專利名稱：Mntf肽組合物及使用方法
MNTF肽組合物及使用方法本公開內(nèi)容總的涉及使用MNTF肽及其類似物治療神經(jīng)元疾病的組合物及方法。相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2008年2月21日提交的題為“MNTF肽組合物及使用方法”的美國臨 時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/066，669的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用整體并入本文。
背景技術(shù)：
下述包括在理解本公開內(nèi)容上有用的信息。不承認(rèn)本文提供的任何信息為現(xiàn)有技 術(shù)或與現(xiàn)有的公開內(nèi)容相關(guān)，或不承認(rèn)明確或隱含引用的任何出版物或文件為現(xiàn)有技術(shù)。已發(fā)現(xiàn)胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活取決于源自相關(guān)的發(fā)育中骨骼肌的特定營養(yǎng)物質(zhì)。 已報(bào)道某些骨骼肌產(chǎn)生能夠通過防止胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的衰退和隨后的自然細(xì)胞死亡來增 強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活和發(fā)育的物質(zhì)。這些物質(zhì)被廣泛稱為神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)，其為對(duì)選 定神經(jīng)元群的存活、生長、維持及功能性能力起促進(jìn)作用的一類?；鞍踪|(zhì)(例如Chau， R. Μ. W.，et al.，6 Chin. J Neuroanatomy 129，1990)?？赏ㄟ^功能性神經(jīng)組織的急性或進(jìn)行性喪失來整體或部分表征影響中樞和/或 外周神經(jīng)系統(tǒng)的各種神經(jīng)退行性、神經(jīng)肌肉和神經(jīng)元疾病、疾病或病況。US 6309877、US 7183373、US 6841531、US 6759389 和 US 20060052299 報(bào)道了被 稱為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)的特定神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)，其具有在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元上發(fā)揮 營養(yǎng)作用的能力，所述文獻(xiàn)內(nèi)容通過引用整體并入本文。發(fā)明概述本文所述內(nèi)容為具有包括但不限于所述發(fā)明概述中闡述、描述或引用的許多特性 和實(shí)施方式的技術(shù)。不希望其為包含全部的且所述權(quán)利要求不為所述發(fā)明概述確定的特征 或?qū)嵤┓绞剿拗?，其僅因說明而非限制的目的而被包括。因此，一方面，本公開內(nèi)容涉及新型肽和組合物，其包含對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的活力 和增殖有用的MNTF分子的一部分，從而提供易于合成及在治療中樞和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)中 的廣泛的神經(jīng)退行性、神經(jīng)肌肉疾病、疾病或病況上為治療有效的神經(jīng)營養(yǎng)肽。一方面，本公開內(nèi)容涉及包含至少兩個(gè)連續(xù)殘基的合成和/或純化的MNTF肽或其 類似物，其包括在 LGTFWGDTLN CWMLSAFSRY ARCLAEGHDGPTQ (SEQ ID NO 1)的位置 17 和 18 處的FS殘基，且對(duì)誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的活力和生長有用。在某些實(shí)施方式中，MNTF肽或其類似物包括包含SEQ ID NO :1 22的序列類似 物。在某些實(shí)施方式中，MNTF肽或其類似物為2聚體、3聚體、4聚體或5聚體非棕櫚?；?肽。在某些其他實(shí)施方式中，MNTF肽或其類似物為2聚體、3聚體、4聚體、5聚體或6聚體 棕櫚?；?。在某些方面中，本公開內(nèi)容提供組合物，其包含通過與滲透增強(qiáng)劑共價(jià)鍵合 (bonding)/鍵合(linkage)或綴合，或者在固相合成期間通過經(jīng)由肽鍵添加所述滲透增強(qiáng) 劑而被N-末端修飾的MNTF肽或其類似物。在某些實(shí)施方式中，麗TF肽由下列構(gòu)成i)SEQ ID NO 1的2個(gè)和6個(gè)之間的連 續(xù)氨基酸；ii)SEQ ID NO :1的2個(gè)和5個(gè)之間的連續(xù)氨基酸；iii)SEQ ID NO :1的3個(gè)和
35個(gè)之間的連續(xù)氨基酸；iv)SEQ ID NO 1的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸；v) SEQ ID NO 1的至少 3個(gè)連續(xù)氨基酸；或vi)它們中任一項(xiàng)的類似物，例如i) ν)中任一項(xiàng)的功能衍生物。在 i)、iv)和ν)中所述MNTF肽不具有由SEQ IDNO :2構(gòu)成的氨基酸序列。在某些其他實(shí)施方 式中，MNTF肽或其類似物具有選自SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 22或它們的功能衍生物的 氨基酸序列。優(yōu)選MNTF肽或其類似物具有MNTF活性。在一些方面中，將所述MNTF肽類似物共價(jià)連接(例如在N-末端處通過肽鍵)至 2 22碳的脂肪酸分子(例如棕櫚酸)。一方面，本公開內(nèi)容提供了皮膚藥學(xué)組合物，其包 含具有選自 LGTFWGDTLNCWMLSAFSRYARCLAEGHDGPTQ(SEQ ID NO 1)的至少 2 個(gè)連續(xù)氨基酸 殘基(包括FS)的肽或其類似物，及藥學(xué)可接受載質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述MNTF肽或其類似物包含SEQ ID NO 1的苯丙氨酸-絲 氨酸二肽和SEQ ID NO :1中的1 30個(gè)額外的氨基酸，任選具有在SEQ ID NO :1中所述序 列的1 5個(gè)連續(xù)氨基酸取代的所述MNTF肽或其類似物、或酯、酰胺、前藥和/或它們的鹽 形式。在另一實(shí)施方式中，所述MNTF肽類似物在N-末端處被綴合或共價(jià)連接或通過肽 鍵連接至2 22碳的脂肪酸分子(例如棕櫚酸)以增強(qiáng)皮膚滲透性和/或油溶解性。LGTFffGDTLN CWMLSAFSRY ARCLAEGHDG PTQ(SEQ ID NO 1)FSRYAR (SEQ ID NO 2)FS (SEQ ID NO 3)FSR (SEQ ID NO 4)AFS (SEQ ID NO 5)FSRY (SEQ ID NO 6)SAFS (SEQ ID NO 7)AFSR (SEQ ID NO 8)LSAFS (SEQ ID NO 9)SAFSR (SEQ ID NO 10)AFSRY(SEQ ID NO 11)FSRYA (SEQ ID NO 12)MLSAFS(SEQ ID NO: 13)LSAFSR(SEQ ID NO: 14)SAFSRY(SEQ ID NO: 15)AFSRYA(SEQ ID NO: 16)SRYAR (SEQ ID NO : 17)RYAR (SEQ ID NO : 18)YAR (SEQ ID NO : 19)SRYA (SEQ ID NO : 20)RYA (SEQ ID NO : 21)SRY (SEQ ID NO : 22)另一方面，提供用于通過給細(xì)胞培養(yǎng)物體外施用所述MNTF肽或其類似物，或者給 遭受神經(jīng)損傷或神經(jīng)退行性疾病的個(gè)體體內(nèi)施用所述MNTF肽或其類似物，以促進(jìn)細(xì)胞增
4殖或穩(wěn)定不適當(dāng)?shù)募?xì)胞死亡，和/或在兩種情況下恢復(fù)正常細(xì)胞行為來調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的 活力和/或生長的組合物和方法。另一方面，提供了提高有神經(jīng)通路損傷癥狀的受試者的 運(yùn)動(dòng)功能的方法，其包括給有需要的受試者施用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)肽或其類似 物。因此，一方面，本公開內(nèi)容涉及新型肽和組合物，其包含對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的活力 和增殖有用的MNTF分子的一部分，從而提供易于合成及在治療廣泛的皮膚疾病(包括皮下 區(qū)域神經(jīng)和肌肉的神經(jīng)移植術(shù))上為治療有效的神經(jīng)營養(yǎng)肽。一方面，本公開內(nèi)容涉及合成和/或純化的MNTF肽或其的類似物，其包含對(duì)誘導(dǎo) 或調(diào)節(jié)鄰近皮膚的神經(jīng)元細(xì)胞的活力和生長有用的FS結(jié)構(gòu)域。另一方面，通過給細(xì)胞培養(yǎng)物體外施用所述MNTF肽或其類似物，或者給遭受神經(jīng) 損傷或神經(jīng)退行性疾病的個(gè)體體內(nèi)施用所述MNTF肽或其類似物，以促進(jìn)細(xì)胞增殖或穩(wěn)定 不適當(dāng)?shù)募?xì)胞死亡，和/或在兩種情況下恢復(fù)正常細(xì)胞行為來調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的活力和/ 或生長的組合物和方法。一方面，提供了修復(fù)受試者中損傷的神經(jīng)通路的方法，其包含給有需要的受試者 施用MNTF肽或其類似物，其中所述損傷的神經(jīng)通路與皮膚損傷或病況相關(guān)，其中以對(duì)治療 所述皮膚病況或疾病，由此在所述受試者中損傷的神經(jīng)通路被修復(fù)來說有效的量施用所述 MNTF肽或其類似物。


圖1示例示MNTF肽對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活的存活測(cè)定。從大鼠脊髓中培養(yǎng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng) 元，并在BDNF、GDNF和CNTF存在下于培養(yǎng)基中生長3天。3天后，所述細(xì)胞在無常規(guī)營養(yǎng) 因子但有指定的10μ g/ml的MNTF肽下生長。48小時(shí)后確定活細(xì)胞數(shù)。所述坐標(biāo)圖示五個(gè) 樣品的平均+/-SD值(BDNF =腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；GDNF =膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子； CNTF=睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)。發(fā)明詳述已發(fā)現(xiàn)胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活取決于源自相關(guān)的發(fā)育中骨骼肌的特定營養(yǎng) 物質(zhì)。已報(bào)道某些骨骼肌產(chǎn)生能夠通過防止胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的衰退和隨后的自然 細(xì)胞死亡來增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活和發(fā)育的物質(zhì)。(0' Brian, R. J. and Fischbach, G. D. , 6J. Neurosci. 3265 (1986) ；Hol lyday, Μ. and Hamburger, V. , 170J. Comp· Neurol.311 (1976). McManaman, J. L. , et al.,263J. Biol. Chem. 5890(1988) ；Oppenheim, R. W.，et al.，240Science, 919 (1988)；及 Smith, R. G.，et al.，6J. Neurosci. 439 (1986))。人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)為源自骨骼肌組織的特定NTF，已顯示其可減少運(yùn) 動(dòng)神經(jīng)元損傷位點(diǎn)的發(fā)炎，加強(qiáng)神經(jīng)再生并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活。已在各種大鼠神經(jīng)系 統(tǒng)(包括外周坐骨神經(jīng)(控制下肢肌肉)、外周肌皮神經(jīng)(控制上肢肌肉)、顱面神經(jīng)(控 制面部和頭部肌肉)、顱舌下神經(jīng)(控制舌)及控制頸部、胸部和上肢肌肉的脊髓的一部 分)中檢測(cè)了 MNTF。在所述脊髓模型中，在大鼠半節(jié)脊髓中的神經(jīng)移植上使用MNTF ;MNTF 減少發(fā)炎、限制變性及加強(qiáng)所述移植神經(jīng)的再生。大量研究已證明，當(dāng)在神經(jīng)上直接使用本 文所述的合成的MNTF或肽類似物時(shí)，所述合成的MNTF或肽類似物在大鼠外周神經(jīng)模型系 統(tǒng)中對(duì)于營養(yǎng)(trophic)和營養(yǎng)(tropic)作用的功效。此外，已顯示MNTF可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神
