專利名稱：作為免疫原的嵌合肽及其抗體,以及利用嵌合肽或抗體進(jìn)行免疫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有一個(gè)與不同來源的T-細(xì)胞表位連接的B-細(xì)胞表位的嵌合肽 免疫原，含有該嵌合肽的免疫組合物以及利用該嵌合肽進(jìn)行免疫的方法。
背景技術(shù)：
的描述阿爾茨海默氏病(AD)的主要組織病理學(xué)標(biāo)志為在杏仁核、海馬和新皮質(zhì)的實(shí)質(zhì) 中的神經(jīng)炎斑點(diǎn)和彌散斑點(diǎn)中出現(xiàn)淀粉狀蛋白沉積(Glermer和Wong，1984 ；Masters等， 1985 ;Sis0dia和Price，1995)。淀粉狀蛋白是用來描述具有普通β-折疊的纖維聚集物 的通用術(shù)語。這些聚集物在有剛果紅和偏振光存在的條件下表現(xiàn)出雙折射特性(Glermer 和Wong，1984)。所述彌散斑點(diǎn)相對(duì)神經(jīng)炎斑點(diǎn)被認(rèn)為是良性的，而神經(jīng)炎斑點(diǎn)似乎與反 應(yīng)和變性過程密切相關(guān)(Dickson 等，1988 ；Tagliavini 等，1988 ；Yamaguchi 等，1989 ； Yamaguchi等，1992)。神經(jīng)炎斑點(diǎn)的主要成分是一種來源于大得多的β-淀粉狀前體蛋白 β APP(或APP) (Kang等，1987)的具有42個(gè)氨基酸殘基的淀粉樣β-(Αβ)肽(Miller等，
1993;Roher等，1993)。在淀粉狀蛋白沉積物中發(fā)現(xiàn)了通過蛋白水解作用從β APP上裂解 下來的淀粉樣β -肽的兩種主要C-末端變異體，終止于Val40的A β 1-40和終止于Ala42 或 Thr43 的 Αβ 1-42(43) (Miller 等，1993 ；Roher 等，1993)。Aβ 1-42 的生成量比 1_40Αβ 肽少(Haass等，1992 ；Seubert等，1992)，但是由于該COOH延伸形式的溶解性比1_40Αβ 差，而且更容易聚集并形成反向平行β-折疊，所以A β 1-42優(yōu)先沉積(Joachim等，1989 ； Halverson 等，1990 ；Barrow 等，1992 ；Burdick 等，1992 ；Fabian 等，1994)。A β 1-42 能夠引 起 Αβ 1-40 的聚集(Jarrett 和 Lansbury 1993)。Iwatsubo 等，(1996)和 Saido 等，(1996) 還報(bào)道了在腦中的淀粉狀蛋白沉積中還發(fā)現(xiàn)存在其它變異的淀粉樣-β肽Αβ3(焦谷氨 酸)-42、A β 11 (焦谷氨酸)-42、A β 17-42、A β 1 (D-Asp)-42 和 A β l(L_iso Asp)-42。對(duì)APP基因進(jìn)行了測序并發(fā)現(xiàn)其被編碼在21號(hào)染色體上(Kang等，1987)。APP 基因的表達(dá)產(chǎn)生了若干含有Αβ的695，751和770個(gè)氨基酸(

圖1)的同種型，后兩個(gè) β APP含有一個(gè)與Kunitz絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)和功能同源的結(jié)構(gòu)域(Kang等，1987 ； Kitaguchi 等，1988 ；Ponte 等，1988 ；Tanzi 等，1988 ；Konig 等，1992)。盡管有越來越多的 證據(jù)說明β APP在介導(dǎo)神經(jīng)元粘附和生長方面具有作用(Schubert等，1989 ;Saitoh等，
1994；Saitoh和Roch，1995)并且在G蛋白-連接的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中也可能具有一定的作用 (Nishimoto等，1993)，但是β APP在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能仍有待確定。在培養(yǎng)細(xì)胞中，β APP通過固有分泌途徑成熟(Weidemann等，1989 ；Haass等，1992 ；Sisodia 1992)而且某些結(jié) 合在細(xì)胞表面的β APP被一種稱作α-分泌酶的酶在Αβ結(jié)構(gòu)域中裂解(Esch等，1990)，結(jié) 果阻止了 Αβ淀粉狀蛋白形成(圖1)。已有幾項(xiàng)研究描述了另外兩種βΑΡΡ加工的途徑， 該兩種途徑都生成淀粉狀蛋白第一種內(nèi)體/溶酶體途徑產(chǎn)生一組復(fù)雜的與β APP-相關(guān)的 膜-結(jié)合片段，其中一些片段含有全長A β序列(Haass等，1992 ；Golde等，1992)；第二種， Αβ 1-40通過不完全清楚的機(jī)理被分泌到條件培養(yǎng)基中并在體內(nèi)出現(xiàn)在腦脊液中(Haass 等，1992 ；Seubert 等，1992 ；Shoji 等，1992 ；Busciglio 等，1993)。不再認(rèn)為溶酶體的降解 對(duì)Αβ的產(chǎn)生起重要作用(Sisodia和Price，1995)。還沒有鑒定出分別被稱作β和Y (圖 1)的在Αβ的NH2和COOH端進(jìn)行裂解的蛋白水解酶。以前普遍認(rèn)為Αβ是通過前體的異 常代謝產(chǎn)生的。然而，Αβ在多種培養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和人腦脊液中的出現(xiàn)表明Αβ的 產(chǎn)生是細(xì)胞的一種正常功能。如果淀粉狀蛋白沉積是產(chǎn)生AD的一種限速因素，那么所有與此病有關(guān)的因素都 將促進(jìn)淀粉狀蛋白的沉積或加重由淀粉狀蛋白導(dǎo)致的病理變化。21三體(唐氏綜合征)， 其患者具有一個(gè)額外拷貝的APP基因(Neve等，1988 ；Rumble等，1989)，APP表達(dá)的增加 和家族性阿爾茨海默氏病(FAD)-相關(guān)突變(Van Broeckhoven等，1987 ;Chartier_Harlin 等，1991 ；Goate 等，1989 ；Goate 等，1991 ；Murrell 等，1991 ；Pericak-Vance 等，1991 ； Schellenberg 等，1992 ；Tanzi 等，1992 ；Hendricks 等，1992 ；Mullan 等，1992)可以增加發(fā) 生淀粉狀蛋白沉積的可能性。這些突變中的某些突變與下列變化有關(guān):Αβ總產(chǎn)量的增加 (Cai等，1993 ；Citron等，1992)或更原纖維形成性肽的特異性過量產(chǎn)生(Wisniewski等， 1991 ；Clements等，1993 ；Suzuki等，1994)或誘導(dǎo)原纖維形成的因子的表達(dá)增加(Ma等， 1994 ；Wisniewski等，1994)。總之，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)有力地支持了淀粉狀蛋白沉積是發(fā)生AD的 一個(gè)關(guān)鍵因素的假說(Hardy 1992)，當(dāng)然它們沒有排除這樣的可能性，即與疾病有關(guān)的年 齡_相關(guān)性變化，如成對(duì)的螺旋絲狀物可以平行發(fā)生，而不是淀粉狀蛋白沉積的結(jié)果，并且 獨(dú)立地對(duì)癡呆癥起作用。研究人員的主要焦點(diǎn)以及從事AD藥物開發(fā)的研究人員的主要目的是減少中樞神 經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的Αβ沉積量。這些作用屬于兩個(gè)基本方面影響Αβ產(chǎn)生的因素，和影響 不溶性Αβ原纖維形成的因素。第三個(gè)治療目的是降低由Αβ神經(jīng)毒性引起的炎癥應(yīng)答。對(duì)于第一方面，正在進(jìn)行的主要努力是詳細(xì)了解新合成的β APP是怎樣被加工而 插入到質(zhì)膜的，以及鑒定推測的形成淀粉狀蛋白的分泌酶，該酶的命名基于其在成熟蛋白 中的裂解位點(diǎn)。從藥理學(xué)的角度看，降低A β產(chǎn)量的最直接途徑是通過直接抑制β或Y 分泌酶。盡管一些化合物已顯示能間接抑制所述活性，但目前還沒有獲得特異性的抑制劑。 例如，巴弗洛霉素(Bafilomycin)以大約50ηΜ的EC5tl抑制A β產(chǎn)生(Knops等，1995 ；Haass 等，1995)，很有可能是通過它作為血管Η+ΑΤΡ酶的抑制劑的作用，該H+ATP酶與A β分泌酶 共同定位在囊泡中。另外一種以高濃度使用的化合物MDL28170似乎能夠阻斷、分泌酶的 活性(Higaki等，1995)。通常希望通過鑒定β或Y分泌酶能夠合成阻斷成淀粉樣肽形 成的特異性蛋白酶抑制劑。然而，還不知道這些酶是否對(duì)β APP是特異性的或者它們也許 還具有其它重要的分泌功能。