. 026mg/mL。在一 定的濃度范圍內(nèi)，多糖對(duì)ABTS+自由基的清除效率和多糖濃度呈一定的量效關(guān)系，隨著多 糖濃度的增加，多糖對(duì)自由基的抑制率也逐步增加。實(shí)施例6尖頂羊肚菌胞外多糖提取物(實(shí)施例1制備的)對(duì)果蠅生存壽命影響試驗(yàn)(1)將成熟野生型黑腹果蠅(北京萬(wàn)域美瀾科技有限公司購(gòu)買(mǎi))裝入有基礎(chǔ)培養(yǎng) 基的50mL三角瓶?jī)?nèi)交配產(chǎn)卵，形成蛹時(shí)除去親本蠅，收取IOh內(nèi)羽化的果蠅，用乙醚將其麻 醉后，即分雌雄，挑取體型大小相近的果蠅隨機(jī)分組。多糖組的培養(yǎng)基采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基按 0. 2g/L、lg/L、5g/L、25g/L的濃度加入尖頂羊肚菌胞外多糖提取物。空白對(duì)照組用基礎(chǔ)培養(yǎng) 基培養(yǎng)。(2)每個(gè)濃度組共用160只果蠅，雌雄各半，各4支管，雌雄分養(yǎng)，每管20只果蠅。 多糖組的果蠅在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)到第14天后，轉(zhuǎn)到含不同濃度多糖提取物的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)直至其全部死亡。實(shí)驗(yàn)在溫度25 士 1 °C、相對(duì)濕度50 % 70 %的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，每4天 更換新鮮的培養(yǎng)基。每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)果蠅死亡數(shù)直至果蠅全部死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算每組的 平均壽命、半數(shù)死 亡時(shí)間和最高壽命(每組最后死亡的5只果蠅的平均存活天數(shù)為該組的 最高壽命)。本實(shí)施例的試驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表1所示。表1尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)果蠅壽命的影響 備注與同性別空白對(duì)照組比較，* :P<0.05 * :P< 0.01 (P是指幾組數(shù)據(jù)之 間的差異性)。從表1可知，0. 2g/L、lg/L、5g/L和25g/L四個(gè)濃度組的尖頂羊肚菌胞外多糖提取 物都能延長(zhǎng)雄性果蠅的平均壽命(P < 0. 01)和最高壽命(P < 0. 01)，平均壽命延長(zhǎng)率分別 為 30. 27%U2. 90%U2. 42%和 15. 84% ；最高壽命延長(zhǎng)率為 31. 52%,28. 39%U5. 20%和 37. 60%;濃度為0. 2g/L、lg/L的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物使雄性果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間分 別延長(zhǎng)了 32. 35%和 32. 09% (P < 0. 01)。0. 2g/L、lg/L、5g/L的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物能提高雌性果蠅的平均壽命，其 平均壽命延長(zhǎng)率分別為 22. 18% (P < 0. 01)U1. 37% (P < 0. 01)和 9. 04% (P < 0. 05)； 0.2g/L的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物使雌性果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間延長(zhǎng)了 20.55% (P < 0.01)，但隨多糖濃度的升高，雌性果蠅的平均壽命延長(zhǎng)率和半數(shù)死亡時(shí)間延長(zhǎng)率都呈下 降趨勢(shì)，0. 2g/L和25g/L的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物可延長(zhǎng)雌性果蠅的最高壽命，其最 高壽命延長(zhǎng)率分別為20. 39% (P < 0. 05)和25. 19% (P < 0. 01)。尖頂羊肚菌胞外多糖提取物能顯著延長(zhǎng)果蠅的壽命，不同濃度對(duì)果蠅的延壽效果 不一樣，0. 2g/L尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)果蠅平均壽命、半數(shù)死亡時(shí)間和最高壽命效 果更為明顯；25g/L的此多糖提取物對(duì)果蠅最高壽命的影響明顯(P < 0. 01)。尖頂羊肚菌 胞外多糖提取物對(duì)果蠅壽命的影響存在性別差異，對(duì)雄性果蠅的延壽效果要比對(duì)雌性果蠅 好。實(shí)施例7尖頂羊肚菌胞外多糖提取物延緩衰老作用的實(shí)驗(yàn)，所用的尖頂羊肚菌胞外多糖提 取物是由實(shí)施例1制備的。(1)尖頂羊肚菌胞外多糖提取物延緩衰老作用的實(shí)驗(yàn)(高劑量)①昆明種小鼠，SPF級(jí)，體重20士2克，由中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買(mǎi)，合格證 號(hào)SCXK (粵)2004-0011 ；粵監(jiān)證字2008A059。將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、造模組、陽(yáng)性對(duì)照組、尖頂羊肚菌多糖提取物高劑量組，每組10只，雌雄各半，自由進(jìn)食和飲水，造模組、 陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量組每天腹腔注射劑量為120mg/kg · d的D-半乳糖溶液0. 