5經(jīng)元的再生和存活。在某些生長和發(fā)育階段期間在脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。因 此，來自相關(guān)靶組織的可溶性神經(jīng)元營養(yǎng)因子的添加有助于緩解神經(jīng)元死亡的所述現(xiàn)象。因此，本公開內(nèi)容的方面和實(shí)施方式為神經(jīng)元疾病的治療提供了包含所述MNTF 肽或其類似物的方法和組合物。本公開內(nèi)容的方面和實(shí)施方式涉及與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子的作用相關(guān)的功能蛋 白結(jié)構(gòu)域，其已被鑒定且定位于MNTF分子中的短重疊序列。包括SEQ ID NO 2 22中結(jié) 構(gòu)域的所述蛋白結(jié)構(gòu)域足以調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的活力和增殖。此外，包含所述結(jié)構(gòu)域的截短 的MNTF肽或類似物本身足以顯示在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元/神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞雜交物中的刺激生物 活性。^JL闡述了在本公開內(nèi)容涉及的所述技術(shù)中使用的某些術(shù)語。除另有說明外，在本文 和隨附的權(quán)利要求中使用時(shí)下列術(shù)語具有下列含義。在說明書下文或其他地方?jīng)]有定義的 那些術(shù)語應(yīng)具有其公認(rèn)的含義。本文所用“運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子”包括在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的營 養(yǎng)和維持中涉及的因子。本文所用術(shù)語“運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子”、“MNTF”、“MNTF肽”、“運(yùn)動(dòng) 神經(jīng)元營養(yǎng)因子類似物”和“MNTF類似物”分別涉及本文所述的肽及其類似物且具有本文 所定義的功能特性。其可包括所述參照MNTF序列的序列和功能同源物。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng) 因子可促進(jìn)定向神經(jīng)前體細(xì)胞的發(fā)育和分化，或其可誘導(dǎo)或加強(qiáng)分化神經(jīng)細(xì)胞的生長(如 神經(jīng)軸突突起)和存活。“MNTF活性”包括下列活性的一種或多種促進(jìn)神經(jīng)元的生長，促 進(jìn)神經(jīng)元的維持，促進(jìn)神經(jīng)軸突突起，促進(jìn)經(jīng)軸突切斷的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的軸突再生，促進(jìn)運(yùn)動(dòng) 功能，修復(fù)損傷的神經(jīng)通路，再生神經(jīng)通路或緩解神經(jīng)元缺陷。通常以以對(duì)產(chǎn)生CNS或PNS 的完全分化神經(jīng)細(xì)胞(例如，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)來說有效的量提供本公開內(nèi)容的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營 養(yǎng)因子。本文提供了所述量的指導(dǎo)且基于本文公開的方案和方法其可由本領(lǐng)域技術(shù)技術(shù)人 員輕易確定。在 Chau，R. M. W. ,et al, Muscle Neuronotrophic Factors Specific for Anterior Horn Motoneurons of Rat Spinal Cord、Recent Advances in Cellular and Molecular Biology, Vol. 5,Peeters Press, Leuven,Belgium,pp. 89-94 (1992)中已報(bào)道了 MNTF 肽，及在例如 US 6309877、US 7183373、US 6841531、US 6759389 和 US 20060052299 中發(fā)現(xiàn)的MNTF肽，其內(nèi)容通過引用整體并入本文。在某些實(shí)施方式中，樣本包括合成和/ 或純化的MNTF肽或其類似物，其包含SEQ ID NO :2 22結(jié)構(gòu)域的一部分和模擬其結(jié)構(gòu)和 /或功能的分子，其包括截短的序列同源物和類似物，且其對(duì)誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的活力 和生長有用。此外，MNTF肽也包括在 Chau，R. M. W.，et al.，The Effect of a 30kD Protein from Tectal Extract of Rat on Cultured Retinal Neurons,34Science in China, Series B,908 (1991)、Chau, R. M. W. , et al. , Muscle Neuronotrophic Factors Specific for Anterior Horn Motoneurons of RatSpinal Cord、 Recent Advances in Cellular and Molecular Biology, Vol.5, Peeters Press, Leuven, Belgium, pp. 89-94(1992)、 Chau, R. M. W. , et al. , The Effectof a 30kD Protein from Tectal Extract of Rat on
6Cultured Retinal Neurons,34Science in China, Series B,908 (1991)> Chau, R. M. W., et al. , Cloning of Genes for Muscle-Derived Motoneuronotrophic Factor 1(MNTFl) and Its Receptor by Monoclonal Antibody Probes, (abstract)19Soc. for Neurosci. parti,252 (1993)、Chau, R. M. W. , et al. , Cloning of Genes for Muscle-Derived Motoneuronotrophic Factorl (MNTFl) and Its Receptor by Monoclonal Antibody Probes, (abstract) 19Soc. for Neurosci. parti, 252 (1993)中所述的 MNTF 肽，其內(nèi)容通過 引用整體并入本文。在某些實(shí)施方式中，MNTF肽或其類似物可包括自MNTF結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)之一的序 列(例如兩個(gè)氨基酸的MNTF肽，如SEQ ID NO :3)。在某些實(shí)施方式中，所述MNTF肽由在SEQ ID NO :2 22中所述的序列構(gòu)成。在 其他一些實(shí)施方式中，所述MNTF肽類似物包括在SEQID NO :2 22中所述的MNTF肽的功 能衍生物。本文所述MNTF肽及其類似物包括源自MNTF (即源自SEQ ID NO 1)的肽和它們的 功能衍生物。所述化合物包括具有SEQ ID NO 2 22之一的氨基酸序列的肽和具有在SEQ ID NO 2 22中提供的氨基酸序列的肽的功能衍生物。本申請(qǐng)所用“類似物”包括已被修飾但保留MNTF活性(例如相對(duì)于33聚體MNTF， SEQ ID NO: 1，通過截短、取代、共價(jià)連接至另一部分等)的肽。MNTF肽類似物包括例如MNTF 肽的酯、酰胺、前藥和/或鹽形式。MNTF肽類似物包括通過連接至另一部分而被共價(jià)修飾的 MNTF肽，例如將MNTF肽共價(jià)連接至親脂部分(例如脂肪酸)、載質(zhì)分子或異源多肽以產(chǎn)生 融合蛋白。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的類似物包括“保守”取代(例如相對(duì)于SEQ ID NO :1)。保守的氨基酸取代包括使用同組內(nèi)的同義氨基酸的氨基酸替換，其具有足夠相似的 物理化學(xué)特性即組成員間的取代會(huì)保持分子的生物學(xué)功能(Grantham，Science, Vol. 185， pp. 862-864(1974))。MNTF類似物還包含本文所述的肽或類似物的MNTF功能衍生物。在一 些實(shí)施方式中，與在SEQ ID NO 1或其截短形式(包括SEQ ID NO :2 22)所示的序列相 比，所述MNTF類似物包括20 %、25 %、30 %、35 %或多達(dá)40 %的保守氨基酸取代。本文所用MNTF的“功能衍生物”指依據(jù)已知方法從氨基酸部分側(cè)鏈或末端的N-或 C-基上存在的功能基制備的衍生物且當(dāng)其為藥學(xué)可接受時(shí)即當(dāng)其不破壞蛋白/肽活性或 不把不可接受的毒性給予包含它們的藥物組合物時(shí)其被包含在本公開內(nèi)容中。所述衍生物 包括例如羧基的脂肪酯或酰胺和游離氨基的N-?；苌?、及游離羥基的0-酰基衍生物 和用?；纬傻睦珂溚轷；蚍减；?、前藥、功能基的鹽或它們的組合。同義氨基酸組包括在表I、II和III中所定義的組表 I同義氨基酸的廣義組氨基酸一同義組Ser-—Ser、Thr、Gly、AsnArg-—Arg、Gln、Lys、Glu、HisLeu-—lie、Phe> Tyr> Met、VaULeuPro-—Gly、Ala、Thr、ProThr-—Pro、Ser、Ala、Gly、His、Gin、Thr
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同義氨基酸的狹義組氨基酸-同義組Ser-—SerArg——ArgLeu——lie、Met、LeuPro-—ProThr-—ThrAla-—AlaVal-—ValGly-—Glylie-—Ile、Met、LeuPhe-—PheTyr-—TyrCys-—Ser、CysHis—HisGln-—GlnAsn——AsnLys——LysAsp——AspGlu—GluMet-—lie、Leu、MetTrp-—Trp在本文所提供的化合物(例如肽和蛋白)中使用的氨基酸可為基因編碼的氨基 酸、天然存在的非基因編碼的氨基酸或合成的氨基酸?？蓪⑸鲜鲋我环N的L-和D-對(duì)映 體用于所述化合物。對(duì)下列基因編碼的氨基酸(和它們的殘基)本文使用下列縮寫丙氨 酸(Ala，Α)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)； 甘氨酸(Gly，G)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；組氨酸(His，H)；異亮氨酸(lie，I)； 亮氨酸(Leu, L)；賴氨酸(Lys, K)；蛋氨酸(Met, Μ)；苯丙氨酸(Phe, F)；脯氨酸(Pro, P)； 絲氨酸(Ser, S)；蘇氨酸(Thr, T)；色氨酸(Trp, W)；酪氨酸(Tyr, Y)及纈氨酸(Val, V)。非基因編碼和在本文所述化合物中存在的某些常見氨基酸包括，但不限于 β-丙氨酸(b-Ala)及其他ω-氨基酸(如3_氨基丙酸(Dap)、2，3_ 二氨基丙酸(Dpr， 2)、4_氨基丁酸等)、α-氨基異丁酸(Aib)、ε-氨基己酸(Aha)、δ -氨基戊酸(Ava)、 甲基甘氨酸(MeGly)、鳥氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit)、叔丁基丙氨酸(t_BuA)、叔丁基甘氨酸 (t-BuG)、N_甲基異亮氨酸(MeIle)、苯基甘氨酸(Phg)、環(huán)己丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle， J)、2_萘丙氨酸(2-Nal)、4-氯苯丙氨酸(Phe (4-C1))、2_氟苯丙氨酸(Phe (2-F))、3_氟苯 丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、青霉胺(Pen)、1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧 酸(Tic)、β -2-噻吩丙氨酸(Thi)、蛋氨酸亞砜(MSO)、高精氨酸(hArg)、N-乙酰賴氨酸 (AcLys)、2，3-二氨基丁酸(Dab)、2，3-二氨基丁酸(Dbu)、對(duì)氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2))、 N-甲基纈氨酸(MeVal)、高半胱氨酸(hCys)、3_苯并噻唑_2_基-丙氨酸(BztAla，B)和高