類似地，在試圖干擾信號(hào)傳導(dǎo)途徑的過程中將會(huì)遇到靶向和靶向特異性問題，所 述傳導(dǎo)途徑可能決定對(duì)β APP的加工是通過淀粉狀蛋白形成途徑還是非淀粉狀蛋白形成途徑。而且，這些信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制仍然需要被進(jìn)一步證實(shí)。總之，目前對(duì)導(dǎo)致Αβ過量產(chǎn)生的 復(fù)雜和不同的內(nèi)在分子機(jī)制的理解幾乎沒有為藥劑的選擇性定位提供希望。假若神經(jīng)毒性似乎與Αβ的β -折疊聚集物有關(guān)，一種治療方法是抑制或阻止Αβ 的聚集。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要清楚了解引發(fā)Αβ過量產(chǎn)生的胞內(nèi)機(jī)制或由Αβ在胞內(nèi)誘 導(dǎo)的效應(yīng)。與Αβ結(jié)合的各種試劑能夠在體外抑制Aβ的神經(jīng)毒性，例如，Αβ-結(jié)合染料， 剛果紅，在培養(yǎng)的神經(jīng)元中完全抑制Αβ-誘導(dǎo)的毒性(Yankner等，1995)。類似地，抗生素 利福平也能防止Αβ聚集以及隨后的神經(jīng)毒性(Tomiyama等，1994)。其它作為該過程抑 制劑的化合物正處于研制過程中，所述化合物通過與Αβ直接結(jié)合來抑制所述過程，例如 十六烷基-N-甲基哌啶(HMP)溴化物(Wood等，1996)，或者通過阻止A β與其它對(duì)A β沉 積形成起作用的分子發(fā)生相互作用來抑制所述過程。這樣一種分子的實(shí)例是硫酸乙酰肝素 或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，基底膜聚糖，其已從所有淀粉狀蛋白中鑒定出來，并且涉及炎癥 相關(guān)的淀粉狀蛋白誘導(dǎo)的最早期階段。硫酸乙酰肝素與Αβ肽相互作用并賦予其特征性的二級(jí)和三級(jí)淀粉狀蛋白結(jié)構(gòu) 特征。最近已證明小分子的陰離子硫酸鹽干擾這種反應(yīng)從而阻止或抑制淀粉狀蛋白的形成 (Kisilevsky, 1995)，盡管還不能明確這些化合物是否會(huì)進(jìn)入CNS。基于結(jié)合基底膜蛋白聚 糖結(jié)構(gòu)域的序列的肽似乎抑制Αβ和基底膜蛋白聚糖之間的相互作用，并且正在探索利用 Αβ-衍生肽抑制自身聚合的能力，作為開發(fā)治療AD方法的潛在線索。然而由于某些原因， 最明顯地是需要緩慢穿透血腦屏障，這些化合物的體外效力似乎不大。作為另一種抑制或阻止Αβ聚集的手段，WO 96/25435公開了利用單克隆抗體避 免A β 1-42發(fā)生聚集的可能性，所述單克隆抗體對(duì)A β 1-42肽而不是A β 1-43肽的游離C 末端是端點(diǎn)_特異性的。雖然還公開了使用這種Αβ端點(diǎn)-特異性單克隆抗體與Αβ 1-42 的游離C末端殘基發(fā)生相互作用，從而干擾和阻斷在AD中可能致病的聚集，但沒有明確公 開如何使用這些C-端點(diǎn)-特異性單克隆抗體進(jìn)行治療。盡管對(duì)A β肽聚集進(jìn)行直接或間 接處理似乎是一種受人關(guān)注的治療方案，但是這種常規(guī)處理方法的潛在缺點(diǎn)可能是這類藥 物化合物需要長期進(jìn)行施用，從而可能積蓄而對(duì)腦組織產(chǎn)生高度的毒性作用。WO 98/44955用一種新型處理方法來避免與藥劑重復(fù)施用有關(guān)的問題而且還公開 了一種通過對(duì)淀粉樣β肽端點(diǎn)_特異的重組抗體在腦中穩(wěn)定異位表達(dá)來預(yù)防阿爾茨海默 氏病發(fā)病或抑制阿爾茨海默氏病進(jìn)展的方法。最近，Schenk等(1999)證明了在PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠中用淀粉狀蛋白-β免疫減 輕了類似阿爾茨海默氏病的病理改變，所述PDAPP轉(zhuǎn)基因鼠被作為淀粉狀蛋白-β沉積和 類似阿爾茨海默氏病的神經(jīng)病變的一種動(dòng)物模型。他們報(bào)道了在阿爾茨海默氏病-型神經(jīng) 病理發(fā)病之前免疫幼小動(dòng)物基本避免了 β -淀粉狀蛋白斑的形成、神經(jīng)性營養(yǎng)不良和星形 膠質(zhì)細(xì)胞病(astragliosis)，而發(fā)現(xiàn)在阿爾茨海默氏病-型神經(jīng)病變發(fā)病之后對(duì)較老動(dòng)物 進(jìn)行的治療降低了這些神經(jīng)病變的程度和進(jìn)展。盡管Schenk等報(bào)導(dǎo)的結(jié)果為使用免疫調(diào)節(jié)作為阿爾茨海默氏病的普通治療方法 提供了前景，但按照Schenk等的描述利用完整淀粉狀蛋白-β進(jìn)行的免疫產(chǎn)生了在制定一 種治療人阿爾茨海默氏病的免疫計(jì)劃中需要解決的幾個(gè)問題。一個(gè)問題是不清楚如何容易 地用人淀粉狀蛋白-β來免疫人從而引起抗-自身抗體應(yīng)答。而且，即使引發(fā)了抗人淀粉 狀蛋白-β的抗自身抗體應(yīng)答，也不清楚對(duì)患者有害的自身免疫會(huì)否發(fā)生。其它問題包括當(dāng)抗原總是以內(nèi)源淀粉狀蛋白形式暴露于患者的免疫系統(tǒng)時(shí)，如何逆轉(zhuǎn)或終止免疫， 以及施用淀粉狀蛋白(所述淀粉狀蛋白被確認(rèn)是神經(jīng)毒性的)是否將對(duì)患者造成 嚴(yán)重的藥理學(xué)副作用。另外一種基于肽的方法是闡明Αβ神經(jīng)毒性的細(xì)胞機(jī)制從而研究出針對(duì)這些細(xì) 胞靶向物的治療方法。重點(diǎn)集中在控制由自由基介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷所造成的鈣功能異常。 據(jù)推測Aβ與細(xì)胞表面的RAGE(高級(jí)糖化終產(chǎn)物的受體)結(jié)合，從而激發(fā)能夠產(chǎn)生細(xì)胞毒 氧化刺激物的反應(yīng)(Yan等，1996)。阻斷Αβ進(jìn)入細(xì)胞表面的結(jié)合位點(diǎn)可以阻止AD中神經(jīng) 元損傷的進(jìn)展。至今還沒有阻斷A β -誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的特異性藥物。本文引用的任何文獻(xiàn)并不是表明該文獻(xiàn)是最相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，或者是涉及本申請(qǐng) 任何權(quán)利要求專利性的相關(guān)材料。有關(guān)任何文獻(xiàn)內(nèi)容和日期的聲明以申請(qǐng)人在申請(qǐng)日獲得 的信息為準(zhǔn)并且不對(duì)這種聲明的正確性作任何承諾。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種嵌合肽或嵌合肽與端點(diǎn)_特異性B細(xì)胞表位的混合物，所述端 點(diǎn)-特異性B細(xì)胞表位來源于一種前體蛋白或成熟蛋白的天然內(nèi)肽裂解產(chǎn)物，作為游離 N-末端或C-末端，通過或不通過間隔氨基酸殘基與T輔助細(xì)胞表位相融合，所述T輔助細(xì) 胞表位的來源不同于內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的來源。本發(fā)明還提供了一種含有免疫有效量的所述嵌合肽或嵌合肽混合物的免疫組合 物。該免疫組合物被用來在哺乳動(dòng)物受體內(nèi)引發(fā)抗體產(chǎn)生，其中所述嵌合肽的B-細(xì)胞表位 對(duì)內(nèi)肽裂解產(chǎn)物是端點(diǎn)特異性的，該內(nèi)肽裂解產(chǎn)物是一種自身分子。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種免疫哺乳動(dòng)物對(duì)抗自身內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的游離N-末端或 游離C-末端的方法，所述內(nèi)肽裂解產(chǎn)物來源于一種自身前體蛋白或成熟蛋白。更具體地， 所述免疫方法的目的是產(chǎn)生抗體從而使個(gè)體獲得抵抗淀粉樣β肽的免疫力，該淀粉樣β 肽與淀粉狀樣β肽沉積和斑點(diǎn)有關(guān)。本發(fā)明的其它方面涉及含有對(duì)根據(jù)本發(fā)明的嵌合肽具有特異性的抗體的抗 原_結(jié)合部位的分子以及利用該分子進(jìn)行被動(dòng)免疫的方法。附圖簡要說明圖1表示β-淀粉樣前體蛋白(βΑΡΡ)和α、β、Y _分泌酶裂解產(chǎn)物的示意圖。 沿著α、β、Y-分泌酶的裂解位點(diǎn)標(biāo)明了各種結(jié)構(gòu)域的大體位置。圖2表示β APP區(qū)域的部分氨基酸序列(SEQ ID NO 1)，其中淀粉樣-β肽(Α β ) 來源于所述βΑΡΡ。