專利名稱：γ-分泌酶抑制劑用于治療癌癥的應(yīng)用的制作方法
Y“分泌酶抑制劑用于治療癌癥的應(yīng)用盡管最近成功使用了為患者提供生存益處的藥物，癌癥仍然是世界上死亡率和發(fā) 病率的主要原因。對(duì)于大部分實(shí)體瘤，仍然存在與極差的預(yù)后相關(guān)的高腫瘤復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移 率。目前可用的藥物包括細(xì)胞毒性化學(xué)治療劑、抗血管生成劑、和靶向藥劑。由于發(fā)展了耐 藥性或可能影響大部分器官的不可耐受的毒性(例如，血液學(xué)毒性、肝臟毒性、腎臟毒性、 和神經(jīng)毒性)，使用大部分目前可用的抗癌藥獲得的臨床益處是有限的。癌癥是一種以不可控的增殖為特征的疾病。在對(duì)驅(qū)動(dòng)癌癥的信號(hào)的理解中取得了 進(jìn)步。在發(fā)育和組織重建過(guò)程中，多能干細(xì)胞作用為分化細(xì)胞的來(lái)源，以產(chǎn)生非專門增殖的 細(xì)胞類型。這些干細(xì)胞的特征和腫瘤的快速不可控的增殖之間的聯(lián)系逐漸變得清楚。一種 主要的發(fā)育信號(hào)傳導(dǎo)軸是Notch途徑。Notch信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)在成體多能干細(xì)胞的發(fā)育和自 我更新過(guò)程中介導(dǎo)祖細(xì)胞的分化而調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)。Notch起作用保持祖細(xì)胞處于多能快速 增殖狀態(tài)。Notch途徑在造血作用和淋巴細(xì)胞增殖的發(fā)育分化和進(jìn)行中起重要作用。在胚 胎發(fā)育過(guò)程中，其參與造血干細(xì)胞的生成、增殖和分化。Notch基因擴(kuò)增、染色體易位或突變導(dǎo)致升高的Notch信號(hào)傳導(dǎo)，由此通過(guò)將腫瘤 細(xì)胞保持在干細(xì)胞樣增殖狀態(tài)而給予腫瘤生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。因此，在Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的突 變和惡性病發(fā)病機(jī)理之間存在非常強(qiáng)的相關(guān)性。由哺乳動(dòng)物中的4種同系物(Notchl，Notch2，Notch3，和Notch4)所代表的Notch 蛋白與配體δ樣1，δ樣3，δ樣4，Jagged UPJagged 2相互作用。在配體結(jié)合后， Notch受體通過(guò)系列的蛋白水解分裂事件而被激活，所述蛋白水解分裂事件包括由Y _分 泌酶(Y -secretase)調(diào)控的膜內(nèi)分裂。這樣的Y -分泌酶加工的Notch變成有活性的，其 作為一種稱為細(xì)胞內(nèi)亞基(ICN)的形式。ICN易位至核，并且形成包括直接改變關(guān)鍵的增 殖_和分化_特異性基因的表達(dá)的CSL (CBF-1，禿頭的抑制子，Lag)轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的大轉(zhuǎn)錄復(fù) 合物的一部分。另外，Y _分泌酶參與幾種其他蛋白的膜內(nèi)蛋白水解加工，所述其他蛋白包括淀粉 樣前體蛋白[APP]，CD44干細(xì)胞標(biāo)記，和HER4 [ErbB4])。通過(guò)、-分泌酶抑制阻斷Notch信 號(hào)傳導(dǎo)在體內(nèi)在人類癌癥細(xì)胞中產(chǎn)生較緩慢的生長(zhǎng)、較少轉(zhuǎn)化的表型。重要的是，該表型在 不存在進(jìn)一步給藥的條件下保持是穩(wěn)定的。這種類型的新型治療途徑具有使癌癥成為更易 處理的疾病的潛力，而沒(méi)有傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物的強(qiáng)副作用。在WO 2005/023772 中公開(kāi) 2，2- 二 甲基-N_((S)_6-氧代-6，7- 二 氫-5H-二苯并[b，d]氮雜-7-基)-N' _(2，2，3，3，3_五氟-丙基)-丙二酰胺(2，
2-Dimethyl-N-((S)-6-oxo-6,7-dihydro-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-yl)-N'-(2,2,3,3,
3-pentafluoro-propyl)-malonamide)(1)有效用于治療阿爾茨海默病。 因此，需要開(kāi)發(fā)新的藥物/化學(xué)治療方案，從而進(jìn)一步改善可用于癌癥患者的治療。發(fā)明概述本發(fā)明提供治療癌癥患者的方法，所述方法包括給所述患者施用治療有效量的化 合物(1)，或其藥用鹽，該化合物(1)具有下式 本發(fā)明還提供治療癌癥患者的方法，所述方法包括給所述患者施用治療有效量的 化合物(1)，或其藥用鹽，該化合物(1)具有下式 其中化合物(1)在21天周期的第1，2，3，8，9和10天以約400ng-hr/ml-約 9000ng-hr/ml的量每天施用一次。本發(fā)明還提供治療癌癥患者的方法，所述方法包括給所述患者施用治療有效量的化合物(1)，或其藥用鹽，該化合物(1)具有下式
其中化合物(1)在21天周期的第1-7天以約400ng-hr/ml-約9000ng_hr/ml的