9絲氨酸(hSer)。涉及的更多氨基酸類似物包括磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、羥脯氨酸、Y-羧 基谷氨酸、馬尿酸、八氫吲哚-2-羧酸、抑胃酶氨酸、α -甲基-丙氨酸、對(duì)苯甲酰_苯基丙 氨酸、炔丙基甘氨酸和肌氨酸。無論現(xiàn)在還是將來，本文所述肽可有任何L-或D-構(gòu)型的上 述氨基酸、或本文所述或本領(lǐng)域已知的任何其他氨基酸?？苫ハ嗳〈陌被嵬ǔ儆谙嗨频念惢騺嗩?。如本領(lǐng)域任一技術(shù)人員所知，主 要取決于所述氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)和物理特性而將氨基酸分進(jìn)不同類中。例如，通常認(rèn)為一 些氨基酸為親水性或極性氨基酸而認(rèn)為其他的為疏水性或非極性氨基酸。極性氨基酸包 括有酸性、堿性或親水性側(cè)鏈的氨基酸而非極性氨基酸包括有芳香族或疏水性側(cè)鏈的氨基 酸。可進(jìn)一步將非極性氨基酸細(xì)分成包括尤其是脂肪族氨基酸。本文所用的氨基酸種類的 定義如下“非極性氨基酸”指具有在生理ρΗ下不帶電、非極性且通常被水溶液排斥的側(cè)鏈的 氨基酸?；蚓幋a的疏水性氨基酸的例子包括Ala、Ile、Leu、Met、Trp、Tyi^nVal。非基 因編碼的非極性氨基酸的例子包括t-BuA、Cha和Nle。“芳香族氨基酸”指具有包含至少一個(gè)具有共軛η -電子系統(tǒng)的環(huán)的側(cè)鏈(芳香 基)的非極性氨基酸。所述芳香基可用取代基(如烷基、烯基、炔基、羥基、磺基、硝基和氨 基及其他基團(tuán))進(jìn)一步取代。基因編碼的芳香族氨基酸的例子包括苯丙氨酸、酪氨酸和色 氨酸。通常遇到的非基因編碼的芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘丙氨酸、β -2-噻吩 丙氨酸、3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸、1，2，3,4-四氫異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟 苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸?！爸咀灏被帷敝妇哂酗柡突虿伙柡椭辨湣⒅ф溁颦h(huán)烴側(cè)鏈的非極性氨基酸。基 因編碼的脂肪族氨基酸的例子包括:Ala、Leu、Val和lie。非編碼的脂肪族氨基酸的例子 包括Nle?！皹O性氨基酸”指具有在生理ρΗ下帶電或不帶電的側(cè)鏈的親水性氨基酸，且其具有 其中由兩個(gè)原子共用的電子對(duì)被所述原子中的一個(gè)更近占有的鍵。極性氨基酸通常為親水 性的，即其具有具有可被水溶液吸引的側(cè)鏈的氨基酸。基因編碼的極性氨基酸的例子包括 天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸和絲氨酸。非基因編碼的極性氨基酸的例子包括瓜 氨酸、高半胱氨酸、N-乙酰賴氨酸和蛋氨酸亞砜?！八嵝园被帷敝妇哂行∮?的側(cè)鏈pK值的親水性氨基酸。由于氫離子的喪失，酸 性氨基酸在生理PH下通常具有帶負(fù)電荷的側(cè)鏈。基因編碼的酸性氨基酸的例子包括天冬 氨酸和谷氨酸?！皦A性氨基酸”指具有大于7的側(cè)鏈pK值的親水性氨基酸。由于水合氫離子的結(jié) 合，堿性氨基酸在生理PH下通常具有帶正電荷的側(cè)鏈?；蚓幋a的堿性氨基酸的例子包 括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。非基因編碼的堿性氨基酸的例子包括鳥氨酸、2，3-二氨基 丁酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。“可電離氨基酸”指在生理ρΗ下可帶電的氨基酸。所述可電離氨基酸包括酸性和 堿性氨基酸，例如D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-組氨酸、D-精氨酸、D-賴氨酸、D-羥賴氨酸、 D-鳥氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸、L-羥賴氨酸或L-鳥氨酸。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解，所述分類不是絕對(duì)的。許多氨基酸顯示出多于一種的
10特征性質(zhì)，且可因此被包括在多于一種分類中。例如酪氨酸既有非極性芳香環(huán)又有極性羥 基。因此，酪氨酸具有可被描述為非極性、芳香化和極性的多種特征。然而，非極性環(huán)是占 優(yōu)勢(shì)的，因此普遍認(rèn)為酪氨酸是非極性的。同樣，除了能形成二硫鍵之外，半胱氨酸也具有 非極性的特征。因此，雖然半胱氨酸沒有被嚴(yán)格劃分為疏水性氨基酸或非極性氨基酸，但在 許多情況下，可用其來為肽賦予疏水性或非極性。在一些實(shí)施方式中，本文所述極性氨基酸可包括例如精氨酸、天冬酰胺、天冬氨 酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、高半胱氨酸、賴氨酸、羥賴氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸及結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸。在一實(shí)施方式中，所述極性氨基酸為可電離氨基酸(如精氨 酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、羥賴氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。可使用的極性或非極性氨基酸殘基的例子包括，例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、蛋 氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等。本文術(shù)語“鹽”指本文所述肽或其類似物的羧基鹽和氨基的酸加成鹽?？赏ㄟ^本領(lǐng) 域已知的方法形成羧基鹽，且其包括無機(jī)鹽(例如鈉、鈣、銨、鐵或鋅鹽等)和與有機(jī)堿(例 如，與胺(如三乙醇胺、精氨酸或賴氨酸、哌啶、普魯卡因等))所形成的鹽。酸性鹽包括，例 如無機(jī)酸(如鹽酸或硫酸)鹽和有機(jī)酸(如醋酸或草酸)鹽。當(dāng)然，所述的任何鹽必須保 留本文所述的肽或其類似物的活性?！扒绑w”為在人體或動(dòng)物體中可被轉(zhuǎn)換成本文所述的肽的化合物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域熟知的任何方案(如固相合成或液相合成)制備本公開內(nèi)容的肽。 作為固相合成，例如對(duì)應(yīng)于要合成的肽C末端的氨基酸被結(jié)合至不溶于有機(jī)溶劑的支持物 上，并通過反應(yīng)的交替重復(fù)，其中一個(gè)反應(yīng)為具有用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基保護(hù)的α-氨基和側(cè)鏈 功能基的氨基酸以C-末端至N-末端的順序依次被縮短，而其中另一個(gè)為釋放結(jié)合至樹脂 或肽α-氨基的保護(hù)基的氨基酸，所述肽鏈從而以此方式延伸。取決于使用的保護(hù)基的類 型，在很大程度上由tBoc方法和Fmoc方法分類固相合成方法。通常使用的保護(hù)基包括對(duì)于氨基的tBoc (叔丁氧羰基)Xl-Z (2-氯芐氧羰基)、 Br-Z (2-溴芐氧羰基)、Bzl (芐基)、Fmoc (9-芴甲氧羰基)、Mbh (4,4' - 二甲氧基二苯甲 基)、Mtr (4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；?、Trt (三苯甲基)、Tos (甲苯磺?；?、Z (芐 氧羰基)和C12-Bzl(2，6 二氯芐基)；對(duì)于胍基的NO2 (硝基)和Pmc (2，2，5，7，8-五甲基色 烷-6-磺?；?；及對(duì)于羥基的tBu (叔丁基)。在所需肽的合成后，其要經(jīng)受去保護(hù)反應(yīng)并從固體支持物上切割出。可用Boc方 法的氟化氫或三氟甲烷磺酸及用Fmoc方法的TFA進(jìn)行所述肽切割反應(yīng)。然后獲得的粗肽要經(jīng)受純化。通過所述目的已知的任一方法即包括提取、沉淀、色 譜、電泳等的任何常規(guī)方案進(jìn)行純化。例如，可使用HPLC(高效液相色譜)。可使用常用于 蛋白純化的基于水_乙腈的溶劑進(jìn)行所述洗脫。基本上以純化的形式提供本文所述的肽，以適于在藥物組合物中、作為活性成分、 在需要MNTF活性和/或由此的調(diào)節(jié)的病變中使用。本文所用術(shù)語“生物活性肽”和“生物活性片段”指依據(jù)上述運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化因子 (MNDF)和/或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)的肽或多肽，其中MNDF可使干細(xì)胞分化成運(yùn)動(dòng) 神經(jīng)元，而其中MNTF顯示出神經(jīng)保護(hù)、修復(fù)和治療功能。本文所用例示MNTF肽及其類似物包括本文已證明的足以使干細(xì)胞分化成運(yùn)動(dòng)神
11經(jīng)元的那些。本文所用“預(yù)防”指整體或部分預(yù)防、或改善或控制。本文所用術(shù)語“治療”指治療性治療和預(yù)防性(prophylactic)或預(yù)防性 (preventative)措施。需要治療者包括已患所述疾病者和易于患所述疾病者，或者診斷患 所述疾病者或要預(yù)防所述疾病者。本文所用參照本文所述的化合物或組合物的“有效量”指對(duì)于誘導(dǎo)所需的生物學(xué)、 藥學(xué)或治療結(jié)果有效的量。所述結(jié)果可為病征、癥狀的緩解、或疾病、疾病或病況的原因、或 生物系統(tǒng)所需的其他任何改變。術(shù)語“百分比(％ )同一性”指在兩個(gè)或多個(gè)序列的比較中發(fā)現(xiàn)的序列相似性的百 分比。例如，可使用任何合適的軟件電子化確定百分比同一性。同樣，通過將一個(gè)序列的序 列與第二個(gè)序列相比較來確定兩個(gè)序列(或兩個(gè)序列中各個(gè)或兩個(gè)的一個(gè)或多個(gè)部分)間 的相似性。本文所用術(shù)語“同源性和同源物”包括包含同源于目的蛋白序列的氨基酸序列的 肽。所述肽與相關(guān)序列(例如超過所述同源序列的至少約15、20、30、40、50、100個(gè)以上的連 續(xù)氨基酸/多肽的區(qū)域)通常具有至少約70%的同源性，并可為至少約80%、90%、95%、 97%或99%同源性。取決于所述肽和參照序列的長度，相對(duì)于參照序列(例如SEQID NO 1)其還可包含多達(dá)約25%、30%、40%或50%的保守氨基酸變化。治療的一般方面提供了治療患有神經(jīng)元疾病的患者的方法，其包含給患者施用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因 子(MNTF)肽或其類似物。本文所用神經(jīng)元疾病可包括通過功能神經(jīng)組織的急性、進(jìn)行性或逐漸喪失整體或 部分表征或相關(guān)聯(lián)的疾病、疾病或病況?！吧窠?jīng)退行性疾病”指通過功能神經(jīng)組織的進(jìn)行性、逐漸喪失表征的與中樞或外周 神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病。碰在美國專利No. 6，309，877,6, 759，389和6，841，531 (及共同在審美國專利申請(qǐng)系 列 No. 10/858，144,10/858, 286,10/858, 543 和 10/858，545)中描述了來自大鼠肌肉組織的 兩種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF1和MNTF2)的分離和鑒定及源自人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤cDNA 文庫的重組MNTFl F6基因的隨后克隆，將這些文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。如在國際申 請(qǐng)No. PCT/US2004/038651中所述，發(fā)現(xiàn)定位于人染色體22q 22內(nèi)的MNTFl F6基因序列 編碼33個(gè)氨基酸的MNTFl多肽，將所述文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。MNTFl F6分子內(nèi)對(duì)MNTFl的已知生物活性似乎足夠的兩個(gè)重疊結(jié)構(gòu)域被確認(rèn)。 (見國際申請(qǐng)No. PCT/US04/01468或美國專利申請(qǐng)系列No. 10/541，343 (被授權(quán)為美國專利 No7, 183，373)，將這些文獻(xiàn)通過引用整體并入本文)。被命名為“WMLSAFS”和“FSRYAR”結(jié) 構(gòu)域的所述結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)足以用類似于MNTFl F6 33聚體的方式刺激源自細(xì)胞系的運(yùn) 動(dòng)神經(jīng)元的增殖。同樣地，所述“FSRYAR”結(jié)構(gòu)域足以用類似于MNTFl F6 33聚體的方式 由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元體內(nèi)指導(dǎo)肌肉目標(biāo)的選擇性再神經(jīng)切除。另外，當(dāng)使用所述“FSRYAR”結(jié)構(gòu)域 來引發(fā)免疫應(yīng)答時(shí)，其提供了足以產(chǎn)生識(shí)別包含“FSRYAR”序列的MNTF肽(包括MNTFl F6 33聚體)的抗體的抗原表位。
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此外，可如本文所述的使用包含SEQ ID NO :1的至少兩個(gè)連續(xù)殘基的所述MNTF 肽，只要所述肽至少包含在SEQ ID NO 1的位置17和位置18處分別存在的苯丙氨酸和絲