箭頭表示α-、β-和Y-分泌酶的裂解位點(diǎn)。優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明一方面總體涉及一種嵌合肽或嵌合肽的混合物，其中來源于一種前體蛋白 或成熟蛋白的天然內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的N-或C-末端端點(diǎn)-特異性B細(xì)胞表位作為游離N-或 C-末端通過或不通過間隔氨基酸殘基與不同來源的T輔助細(xì)胞表位相融合。所述一種或 多種嵌合肽被用于免疫哺乳動(dòng)物抵抗內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的游離N-端或游離C-端的免疫組合 物，所述內(nèi)肽裂解產(chǎn)物是所述被免疫哺乳動(dòng)物的自身分子(對(duì)其是天然的分子)。作為本發(fā) 明更具體的優(yōu)選實(shí)施方案，所述嵌合肽具有一個(gè)與T輔助細(xì)胞表位融合的N-或C-末端端 點(diǎn)_特異性B細(xì)胞表位，該表位是一種淀粉樣_ β肽的N-末端的最前二至五個(gè)氨基酸殘基 或C-末端的最后二至五個(gè)氨基酸殘基。當(dāng)這種嵌合肽作為免疫組合物的一部分被施用于人體時(shí)，該個(gè)體將獲得抵抗淀粉樣_ β肽或肽的免疫力，所述端點(diǎn)_特異性B細(xì)胞表位來源 于該淀粉樣-β肽或肽。通過含有淀粉樣β肽-特異性B細(xì)胞表位的嵌合肽和一種用于免疫抵抗作為本 發(fā)明實(shí)例的淀粉樣β肽的方法的優(yōu)選實(shí)施方案，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地想到所述 嵌合肽、免疫組合物和免疫方法能被將范圍擴(kuò)大到并涉及到其它內(nèi)肽裂解產(chǎn)物，針對(duì)該內(nèi) 肽裂解產(chǎn)物，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的端點(diǎn)-特異性抗體與所述前體或成熟自身蛋白不發(fā)生交 叉反應(yīng)。類似地，下述根據(jù)本發(fā)明的免疫方法的主要優(yōu)點(diǎn)是普遍適用于采用本發(fā)明的一種 或多種嵌合肽的免疫過程，所述免疫方法作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案在人體內(nèi)產(chǎn)生抗淀粉 樣-β肽的端點(diǎn)-特異性抗體。眾所周知由B細(xì)胞引起的針對(duì)一種蛋白或肽的特定區(qū)域發(fā)生的抗體應(yīng)答需要免 疫系統(tǒng)的T輔助細(xì)胞同時(shí)識(shí)別這種抗原的另一個(gè)部分。通常將這種現(xiàn)象稱作Β/Τ細(xì)胞合作。 根據(jù)本發(fā)明，可以通過制備一種在鄰近的線性序列中含有B和T細(xì)胞表位的合成嵌合肽來 模擬這一現(xiàn)象。這種嵌合肽已被成功地用來在鼠、人/鼠嵌合體和靈長目動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)抗 體產(chǎn)生(Sharma 等，1993 ；Ifversen 等，1995 ；0' Hern 等，1997)。在本發(fā)明中，所述含有淀粉樣肽的N-末端的最前二至五個(gè)氨基酸殘基 或C-末端的最后二至五個(gè)氨基酸殘基的B細(xì)胞表位通過或不通過間隔氨基酸殘基與已 知的強(qiáng)T輔助細(xì)胞表位融合后形成一種嵌合肽。由于已知這種強(qiáng)T細(xì)胞表位在許多不 同人遺傳背景下能發(fā)揮作用(Valmori等，1992 and 1994)，這種表位的一個(gè)非限制性實(shí) 例是已被研究透徹的破傷風(fēng)類毒素混棲表位，該表位由SEQ ID NO 8所示(Ho等，1990 ； Panina-Bordignon 等，1989)。作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，利用含有淀粉狀蛋白β端點(diǎn)特異性B細(xì)胞表位和破傷 風(fēng)類毒素的混棲T輔助細(xì)胞表位的嵌合肽進(jìn)行免疫，應(yīng)該產(chǎn)生具有下列特性的抗體(1)抗-破傷風(fēng)抗體，由于大多數(shù)個(gè)體對(duì)破傷風(fēng)類毒素已經(jīng)是血清陽性的(即，來 源于先前的破傷風(fēng)免疫)，其對(duì)人體可能是不相關(guān)的；(2)抗接頭抗體，其識(shí)別通過連接淀粉樣_ β肽的端點(diǎn)_特異性B-細(xì)胞表位與破 傷風(fēng)類毒素的T輔助細(xì)胞表位的接頭而產(chǎn)生的新表位，但不識(shí)別除免疫原本身以外的任何 物質(zhì)，因而在免疫個(gè)體體內(nèi)可能是不相關(guān)的；和(3)抗-N-末端或抗-C-末端的端點(diǎn)_特異性淀粉狀蛋白β抗體，該抗體是由根 據(jù)本發(fā)明的方法試圖產(chǎn)生的用于抑制、降低或甚至能逆轉(zhuǎn)淀粉狀蛋白β沉積/斑點(diǎn)形成的 理想抗體。由根據(jù)本發(fā)明的免疫方法產(chǎn)生的所述理想的抗N-末端或抗C-末端的端點(diǎn)特異 性淀粉狀蛋白β抗體能夠區(qū)分淀粉樣β肽和蛋白水解產(chǎn)生該肽的β淀粉狀蛋白前體 (APP)。這些端點(diǎn)特異性淀粉狀蛋白β抗體與淀粉樣β肽的末端/端點(diǎn)特異性結(jié)合從而 減慢、降低或避免淀粉樣β肽在胞外空間、腦組織液和腦脊液中蓄積，以及聚集成老年性 淀粉狀蛋白沉積或斑點(diǎn)，并且阻斷淀粉樣β肽與對(duì)淀粉狀蛋白β的神經(jīng)毒性起作用的其 它分子發(fā)生相互作用。在有可溶性淀粉樣β肽存在的血液和胞外空間、腦組織液和腦脊液中抗N-末端 或抗C-末端端點(diǎn)特異性淀粉狀蛋白β抗體的存在促進(jìn)了可溶性抗體-淀粉狀蛋白β復(fù) 合物的形成。通過上矢狀竇的蛛網(wǎng)膜絨毛將胞外空間、組織液和腦脊液引流到全身血液循
8環(huán)從而將可溶性抗體-淀粉狀蛋白β復(fù)合物清除出中樞神經(jīng)系統(tǒng)。以這種方式，避免了可 溶性淀粉樣β肽在胞外空間、組織液和腦脊液中的蓄積形成淀粉狀蛋白沉積和/或誘導(dǎo)神 經(jīng)毒性(圖1)。而且，按照本發(fā)明的方法對(duì)可溶性淀粉樣β肽進(jìn)行清除預(yù)計(jì)能夠通過抑制 例如淀粉狀蛋白β誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活和細(xì)胞因子的釋放并且還通過阻斷Αβ與細(xì)胞表面受 體如RAGE受體之間的相互作用而減弱在阿爾茨海默氏病中觀察到的炎癥過程。如圖1所示(參見Schehr，1994)以及如背景技術(shù)部分所述，β -淀粉狀蛋白前體 (β APP)被認(rèn)為也是蛋白水解產(chǎn)物的前體，一種被認(rèn)為具有促進(jìn)生長和神經(jīng)保護(hù)功能的可 溶性β-淀粉狀蛋白前體(s β APP)。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解所述抗-N-末端或 抗-C-末端端點(diǎn)-特異性淀粉狀蛋白β抗體不干擾β APP的正常生物學(xué)功能，該β APP的 正常生物學(xué)功能與淀粉狀蛋白β肽的形成無關(guān)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行免疫的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)用一種廉價(jià)的肽抗原作主動(dòng)免疫，能夠快捷和容易地制備該抗原并且能夠保 證質(zhì)量；(2)只包括內(nèi)肽裂解產(chǎn)物(淀粉狀蛋白β肽)的N-末端或C-末端的兩到三個(gè)， 或許高達(dá)四到五個(gè)氨基酸殘基應(yīng)該使產(chǎn)生與通過蛋白水解作用產(chǎn)生內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的所述 前體或成熟蛋白(β APP)發(fā)生反應(yīng)而影響前體或成熟蛋白的功能的抗體的量降到最低。(3)應(yīng)用非依賴性非自身T細(xì)胞表位能夠打破自身耐受性從而產(chǎn)生了針對(duì)自身抗 原的抗體(Schofield 等，1991)；(4)由于抗_自身T細(xì)胞免疫是所有已知自身免疫病進(jìn)展的基礎(chǔ)，所以在嵌合肽中 不存在來源于內(nèi)肽裂解產(chǎn)物(淀粉狀蛋白β)的T細(xì)胞表位可以避免產(chǎn)生任何自身免疫的 嚴(yán)重問題；和(5)由于患者的免疫系統(tǒng)從來不會(huì)自然遇到淀粉狀蛋白β與作為免疫原的破傷 風(fēng)毒素的結(jié)合物，所以隨著抗體滴度隨時(shí)間逐漸下降，免疫應(yīng)當(dāng)是自限和可逆的。