量每天施用一次。本發(fā)明還提供包括一種以上口服單位劑型的試劑盒，每個(gè)單位包含約3mg_約 300mg化合物(1)，或其藥用鹽，該化合物(1)具有下式 本發(fā)明還進(jìn)一步提供上述式(1)的化合物、或其藥用鹽用于制備治療癌癥特別是 實(shí)體瘤的藥物的應(yīng)用，所述實(shí)體瘤諸如例如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳 腺癌或前列腺癌。本發(fā)明還進(jìn)一步提供上述式(1)的化合物、或其藥用鹽用于制備治療癌癥特別是 實(shí)體瘤的藥物的應(yīng)用，所述實(shí)體瘤諸如例如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳 腺癌或前列腺癌，所述應(yīng)用包括按照本文所述的具體方法、劑量方案和/或治療周期中的 任一種施用式(1)的化合物、或其藥用鹽。本發(fā)明另外提供用于制備目的是治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥物的方法，所述實(shí)體 瘤諸如例如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌或前列腺癌，所述方法的特 征在于使用式(1)的化合物、或其藥用鹽。本發(fā)明另外提供用于制備目的是治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥物的方法，所述實(shí)體 瘤諸如例如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌或前列腺癌，所述方法的特 征在于，按照本文所示的具體方法、劑量方案和/或治療周期中的任一種使用式(1)的化合 物、或其藥用鹽。本發(fā)明最后提供本文所示的具體方法和應(yīng)用，其中化合物(1)與治療有效量的吉西他濱(gemcitabine)組合使用，優(yōu)選地用于治療胰腺癌。發(fā)明詳述本發(fā)明提供治療癌癥患者的新型方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量 的化合物(1)、或其藥用鹽?；衔?1)是Y-分泌酶的有效且選擇性的抑制劑，其在腫瘤 細(xì)胞中產(chǎn)生對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)的抑制活性。當(dāng)用于本文時(shí)，下述術(shù)語(yǔ)具有下文描述的意思。術(shù)語(yǔ)“抗腫瘤”意指抑制或防止惡性細(xì)胞的發(fā)育、成熟或增殖。術(shù)語(yǔ)“曲線下面積”(AUC)是在血漿中的藥物濃度針對(duì)時(shí)間繪制的圖中曲線下的面 積。AUC表示被機(jī)體吸收的藥物總量，與吸收速率無(wú)關(guān)。這有效用于藥物的治療性監(jiān)測(cè)?；?者血漿中藥物濃度的測(cè)量和AUC的計(jì)算有效用于指導(dǎo)該藥物的劑量。AUC對(duì)于獲知在一定 時(shí)間間隔的平均濃度AUC/t是有用的。AUC通常表示為(質(zhì)量*時(shí)間/體積)，例如，ng-hr/ ml ο術(shù)語(yǔ)“藥用的”，諸如藥用載體、賦形劑等，意指對(duì)于施用特定化合物的受試者是藥 學(xué)可接受的且基本上無(wú)毒。術(shù)語(yǔ)“藥用鹽”指常規(guī)的酸加成鹽或堿加成鹽，其保留本發(fā)明化 合物的生物學(xué)效用和特性，并且由適當(dāng)?shù)臒o(wú)毒有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸或有機(jī)堿或無(wú)機(jī)堿形成。樣 品酸加成鹽包括來(lái)源于無(wú)機(jī)酸的那些和來(lái)源于有機(jī)酸的那些，所述無(wú)機(jī)酸諸如鹽酸、氫溴 酸、氫碘酸、硫酸、磺酸、磷酸和硝酸，所述有機(jī)酸諸如對(duì)-甲苯磺酸、水楊酸、甲磺酸、草酸、 琥珀酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、乳酸、富馬酸等。樣品堿加成鹽包括來(lái)源于銨、鉀、鈉、和季銨氫氧 化物諸如例如四甲基氫氧化銨的那些。術(shù)語(yǔ)化合物的“藥用酯”意指具有羧基的常規(guī)酯化化 合物，所述酯保留該化合物的生物學(xué)效用和特性。將藥物化合物(即，藥物)化學(xué)修飾成鹽 是制藥化學(xué)家獲得化合物提高的物理和化學(xué)穩(wěn)定性、親水性(hydroscopicity)和溶解性 的熟知的技術(shù)。參見(jiàn)，例如，H. Ansel 等,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng))(第6版，1995)，第196和1456-1457頁(yè)。術(shù)語(yǔ)“前體藥物”指在表現(xiàn)出其藥物作用之前進(jìn)行轉(zhuǎn)化的化合物。為了克服制藥 學(xué)問(wèn)題而對(duì)藥物進(jìn)行化學(xué)修飾還被稱為“藥物潛在化”。藥物潛在化是對(duì)生物活性化合物 進(jìn)行化學(xué)修飾，以形成新化合物，所述新化合物在體內(nèi)酶攻擊時(shí)將釋放母體化合物。母體化 合物的化學(xué)改變是這樣的，從而物理化學(xué)特性的改變將影響吸收、分布和酶代謝。藥物潛在 化的定義還被延伸以包括母體化合物的非酶再生。再生作為水解、解離、和其它不需要酶介 導(dǎo)的反應(yīng)結(jié)果而發(fā)生。所述術(shù)語(yǔ)，前體藥物，潛在化的藥物，和生物可逆衍生物可以互換使 用。經(jīng)過(guò)推論，潛在化意指參與在體內(nèi)產(chǎn)生生物活性母體分子的時(shí)間延遲元件(time lag element)或時(shí)間成分(time component)。術(shù)語(yǔ)前體藥物是概括性的，因?yàn)槠浒撛诨?