氨酸殘基。在人胎兒孕育期中的第9周期間運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)在表達(dá)上達(dá)到峰值 (Di，X. et al.，Acta Anatomica Sinica 29 :86_89，1998)?；谠诎l(fā)育的人體中 MNTF 的 表達(dá)，我們推斷MNTF可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分化和/或存活。使用方法MNTFl和/或其肽類似物促進(jìn)哺乳動(dòng)物運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體外的存活。因此，本文所述 技術(shù)提供了作為神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的生長因子/補(bǔ)充物的MNTF肽或其類似物的使用、包括 用于促進(jìn)干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞系的存活的方法、通過用有效量的MNTF肽或其類似物 體外培養(yǎng)干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞。如美國專利申請(qǐng)No. 12/093,452、PCT/US06/043874所述，其他的MNTF肽已在干 細(xì)胞的分化中顯示出功效。本文所提供的MNTF肽具有相似的生物活性，并因此調(diào)節(jié)多能胚 胎干細(xì)胞至運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分化，且增強(qiáng)ES細(xì)胞衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活。ES細(xì)胞與RA和 MNTF類似物的接觸可指導(dǎo)所述細(xì)胞產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。MNTF和截短的MNTF分子包括但不限于包含MLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域的分子、被稱作運(yùn) 動(dòng)神經(jīng)元分化因子(MDNF)的分子、在美國專利申請(qǐng)No. 12/093，452、PCT/US06/043874中被 證明可誘導(dǎo)干細(xì)胞或部分分化的神經(jīng)元細(xì)胞分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分子。所述制劑提供了從 干細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生和/或分離一群運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的新型方法。所述方法包括胚胎干細(xì)胞與視黃酸(RA)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化因子(MNDF)的接觸。 在本文所述的一實(shí)施方式中，用RA同時(shí)用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化因子接觸胚胎干細(xì)胞。另外，所 述方法包括部分分化的神經(jīng)元細(xì)胞與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化因子的接觸。以對(duì)產(chǎn)生分化的神經(jīng)細(xì) 胞有效的量提供所述因子?；诒疚乃_的方案和方法，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易確定 所述量。例如可通過FACS分選分離或富集分化的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。例如基于GFP的運(yùn)動(dòng)神經(jīng) 元標(biāo)記方法的使用允許純的ES細(xì)胞衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元群的表征。我們已使用了從自胚狀 體的細(xì)胞的混合群中分離純的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞群的所述規(guī)程。使用膠原酶和分散酶將胚狀 體分解成單個(gè)細(xì)胞。然后用GFP來FACS分選所述單個(gè)細(xì)胞，因?yàn)樵谌褐斜磉_(dá)由HB9啟動(dòng)子 控制的GFP的細(xì)胞為真的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。因此，本技術(shù)另一方面涉及如下分離和/或純化一群分化的神經(jīng)細(xì)胞的方法(a) 獲得或產(chǎn)生在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子控制下表達(dá)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(eGFP)的胚胎干 細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)將胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)物與對(duì)于產(chǎn)生表達(dá)eGFP的分化的神經(jīng)細(xì)胞有效的量 的RA和MNTF相接觸；(d)在分化的神經(jīng)細(xì)胞中檢測(cè)eGFP的表達(dá)；和(f)分離表達(dá)eGFP的 分化的神經(jīng)細(xì)胞。MNTF肽及其類似物如熟知本領(lǐng)域和本公開內(nèi)容的技術(shù)人員所了解，包含MNTF活性結(jié)構(gòu)域及其肽類 似物的序列可將神經(jīng)保護(hù)、修復(fù)和治療功能體內(nèi)和體外給予運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?？珊铣苫蛑亟M產(chǎn) 生、或從自然細(xì)胞中分離本文所述的MNTF因子。本文經(jīng)由常用的三字母命名的使用或通過其單字母命名來命名包含本公開內(nèi)容
13的MNTF肽或其類似物的蛋白或肽中的氨基酸殘基的序列。在教課書(如Biochemistry， Second Edition, Lehninger, Α. ，Worth Publishers, New York, N. Y. (1975)) RMfff 述三字母和單字母命名的一覽表。當(dāng)氨基酸序列被水平列出時(shí)，希望氨基末端在左邊而希 望羧基末端在右端。技術(shù)人員應(yīng)了解，取決于大量因素，包含各種MNTF肽或其類似物的肽的準(zhǔn)確化學(xué) 結(jié)構(gòu)會(huì)有所不同。例如，因?yàn)樵诜肿又邪l(fā)現(xiàn)了可電離的羧基和氨基，可以酸性鹽或堿性鹽、 或以中性形式獲得給定的多肽。由于本發(fā)明的目的，從而希望包含SEQ ID NO :2 22中列 出的序列/結(jié)構(gòu)域的保留MNTF肽生物活性的肽的任何形式在本文所述技術(shù)的范圍內(nèi)。在 某些實(shí)施方式中，所述公開內(nèi)容包括基本上由SEQ ID NO :2 22中列出的序列/結(jié)構(gòu)域構(gòu) 成的保留MNTF肽的生物活性的肽組合物。本公開內(nèi)容包括保留MNTF的能力的MNTF肽類似物的使用，所述MNTF的能力是施 行神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、維持和/或修復(fù)，或在某些情況下使干細(xì)胞分化成運(yùn) 動(dòng)神經(jīng)元的能力?？墒褂每蓮拿绹锛夹g(shù)信息中心(www. ncbi. nlm. nih. gov)公共可得的BLAST 程序進(jìn)行序列的全面比對(duì)，以將多肽序列與相應(yīng)的SEQID NO :1片段相比較。在進(jìn)行全面比 對(duì)之前，可將SEQ ID N0:1提交至GenBank?？蓪⒚绹锛夹g(shù)信息中心提供的默認(rèn)參數(shù) 用于全面比對(duì)。應(yīng)了解本文所述技術(shù)包括肽類似物的使用，其中用其他的氨基酸取代一個(gè)或多個(gè) 氨基酸。在一些實(shí)施方式中，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子肽類似物包含對(duì)SEQ ID NO :1的至少2 個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的片段的一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中，所述2個(gè)連 續(xù)氨基酸殘基為F-S?；谀Ｐ?實(shí)驗(yàn)確定的)肽結(jié)構(gòu)，技術(shù)人員可使用已知的合理藥物設(shè)計(jì)方法進(jìn)行 MNTF及其他類似的結(jié)構(gòu)域模擬物或結(jié)合分子的合理設(shè)計(jì)。合理藥物設(shè)計(jì)的目標(biāo)為制備生 物活性肽或靶化合物的結(jié)構(gòu)類似物。通過創(chuàng)造所述類似物，改造藥物成為可能，其比天然分 子更有活性或更穩(wěn)定，其對(duì)改變有不同的易感性，或其影響各種其他分子的功能。在一方法 中，可產(chǎn)生靶分子或其片段的三維結(jié)構(gòu)。這可通過X射線晶體學(xué)、計(jì)算機(jī)模擬或通過兩種方 法的組合完成?？稍谟?jì)算機(jī)化的合理藥物設(shè)計(jì)(即分子模擬和分子_分子互作模擬)方法中使用 本文所公開的三維MNTF分子和相關(guān)結(jié)構(gòu)，以確認(rèn)與MNTF的活性部分結(jié)合的候選化合物。在 本領(lǐng)域中已知能模擬候選化合物與例如本文所述的原子坐標(biāo)間互作的各種計(jì)算機(jī)化藥物 設(shè)計(jì)程序，且所述程序的操作在合理藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的理解內(nèi)。制備方法應(yīng)了解可通過本領(lǐng)域熟知的方法(包括但不限于通過固相合成的化學(xué)合成和通 過HPLC從化學(xué)反應(yīng)的其他產(chǎn)物的純化、或通過在體外翻譯系統(tǒng)或在活細(xì)胞中表達(dá)編碼包 含本文所述的MNTF肽或其類似物的肽或多肽的核酸序列(例如DNA序列)的制備)制備包 含本公開內(nèi)容所述MNTF肽或其類似物的組合物?？煞蛛x和大規(guī)模透析組合物的MNTF肽或 其類似物以去除一種或多種不需要的小分子量分子和/或被凍干以使更易配入所需媒質(zhì)。 還應(yīng)了解在制備入MNTF肽成分中的額外氨基酸、突變、化學(xué)修飾等(無論何者)應(yīng)基本上 不干擾MNTF對(duì)接序列的受體識(shí)別。
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對(duì)應(yīng)于MNTF的一種或多種片段的肽或多肽在長度上通常應(yīng)為至少兩個(gè)氨基酸殘 基，且可包含2、3、4或5個(gè)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，所述MNTF肽類似物包含6個(gè) 氨基酸殘基及功能衍生物，例如棕櫚?；铩？赏ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法(如 使用自動(dòng)化肽合成機(jī)器(如從Applied Biosystems (Foster City, CA)可得的機(jī)器)的肽 合成)合成肽序列。本文所述技術(shù)包括源自SEQ ID NO :1 22的環(huán)肽的合成和使用。通過靶氨基酸與能與選定的側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生化試劑間的反應(yīng)將 共價(jià)修飾引入肽中。使用有機(jī)衍生化試劑共價(jià)修飾多肽為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，用 α-鹵代乙酸(和相應(yīng)的胺)(如氯乙酸或氯乙酰胺)與半胱氨酰殘基反應(yīng)以給出羧甲基或 甲酰胺基甲基衍生物。可通過與ρΗ 5. 5 7. O的焦碳酸二乙酯或與ρΗ 6的對(duì)溴苯酰甲基 溴在IM 二甲胂酸鈉溶液中反應(yīng)而將組氨酰殘基衍生化。賴氨酰和氨末端殘基可與琥珀酸 或其他羧酸酐反應(yīng)?？赏ㄟ^與苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、茚三酮之中的一種 或多種常規(guī)試劑的反應(yīng)修飾精氨酰殘基。通過與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)將譜 標(biāo)記引入至酪氨酰殘基；最常見的是，使用N-乙酰咪唑和四硝基甲烷來分別形成O-乙酰酪 氨酰類和3-硝基衍生物?？赏ㄟ^與碳二亞胺類(R’ -N-C-N-R')(如1-環(huán)己基-3-(2-嗎 啉-(4-乙基)碳二亞胺或1-乙基_3 (4氮鐺4，4-二甲基戊基)碳二亞胺)反應(yīng)來選擇性 地修飾羧基側(cè)基(天冬氨?；蚬劝滨?。此外，通過與銨離子反應(yīng)使天冬氨酰和谷氨酰殘基 轉(zhuǎn)換成天冬酰胺?；蚬劝滨０孵埢?。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基可被去酰胺至相應(yīng)的 谷氨酰和天冬氨酰殘基。其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基的 羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化(T.E.Creight0n，1983， Proteins !Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman& Co. , San Francisco, PP. 79-86)，N-末端胺的乙酰化和在一些情況下、C-末端羧基的酰胺化?？稍跍y(cè)定和用于測(cè)定的試劑盒中以游離的形式或連接至載質(zhì)分子(如蛋白或固 體顆粒)的形式及連接至標(biāo)記物或示蹤物(例如生物素或熒光素異硫氰酸酯)的修飾的肽 使用本文所述的MNTF肽或其類似物。可用本領(lǐng)域熟知的雙功能試劑(包括1，1雙(重氮乙?；?2乙苯、戊二醛、N-羥基 琥珀酰亞胺酯(例如4-疊氮基水楊酸酯、同型雙功能酰亞胺酯(包括雙琥珀酰亞胺酯(如 3，3’ - 二硫代雙(琥珀酰亞胺丙酸))和雙功能馬來酰亞胺(如雙-N-馬來酰亞胺基-1， 8_辛烷))))進(jìn)行MNTF肽或其類似物與水不溶性支持基質(zhì)間的交聯(lián)。甲基_3-[(對(duì)疊氮 基苯基)二硫代]丙亞胺酸酯之類的雙功能試劑產(chǎn)生在光存在下能形成交聯(lián)的光活性中間 體。另外，可將反應(yīng)性水不溶性基質(zhì)(如溴化氰活化的碳水化合物)用于蛋白固定。可使用本文所述的雙功能試劑進(jìn)行MNTF肽或其類似物與包括第二 MNTF肽或其類 似物的第二蛋白間的交聯(lián)。在一些實(shí)施方式中，有插入的間隔基，例如二巰基或二氨基或多 個(gè)氨基酸殘基(例如，甘氨酸)。所述間隔基也可為同型或異型雙功能交聯(lián)劑，例如異型雙 功能交聯(lián)劑N-(4-羧基-環(huán)己基-甲基)_馬來酰亞胺。可通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)制備長肽或多肽(如融合蛋白)。例如，用已包含異源 蛋白的商用表達(dá)載體克隆編碼MNTFl肽片段的DNA片段，其結(jié)果為MNTFl肽片段框內(nèi)融合 進(jìn)異源蛋白。在某些實(shí)施方式中，可使用編碼MNTFl肽的核酸和/或本文所述成分例如來體外 或體內(nèi)產(chǎn)生用于本文所述各種組合物和方法的肽。例如，在某些實(shí)施方式中，編碼MNTFl肽