這種自限 和可逆的免疫已經(jīng)在對(duì)合成避孕疫苗進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中得到了證實(shí)(Talwar等，1997)。本發(fā)明的嵌合肽由式⑴或式(II)表示(I)N-(S)m-(Th)n(II) (Th)n-(S)m-C其中Ν是來自天然內(nèi)肽裂解產(chǎn)物如淀粉樣β肽的游離N-末端的最前2、3、4或5 個(gè)氨基酸殘基，對(duì)于哺乳動(dòng)物來說，所述內(nèi)肽裂解產(chǎn)物由前體蛋白或成熟蛋白產(chǎn)生；C是來自天然內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的游離C-末端的最后2、3、4或5個(gè)氨基酸殘基；Th是一種來自不同于天然內(nèi)肽裂解產(chǎn)物來源的天然來源(S卩，活生物體物種)的 T輔助細(xì)胞表位；S是一個(gè)間隔氨基酸殘基；m 是 0、1、2、3、4 或 5 ；而η 是 1、2、3 或 4。還涉及式(I)和(II)所示嵌合肽的混合物，其中每一種嵌合肽的內(nèi)肽裂解產(chǎn)物可 以相同或不同，即，不同的淀粉樣β肽。然而這些嵌合肽混合物并不限于式(I)和(II)所 示嵌合肽的混合物而可以包括式(I)肽的混合物，其中N來自不同的內(nèi)肽裂解產(chǎn)物(S卩，不 同的淀粉樣β肽)，或式(II)肽的混合物，其中C來自不同的內(nèi)肽裂解產(chǎn)物(S卩，不同的淀粉樣β肽)。本發(fā)明嵌合肽的長度是大約20至90個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選大約20至75個(gè)氨基酸 殘基，更優(yōu)選大約20至50個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選大約20至40個(gè)氨基酸殘基。來源于天然內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的游離N-末端(N)或游離C-末端(C)的B細(xì)胞表位優(yōu) 選是兩個(gè)或三個(gè)氨基酸殘基，該表位不足以產(chǎn)生與所述肽裂解產(chǎn)物的前體蛋白或成熟蛋白 發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體。盡管產(chǎn)生與前體蛋白或成熟蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的某些抗體的可能性 略有增加，但來源于天然內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的游離N-末端或游離C-末端的四個(gè)或五個(gè)氨基酸 殘基的B細(xì)胞表位也是合適的。本發(fā)明的優(yōu)選嵌合肽在式(I)或(II)中分別具有來自淀粉樣β肽的N或C，當(dāng) 所述淀粉樣β肽自然存在于人體中時(shí)，其來源于βΑΡΡ。本文所采用的術(shù)語“來源于”指 的是，當(dāng)獲自于一種天然來源時(shí)，不論是通過單一的蛋白水解裂解方式還是通過多于一種 的裂解和/或轉(zhuǎn)化方式，所述肽或蛋白是由一種前體蛋白或成熟蛋白裂解或轉(zhuǎn)化而來的。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，淀粉狀蛋白沉積、原纖維和斑點(diǎn)中天然存在的任何淀粉樣β肽都作 為內(nèi)肽裂解產(chǎn)物被包括在術(shù)語“淀粉樣β肽”中。SEQ ID NO 2 (Α β 1-40)，3 (Α β 1-42)， 4 (Α β 1-43)，5 (Α β 3-42)，6 (Α β 11-42)和 7 (Α β 17-42)所示的肽是這種“淀粉樣 β 肽”的 非限制性實(shí)例。Th是來自不同于天然內(nèi)肽裂解產(chǎn)物來源的天然來源的T輔助細(xì)胞表位。換句話說， 所述T輔助細(xì)胞表位不被認(rèn)為是按照本發(fā)明方法進(jìn)行免疫的哺乳動(dòng)物受體中的自身-分子 的一部分。所述τ輔助細(xì)胞表位與對(duì)肽裂解產(chǎn)物的N-末端或C-末端特異的B細(xì)胞表位相 結(jié)合，以激發(fā)有效的抗體應(yīng)答，所述肽裂解產(chǎn)物處于前體蛋白或成熟蛋白的內(nèi)部(不定位 在末端)O已知免疫原必須與主要組織相容性(MHC) II型抗原一起被呈遞才能激發(fā)有效的 抗體應(yīng)答。由抗原呈遞細(xì)胞(APCs)產(chǎn)生的MHC II型抗原以序列特異性方式與存在于免疫 原中的T細(xì)胞表位結(jié)合。這種MHC II型-免疫原復(fù)合物被CD4+淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞)識(shí)別， 結(jié)果引起能夠識(shí)別來源于呈遞的免疫原的B細(xì)胞表位的特異性B細(xì)胞的增殖，從而引起這 種B細(xì)胞產(chǎn)生B細(xì)胞表位-特異性抗體。由于淀粉樣β肽是自身分子，所以它們不具有任 何可識(shí)別的Th表位，并且2至5個(gè)氨基酸殘基的B細(xì)胞表位完全缺乏T細(xì)胞表位。這種表位 可以由來源于包括破傷風(fēng)毒素、百日咳毒素、麻疹病毒F蛋白和乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 在內(nèi)的有效免疫原的特定序列來提供。所選的Th表位優(yōu)選能夠在表達(dá)不同MHC單元型的 許多個(gè)體中引起T輔助細(xì)胞應(yīng)答。這些表位在許多不同的異源種群個(gè)體中起作用，因而被 認(rèn)為是混棲Th表位?；鞐玊h表位的優(yōu)勢是其能在大多數(shù)遺傳多樣化群體中引發(fā)有效的抗 體應(yīng)答。而且，優(yōu)先選擇本發(fā)明的嵌合肽中的T輔助細(xì)胞表位不只是由于它們在大多數(shù)給 定的群體的成員中能夠引起免疫應(yīng)答，而且還由于它們能夠引起記憶/回憶應(yīng)答。當(dāng)所述 哺乳動(dòng)物是人時(shí)，接受本發(fā)明的嵌合肽免疫治療的大多數(shù)受體/患者已經(jīng)被兒科疫苗所 免疫(即，麻疹+流行性腮腺炎+風(fēng)疹疫苗和白喉+百日咳+破傷風(fēng)疫苗)，而且還可能被 乙型肝炎病毒疫苗所免疫。因此這些患者被預(yù)先暴露于至少一種存在于嵌合兒科疫苗中的 Th表位。通過采用標(biāo)準(zhǔn)疫苗進(jìn)行免疫而先暴露于Th表位應(yīng)建立起Th細(xì)胞克隆，其通過施用 所述嵌合肽能立即增殖(即，一種回憶應(yīng)答)，因而刺激B細(xì)胞對(duì)所述嵌合肽產(chǎn)生快速應(yīng)答
10反應(yīng)。另外，所述Th表位避免了任何病原體_特異性B細(xì)胞和/或抑制T細(xì)胞表位產(chǎn)生載 體-誘導(dǎo)的免疫抑制，這是一個(gè)當(dāng)毒素分子被用來引發(fā)T輔助細(xì)胞應(yīng)答時(shí)所遇到的問題。本發(fā)明嵌合肽中的Th表位是混棲的但不是通用的。這種特征是指所述Th表位在 大部分表達(dá)不同MHC抗原的遠(yuǎn)系繁殖種群中具有反應(yīng)性(在50至90%的種群中具有反應(yīng) 性)，但不是在該種群的所有成員中都具有反應(yīng)性。為了給內(nèi)肽裂解產(chǎn)物提供一種全面的、 近乎通用的免疫反應(yīng)性，可以制備一種具有不同Th表位的嵌合肽組合物。例如，一種具有 來源于破傷風(fēng)和百日咳毒素、麻疹病毒F蛋白和HBsAg的混棲Th表位的四種嵌合肽的組合 可能更有效?；鞐玊h表位通常具有共同的結(jié)構(gòu)特性。例如，混棲Th表位的大小范圍是大約15 至大約30個(gè)殘基。兩親性螺旋是Th表位的共同結(jié)構(gòu)。兩親性螺旋被定義為周圍表面主要 是疏水氨基酸殘基的α-螺旋結(jié)構(gòu)。Th表位通常含有附加初級(jí)氨基酸模式，如一個(gè)Gly或 一個(gè)帶電荷的殘基后面接著兩到三個(gè)疏水殘基，再接著一個(gè)帶電荷的或極性的殘基。這一 模式定義了 Rothbard序列。Th表位通常遵守1、4、5、8規(guī)則，即一個(gè)帶正電荷的殘基在其后 的第四、第五和第八位上接著疏水殘基。由于所有這些結(jié)構(gòu)由常見的疏水性的、帶電荷的和 極性的氨基酸組成，所有每個(gè)結(jié)構(gòu)可同時(shí)存在于一個(gè)單一 Th表位中。因而Th是一個(gè)含有一個(gè)Th表位的氨基酸序列(天然的或非天然的)。Th表位可以 是連續(xù)的或不連續(xù)的表位。因此，不是Th的每一個(gè)氨基酸都是所述表位的必要部分。因此， Th表位，包括Th表位的類似物和片段，都能夠增強(qiáng)或刺激對(duì)內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的免疫應(yīng)答。