2mL，空白對(duì) 照組注射等量的生理鹽水，連續(xù)注射42天。高劑量組分別灌胃尖頂羊肚菌多糖提取物濃度 為800mg/kg · d，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃濃度為800mg/kg · d的維生素E，空白對(duì)照組和造模組分 別灌胃生理鹽水，各組小鼠的灌胃量均為0. 2mL。②實(shí)驗(yàn)周期42天，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定小鼠腦的SOD活性，硫代巴 比妥酸法測(cè)定小鼠腦MDA含量，熒光比色法測(cè)定小鼠腦LF含量。(2)尖頂羊肚菌胞外多糖提取物延緩衰老作用的實(shí)驗(yàn)(中劑量)①昆明種小鼠，SPF級(jí)，體重20 士 2克，由中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買(mǎi)，合格證 號(hào)SCXK (粵)2004-0011 ；粵監(jiān)證字2008A059。將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、造模組、陽(yáng)性 對(duì)照組、尖頂羊肚菌多糖提取物中劑量組，每組10只，雌雄各半，自由進(jìn)食和飲水，造模組、 陽(yáng)性對(duì)照組、中劑量組每天腹腔注射劑量 為120mg/kg · d的D-半乳糖溶液0. 2mL，空白對(duì) 照組注射等量的生理鹽水，連續(xù)注射42天。中劑量組分別灌胃尖頂羊肚菌多糖提取物濃度 為200mg/kg · d，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃濃度為800mg/kg · d的維生素E，空白對(duì)照組和造模組分 別灌胃生理鹽水，各組小鼠的灌胃量均為0. 2mL。②實(shí)驗(yàn)周期42天，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定小鼠腦的SOD活性，硫代巴 比妥酸法測(cè)定小鼠腦MDA含量，熒光比色法測(cè)定小鼠腦LF含量。(3)尖頂羊肚菌胞外多糖提取物延緩衰老作用的實(shí)驗(yàn)(低劑量)①昆明種小鼠，SPF級(jí)，體重20 士 2克，由中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買(mǎi)，合格證 號(hào)SCXK (粵)2004-0011 ；粵監(jiān)證字2008A059。將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、造模組、陽(yáng)性 對(duì)照組、尖頂羊肚菌多糖提取物低劑量組，每組10只，雌雄各半，自由進(jìn)食和飲水，造模組、 陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組每天腹腔注射劑量為120mg/kg ·(!的D-半乳糖溶液0. 2mL,空白對(duì)照 組注射等量的生理鹽水，連續(xù)注射42天。低劑量組分別灌胃尖頂羊肚菌多糖提取物濃度為 50mg/kg · d，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃濃度為800mg/kg · d的維生素E，空白對(duì)照組和造模組分別灌 胃生理鹽水，各組小鼠的灌胃量均為0. 2mL。②實(shí)驗(yàn)周期42天，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定小鼠腦的SOD活性，硫代巴 比妥酸法測(cè)定小鼠腦MDA含量，熒光比色法測(cè)定小鼠腦LF含量。上述⑴、⑵、(3)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2和圖4所示。表2尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)小鼠腦SOD、LF, MDA影響(χ士 s) 注與造模組比較，* :P < 0. 05 ；# =P < 0. 01 (P是指幾組數(shù)據(jù)之間的差異性)。從表2可知，尖頂羊肚菌胞外多糖提取物在50mg/kg · d的劑量下使雄性小鼠腦 SOD活性提高20. 70% (P < 0.05)，腦LF含量降低35. 14% (P < 0. 01)，腦MDA含量降低 15. 10% ；其對(duì)雌性小鼠腦SOD活性提高21. 13% (P < 0. 05)，腦LF含量降低44. 79% (P
<0. 01)，腦MDA含量降低15. 61%，小鼠SOD活性比陽(yáng)性對(duì)照組高，LF含量比陽(yáng)性對(duì)照組 低。200mg/kg ·d尖頂羊肚菌胞外多糖提取物能使雄性小鼠腦LF含量降低24. 32 % (P
<0. 05)，MDA含量降低18. 68% ；其使雌性小鼠腦LF含量、MDA含量分別降低41. 67% (P