15的核酸為例如重組細(xì)胞中的載體成分?？杀磉_(dá)所述核酸以產(chǎn)生包含MNTFl肽序列的肽或多 肽。所述肽或多肽可從細(xì)胞中分泌、或作為細(xì)胞的一部分或在細(xì)胞內(nèi)?；衔锖Y選基于其在本領(lǐng)域可接受的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)疾病(disease)和病癥(disorder)模型 系統(tǒng)中治療神經(jīng)元疾病的能力，由本文所述的篩選方案確認(rèn)的化合物可進(jìn)一步被區(qū)分且所 述化合物的功效可被評(píng)估。在測(cè)試化合物和天然提取物庫的許多藥物篩選測(cè)定中，需要高 通量的測(cè)定以使在給定的時(shí)間段內(nèi)調(diào)查的化合物的量最大化。通常使用在無細(xì)胞系統(tǒng)(如 可用純化或部分純化的蛋白得到的系統(tǒng))中進(jìn)行的測(cè)定作為“主要”篩選，其中所述篩選可 產(chǎn)生以允許由測(cè)試化合物介導(dǎo)的分子靶中改變的快速發(fā)展和相對(duì)容易檢測(cè)。此外，在體外 系統(tǒng)中一般忽略測(cè)試化合物細(xì)胞毒性和/或生物利用度的影響，而主要著重于藥物對(duì)分子 靶的作用，如可表現(xiàn)在與受體蛋白的結(jié)合親和力的改變。因此另一方面，提供了鑒定用于促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長或存活的化合物的方法。在 一實(shí)施方式中，所述方法包括下列步驟i)制備包含候選化合物的樣品，ii)將細(xì)胞與所述 樣品接觸，iii)確定涉及在信號(hào)傳導(dǎo)通路中化合物的表達(dá)或活性是否被調(diào)節(jié)，及iv)確定 所述樣品是否能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長或存活的步驟。在其他實(shí)施方式中，所述方法還包 括確定包含候選化合物的樣品是否被MNTF肽或其類似物所調(diào)控，或調(diào)控MNTF肽或其類似 物(例如活性、表達(dá)等)。另一方面，本文所述技術(shù)包括促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長或存活的方法 或通過施用由本文所述篩選方案鑒定的化合物進(jìn)行神經(jīng)元疾病治療的方法。在一例示篩選測(cè)定中，在其中所述化合物一般能結(jié)合MNTF肽的條件下使目的化 合物與包含MNTF結(jié)合蛋白(例如表達(dá)MNTF肽受體的細(xì)胞)和MNTF肽的混合物接觸。然后 添加包含測(cè)試化合物的組合物至所述混合物中。受體/MNTF肽復(fù)合物的檢測(cè)和定量為確定 測(cè)試化合物在抑制(或強(qiáng)化)受體蛋白和MNTF肽間復(fù)合物形成上的功效提供了方法?？?進(jìn)行對(duì)照測(cè)定以為比較提供基線，其中添加分離和純化的MNTF肽至受體蛋白中，且在無測(cè) 試化合物下定量受體/MNTF肽復(fù)合物的形成?？赏ㄟ^各種技術(shù)檢測(cè)MNTF肽和MNTF肽間的復(fù)合物形成。例如，可使用例如以可 檢測(cè)的方式標(biāo)記的蛋白(如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記的MNTF肽)通過免疫測(cè)定或通 過色譜檢測(cè)定量復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)。對(duì)于無細(xì)胞測(cè)定，通常需要固定MNTF肽或MNTF肽結(jié) 合蛋白以便于從蛋白之一的非復(fù)合物形式中分離受體/MNTF肽復(fù)合物，及便于適應(yīng)測(cè)定的 自動(dòng)化。例如，可提供融合蛋白，其添加了允許將蛋白結(jié)合至基質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。例如可將谷胱 甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/受體(GST/受體)融合蛋白吸收到谷胱甘肽瓊脂糖珠(Sigma Chemical, St. Louis, Mo.)或谷胱甘肽衍生化微滴度板上，然后將其與MNTF肽(例如35S標(biāo)記的MNTF 肽)和測(cè)試化合物相結(jié)合，并在有助于復(fù)合物形成的條件(例如在鹽和PH的生理?xiàng)l件下， 盡管需要稍微更嚴(yán)格的條件)下溫育。溫育后，洗滌所述珠以去除任何未結(jié)合的MNTF肽， 并直接(例如，在閃爍器中放置的珠)或在復(fù)合物解離之后的懸液中確定基質(zhì)珠_結(jié)合的 放射性標(biāo)記?；蛘邚乃鲋樯辖怆x所述復(fù)合物，通過SDS-PAGE膠分離，并使用標(biāo)準(zhǔn)的電泳 技術(shù)從膠上定量珠級(jí)分中發(fā)現(xiàn)的MNTF肽的水平。用于在基質(zhì)上固定蛋白的其他技術(shù)適于在受試者測(cè)定中使用。例如，可利用生物 素和鏈酶親和素的綴合固定MNTF肽蛋白的可溶部分。例如，可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(例 如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals, Rockford，111.)由生物素-NHS (N-羥基-琥珀酰
16亞胺)制備生物素化的受體分子，并在用鏈酶親和素包被的96孔板(Pierce Chemical)的 孔中將其固定?；蛘吲cMNTF肽反應(yīng)但不干擾配體結(jié)合的抗體可被衍生至板的孔中，且通 過抗體綴合在孔中捕獲所述受體。如上所述，MNTF肽制劑和測(cè)試化合物在存在受體的板孔 中溫育，且可定量孔中捕獲的受體/hedgehog復(fù)合物的量。除了上文所述的GST固定復(fù)合 物的方法之外，檢測(cè)所述復(fù)合物的例示方法包括使用與MNTF肽反應(yīng)或與受體蛋白反應(yīng)且 與MNTF肽競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的抗體的復(fù)合物免疫檢測(cè)；及依賴于檢測(cè)與MNTF肽相關(guān)的酶活性的 酶聯(lián)測(cè)定。在后一種情況下，可化學(xué)綴合或以與MNTF肽的融合蛋白提供所述酶。有這樣 一個(gè)例子，所述MNTF肽可被化學(xué)交聯(lián)或與堿性磷酸酶基因融合，并可用酶的顯色底物(例 如對(duì)硝基苯堿性磷酸酯)評(píng)估復(fù)合物中捕獲的MNTF肽的量。同樣地，可提供包含MNTF肽 和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白，且通過使用1-氯_2，4- 二硝基苯檢測(cè)GST活性來定量 復(fù)合物的形成(Habig et al. , J Biol Chem，249 :7130 (1974))。對(duì)于用于定量在復(fù)合物 中捕獲的蛋白之一的免疫檢測(cè)，可使用抗所述蛋白的抗體(如抗MNTF肽抗體)?；蛘?，在 復(fù)合物中要被檢測(cè)的蛋白可為以融合蛋白形式“附加表位標(biāo)簽的”，其除了所述MNTF肽或 MNTF肽序列之外，包括針對(duì)易得(例如，來自商業(yè)來源)抗體的第二多肽。例如，也可使用 抗GST部分的抗體將上文所述GST融合蛋白用于結(jié)合的定量。其他有用的表位標(biāo)簽包括 包括從c-myc的10個(gè)殘基序列的myc表位(例如見Ellison et al.，J Biol Chem 266 21150-21157(1991))及 pFLAG 系統(tǒng)(International Biotechnologies, Inc.)或 pEZZ 蛋 白 A 系統(tǒng)(Pharamacia, N. J.)。組合物藥物組合物包括與藥學(xué)可接受稀釋劑和/或載質(zhì)一起的本文所公開的一種或多 種MNTF肽或其類似物。合適的載質(zhì)/稀釋劑為本領(lǐng)域所熟知，且包括鹽水或其他無菌水介 質(zhì)，其任選包括更多的成分，如鹽緩沖液和防腐劑、或糖、淀粉、鹽或其混合物?？梢赃m于施用方案和/或患者需要的任何合適形式提供包含MNTF肽的組合物來 使用。本文所述技術(shù)包括對(duì)建立和繁殖干細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞、分化的神經(jīng)細(xì)胞和干細(xì) 胞衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有用的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基特別適于干細(xì)胞的分化和干細(xì)胞衍生的運(yùn) 動(dòng)神經(jīng)元的長期培養(yǎng)。需要用成形素和/或生長因子補(bǔ)充所述細(xì)胞培養(yǎng)基，并依據(jù)希望培養(yǎng)的個(gè)體細(xì)胞 類型對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。所述補(bǔ)充和優(yōu)化在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解內(nèi)。在一些實(shí)施方式中， 可用在下列近似水平(或在一有效數(shù)字內(nèi))的任何或全部下列成形素和/或生長因子補(bǔ)充 所述細(xì)胞培養(yǎng)基0. 001 1 μ M的RA，0. 001 1 μ M的Shh或Shh拮抗劑和/或0. 01 250 μ g/ml的一種或多種MNTF肽或其類似物。本文所述的藥物制劑包括作為可選成分的藥學(xué)可接受載質(zhì)、稀釋劑、增溶劑或乳 化劑及在本領(lǐng)域可用的鹽類型。所述物質(zhì)的例子包括正常的鹽溶液(如生理緩沖的鹽溶液 和水)。在藥物制劑中有用的載質(zhì)和/或稀釋劑的具體非限制性例子包括水和生理可接受 的緩沖鹽溶液(如PH 7.0 8.0的磷酸鹽緩沖溶液)。適合的藥用載質(zhì)包括，但不限于無 菌水、鹽溶液(如Ringer’ s溶液)、醇、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(如乳糖、直鏈淀粉或 淀粉)、硬脂酸鎂、滑石粉、硅酸、粘性石蠟，脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。所 述藥用制劑可為無菌和需要的，且其可與不與活性化合物發(fā)生有害反應(yīng)的助劑(例如潤滑