藥物衍生物以及與受體組合、在施用后轉(zhuǎn)化為實(shí)際物質(zhì)的那些物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)前體藥物是這樣 的藥劑的通用術(shù)語(yǔ)，所述藥劑在表現(xiàn)出其藥學(xué)活性之前進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”意指在施用給患者時(shí)有效產(chǎn)生需要的治療效果的藥物量，所述 治療效果例如阻止癌腫瘤的生長(zhǎng)、或?qū)е缕涫湛s。與化合物(1)組合施用的治療有效量的 吉西他濱優(yōu)選地意指如在下述實(shí)施例7中公開(kāi)的具體劑量和時(shí)間表。術(shù)語(yǔ)“與……組合施用”當(dāng)用于本文時(shí)意指同時(shí)或順序地施用。化合物“吉西他濱”意指4-氨基-1-[3，3- 二氟-4-羥基_5_ (羥甲基)-四氫呋 喃-2-基]-IH-嘧啶-2-酮(4-Amino-l-[3，3-dif luor-4-hydroxy-5- (hydroxymethyl) _tetrahydrofuran-2-yl] -1 H-pyrimidin-2-on)，并且例如以 Gemzar 市售。術(shù)語(yǔ)“治療指數(shù)”是選擇臨床試驗(yàn)用抗癌藥劑的重要參數(shù)。治療指數(shù)考慮抗癌藥 劑的功效、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、代謝和生物利用度。參見(jiàn)，例如，J. Natl. Cancer Inst.(國(guó)家 癌癥研究雜志)81 (13) 988-94 (1989年7月5日)。術(shù)語(yǔ)“腫瘤控制”意指從最后測(cè)量其可測(cè)量的損傷的垂直直徑?jīng)]有增加25%以 上。參見(jiàn),例如，World Health Organization (世界衛(wèi)生組織)(〃 WHO" ) Handbook for Reporting Results of Cancer Treatment, Geneva(曰內(nèi)瓦 艮告癌癥治療結(jié)果的手冊(cè)) (1979)。術(shù)語(yǔ)“實(shí)體瘤”意指非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，結(jié)腸直腸癌，胰腺癌，結(jié)腸癌，乳腺癌， 前列腺癌等。當(dāng)用在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中時(shí)，“化合物⑴，，的意思包括下式的具體化合 物及其藥用鹽 本發(fā)明提供用于治療癌癥患者的方法，其包括給所述患者施用治療有效量的化合 物(1)，或其藥用鹽，所述化合物(1)具有下式 化合物(1)是Y-分泌酶的有效且選擇性的抑制劑，Y-分泌酶是負(fù)責(zé)分裂和 激活Notch受體的關(guān)鍵酶。由于基因擴(kuò)增、染色體易位、或突變導(dǎo)致的Notch信號(hào)傳導(dǎo) 失調(diào)已經(jīng)參與多種類型的癌癥，包括白血病(Leukemia)，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞 瘤(medullo-and glioblastoma),乳腺癌(breadcarcinoma)，頭頸癌(head and neck cancer)，和胰腺癌(pancreatic carcinoma)。臨床前的證據(jù)已經(jīng)表明通過(guò)抑制γ-分泌酶 的蛋白水解活性阻斷Notch信號(hào)傳導(dǎo)在小鼠異種移植模型中導(dǎo)致對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的阻止?；衔?1)的治療有效量是在施用給患者時(shí)有效產(chǎn)生需要的治療效果從而阻止癌腫瘤的生長(zhǎng)、或?qū)е缕涫湛s的量。優(yōu)選地，化合物(1)的治療有效量為約400ng-hr/ml-約 9000ng-hr/ml,更優(yōu)選地約 1100ng-hr/ml-約 4100ng_hr/ml，且最優(yōu)選地約 1380ng_hr/ ml-約 2330ng-hr/mlo在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物(1)的治療有效量為約400ng-hr/ml-約9000ng-hr/ ml,更優(yōu)選地約 1100ng-hr/ml-約 4100ng-hr/ml,且最優(yōu)選地約 1380ng-hr/ml-約 2330ng-hr/ml，在至多約21天的時(shí)間階段中施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天每天施 用一次。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以 約400ng-hr/ml-約9000ng_hr/ml的量每天施用一次。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物(1)在21天周期中的第1-7天每天施用一次。在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物(1)在21天周期中的第1-7天以約400ng-hr/ml-約 9000ng-hr/ml的量每天施用一次。優(yōu)選地，化合物(1)以藥物口服單位劑型存在。本方法還包括另外對(duì)患者進(jìn)行放 射治療。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療癌癥患者的方法，其包括給所述患 者施用治療有效量的化合物(1)，或其藥用鹽，所述化合物(1)具有下式 其中化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以約400ng-hr/ml-約 9000ng-hr/ml的量每天施用一次，只要癌癥保持為得到控制就重復(fù)進(jìn)行。