優(yōu) 勢免疫Th表位在具有廣泛差異MHC類型的動(dòng)物和人群中廣泛具有反應(yīng)性(Celis等，1988 ； Demotz等，1989 ；和Chong等，1992)。本發(fā)明嵌合肽的Th結(jié)構(gòu)域具有大約10至大約50個(gè) 氨基酸殘基，并且優(yōu)選具有大約10至大約30個(gè)氨基酸殘基。當(dāng)多Th表位(即η >2)存 在時(shí)，則每個(gè)Th表位獨(dú)立地是相同的或不同的。Th表位類似物包括在Th表位中的一個(gè)至大約五個(gè)氨基酸殘基的置換、缺失和插 入。Th片段是Th表位的相連部分，其足以增強(qiáng)或刺激對(duì)內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的免疫應(yīng)答。Th片段 的一個(gè)實(shí)例是一系列來源于單一更長肽的重疊肽。本發(fā)明的Th表位包括乙型肝炎表面抗原T輔助細(xì)胞表位(HBs Th)、百日咳毒素T 輔助細(xì)胞表位(PT Th)、破傷風(fēng)毒素T輔助細(xì)胞表位(TT Th)、麻疹病毒F蛋白T輔助細(xì)胞表 位(MVfi Th)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomitis)主要外膜蛋白T輔助細(xì)胞表位(CT Th)、 白喉毒素T輔助細(xì)胞表位(DT Th)、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)環(huán)子孢子T輔助 細(xì)胞表位(PF Th)、曼森血吸蟲(Schistosoma mansoni)丙糖磷酸異構(gòu)酶T輔助細(xì)胞表位 (SM Th)、大腸桿菌(Escherichia coli)TraT T輔助細(xì)胞表位(TraT Th)，下列表1給出了 免疫增強(qiáng)類似物和表位序列。表1
TToThSEQIDNO8
HB3ThSEQIDNO9
TT1ThSEQIDNO10
TT1ThSEQIDNO11
TT2ThSEQIDNO12
PT1AThSEQIDNO 13
TT3ThSEQIEι NO14
PT2ThSEQIEι NO15
MVFIThSEQIDNO16
MVf2ThSEQIDNO17
TT4ThSEQIEι NO18
TT5ThSEQIDNO 19
CT1ThSEQIDNO 20
DT1ThSEQIDNO 21
DT2ThSEQIDNO 22
PFThSEQIDNO23
SMThSEQIDNO24
TraT1 ThSEQIDNO 25
TraT2 ThSEQIDNO 26
TraT3 ThSEQIDNO 27免疫原性可以通過在根據(jù)本發(fā)明的嵌合肽的混棲Th表位與B細(xì)胞表位之間插入 間隔殘基S(即，Gly-Gly)得到增強(qiáng)。除了在結(jié)構(gòu)上將Th表位與B細(xì)胞表位分離開來，所述 甘氨酸間隔殘基還能破壞任何通過連接Th表位與B細(xì)胞表位而建立的人工二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而 消除T和/或B細(xì)胞應(yīng)答之間的干擾。這樣該輔助表位和抗體激發(fā)結(jié)構(gòu)域之間的構(gòu)象分離 使得被呈遞的免疫原與適當(dāng)?shù)腡h和B細(xì)胞之間的相互作用更有效。S的氨基酸殘基可以是 天然氨基酸或非天然氨基酸，包括但不限于β-丙氨酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯 氨酸、甲狀腺素、Y-氨基丁酸、高絲氨酸、瓜氨酸等。本發(fā)明的嵌合肽可以通過本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的化學(xué)合成方法制 備。因此，所述嵌合肽可以利用肽合成儀如Applied Biosystems肽合成儀進(jìn)行的t-Boc或 F-moc化學(xué)法通過固相合成的自動(dòng)Merrifield技術(shù)來合成。完全裝配所需嵌合肽后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法處理樹脂以從樹脂上將肽裂解下來并將氨 基酸側(cè)鏈上的保護(hù)基去封閉。通過HPLC純化所述游離肽并例如通過氨基酸分析或側(cè)序進(jìn) 行生物化學(xué)表征。肽的純化和表征方法對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的?；蛘?，較長的線性嵌合肽可以通過公知的重組DNA技術(shù)來進(jìn)行合成。任何DNA技 術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)手冊都提供了詳細(xì)技術(shù)方案以制備本發(fā)明嵌合肽。為了構(gòu)建編碼本發(fā)明嵌合肽的 基因，將氨基酸序列反轉(zhuǎn)錄為核苷酸序列，優(yōu)選采用對(duì)表達(dá)所述基因的生物體的最佳密碼 子選擇。然后，通常通過合成重疊寡核苷酸并且如果需要還合成調(diào)節(jié)元件來制備合成基因， 所述寡核苷酸編碼所述肽。將所述合成基因插入合適的克隆載體，從而獲得重組克隆并對(duì) 其進(jìn)行表征。接著在適合于所選的表達(dá)系統(tǒng)和宿主的適當(dāng)條件下表達(dá)所述嵌合肽，并通過 標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)所述嵌合肽進(jìn)行純化和表征。一種耶爾森(Yersinia)菌種的侵襲素蛋白的免疫刺激表位可以作為所述嵌合肽 的任選片段與所述嵌合肽的T輔助細(xì)胞表位連接，所述T輔助細(xì)胞表位與B細(xì)胞表位相反。 致病細(xì)菌耶爾森菌屬的侵襲素是介導(dǎo)所述細(xì)菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的外膜蛋白(Isberg等， 1990)。細(xì)菌侵入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞被證明需要耶爾森菌屬侵襲素分子與培養(yǎng)細(xì)胞上存 在的幾種β 1家族整合蛋白之間相互作用(Tran Van Nhieu等，1991)。由于T淋巴細(xì)胞富含β 1整合蛋白(特別是激活的免疫或記憶T細(xì)胞)，所以已經(jīng)研究了侵襲素對(duì)人T細(xì)胞的 作用(Brett等，1993)。認(rèn)為整合蛋白促進(jìn)免疫T細(xì)胞向血管外的遷移并且通過與包括纖 連蛋白、層粘連蛋白和膠原在內(nèi)的胞外基質(zhì)蛋白的相互作用穿過結(jié)締組織到達(dá)抗原攻擊位 點(diǎn)。在有非特異性促細(xì)胞分裂劑、抗-CD3抗體存在的條件下，發(fā)現(xiàn)侵襲素分子的羧基端對(duì) 人幼稚CD4+T起共同刺激作用，從而引起明顯的增殖和細(xì)胞因子的表達(dá)。對(duì)與β 整合蛋 白相互作用從而引起這種刺激的特異性侵襲素結(jié)構(gòu)域也進(jìn)行了鑒定(Brett等，1993)。由 于證實(shí)了 T細(xì)胞共同刺激作用特性與該結(jié)構(gòu)域與有關(guān)，所以可以將該結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明的嵌 合肽的混棲Th表位進(jìn)行連結(jié)，所述混棲Th表位與B細(xì)胞表位相反。革蘭氏陰性菌的許多外膜蛋白既是脂質(zhì)修飾的又是免疫原性非常強(qiáng)的。由于脂質(zhì) 的共價(jià)連接與免疫原性有著明顯的聯(lián)系，所以三棕櫚酰-S-甘油半胱氨酸(Pam3Cys)，一種 對(duì)細(xì)菌膜蛋白常見的的脂質(zhì)可以被偶連到代表B細(xì)胞或細(xì)胞毒T細(xì)胞表位的合成肽上。因 為通過這種脂質(zhì)連接引發(fā)了強(qiáng)烈的輔助應(yīng)答反應(yīng)，所以可以在其與B細(xì)胞表位連接的對(duì)側(cè) 對(duì)嵌合肽的混棲Th表位進(jìn)行脂質(zhì)修飾。這種脂質(zhì)修飾的嵌合肽可能比未修飾的同樣肽免 疫原性更強(qiáng)。美國專利US 5，843，446被本文全文引用，該專利公開了 Th表位和侵襲素表 位的免疫刺激特性和脂質(zhì)部分。如果抗原與佐劑一起施用，那么免疫原性可以進(jìn)一步顯著加強(qiáng)。佐劑增強(qiáng)了抗原 的免疫原性但其本身并不必需具有免疫原性。佐劑起的作用可能是將所述抗原保留在施用 位點(diǎn)的附近從而產(chǎn)生一種貯存效應(yīng)以利于緩慢、持續(xù)地將抗原釋放給免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。佐 劑還能將免疫系統(tǒng)的細(xì)胞吸引到抗原貯存處并刺激這些細(xì)胞引發(fā)免疫應(yīng)答。