17齊U、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑，著色劑和/或芳香物質(zhì)等) 混合。如需要，其也可與其他活性物質(zhì)(例如酶抑制劑)結(jié)合以降低代謝降解?？稍谒幬锝M合物中配制本文所提供的化合物，其除了所述肽之外，可包括藥學(xué)可 接受載質(zhì)、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、中性或陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)復(fù)合物、 脂質(zhì)體、滲透增強(qiáng)劑、載質(zhì)化合物及其他藥學(xué)可接受的載質(zhì)或賦形劑等。一般以為了治療目的的施用制備藥物組合物。藥物組合物也包括一種或多種有效 成分(如干擾素、抗菌藥物、消炎劑、麻醉劑等)。胃腸外遞送的制劑可包括還可包含緩沖 劑、脂質(zhì)體、稀釋劑及其他合適的添加劑的無菌水溶液。包含本文所提供的肽的藥物組合物 包括滲透增強(qiáng)劑以加強(qiáng)肽的消化道遞送。滲透增強(qiáng)劑可被分類為屬于五個(gè)大類別即脂肪 酸、膽汁鹽、螯合劑、表面活性劑和非表面活性劑之一 (Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems8,91-192 (1991) ；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7，1-33 (1990))?？砂▉碜运龃箢悇e的一個(gè)或多 個(gè)的一種或多種滲透增強(qiáng)劑。作為滲透增強(qiáng)劑的各種脂肪酸及它們的衍生物包括例如=CabryliC酸、戊酸、油 酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、蓖酸酯、 甘油單油酸酯(又名ι-單油?；?消旋-甘油酯)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油 1-癸酸酯、1-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮、?；舛緣A、酰基膽堿、單-和二 -甘油酯及它 們的生理可接受的鹽(即油酸鹽、月桂酸鹽、癸酸鹽、肉豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、亞 油酸鹽等)° (Lee et al. , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92(1991) ；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7，1(1990) ；El-Hariri et al.，J.Pharm. Pharmacol. 44，651-654(1992))。在某些實(shí)施方式中，例示MNTF肽類似物包括具有滲透增強(qiáng)劑(例如被共價(jià)連接至 所述肽上的一個(gè)或多個(gè)功能基的一種或多種脂肪酸)的MNTF肽的功能衍生物。在一些實(shí)施 方式中，所述MNTF肽類似物包括在SEQ ID NO :1 22中所示且還具有用滲透增強(qiáng)劑(例 如脂肪酸和/或從2 22個(gè)碳原子的烷羰基(Alk-C(O)-))的N-末端修飾的肽，和/或具 有保護(hù)基(其選自芐氧羰基、叔丁氧羰基、芴-甲氧羰基和烯丙氧基羰基)的MNTF肽的功 能衍生物，且Y為OH或NH2。在一些實(shí)施方式中，所述烷羰基包含10 20、12 18或2 22個(gè)碳。在某些實(shí)施方式中，在MNTF肽類似物上適合的N末端修飾為通過棕櫚?；?例如 棕櫚酸)。膽汁的生理作用包括脂質(zhì)和脂溶性維生素分散和吸收的促進(jìn)作用(Brimton， Chapter 38In :Goodman & Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.，Hardman et al. McGraw-Hill, New York, N. Y.，pages 934-935(1996))。各種天然膽 汁鹽及其合成衍生物可作為滲透增強(qiáng)劑。因此，術(shù)語“膽汁鹽”包括天然存在的任何膽汁成 分及任何其合成的衍生物?？墒褂冒环N或多種滲透增強(qiáng)劑的復(fù)合物制劑。例如可使用膽汁鹽與脂肪酸 組合來制備復(fù)合物制劑。螯合劑包括但不限于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊 酸鹽(如水楊酸鈉、5甲氧基水楊酸鹽和高香草酸鹽)、膠原的N-?；苌?、聚乙二醇單 十二醚_9及β - 二酮(烯胺)的N-氨?；苌?Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92(1991) ；Muranishi, Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 7,1-33(1990) ；Buur et al. , J. Control Rel. 14, 43-51 (1990))。螯合劑具有也充當(dāng)DNA酶抑制劑的添加優(yōu)勢(shì)。表面活性劑包括例如十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂醚和聚氧乙 烯-20-十六燒基醚(Lee et al. , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92 (1991))；及全氟化合物乳劑(如 FC-43) (Takahashi et al. , J. Pharm. Phamacol. 40,252-257(1988)) ο非表面活性劑包括例如不飽和的環(huán)尿素、烷基-和 1- “ lil^Sltl^^ (Lee et al. , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92(1991))；及非留體消炎劑(如雙氯芬酸鈉，吲哚美辛和保泰松) (Yamashita et al. , J.Pharm. Pharmacol. 39,621-626(1987))。通常的藥學(xué)可接受的載質(zhì)包括，但不限于結(jié)合劑(例如，預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙 烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)、填料(例如乳糖及其他糖類、微晶纖維素、果膠、明 膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)、潤滑油(例如，硬脂酸鎂、滑石粉、氧 化硅、膠體二氧化硅、硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、 醋酸鈉等)、解體劑(例如淀粉、淀粉羥乙酸鈉等)或潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉等)。本文所提供的組合物另外還包含在藥物組合物中以其領(lǐng)域中建立的使用程度按 慣例發(fā)現(xiàn)的其他輔助成分。因此，例如所述組合物可包含更多的兼容性藥學(xué)活性材料(如 止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎藥)，或可包含在本文所述的物理配制的各種劑量形式 的組合物中有用的更多材料，如染料、香料劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。 然而，當(dāng)添加所述材料時(shí)，其不應(yīng)過度干擾本文所提供組合物成分的生物活性。無論通過何種方法將化合物導(dǎo)入至患者內(nèi)，可使用膠體分散系統(tǒng)作為遞送媒質(zhì)以 增強(qiáng)肽的體內(nèi)穩(wěn)定性和/或使所述肽靶向特定的器官、組織或細(xì)胞類型。膠體分散系統(tǒng)包 括但不限于高分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(包括水包油乳劑、膠 束、混合膠束、脂質(zhì)體和脂質(zhì)未鑒定結(jié)構(gòu)的肽復(fù)合物)。膠體分散系統(tǒng)的例子為多種脂質(zhì) 體。脂質(zhì)體為微觀球體，其具有由雙層構(gòu)型中排列的脂質(zhì)構(gòu)成的一個(gè)或多個(gè)外層包圍的水 性核心(通常見 Chonn et al. , Current Op. Biotech. 6，698-708 (1995))。在某些實(shí)施方式中，可將MNTF肽及MNTF類似物并入生物分布導(dǎo)向部分(包括一 種或多種聚合物)或與其結(jié)合使用，以導(dǎo)向本文提供的MNTF肽或MNTF類似物或其他化合 物的生物分布鄰近所需目標(biāo)或允許它們的連續(xù)釋放?；钚詣┌ɡ鐚?duì)提高治療效果、對(duì) 優(yōu)化生物分布和生物利用度、對(duì)減少組織損傷、對(duì)促進(jìn)愈合或?qū)μ岣呋颊叩氖孢m度有用的 化合物；例示活性劑包括血管活性劑、麻醉劑，針對(duì)缺血的治療劑、生長因子和細(xì)胞因子。 或者，可在本文提供的組合物中使用微米顆粒或納米顆粒聚合物珠劑型。本文所提供化合 物可與活性劑結(jié)合使用，且可在具有大量連接至其上的配體或抗配體分子的顆粒劑型中被 包裹。本文單獨(dú)或與其他的活性劑組合提供的MNTF肽和MNTF類似物及其他化合物以所 述方式隨著時(shí)間被釋放來提供持續(xù)的治療效果。對(duì)于在本文所述的方法中有用的其他活性 劑(如生長因子、細(xì)胞因子等)，持續(xù)釋放的劑型也是有用的。由于擴(kuò)散和顆?；|(zhì)侵蝕，來 自顆粒劑型的活性劑釋放可發(fā)生。生物降解速度直接影響活性劑釋放動(dòng)力學(xué)。在某些實(shí)施方式中，本文所述MNTF肽、MNTF類似物和化合物的控制釋放的胃腸外 制劑可被制成植入物、油性注射或顆粒體系。顆粒體系包括微球、微顆粒、微囊、納米囊、納
19米球和納米顆粒。微囊包含作為中央核心的治療蛋白。在微球中所述治療物被分散在整個(gè) 顆粒中。可將脂質(zhì)體用于控制的釋放及捕獲的藥物的藥物靶向。在某些實(shí)施方式中，可局部(locally)、局部(topically)、經(jīng)鼻、口服、胃腸道、氣 管內(nèi)、膀胱內(nèi)、陰道內(nèi)、至子宮、皮下、肌肉、關(guān)節(jié)周圍、關(guān)節(jié)腔內(nèi)、至腦脊液(ICSF)、至腦組織 (如顱內(nèi)施用)、至脊髓、至傷口、腹膜內(nèi)或胸腔內(nèi)或全身(例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肝門內(nèi)或直 接至器官)施用本文所述的包含MNTF肽和MNTF類似物的藥物組合物。如本領(lǐng)域已知，可使用各種導(dǎo)管或遞送途徑來完成冠狀動(dòng)脈內(nèi)遞送。例如，適于 本文所述用途的各種通用導(dǎo)管及改良導(dǎo)管可從商業(yè)供銷商(如Advanced Cardiovascular Systems (ACS)、Target Therapeutics和Cordis)處獲得。此外，如本領(lǐng)域已知，在通過直 接注射進(jìn)冠狀動(dòng)脈完成心肌遞送的情況下，可使用大量方法來將導(dǎo)管導(dǎo)入到冠狀動(dòng)脈內(nèi)。 舉例而言，可將導(dǎo)管便利的導(dǎo)入股動(dòng)脈并將其逆行穿過髂動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈而進(jìn)入冠狀動(dòng)脈 內(nèi)。或者，最初將導(dǎo)管導(dǎo)入肱動(dòng)脈或頸動(dòng)脈內(nèi)并使其逆行穿過至冠狀動(dòng)脈。本領(lǐng)域可發(fā)現(xiàn) 所述及其他技術(shù)的詳細(xì)描述(見例如Topol，E J(ed.)，The Textbook of Interventional Cardiology,2nd Ed. (W. B. Saunders Co. 1994) ；Rutherford, RB, Vascular Surgery,3rd Ed. (W. B. Saunders Co.1989) ；Wyngaarden J Bet al. (eds.), The Cecil Textbook of Medicine, 19th Ed. (W. B. Saunders, 1992)；及 Sabiston，D, The Textbook of Surgery, 14th Ed. (W. B. Saunders Co. 1991))。可胃腸外施用本文所提供的化合物。某些化合物可與藥學(xué)可接受載質(zhì)或稀釋劑 結(jié)合以制備藥物組合物。合適的載質(zhì)和稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖液?？蔀?胃腸外、肌肉內(nèi)、腦內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或透皮施用制備所述組合物。施用的制劑可包含所述 試劑。所述試劑的例子包括陽離子劑(例如磷酸鈣和DEAE-葡聚糖)和脂轉(zhuǎn)染劑(例如 IipofectamTM 禾口 transfectamTM)。局部施用的制劑可包括貼劑、軟膏、洗劑、乳劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體
和粉末。常規(guī)的藥學(xué)載質(zhì)、水、粉末或含油堿、增稠劑等可為必要和希望的。涂層手套、避孕 套等也是有用的?？诜┯玫慕M合物包括粉末或顆粒、水或非水介質(zhì)的懸液或溶液、膠囊、 藥囊或藥片。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散劑或粘合劑是希望的。胃腸外施用的組 合物可包括可包含緩沖劑、稀釋劑或其他適合的添加劑的無菌水溶液。在一些情況下，將用 肽治療患者與其他傳統(tǒng)的治療方式相結(jié)合以提高治療方案的功效。本文所用術(shù)語“治療方 案”應(yīng)包含治療性、姑息性和預(yù)防性方式。劑量可取決于大量因素，其包括要治療的病情的嚴(yán)重性和反應(yīng)性，和持續(xù)數(shù)天至 數(shù)月的治療過程、或直到實(shí)現(xiàn)治療或達(dá)到病情的減弱?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方案在細(xì)胞培養(yǎng) 物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定本文所提供的化合物的毒性和療效。例如，可確定LD5tl(致死群體的 50%的劑量)和ED5tl(對(duì)群體中50%治療有效的劑量)。在毒性和療效間的劑量比為治療 指數(shù)，且其可用LD5tZED5tl表示。顯示出大治療指數(shù)的化合物是有用的。當(dāng)使用顯示毒性副 作用的化合物時(shí)，應(yīng)小心設(shè)計(jì)遞送系統(tǒng)，其可將所述化合物靶向至感染組織的位點(diǎn)以使其 對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損害最小化并由此減少副作用?？稍谥苽湟幌盗腥梭w中使用的劑量中使用從細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定和動(dòng)物研究中獲得 的數(shù)據(jù)。所述化合物的劑量在包括有很小或沒有毒性的ED5tl的一系列循環(huán)濃度內(nèi)。取決于 使用的劑型和使用的施用途徑，所述劑量在所述范圍內(nèi)變化。對(duì)于本文所用的任何化合物，