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療癌癥患者的方法，其包括給所述 患者施用治療有效量的化合物(1)，或其藥用鹽，所述化合物(1)具有下式 其中化合物(1)在21天周期中的第1-7天以約400ng-hr/ml-約9000ng_hr/ml的量每天施用一次，只要癌癥保持為得到控制就重復(fù)進(jìn)行。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供化合物(1) 或其藥用鹽用于制備治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥物的應(yīng)用。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述化合物(1)的應(yīng)用，其中所述治療包 括施用約400ng-hr/ml-約9000ng-hr/ml治療有效量的化合物(1)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述化合物(1)的應(yīng)用，其中治療有效量 的化合物(1)為約 1100ng-hr/ml-約 4100ng-hr/ml。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述化合物(1)的應(yīng)用，其中治療有效量 的化合物(1)為約 1380ng-hr/ml-約 2330ng-hr/ml。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述化合物(1)的應(yīng)用，其中治療有效量 的化合物(1)為約400ng-hr/ml-約9000ng-hr/ml，其在至多約21天的時(shí)期內(nèi)施用。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述化合物(1)的應(yīng)用，其中治療有效量 的化合物(1)為約llOOng-hr/ml-約4100ng-hr/ml，其在至多約21天的時(shí)期內(nèi)施用。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述化合物(1)的應(yīng)用，其中治療有效量 的化合物(1)為約1380ng-hr/ml-約2330ng-hr/ml，其在至多約21天的時(shí)期內(nèi)施用。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述化合物(1)的應(yīng)用，其中化合物(1)在 21天周期中的第1，2，3，8，9和10天每天施用一次。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述化合物⑴的應(yīng)用，其中化合物⑴在 21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以約400ng-hr/ml_約9000ng_hr/ml的量每天施用一次。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述化合物(1)的應(yīng)用，其中化合物(1)在 21天周期中的第1-7天每天施用一次。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述化合物(1)的應(yīng)用，其中化合物(1)在 21天周期中的第1-7天以約400ng-hr/ml-約9000ng-hr/ml的量每天施用一次。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述化合物(1)的應(yīng)用，其中化合物(1)以 藥物口服單位劑型存在。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述化合物(1)的應(yīng)用，其包括另外使患 者進(jìn)行放射治療。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供化合物(1)
或其藥用鹽用于制備治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥物的應(yīng)用，其中所述治療包括在 21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以約400ng-hr/ml_約9000ng_hr/ml的量每天施用化 合物⑴一次。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供化合物(1) 或其藥用鹽用于制備治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥物的應(yīng)用，其中所述治療包括在 21天周期中的第1-7天以約400ng-hr/ml-約9000ng-hr/ml的量每天施用化合物(1) 一次。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備目的是用于治療癌癥特別是實(shí)體瘤的 藥物的方法，所述方法特征在于，以治療有效量使用式(1)的化合物 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其中化合物(1)的治療有效量 為約 400ng-hr/ml-約 9000ng-hr/ml。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其中化合物(1)的治療有效量為約 1100ng-hr/ml-約 4100ng_hr/ml。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其中化合物(1)的治療有效量 為約 1380ng-hr/ml-約 2330ng_hr/ml。