多年來免疫刺激劑或佐劑一直被用來促進(jìn)宿主的免疫應(yīng)答，例如用于疫苗。內(nèi)在 的佐劑，諸如脂多糖，通常是被用于疫苗的滅活或減毒細(xì)菌的組分。外在的佐劑是免疫調(diào)節(jié) 劑，其通常與抗原非共價(jià)連接并被用來增強(qiáng)宿主的免疫應(yīng)答。因此，已經(jīng)證實(shí)佐劑增強(qiáng)對(duì)腸 道外傳遞的抗原的免疫應(yīng)答。然而這些佐劑中的一些是有毒的，并會(huì)引起不良副作用，使得 它們不適用于人和多種動(dòng)物。實(shí)際上，只有氫氧化鋁或磷酸鋁(統(tǒng)稱為明礬)被常規(guī)用作 人和獸疫苗中的佐劑。已經(jīng)明確了明礬在增強(qiáng)對(duì)白喉和破傷風(fēng)類毒素的抗體應(yīng)答方面的效 力，并且HBsAg疫苗也已采用明礬作為佐劑。許多外在的佐劑能夠激發(fā)針對(duì)抗原的有效免疫應(yīng)答。這些包括復(fù)合到膜蛋白抗原 上的皂苷(免疫刺激復(fù)合體)、混有礦物油的pluronic聚合物、在礦物油中的死分枝桿菌、 弗氏完全佐劑、細(xì)菌產(chǎn)物如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)，以及脂質(zhì)A和脂質(zhì)體。為了 有效誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答(HIR)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)，將免疫原在佐劑中乳化。許多佐劑 具有毒性，引起肉芽腫、急性和慢性炎癥(弗氏完全佐劑，F(xiàn)CA)、細(xì)胞溶解(皂苷和pluronic 聚合物)和發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎和前葡萄膜炎(LPS和MDP)。盡管FCA是一種很好的佐劑并廣泛用 于研究，但是由于其毒性而不允許在人或獸疫苗中使用FCA。美國專利US4，855，283記載了將包括N-葡基酰胺、N-葡基脲和N-葡基氨基甲酸 酯在內(nèi)的糖脂類似物作為免疫調(diào)節(jié)劑或佐劑，其中每一種物質(zhì)的糖殘基被氨基酸取代。美 國專利US4，258，029記載了當(dāng)與破傷風(fēng)類毒素和甲醛滅活的I型、II型和III型脊髓灰質(zhì) 炎病毒疫苗復(fù)合時(shí)，十八烷基酪氨酸氫氯化物(OTH)具有佐劑的功能。并且，Nixon-George 等，于1990年報(bào)道了與重組乙型肝炎表面抗原復(fù)合的芳香氨基酸的十八烷基酯增強(qiáng)了宿 主對(duì)乙型肝炎病毒的免疫應(yīng)答。
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優(yōu)選將使免疫應(yīng)答最大化的外源佐劑/乳化制劑添加到內(nèi)肽裂解產(chǎn)物中。合適的 佐劑和載體是(1)已被成功用于I期人體臨床試驗(yàn)的佐劑和載體；(2)基于它們在臨床前 安全性研究中缺乏反應(yīng)原性，具有被批準(zhǔn)用于人體的可能性的佐劑和載體；或(3)已被批 準(zhǔn)用于食品和結(jié)伴(companion)動(dòng)物的佐劑和載體。用藥次數(shù)最少，理想地僅一劑，而產(chǎn)生最強(qiáng)免疫應(yīng)答的免疫治療方案是非常理想 的。這種效果可以通過將免疫原包埋在微粒中來達(dá)到。例如，可將可吸收的縫合材料聚(丙 交酯-共-乙交酯)共聚物形成含有免疫原的微粒。在口服或非腸道用藥后，微粒在體內(nèi) 水解而產(chǎn)生無毒性副產(chǎn)物，乳酸和乙醇酸，并且釋放經(jīng)包埋過程大部分未發(fā)生變化的免疫 原。微粒降解和釋放被包埋的免疫原的速率可以通過幾個(gè)參數(shù)來控制，這些參數(shù)包括(1) 用于形成微粒的聚合物的比例(顆粒中的共乙交酯濃度愈高，顆粒降解得愈快)；(2)微粒 大小(較小的顆粒比較大的顆粒降解得快)；和(3)包埋效率(包埋抗原濃度較高的顆粒 比負(fù)載較低的顆粒降解得快)。通過混合具有不同釋放速率的包埋免疫原的微粒，微粒制劑 還可以通過單次施用提供初次免疫和隨后的加強(qiáng)免疫?？梢暂p易地獲得單劑制劑，該制劑 能夠在少于一星期至大于六個(gè)月的范圍內(nèi)釋放抗原。而且，當(dāng)所述微粒化免疫原與外源佐 劑/乳化制劑混合后，包埋在微粒中的根據(jù)本發(fā)明的嵌合肽的傳遞效力增強(qiáng)。通過給一種動(dòng)物，例如小鼠或大兔，注射以明礬配制的嵌合肽從而引起對(duì)內(nèi)肽裂 解產(chǎn)物的應(yīng)答來確定和分析所述嵌合肽的效力。本發(fā)明的另一方面提供了一種免疫組合物，該免疫組合物含有一種或多種免疫有 效量的本發(fā)明嵌合肽以及一種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑或包括佐劑在內(nèi)的輔 劑。因此，可以利用佐劑、藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、輔劑或其它通常在免疫組 合物中使用的組分將所述嵌合肽配制成一種免疫組合物。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員很容 易確定這種配方其包括用于即時(shí)釋放和持續(xù)釋放(例如微囊化)的制劑。該免疫組合物可 以通過包括皮下、口服、肌內(nèi)或其它非腸道或體內(nèi)途徑在內(nèi)的便利途徑進(jìn)行用藥。類似地 所述疫苗可進(jìn)行單劑用藥或分多劑用藥。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易確定免疫程序。 例如，可用于本發(fā)明的佐劑或乳化劑包括明礬、不完全弗氏佐劑、liposyn、皂苷、角鯊烯、 L121、emulsigen和ISA720。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述佐劑/乳化劑是明礬、不完全弗氏 佐劑、Iiposyn和皂苷的混合物、角鯊烯和L121的混合物或emulsigen和皂苷的混合物。本發(fā)明的免疫組合物含有一種或多種免疫有效量的所述嵌合肽和藥學(xué)上可接受 的載體。這種組合物的劑量單位形式是每千克體重含有大約0. 5 μ g至大約Img的每種肽。 當(dāng)進(jìn)行多次用藥時(shí)，所述劑量單位形式被適當(dāng)?shù)胤殖擅縿┑暮线m用量。含有兩種或多種本發(fā)明嵌合肽混合物的免疫組合物在更廣的種群中增強(qiáng)了免疫 效力從而對(duì)內(nèi)肽裂解產(chǎn)物如淀粉狀蛋白β提供更好的免疫應(yīng)答。通過修飾成脂肽得到其 它免疫刺激合成嵌合肽免疫原，從而為有效疫苗提供內(nèi)在的輔助作用。對(duì)本發(fā)明的合成嵌 合肽免疫原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以通過以包埋在由0' Hagan等(1991)所描述類型的可生物 降解的微粒內(nèi)或上的形式進(jìn)行傳遞來增強(qiáng)。所述免疫原可以與或不與包括共價(jià)連接的脂質(zhì) 部分如Pam3Cys在內(nèi)的佐劑一起被包入膠囊內(nèi)，而且這種微?？梢耘c免疫刺激佐劑如弗氏 不完全佐劑或明礬一起進(jìn)行用藥。對(duì)于口服用藥和局部用藥，所述微粒的功能是增強(qiáng)對(duì)免 疫原的免疫應(yīng)答并且對(duì)持續(xù)或周期性應(yīng)答提供由時(shí)間調(diào)控的釋放(0' Hagan等，1991)。本發(fā)明的另一方面涉及抗天然內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的游離N-末端和/或游離C-末端的免疫方法，其中當(dāng)所述天然內(nèi)肽裂解產(chǎn)物天然存在于哺乳動(dòng)物中時(shí)，其來自一種前體蛋白 或成熟蛋白。根據(jù)本發(fā)明的該方法包括給哺乳動(dòng)物施用一種含有本發(fā)明嵌合肽的免疫組合 物，所述內(nèi)肽裂解產(chǎn)物對(duì)其是一種自身分子。該方法的一種優(yōu)選實(shí)施方案是一種目的在于 針對(duì)淀粉樣β肽來進(jìn)行免疫從而產(chǎn)生抗-N-末端或抗-C-末端的端點(diǎn)-特異性淀粉蛋白 β抗體的方法，所述抗體與β淀粉狀蛋白前體蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)。在該優(yōu)選的實(shí)施方 案中，在本發(fā)明方法中使用的式(I)和(II)所示嵌合肽的N和/或C來自淀粉樣β肽的 N-末端和/或C-末端。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及一種含有抗體的抗原_結(jié)合部分的分子，該抗體對(duì)本發(fā)明嵌 合肽具有特異性，優(yōu)選是單克隆抗體。