20最初可由細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定估計(jì)治療有效劑量?？稍趧?dòng)物模型中制定劑量以達(dá)到循環(huán)的血漿 濃度范圍，其包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中確定的IC5tl(即達(dá)到了癥狀的半-最大抑制的測(cè)試化合物 的濃度)?？墒褂盟鲂畔砀鼫?zhǔn)確的確定在人體中有用的劑量。例如可通過高效液相色 譜測(cè)量血漿中的水平?？蓮幕颊唧w內(nèi)藥物積累量的測(cè)量計(jì)算劑量方案。劑量可依個(gè)體化合 物(包括MNTF肽和MNTF類似物)的相對(duì)功效而變化，且通?；趧?dòng)物模型體內(nèi)和體外發(fā) 現(xiàn)的有效EC50s對(duì)其進(jìn)行估計(jì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解所述劑量將依MNTF肽或其類似物 如何和在哪里被施用(例如體外、體內(nèi)、局部、全身等)而變化。例如，一方面，可施用MNTF肽和MNTF類似物以在靶位點(diǎn)處(在ES干細(xì)胞的細(xì)胞 培養(yǎng)物中)達(dá)到約0. 01微克/毫升(μ g/mL) 約lmg/ml、約0. 1 μ g/mL 約50 μ g/mL、 約 0· 1 μ g/mL 約 150 μ g/mL、約 1 μ g/mL 約 200 μ g/mL 及約 0· 1 μ g/mL 約 500 μ g/ mL(包括所述范圍的任一范圍)的最終濃度。取決于施用的途徑，替代性的合適劑量可從例如約0. 1 μ g至約Ig的總劑量而變 化。在文獻(xiàn)中提供了遞送具體劑量和具體方法的指導(dǎo)且對(duì)于本領(lǐng)域從業(yè)者通?？傻谩１?領(lǐng)域技術(shù)人員將使用不同的核苷酸制劑，而非蛋白或其抑制劑。同樣地，本文所提供的多 核苷酸、多肽和化合物的遞送對(duì)具體的細(xì)胞、條件和位置是特異的。通常而言，劑量通常在 0. 01mg/kg 1000mg/kg體重的范圍中，且更通常在例如0. lmg/kg 300mg/kg體重的范圍 中，并可以每天、每周、每月或每年一次或多次，或甚至在2 20年的時(shí)間跨度期間一次或 多次遞送。在某些實(shí)施方式中，可在手術(shù)后24小時(shí)即刻給定劑量。在另一實(shí)施方式中，可 從2小時(shí)至達(dá)24小時(shí)間給定劑量。取決于顆粒制劑的半衰期和清除率，可每3 4天、每 周或每兩周施用長效組合物?；谠隗w液或組織中測(cè)量的藥物殘留時(shí)間和濃度，本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員可輕易估計(jì)給藥的重復(fù)頻率。成功治療后，需要使患者經(jīng)歷維持性治療以防止 病情的復(fù)發(fā)，其中以在0.01mg/kg 100mg/kg體重的范圍內(nèi)的維持劑量、每天一次或多次 至每20年一次施用所選定化合物。在某些疾病的治療或預(yù)防中，適當(dāng)?shù)膭┝克酵ǔ?yīng)為 約0. 001mg/kg 100mg/kg患者體重/天，其可以單劑量或多劑量施用。合適的劑量水平可 為約1 約40mg/kg/天。在某些實(shí)施方式中，以達(dá)到約Ιμπιο 約lmmol、約ΙΟμπιοΙ 約500 μ mol、或約30 μ mol 約300 μ mol和約25 μ mol 約300 μ mol損傷位點(diǎn)上最終濃 度的體內(nèi)濃度，且包括約25 μ mol、或約220 μ mol或約300 μ mol損傷位點(diǎn)上的最終濃度，且 仍更通常在約1 μ mol 約100 μ mol之間的量施用本文所提供的包括MNTF肽或其類似物 的化合物。在某些實(shí)施方式中，可施用1、5、10、20、50、100、150或200mg/kg的劑量。可在診斷、治療、預(yù)防中、及作為研究試劑和在試劑盒中使用本文所述化合物。可 常規(guī)完成用于檢測(cè)目的化合物(例如MNTF肽和MNTF類似物)的方法的規(guī)定。所述規(guī)定可 包括酶綴合、放射性標(biāo)記或任何其他合適的檢測(cè)系統(tǒng)。也可制備用于檢測(cè)目的化合物有無 的試劑盒。本文所用脊髓損傷可包括由腫瘤、機(jī)械性損傷和化學(xué)性損傷所致的損傷。在某些方面，提供了組合物和治療性治療方法，其包含當(dāng)神經(jīng)通路被損傷或預(yù)期 所述損傷時(shí)，以足以維持神經(jīng)通路(包括修復(fù)損傷的通路或抑制其上的更多損傷)的時(shí)間 和濃度給受試者施用本文所定義的治療有效量的MNTF肽或其類似物。另一方面，本文所述技術(shù)包括用于維持神經(jīng)通路的組合物和治療性治療方法。所
21述治療方法包括當(dāng)神經(jīng)通路被損傷或預(yù)期所述損傷時(shí)，給受試者施用可刺激內(nèi)源性MNTF 的治療有效濃度的化合物。本文所述的方面和實(shí)施方式提供了保護(hù)神經(jīng)元不受與神經(jīng)損傷的機(jī)體免疫和發(fā) 炎反應(yīng)有關(guān)的組織破壞性影響的方法。在某些實(shí)施方式中，提供了刺激損傷的神經(jīng)元和神經(jīng)通路的細(xì)胞修復(fù)(包括再生 損傷的樹突或軸突)的方法、組合物和裝置。一方面，本發(fā)明的MNTF肽或其類似物在修復(fù)損傷的外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)通路中是 有用的。尤其，MNTF對(duì)修復(fù)損傷的神經(jīng)通路(包括切斷或損傷神經(jīng)纖維)有用。具體而言， 本文所述MNTF能刺激完整軸突的神經(jīng)再生(其包括髓鞘的血管化和再造化)。可用能在 位點(diǎn)處維持MNTF的生物兼容性、生物吸收性載質(zhì)給損傷位點(diǎn)提供所述MNTF，且如果需要的 話，可提供指導(dǎo)軸突從切斷神經(jīng)元的近端向遠(yuǎn)端生長的方法。例如，當(dāng)要誘導(dǎo)的神經(jīng)再生超 過延伸距離，例如大于IOmm時(shí)，需要指導(dǎo)軸突生長的方法。設(shè)想了能提供所述功能的許多 載質(zhì)。例如，有用的載質(zhì)包括本文所公開的基本不溶性材料和粘性溶液，其包含層粘連蛋 白、透明質(zhì)酸或膠原、或其他合適的合成、生物兼容性聚合物材料(如聚乳酸、聚羥基乙酸 或聚丁酸和/或它們的共聚物)。在某些實(shí)施方式中，在跨越損傷通路的神經(jīng)向?qū)ǖ乐邪仓肕NTF肽或其類似物。 所述通道可起到保護(hù)覆蓋和用于指導(dǎo)突起生長的物理方法的作用。有用的通道包含生物兼 容性膜，其在結(jié)構(gòu)上為管狀的、具有足以橫跨待修復(fù)神經(jīng)中缺口的直徑，且具有適于接受切 斷的神經(jīng)末端的開口。所述膜可由任何生物兼容性、無刺激性材料(如硅酮或生物兼容性 聚合物(如聚乙烯或聚乙烯醋酸乙烯酯))制成。所述外殼也由生物相容性、生物吸收性聚 合物(包括例如膠原、透明質(zhì)酸、聚乳酸、聚丁酸和聚羥基乙酸)組成。在一實(shí)施方式中，所 述通道的外部表面基本上不通透。另一方面，本文所述的MNTF肽及其類似物可被用于保護(hù)不受與響應(yīng)針對(duì)初始神 經(jīng)組織的損傷的機(jī)體免疫/發(fā)炎應(yīng)答有關(guān)的損傷。所述應(yīng)答可后隨例如由自身免疫功能障 礙、腫瘤病變、感染、化學(xué)或機(jī)械損傷、疾病，由流向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的血液的阻斷， 或由其他的神經(jīng)創(chuàng)傷或周圍材料引起的神經(jīng)組織創(chuàng)傷。例如，認(rèn)為在栓塞中風(fēng)中由神經(jīng)血 液供應(yīng)的阻斷之后的缺氧或缺血再灌注所致的原發(fā)性損傷是免疫相關(guān)的。另外，與大量原 發(fā)性腦腫瘤相關(guān)的至少部分損傷似乎也是免疫相關(guān)的。MNTF肽或其類似物的應(yīng)用直接或系 統(tǒng)的緩解和/或抑制針對(duì)神經(jīng)損傷的免疫相關(guān)應(yīng)答。在一實(shí)施方式中，本文所述技術(shù)包含本文所述的MNTF因子中的任何一種的生物 活性類(系統(tǒng)發(fā)育)變異體(其包括保守氨基酸序列變異體；由簡并核苷酸序列變異體編 碼的蛋白；享有保守的MNTF結(jié)構(gòu)域、且由在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格條件下雜交至編碼本文所公開、包 含的MNTF因子的DNA的DNA編碼的MNTF因子)的使用。本文所述化合物也可用于研究的目的。因此，由所述肽顯示的特異性雜交可被用 于測(cè)定、純化、細(xì)胞產(chǎn)品制備及在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的其他方法中使用。本文所用的技術(shù)性和科學(xué)性術(shù)語具有由本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員 普遍理解的含義，除非另有定義。本文參考本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法。闡述參考 的所述已知方法的出版物及其他材料通過引用而像全面闡述樣整體并入本文。闡述重組 DNA技術(shù)的普遍原理的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括Sambrook，J.，et al.，Molecular Cloning
22A Laboratory Manual，2d Ed. ， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Planview, N. Y. (1989)and Molecular Cloning :A Laboratory Manual，third edition(Sambrook and Russe1，2001)，jointly and individually referred to herein as "Sambrook"； McPherson，M. J.，Ed.，Directed Mutagenesis :A Practical Approach，IRL Press， Oxford (1991) ；Jones，J.，Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications，Oxford (1992) ；Austen，B. M. andWestwood, 0. M. R.，Protein Targeting and Secretion，IRL Press，Oxford(1991) ；Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed.， 1984) ；Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed.，1987) ；Handbook ofExperimental Immunology(D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller & Μ. P. Calos,eds.，1987) ；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al.，eds. ,1987, including supplementsthrough 2001) ；PCR :The Polymerase Chain Reaction，(Mullis et al.，eds.，1994) ；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al.，eds.，1991) ；The Immunoassay Handbook(D. Wild, ed.，Stockton Press NY，1994) ；Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed.， Academic Press，1996) ；Methods of Immunological Analysis(R. Masseyeff,W. H. Albert, and N. A. Staines, eds.，Weinheim :VCH Verlags gesellschaft mbH，1993)，Harlow and Lane(1988)Antibodies， A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Publications， New York， and Harlow and Lane(1999)UsingAntibodies :A Laboratory Manual Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor，NY(jointly and individually referred to herein as Harlow and Lane)，Beaucage et al.eds. ，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons,Inc.，New York，2000) ；and Agrawal,ed.， Protocols forOligonucleotides and Analogs,Synthesis and Properties Humana Press Inc. , New Jersey,1993) ；Teratocarcinomas and embryonic stem cells :A practical approach (E. J. Robertson, ed.，IRL Press Ltd. (1987) ；Guide to Techniques in Mouse Development (P. M. Wasserman et al. eds. , Academic Press (1993) ；Embryonic StemCell Differentiation in vitro (Μ. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225 900 (1993) ；Properties and uses of Embryonic Stem Cells Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P.D.Rathjen et al.，Reprod. Fertil. Dev.，10 :31 (1998)) ；CNS Regeneration :Basic Science and Clinical Advances,M. H. Tuszynski & J. H. Kordower, eds. ，Academic Press， (1999)0在各種專利和專利申請(qǐng)中描述了在本文所公開技術(shù)的應(yīng)用中有用的某些技 術(shù)，所述專利和專利申請(qǐng)包括報(bào)道了從腦組織獲得的多能神經(jīng)干細(xì)胞的美國專利 No. 5，851，832 ；報(bào)道了從新生兒大腦半球產(chǎn)生神經(jīng)母細(xì)胞的美國專利No. 5，766，948 ；報(bào)道 了哺乳動(dòng)物神經(jīng)嵴干細(xì)胞的使用的美國專利No. 5，654，183和5，849，553 ；報(bào)道了從哺乳動(dòng) 物多能CNS干細(xì)胞培養(yǎng)物體外產(chǎn)生分化的神經(jīng)元的美國專利No. 6，040，180 ；報(bào)道了神經(jīng) 上皮干細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞_星形膠質(zhì)細(xì)胞前體、種系限制性的神經(jīng)元前體的產(chǎn)生和分離 的TO 98/50526和W099/01159 ；及報(bào)道了從胚胎前腦獲得并用包含葡萄糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島 素、硒、孕酮及許多其他生長因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的美國專利No. 5，968，829?？稍趯?shí)行本文所述技術(shù)中利用技術(shù)人員已知的任何合適材料和/或方法；然而，