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其中化合物(1)的治療有效量 為約400ng-hr/ml-約9000ng_hr/ml，其在至多約21天的時(shí)期內(nèi)施用。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其中化合物(1)的治療有效量 為約1100ng-hr/ml-約4100ng_hr/ml，其在至多約21天的時(shí)期內(nèi)施用。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其中化合物(1)的治療有效量 為約1380ng-hr/ml-約2330ng-hr/ml，其在至多約21天的時(shí)期內(nèi)施用。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其中化合物(1)在21天的周期 中的第1，2，3，8，9和10天每天施用一次。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其中化合物(1)在21天周期中 的第1，2，3，8，9和10天以約400ng-hr/ml-約9000ng_hr/ml的量每天施用一次。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其中化合物(1)在21天周期中 的第1-7天每天施用一次。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其中化合物(1)在21天周期中 的第1-7天以約400ng-hr/ml-約9000ng_hr/ml的量每天施用一次。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其中化合物(1)以藥物口服單 位劑型存在。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其包括另外使患者進(jìn)行放射治療。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備目的用于治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥 物的方法，其特征在于，式(1)的化合物 或其藥用鹽，在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以約400ng-hr/ml-約 9000ng-hr/ml的量每天使用一次。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備目的用于治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥 物的方法，其特征在于，式(1)的化合物 或其藥用鹽，在21天周期中的第1-7天以約400ng-hr/ml-約9000ng-hr/ml的量
每天使用一次。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法和應(yīng)用，其中化合物(1)與有效 量的吉西他濱組合施用。在這一實(shí)施方案中，化合物(1)和吉西他濱的組合優(yōu)選地用于制備治療胰腺癌的 藥物。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括一種以上口服單位劑 型，每一單位包含約3mg-約300mg化合物(1)，或其藥用鹽，所述化合物(1)具有下式 在這一實(shí)施方案中，所述試劑盒可以包括包含足夠數(shù)量的單位足以可以在約21 天的時(shí)期內(nèi)每天給患者施用約300mg的化合物(1)、或其藥用鹽的口服單位劑型。在這一實(shí)施方案中，所述試劑盒還可以包括包含有效量的吉西他濱的單位劑型。醫(yī)師可以根據(jù)患者的需要、以及患者對(duì)治療的反應(yīng)而改變每種組分的劑量水平至 低于或高于本文所述的劑量水平。劑量可以按照由醫(yī)師根據(jù)患者需要確定的任意給藥時(shí)間 表施用。例如，兩種組分中每一種的劑量可以在數(shù)天的時(shí)期內(nèi)以單次給藥或分開(kāi)給藥施用、 或改變?nèi)粘r(shí)間表施用。優(yōu)選地，每21天、或只要由毒性恢復(fù)所允許就重復(fù)治療時(shí)間表，條件是腫瘤得到 控制且患者耐受治療方案或腫瘤消退。優(yōu)選地，這些治療周期重復(fù)總共至多約8個(gè)周期。本發(fā)明的方法可以按照下文所述的實(shí)施例進(jìn)行準(zhǔn)備。所述實(shí)施例以證明而不是限 制本發(fā)明的化合物和組合物的制備的目的進(jìn)行描述。實(shí)施例實(shí)施例1在裸鼠中人腫瘤異種移植中每天口服施用一次化合物(1)的抗腫瘤活性的廣度。在先前的抗腫瘤功效研究中，當(dāng)給攜帶A549非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)異種移植物的 小鼠口服施用化合物⑴時(shí)，與賦形劑處理的對(duì)照動(dòng)物相比較，以3，10，或30mg/kg的劑量 每天給藥一次或兩次持續(xù)14(14+/7_)或21天導(dǎo)致顯著且持續(xù)不變的腫瘤生長(zhǎng)抑制，腫瘤 生長(zhǎng)抑制(TGIs) %在66-83%范圍內(nèi)。使用14+/7-或21天的治療時(shí)間表每天施用化合物 (1) 一次與每天兩次治療一樣有效，沒(méi)有劑量依賴性。此外，較短的給藥持續(xù)時(shí)間(14+/7-) 與完整的21天給藥一樣有效地抑制A549腫瘤生長(zhǎng)。為了研究化合物(1)的抗腫瘤活性的廣度，在兩個(gè)結(jié)腸直腸癌(Lovo和HCT116) 和兩個(gè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) (Calu-6和H460a)異種移植模型中進(jìn)行4種另外的功效研 究。