<0. 01) ,19. 41%，但是對(duì)雄性和雌性小鼠腦SOD活性均與模型組沒(méi)有顯著差異。800mg/kg-d的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物能使雄性小鼠腦LF含量降低29. 73% (P < 0. 01)，MDA含量降低19. 13%，腦SOD活性則比模型組降低13. 20%，但沒(méi)有顯著差異 (P > 0. 05)；其能使雌性小鼠腦LF含量、MDA含量分別降低31. 25% (P < 0. 01) ,23. 07% (P < 0. 05)，使腦SOD活性提高了 18. 02%，但無(wú)顯著差異(P > 0. 05)。從圖4可見(jiàn)，尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)小鼠的LF影響最大，本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的 3個(gè)劑量組中，50mg/kg ·(!(低劑量組)的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物具有良好的延緩衰老 效果，總體優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，且具有性別的差異，對(duì)雌性小鼠的延緩衰老作用略?xún)?yōu)于對(duì)雄性 小鼠的。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將尖頂羊肚菌液體發(fā)酵液濃縮至原體積的1/3～1/6，得到濃縮液，濃縮溫度為50～70℃；(2)濃縮液采用Sevage法去蛋白、離心，得到去蛋白后的活性提取液；(3)去蛋白后的活性提取液用1～5倍體積的95％乙醇在0～10℃透析沉降濃縮液中的多糖12～25小時(shí)，pH值為4～8，靜置析出絮狀白色物質(zhì)，再離心分離得到白色沉淀，冷凍干燥，制得尖頂羊肚菌胞外多糖提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法，其特征在于，所述步 驟(2)SeVage法去蛋白、離心是在濃縮液中加入0. 2倍體積的氯仿正丁醇混合液，在恒溫磁 力攪拌器上攪拌30分鐘，用Sigma臺(tái)式冷凍離心機(jī)，溫度4°C，以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分 鐘，回收上清液即去蛋白后的活性提取液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法，其特征在于，步驟(1) 中所述尖頂羊肚菌液體發(fā)酵液濃縮至原體積的1/5，所述濃縮溫度為60°C;步驟(3)中所述 活性提取液用4倍體積的95%乙醇在4°C透析沉降濃縮液中的多糖25小時(shí)，pH值為6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法，其特征在于，所述尖 頂羊肚菌液體發(fā)酵液是經(jīng)過(guò)尖頂羊肚菌(Morchella conica)液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵物， 再通過(guò)離心和真空抽濾分離菌絲體，獲得的發(fā)酵液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法，其特征在于，所述尖 頂羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)是將尖頂羊肚菌接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，其液體發(fā)酵培 養(yǎng)基配方為葡萄糖150g，硝酸銨6g，KH2P043. 0g, MgS04 7H20 3. 0g，維生素BIO. 3g，加蒸 餾水定容至3000ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法，其特征在于，所述發(fā) 酵培養(yǎng)的步驟是(1)取100ml所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在其中接入3個(gè)直徑為4mm的尖頂羊 肚菌菌絲塊，經(jīng)滅菌后，在25 28°C，轉(zhuǎn)速130 160rpm，避光恒溫振蕩培養(yǎng)6 8天，得到 液體菌種；(2)將上述液體菌種接入3L滅菌后的所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25 28°C，轉(zhuǎn)速為130 160rpm，培養(yǎng)5 9天，得到發(fā)酵物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的制備方法，其特征在于，所述離 心條件為轉(zhuǎn)速4000-5000rpm、時(shí)間20_30min。
8.一種頂羊肚菌胞外多糖提取物，是由權(quán)利要求1 7任一頂所述的方法制備得到。
9.權(quán)利要求8所述的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物在制備抗氧化和延緩衰老藥物或保 健食品中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述尖頂羊肚菌胞外多糖提取物的使用 劑量為 50mg/kg d。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種尖頂羊肚菌胞外多糖提取物及其制備方法和應(yīng)用，該提取物是經(jīng)過(guò)尖頂羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)離心和真空抽濾分離菌絲體后而獲得液體發(fā)酵液，并濃縮液體發(fā)酵液至原體積的1/3～1/6，得到濃縮液，濃縮溫度為50～70℃；然后濃縮液去蛋白、離心，得到的活性提取液用1～5倍體積的95％乙醇在0～10℃透析沉降濃縮液中的多糖12～25小時(shí)，pH值為4～8，靜置析出絮狀白色物質(zhì)，再離心分離得到白色沉淀，冷凍干燥，制得尖頂羊肚菌胞外多糖提取物。本發(fā)明制備過(guò)程簡(jiǎn)單、可大量生產(chǎn)，提取物對(duì)人體無(wú)毒害，具有良好的抗氧化和延緩衰老作用，可用于制備抗氧化和延緩衰老藥物或保健食品。
文檔編號(hào)A61P39/06GK101870740SQ20101020252
公開(kāi)日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者蘭瑛, 張松, 潘志福 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)