23本文描述了材料和/或方法的非限制性例子?？蓞⒖枷铝袑?shí)施例、通過舉例的方式而不通過限制的方式提供的某些方面中了解 本文所述技術(shù)?？蓮纳虡I(yè)來源獲得在下列例子中參考的材料、試劑等，除非另有強(qiáng)調(diào)。如本文所用，希望可通過在下列例子中所述的基本相似和/或相同的方案確定 MNTF肽和序列和/或其功能類似物的功效。此外，希望可依據(jù)本文所述的實(shí)驗(yàn)條件確定在 SEQ ID NO :1 22所述的任何MNTF肽及其類似物的效力。實(shí)施例1鼠,運(yùn)云_肖Tfjffl胞/本夕陥MNTF胞死t白爐々 的測(cè)試實(shí)施例1示在大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞體外存活模型中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF) 的6氨基酸類似物(GM6)和各種更短的肽類似物減弱細(xì)胞死亡的能力。以10μ g/ml進(jìn)行 的GM6(SEQ ID NO 2)及其他類似物(3聚體、4聚體、5聚體)的施用證明了為類似物特異 性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞死亡的減弱。所述類似物顯示了使用包含最有效的末端苯丙氨酸的類 似物的營養(yǎng)作用的獨(dú)特模式。所述數(shù)據(jù)表明在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞存活模型中GM6和一些類似 物為有效的營養(yǎng)因子。本實(shí)施例中的縮寫/術(shù)語“GM6”和“6聚體”指MNTF的例示6氨基酸肽類似物。"Genervon，，禾口 "GB，，指 Genervon Biopharmaceuticals, LLC?！癐. V.” 指靜脈內(nèi)。“NTS” 指 Neurological Testing Service，其為約定研究組織。GM6為合成的6氨基酸肽。以固體提供GM6，且通過NTS制備制劑(在4°C儲(chǔ)存的 溶液)。GM6類似物包括GM6肽的序列同源物。“PD”指帕金森氏癥?！癇DNF”指腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。“⑶NF”指膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。“CNTF”指睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子“Genervon，，指 Genervon Biopharmaceuticals, LLC“GB，，指 Genervon Biopharmaceuticals, LLC方法和材料運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的純化和培養(yǎng)。從E14. 5 Sprague-Dawley 大鼠(Charles River Labs) 中制備脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物。簡言之，在0. 025%胰酶(Gibco)中于37°C消化解剖的脊髓 8分鐘。將組織轉(zhuǎn)移至包含補(bǔ)充2%馬血清(Gibco)、胰島素(5 μ g/ml)；腐胺(1X10D4M), 伴清蛋白(100 μ g/ml)、亞硒酸鈉(3X10D8M)、孕酮(2 X 10 □ 8M)、葡萄糖(3. 6mg/ml)、青 霉素(100IU/ml)、鏈霉素(100 μ g/ml) ,DNA Sl (100 μ g/ml)和牛血清白蛋白(BSA ；0. 4% ) 的L-15培養(yǎng)基(Gibco)的溶液。然后用1-ml pipetman磨碎所述組織，并經(jīng)在L-15中 10. 4% Optiprep (Nycomed Pharma)的緩沖墊在15mlFalcon管中分層所述懸液。將分層 的懸液以830Xg離心15分鐘。在包含0. 5% BSA的PBS中懸浮分界面處的細(xì)胞，并使用 IgG-192 p75特異性抗體通過免疫親和進(jìn)行分離，隨后通過使用磁微珠(Miltenyi Biotec) 的細(xì)胞分選來純化所述運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。所述運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)基由補(bǔ)充B27補(bǔ)充物(Gibco)、
24谷氨酸(25μΜ)、2-巰基乙醇(25 μ Μ)和2%馬血清的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco)構(gòu)成。除 非另有說明，所述運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以3000細(xì)胞/蓋玻片的密度被放置到包被層粘連蛋白的蓋破 片上。在細(xì)胞接種的時(shí)間添加神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合物(NTF:lng/ml BDNFU00pg/ml⑶NF、 10ng/ml CNTF)。在培養(yǎng)24小時(shí)后，在缺乏NTF的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)基中通過不同的稀釋類 似物的添加來處理運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。存活測(cè)定。如上所沭從E14. 5大鼠胚胎中制備脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。在NTF存在下培 養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，且通過計(jì)算鈣黃綠素AM-陽性細(xì)胞數(shù)來評(píng)估活力(VI)。為進(jìn)行活力研究， 在不存在NTF，但添加類似物或GM6下培養(yǎng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。通過計(jì)算神經(jīng)元數(shù)來計(jì)算存活的運(yùn) 動(dòng)神經(jīng)元的百分比。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以在NTF單獨(dú)存在(對(duì)照)下存活的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)的百分比表示對(duì) 于各處理的存活的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)。每種條件使用五個(gè)皿。通過用post hoc Tukey' s測(cè)試 的單因素ANOVA分析了處理組間的差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 處理組。所有組經(jīng)警了 GM6、類似物或?qū)φ铡?br> 權(quán)利要求
MNTF肽或其類似物，其選自由SEQ ID NO1的2個(gè)和6個(gè)之間的連續(xù)氨基酸或其功能衍生物構(gòu)成的肽，其中所述MNTF肽或其類似物表現(xiàn)出MNTF活性，且所述MNTF肽或其類似物不具有由SEQ ID NO2構(gòu)成的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的MNTF肽或其類似物，其至少含SEQID NO=I的氨基酸殘基17和18。
3.權(quán)利要求1的MNTF肽或其類似物，其選自SEQID NO 3 SEQID NO :22。
4.權(quán)利要求1的MNTF肽或其類似物，其由SEQID NO 1的至少3個(gè)連續(xù)氨基酸構(gòu)成。
5.權(quán)利要求1的MNTF肽或其類似物，其由SEQID NO :1的2個(gè)和5個(gè)之間的連續(xù)氨 基酸構(gòu)成。
6.權(quán)利要求1的MNTF肽或其類似物，其由SEQID NO :1的3個(gè)和5個(gè)之間的連續(xù)氨基酸構(gòu)成。
7.權(quán)利要求3的MNTF肽或其類似物，其具有SEQID NO :4的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求3的MNTF肽或其類似物，其具有SEQID NO 6的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求3的MNTF肽或其類似物，其具有SEQID NO 12的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)的MNTF肽或其類似物，其中所述MNTF肽或其類似物通過 與滲透增強(qiáng)劑共價(jià)鍵合而被修飾，由此所述組合物的組織滲透能力被提高。
11.權(quán)利要求10的MNTF肽或其類似物，其中所述MNTF肽或其類似物通過其N-末端與 所述滲透增強(qiáng)劑共價(jià)鍵合而被修飾。
12.權(quán)利要求11的MNTF肽或其類似物，其中所述滲透增強(qiáng)劑通過一個(gè)或多個(gè)游離氨基 的N-?；苌c所述MNTF肽或其類似物共價(jià)連接。
13.權(quán)利要求10的MNTF肽或其類似物，其中所述滲透增強(qiáng)劑是任選被取代的2 22 碳的烷基羧酸，其中所述烷基羧酸任選被羥基化、不飽和化和/或硫化。
14.權(quán)利要求13的MNTF肽或其類似物，其中所述滲透增強(qiáng)劑是選自下列的脂肪酸 cabrylic酸、油酸、月桂酸、癸酸、辛酸、己酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、戊酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻 酸、花生四烯酸、油酸、反油酸、芥酸和神經(jīng)酸。
15.組合物，其含 權(quán)利要求1 14中任一項(xiàng)的MNTF肽或其類似物，和眷藥學(xué)可接受載質(zhì)。
16.促進(jìn)神經(jīng)元生長或維持的方法，所述方法包括給神經(jīng)元細(xì)胞施用權(quán)利要求16的 組合物，其中所述組合物具有一種或多種選自下列的生物活性促進(jìn)神經(jīng)元的生長，促進(jìn) 神經(jīng)元的維持，促進(jìn)神經(jīng)軸突突起，促進(jìn)經(jīng)軸突切斷的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的軸突再生，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功 能，修復(fù)損傷的神經(jīng)通路，再生神經(jīng)通路或緩解神經(jīng)元缺陷。
17.緩解患病癥動(dòng)物的神經(jīng)元病癥的方法，所述方法包括給所述動(dòng)物施用對(duì)緩解所 述病癥而言有效量的權(quán)利要求16的含MNTF肽或其類似物的組合物。全文摘要
本發(fā)明涉及新型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)及其類似物，其包括能促進(jìn)神經(jīng)元生長和存活的組合物。提供了長度為二至六個(gè)氨基酸之間的MNTF肽及通過共價(jià)連接至另一部分而被修飾的所述MNTF肽的類似物。本文描述了其他實(shí)施方式。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101951942SQ200980105892
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2009年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月21日
發(fā)明者M·S·金迪, P-Y·D·寇 申請(qǐng)人:健能萬生物制藥公司