盡管可能驅(qū)動(dòng)功效的參數(shù)是未知的，認(rèn)為Notch下游靶標(biāo)Hes-I和Hey-I的表達(dá)表示活 性Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑。此外，已經(jīng)報(bào)道Ras癌基因的表達(dá)在Notch激活中起作用?；?Notch配體、受體、和下游靶標(biāo)的內(nèi)部基因表達(dá)模式，預(yù)測(cè)L0V0，HCT116，和Calu_6腫瘤模型 對(duì)化合物(1)介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制敏感，而預(yù)測(cè)H460a模型是不敏感的。例如，Lovo結(jié)腸直腸癌 細(xì)胞系具有與已經(jīng)表明對(duì)化合物(1)介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制敏感的A549異種移植模型相似 的基因表達(dá)，具有Notch配體Jag 1和DNER，Notch受體1，2，和3，以及下游靶標(biāo)Hes-I和 Hey-I的表達(dá)。NSCLC細(xì)胞系Calu_6和H460a具有相似的配體和受體基因模式，具有Notch 1和Notch 3的高表達(dá)。這兩種細(xì)胞系還具有升高的Hes-I，Hey-I和NUMB的表達(dá)。此外， 所有這些細(xì)胞系均具有突變的K-ras。在目前的研究中，在至多三周內(nèi)給攜帶確定的皮下(sc)L0V0，Calu-6, HCT116，或 H460a腫瘤的小鼠口服施用化合物(1)。化合物(1)以每天3mg/kg和10mg/kg(qd)給藥21 天，或按照間斷的時(shí)間表(7天給藥，14天不給藥，然后7天給藥(7+/14-/7+))以30mg/kg 和60mg/kg給藥。材料和方法_使用獲自查理斯河實(shí)驗(yàn)室(CharlesRiver Laboratories) (Wilmington,ΜΑ)的雌 性裸鼠(10只/組)，此時(shí)它們約為13-14周齡，并且重約23-25克。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的總體 觀察和通過(guò)分析籠養(yǎng)在共用架臺(tái)上的sentinel動(dòng)物的血液樣品而每天確定所有動(dòng)物的健 康。在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用之前，允許所有動(dòng)物適應(yīng)并且由任何運(yùn)輸相關(guān)的壓力恢復(fù)最少72小時(shí)。隨 意提供高壓滅菌的水和照射過(guò)的食物[5058-ms Pico chow (小鼠)Purina，Richmond，IN]， 并且保持動(dòng)物為12小時(shí)光照和黑暗的周期。在使用之前將籠、草墊和水瓶高壓滅菌，并且 每周更換。IiSLovo 人結(jié)腸直腸，Calu-6 NSCLC，和 HCTl 16 結(jié)腸直腸細(xì)胞購(gòu)自 ATCC (Manassas， VA)。H460a NSCLC細(xì)胞為德克薩斯州休斯頓MD安德森醫(yī)學(xué)中心(MD Anderson Medical Center, Houston, TX) Jack Roth 博士的饋贈(zèng)。Lovo 細(xì)胞在 F12K 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，Calu-6 和 H460a 在 Dulbecco 改良的基本培養(yǎng)基(Dulbecco' s Modified Essential Medium) (DMEM) 中生長(zhǎng)，并且HCT116細(xì)胞在McCoy’ s 5A培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。所有的培養(yǎng)基補(bǔ)充有10% (ν/ν)FBS 和 (ν/ν) 200nM L-谷氨酰胺。在 9/22/06，9/22/06，9/26/06 和 9/29/06 分別對(duì)小鼠 在右后腰窩處皮下(sc)植入處于0. 2ml PBS體積中的5xl06 Lovo,3xl06 Calu-6或HCT116， 或IxlO7 H460a細(xì)胞/小鼠。檢測(cè)藥劑按下述，將化合物(1)用0. 2%吐溫-80配制為在水中的1. 0% Klucel中的混懸 液用于口服(Po)施用。藥物配制 將配制的化合物和賦形劑保存在4°C，并且每周制備。在施用前強(qiáng)烈混合化合物 ⑴。隨機(jī)化在植入后第19天，將植入Lovo和Calu-6異種移植物的小鼠隨機(jī)化，并且在第20 天將植入HCT116異種移植物的小鼠隨機(jī)化，，而植入H460a異種移植物的小鼠在植入后第 12天進(jìn)行隨機(jī)化。所有小鼠按照腫瘤體積隨機(jī)化，從而所有組具有約IOO-ISOmm3的相似的 起始平均腫瘤體積。研究設(shè)計(jì)在該報(bào)道中用于所有4種體內(nèi)研究的研究設(shè)計(jì)是相同的。劑量組在下述文列出。研究設(shè)計(jì) *除了 H460a功效研究之外，接受兩輪7天的治療，所述H460a功效研究早已停止i^x對(duì)于Lovo和Calu-6腫瘤研究的治療于10/11/06 (腫瘤細(xì)胞植入后第19天)開(kāi) 始，對(duì)于HCTl 16的研究于10/16/06 (腫瘤細(xì)胞植入后第20天)開(kāi)始，并且對(duì)于H460a研究于10/11/06 (腫瘤細(xì)胞植入后第12天)開(kāi)始。使用無(wú)菌Icc注射器和18 口徑的管飼針頭 (0. 