所述分子可以是一種體內(nèi)產(chǎn)生的抗所述嵌合肽的抗 體或者是一種旨在包含含有抗原結(jié)合部分的抗體片段的重組抗體、嵌合的或人源化的任何 同型免疫球蛋白分子以及單鏈抗體。嵌合抗體應(yīng)被理解為是其不同部分來源于不同的動(dòng)物種類的分子，如那些具有來 源于鼠單克隆抗體的可變區(qū)和一種人免疫球蛋白恒定區(qū)的人源化抗體。嵌合抗體及其生 產(chǎn)方法是本技術(shù)領(lǐng)域熟知的。例如，可以將編碼所述抗體的可變區(qū)的DNA插入到編碼其它 抗體的DNA中或與編碼其它抗體的DNA進(jìn)行連接以產(chǎn)生嵌合抗體(美國專利US4816567 ； Orlandi 等，1989)。單鏈抗體可以是具有端點(diǎn)-特異性肽結(jié)合能力的和含有一對(duì)與免疫球蛋白輕鏈 和重鏈的可變區(qū)同源或類似的氨基酸序列(連接WVh-I或單鏈Fv)的單鏈復(fù)合多肽。 Vh和\可以拷貝天然單克隆抗體的序列，或者所述鏈的一條或兩條可能含有美國專利 US 5，091，513中記載類型的⑶R-FR構(gòu)建體。類似于輕鏈和重鏈可變區(qū)的分離開的多肽 通過肽連接被結(jié)合在一起。生產(chǎn)這種單鏈抗體，例如單鏈Fv(ScFv)，特別是其中編碼Vh和 八鏈的多肽結(jié)構(gòu)的DNA被表征或可以通過序列分析容易確定的單鏈抗體的方法可以按照 下列文獻(xiàn)中記載的方法來實(shí)現(xiàn)例如美國專利4，946，778，美國專利5，091，513，美國專利 5，096，815，Biocca 等(1993)，Duan 等(1994)，Mhashilkar 等(1995)，Marasco 等(1993)， 和 Richardson 等(1995)。除了在體內(nèi)產(chǎn)生抗體的常規(guī)方法外，抗體還可以通過利用噬菌體展示技術(shù)在體外 進(jìn)行生產(chǎn)。重組抗體的產(chǎn)生比常規(guī)抗體產(chǎn)生快得多而且能夠產(chǎn)生出針對(duì)大量抗原的重組抗 體。與此相比，在常規(guī)方法中，許多抗原被證明是非免疫原性的或者具有極大的毒性，從而 不能被用來在動(dòng)物中產(chǎn)生抗體。而且，重組抗體的親合力成熟(即，增強(qiáng)親合力和特異性) 是非常簡單的而且相對(duì)快。最后，針對(duì)一種特異性抗原的大量不同抗體可以通過一種選擇 過程來產(chǎn)生。為了產(chǎn)生重組單克隆抗體，可以利用以噬菌體展示庫為基礎(chǔ)的各種方法來產(chǎn) 生具有不同抗原識(shí)別位點(diǎn)的一大組抗體。這種庫可以通過幾種方式來制備通過在一組重 鏈種系基因中克隆合成的CDR3區(qū)域來制備一個(gè)合成系統(tǒng)從而得到了一個(gè)大的抗體系統(tǒng)， 從該系統(tǒng)中可以選擇具有不同特異性的抗體片段。還可以利用人淋巴細(xì)胞組作為構(gòu)建抗體 庫的起始物質(zhì)。有可能構(gòu)建人IgM抗體的幼稚系統(tǒng)并由此建立一個(gè)多樣性豐富的人體庫。 該方法已成功地被廣泛用來選擇大量抗不同抗原的抗體。而且本發(fā)明的另一方面還涉及一種被動(dòng)免疫的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物，優(yōu) 選人，施用含有對(duì)本發(fā)明嵌合肽特異的抗體的抗原結(jié)合部分的分子，所述內(nèi)肽裂解產(chǎn)物對(duì) 其是一種自身分子。該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是一種目的在于用其中抗原結(jié)合部分對(duì)淀粉樣β肽是端點(diǎn)特異性的分子進(jìn)行被動(dòng)免疫的方法。至此已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解可在相當(dāng)參數(shù)、濃 度和條件的寬范圍內(nèi)進(jìn)行同樣的發(fā)明而不會(huì)偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍并且也不需要額外 的實(shí)驗(yàn)。當(dāng)聯(lián)系特定的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解其能夠進(jìn)一步進(jìn)行改動(dòng)。 本申請(qǐng)旨在覆蓋對(duì)本發(fā)明的任何改變、使用或修飾，這些改變、使用或修飾總的來說都遵循 了本發(fā)明的原理，并且包括那些屬于本發(fā)明所涉及的技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知或常規(guī)的慣例之內(nèi)和 適用如下所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)列出的必要特征的偏離本發(fā)明的內(nèi)容。本文所引用的包括雜志論文或文摘、公開的或相應(yīng)的美國或外國專利申請(qǐng)、頒發(fā) 的美國或外國專利或任何其它的參考文獻(xiàn)在內(nèi)的所有參考文獻(xiàn)被本文全文引用作為參考， 包括被引用文獻(xiàn)中提供的所有的數(shù)據(jù)、表格、圖和正文。另外，在本文引用的參考文獻(xiàn)中的 被引用的參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容也被全文引用作為參考。對(duì)已知的方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法或常規(guī)方法的參考無論如何并不意 味本發(fā)明的任何方面、描述或?qū)嵤┓桨冈谙嚓P(guān)技術(shù)中已被公開、教導(dǎo)或暗示。上述特定實(shí)施方案的描述將本發(fā)明的總體特征展示得如此充分以致于他人通過 應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)知識(shí)(包括本文引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)能輕而易舉地對(duì)該特定實(shí)施方案 進(jìn)行修飾和/或改變以便進(jìn)行不同的應(yīng)用，而不需要額外的實(shí)驗(yàn)，不需要偏離本發(fā)明的總 構(gòu)思。因此，在本申請(qǐng)教導(dǎo)和指導(dǎo)的基礎(chǔ)上，這種改變和修飾將落在所記載的實(shí)施方案的同 等范疇內(nèi)。應(yīng)將本文中出現(xiàn)的術(shù)語或措辭理解為是描述性質(zhì)的而不是限制性質(zhì)的，因此本 申請(qǐng)的術(shù)語或措辭由本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本文的教導(dǎo)和指導(dǎo)下結(jié)合本技術(shù)領(lǐng)域普通 技術(shù)人員所掌握的知識(shí)來進(jìn)行解釋。參考文獻(xiàn)Barrow等，"合成的阿爾茨海默氏病的淀粉樣β肽的溶液構(gòu)象和聚集特性。圓 二色i普分析(Solution conformations and aggregational propertiesof synthetic amyloid beta-peptides of Al zheimer' s disease. 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<160>27
<170>PatentIn version 3.1 <210>1
<211>59 <212>PRT <213> 人 <400>1
Glu Val Lys Met Asp 15
His His Gln Lys Leu
Gly Ala
Lys Met
Gln Lys 20 lie lie 35
lie Thr Leu
Ala Glu Phe Arg Val Phe Phe
lie Val 50 <210>2 <211>40 <212>PRT <213> 人 <400>2
Asp Ala Glu Phe 1
Leu Val Phe Phe 20 Val
Gly Leu Met Val 40
Val Met Leu 55
Ala
25
Gly
Arg 5
Ala
His Asp Ser Gly Glu Asp Val
Gly 25
Gly Gly Val Val 40
His Asp 10
Glu Asp
Ser Gly Tyr Gly
Gly Val Lys Lys Lys
Val Val
lie 45
Ser
30
Ala
Glu Val 15
Asn Lys Thr Val
Tyr Glu 10
Ser Asn
Val Lys
His His
Gly Ala 30
Gln
15
lie
Lys lie