2ml/動(dòng)物)每天一次(qd)給藥賦形劑或化合物(1)混懸液共21天，或使用間斷的時(shí)間 表(7天給藥，14天不給藥，然后7天給藥(7+/14-/7+))給藥。對(duì)于Lovo和Calu_6研究， 21天的給藥在腫瘤細(xì)胞植入后第40天結(jié)束。對(duì)于間斷給藥，治療在第26天結(jié)束，在第40 天重新開(kāi)始，并且在第47天結(jié)束。對(duì)于HCT116研究，21天的給藥在腫瘤細(xì)胞植入后第42 天結(jié)束。間斷給藥在第27天結(jié)束，在第42天重新開(kāi)始，并且在第49天結(jié)束。對(duì)于H460a 研究，21天的給藥早在腫瘤細(xì)胞植入后第27天結(jié)束，而對(duì)于間斷給藥，治療在第19天結(jié)束， 并且沒(méi)有重新開(kāi)始(由于缺乏功效)。病理學(xué)/尸體剖檢在研究結(jié)束時(shí)，對(duì)于Eff#l 137 (Lovo)，Eff#1147 (HCT116)，和 Eff#1148 (H460a) 進(jìn)行尸體剖檢。在處死之前2小時(shí)對(duì)動(dòng)物注射在Iml無(wú)菌水中的Img BrdU(溴脫氧尿苷 (bromodeoxyuridine))來(lái)評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖。通過(guò)用CO2誘導(dǎo)然后斷頸而處死動(dòng)物。收集 來(lái)自賦形劑處理的組和所選化合物(1)處理的組的腫瘤，并且在鋅-福爾馬林中固定過(guò)夜， 處理，石蠟包埋，并且切片，用于組織病理學(xué)(蘇木精和曙紅(H&E)染色用于形態(tài)學(xué)評(píng)估，和 BrdU染色)，如下文所述。尸體剖檢/病理學(xué)總結(jié) 廁每周測(cè)量腫瘤和小鼠體重兩次。所有的動(dòng)物分別進(jìn)行整個(gè)實(shí)驗(yàn)。計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析體重減少使用下式以平均組體重變化百分?jǐn)?shù)繪圖表示((W-W0) /W0) xlOO其中W表示在具體某一天治療組的平均體重，Wtl表示同一治療組在治療開(kāi)始時(shí)的 平均體重。最大體重減少也使用上式表示，并且表示在關(guān)于具體某一組的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中 的任意時(shí)間觀察到的最大體重減少百分?jǐn)?shù)。功效數(shù)據(jù)以平均腫瘤體積士平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)繪圖表示。治療組的腫瘤 體積利用下式表示為對(duì)照組的腫瘤體積的百分?jǐn)?shù)(％ T/C)
IOOx ((T-T0)/(C-C0))其中T表示治療組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中具體某一天的平均腫瘤體積，T0表示同一治療 組在治療的第一天的平均腫瘤體積；C表示對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中具體某一天的平均腫瘤體 積，C0表示同一治療組在治療的第一天的平均腫瘤體積。使用橢圓體式計(jì)算腫瘤體積(單位為立方毫米)(Dx(d2))/2其中D表示腫瘤的大直徑，d表示小直徑。在一些情形中，使用下式計(jì)算腫瘤消退和/或腫瘤體積的百分?jǐn)?shù)改變((T-T0) /T0) XlOO其中T表示治療組在具體某一天的平均腫瘤體積，T0表示同一治療組在開(kāi)始治療 時(shí)的平均腫瘤體積。通過(guò)秩禾口檢驗(yàn)(rank sum test)禾口單向 Anova 禾口 post—hoc Bonferroni t_ 檢驗(yàn) (SigmaStat，版本 2. 0，Jandel Scientific, San Francisco，CA)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。當(dāng)概率 值(ρ) ( 0. 05時(shí)，認(rèn)為組間差異是顯著的。MM先前發(fā)現(xiàn)在本研究設(shè)置中所檢測(cè)的化合物(1)的劑量和方案在裸鼠中是很好耐 受的。如預(yù)測(cè)的，在本研究中沒(méi)有觀察到體重減少或其它臨床毒性跡象。在本研究設(shè)置中，化合物(1)以每日3和10mg/kg 21天，或按照間斷的時(shí)間表(7 天給藥，14天不給藥，然后7天給藥(7+/14-/7+))以30和60mg/kg進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)按照21天 或7+/14-/7+時(shí)間表用化合物(1)治療攜帶Lovo結(jié)腸直腸異種移植物的裸鼠時(shí)，腫瘤生長(zhǎng) 被顯著抑制，在第47天，即在21-天治療組最后一天后7天(21+/7-)，或在第二輪7天治療 結(jié)束時(shí)(7+/14-/7+)，鑒定了最大的腫瘤生長(zhǎng)抑制。與賦形劑治療的對(duì)照相比較，3和IOmg/ kg qd χ 21天的化合物(1)劑量分別導(dǎo)致40% (ρ = 0. 136)和83% (ρ彡0. 001) TGI，而間 斷給藥 30 和 60mg/kg 劑量的化合物(1)產(chǎn)生 59% (ρ = 0. 021)和 85% (ρ = 0. 001)TGI。與化合物(1)在Lovo結(jié)腸直腸腫瘤模型中的抗腫瘤活性相比，在Calu-6 NSCLC 模型中，腫瘤生長(zhǎng)抑制減弱。在第47天，即在21-天治療組(21+/7-)最后一天后7天，或 在第二輪7天治療結(jié)束時(shí)(7+/14-/7+)，獲得最大腫瘤生長(zhǎng)抑制。