Gly Leu Met 35 <210>3 <211>42 <212>PRT <213> 人 <220>
<221>MISC_FEATURE
<223>Xaa 是 L-Asp, D-Asp,或 L_iso Asp
21
Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr202530<210>11<211>17<212>PRT<213>破傷風(fēng)毒素細(xì)菌<400>11Lys Lys Gln Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu151015Leu<210>12<211>22<212>PRT<213>破傷風(fēng)毒素細(xì)菌<400>12Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys151015Val Ser Ala Ser His Leu20<210>13<211>15<212>PRT<213>百日咳毒素細(xì)菌<400>13Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu151015<210>14<211>27<212>PRT<213>破傷風(fēng)毒素細(xì)菌<400>14Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu151015Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn lie Lys2025<210>15<211>24<212>PRT<213>百日咳毒素細(xì)菌
<400>24
Lys Trp Phe Lys
1
Ile
<210>25
<211>14
<212>PRT
<213>大腸桿菌
<400>25
Gly Leu Gln Gly
1
<210>26
<211>19
<212>PRT
<213>大腸桿菌
<400>26
Gly Leu Ala Ala
1
Asp Val Asn
<210>27
<211>20
<212>PRT
<213>大腸桿菌
<400>27
Ser Thr Glu Thr
1
Asn Ala Asn Lys
20
權(quán)利要求
由式(I)或式(II)所示的嵌合肽或者是式(I)肽的混合物、式(II)肽的混合物或式(I)肽和式(II)肽的混合物的嵌合肽，(I)N (S)m (Th)n(II)(Th)n (S)m C，其中N是來自天然存在的內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的游離N 末端的最前2、3、4或5個(gè)氨基酸殘基，當(dāng)所述內(nèi)肽裂解產(chǎn)物天然存在于哺乳動(dòng)物中時(shí)，其來源于前體蛋白或成熟蛋白；C是來自所述天然存在的內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的游離C 末端的最后2、3、4或5個(gè)氨基酸殘基；Th是T輔助細(xì)胞表位；S是間隔氨基酸殘基；m是0、1、2、3、4或5；而n是1、2、3或4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種或多種嵌合肽，其中所述內(nèi)肽裂解產(chǎn)物是一種淀粉樣β肽， 當(dāng)其天然存在時(shí)，由β淀粉狀蛋白前體蛋白(β APP)的裂解產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的一種或多種嵌合肽及其混合物，其中所述內(nèi)肽裂解產(chǎn)物具有選自 SEQ ID NO :2、3、4、5、6、7 的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的一種或多種嵌合肽，其中N是所述內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的游離N-末端的 最前2或3個(gè)氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的一種或多種嵌合肽，其中C是所述內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的游離C-末端的 最后2或3個(gè)氨基酸殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的一種或多種嵌合肽，其中Th是混棲T輔助細(xì)胞表位。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的一種或多種嵌合肽，其中所述混棲T輔助細(xì)胞表位來自破傷風(fēng) 毒素、百日咳毒素、白喉毒素、麻疹病毒F蛋白、乙型肝炎表面抗原、沙眼衣原體主要外膜蛋 白、惡性瘧原蟲環(huán)子孢子、曼森血吸蟲丙糖磷酸異構(gòu)酶或大腸桿菌TraT。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的一種或多種嵌合肽，其中所述混棲T輔助細(xì)胞表位具有選自SEQ ID NO :8至27的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的一種或多種嵌合肽，其中S是甘氨酸。
10.一種免疫組合物，其含有免疫有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的一種或多種嵌合肽以及 藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑或輔劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的免疫組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的輔劑是佐劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的免疫組合物，其中所述佐劑是明礬。
13.對(duì)抗來自前體蛋白或成熟蛋白的自身肽內(nèi)裂解產(chǎn)物的游離N-末端或游離C-末端 的免疫方法，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用根據(jù)權(quán)利要求10的免疫組合物，其中所述內(nèi)肽裂解產(chǎn) 物是哺乳動(dòng)物的自身分子。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述自身肽內(nèi)裂解產(chǎn)物是一種淀粉樣β肽，當(dāng)該肽 天然存在時(shí)，其由β淀粉狀蛋白前體蛋白的裂解產(chǎn)生，由此所述方法產(chǎn)生對(duì)所述淀粉樣β 肽的游離N-末端和/或游離C-末端特異性的抗體。
16.一種分子，該分子含有對(duì)根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合肽特異的抗體的抗原結(jié)合部分。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的分子，其中所述抗體是單克隆抗體。
18.被動(dòng)免疫的方法，其包括給哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求16所述的分子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中誘導(dǎo)所述抗體產(chǎn)生的所述嵌合肽是一種其中內(nèi)肽裂 解產(chǎn)物是淀粉樣β肽的嵌合肽，當(dāng)該肽天然存在時(shí)，其由β淀粉狀蛋白前體蛋白(βΑΡΡ)裂解產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種嵌合肽或嵌合肽混合物，該嵌合肽或嵌合肽混合物可被配制成一種免疫組合物并且用于免疫哺乳動(dòng)物抵抗來自前體蛋白或成熟蛋白的內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的方法中，其中所述肽裂解產(chǎn)物和前體或成熟蛋白是自身分子。所述一種或多種嵌合肽具有來源于天然存在的前體或成熟蛋白的內(nèi)肽裂解產(chǎn)物的端點(diǎn)-特異性B細(xì)胞表位，該表位作為游離N-末端或C-末端通過或不通過間隔殘基與來源于不同于內(nèi)肽裂解產(chǎn)物來源的生物來源的T輔助細(xì)胞表位融合。
文檔編號(hào)A61K39/39GK101935352SQ20101010667
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2000年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月8日
發(fā)明者B·錢恩 申請(qǐng)人:智力神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)公司