在最低劑量3mg/kg發(fā)現(xiàn) 最大抗腫瘤效果，其抑制腫瘤生長(zhǎng)59%，(ρ = 0.011)，而10mg/kg僅具有42%的TGI，并且 與賦形劑治療的對(duì)照小鼠相比較不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P = 0. 083)。在兩個(gè)7天治療周期后， 30mg/kg的劑量沒(méi)有顯著抑制Calu-6腫瘤生長(zhǎng)(34% TGI,p = 0. 179)，而將該劑量加倍至 60mg/kg 化合物(1)導(dǎo)致 52% TGI (ρ = 0. 035)。化合物(1)在HCT116結(jié)腸直腸模型中介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制與在Lovo結(jié)腸直腸 模型中介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制非常相似，使用所有的劑量和時(shí)間表均鑒定了顯著的抗腫瘤活 性。對(duì)于21天方案在第42天(21天治療結(jié)束時(shí))，對(duì)于7+/14-/7+方案在第53天(第二 個(gè)7天治療結(jié)束后3天)，觀察到最大抗腫瘤活性。與賦形劑對(duì)照相比較，在每天用3mg/kg 化合物(1)連續(xù)治療21天結(jié)束時(shí)，HCTl 16結(jié)腸直腸腫瘤生長(zhǎng)被抑制85% (ρ彡0. 001)，并 且每天10mg/kg的劑量產(chǎn)生76% (ρ = 0. 003) TGI。使用30mg/kg和60mg/kg化合物(1)進(jìn) 行兩輪7天的治療分別產(chǎn)生63% (ρ = 0. 016)和90% (ρ彡0. 001)的TGIs。證明H460aNSCLC模型完全抗化合物(1)介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制。由于在所有劑量均缺少功效，很早(僅 2周后)終止對(duì)攜帶H460異種移植物的小鼠的治療。與A549 NSCLC異種移植物模型中先前的功效研究相似，在本研究中，值得注意的 是關(guān)于腫瘤生長(zhǎng)抑制一般缺少對(duì)每日給藥的劑量響應(yīng)。例如，當(dāng)對(duì)HCT116荷瘤小鼠以3或 10mg/kg給藥化合物(1)21天時(shí)，獲得的％ TGIs不與劑量成比例，分別具有85%和76%的 TGI0當(dāng)對(duì)Calu-6荷瘤小鼠施用相同劑量的化合物(1) 21天時(shí)，較高劑量的％ TGI小于較 低劑量的％ TGI (42% TGI相對(duì)于59% TGI)。通過(guò)對(duì)攜帶建立的腫瘤的裸鼠口服施用Y-分泌酶抑制劑化合物(1)引起的 Notch信號(hào)傳導(dǎo)中斷產(chǎn)生了抗腫瘤功效。較早的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)表明化合物(1)對(duì)于植入裸鼠中 的A549 NSCLC腫瘤的延長(zhǎng)且持久的抑制是有效的。開(kāi)始進(jìn)行另外的體內(nèi)研究，來(lái)研究化合 物(1)抗腫瘤功效的廣度?；趦?nèi)源性Notch信號(hào)傳導(dǎo)的事實(shí)，在體內(nèi)異種移植物研究中， 選擇Lovo結(jié)腸直腸癌，Calu-6 NSCLC，HCT116結(jié)腸直腸癌和H460a NSCLC進(jìn)行檢測(cè)。在所 述4種腫瘤模型中的3種中，化合物(1)是有效的，并且顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，而無(wú)毒性。在本功效研究設(shè)置中，以兩種不同的方案檢測(cè)兩種劑量的化合物(1)中的每一 種3和10mg/kg qd 21天，或30和60mg/kg間斷給與(7+/14-7+)。預(yù)先檢測(cè)這些劑量和 時(shí)間表，并且發(fā)現(xiàn)在裸鼠中是很好耐受的。化合物(1)在兩種結(jié)腸直腸模型Lovo和HCTl 16 中表現(xiàn)出最大的抗腫瘤活性。在給藥21天后，與賦形劑治療的對(duì)照相比，3和10mg/kg的化 合物(1)劑量分別導(dǎo)致40%和83% TGI，而30和60mg/kg的化合物(1)劑量產(chǎn)生59%和 85% TGI0在HCT116模型中，最低的3mg/kg劑量甚至更有活性(TGI = 85% )，并且IOmg/ kg的劑量同樣有效，與賦形劑治療的對(duì)照相比較，具有76% TGI。使用30mg/kg和60mg/kg 化合物(1)進(jìn)行兩輪7天的治療分別產(chǎn)生63%和90%的TGIs。針對(duì)檢測(cè)的兩種NSCLC異種移植物模型(Calu-6和H460a)，化合物(1)較不有效。 在Calu-6模型中，以最低劑量3mg/kg每天給藥21天獲得最大生長(zhǎng)抑制(與賦形劑相比較， 59% TGI)，而所有的其它劑量和方案證明是較不有效的。對(duì)于化合物(1)的抗腫瘤作用， H460a模型是完全難治愈的。盡管到目前數(shù)據(jù)組較小，總共僅檢測(cè)了 4種腫瘤模型，但是所觀察到的體內(nèi)抗腫 瘤反應(yīng)似乎與細(xì)胞系Notch 1/Notch 3的表達(dá)比例相關(guān)。已經(jīng)表明Notch 3在由γ.-分 泌酶加工和蛋白水解分裂后作用為胞內(nèi)Notch 1 (ICN)的負(fù)調(diào)控子。Notch 3在核易位后與 ICN競(jìng)爭(zhēng)，并且結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。內(nèi)部數(shù)據(jù)揭示H460a細(xì)胞中升高的Notch 3蛋白表達(dá)，和在 敏感細(xì)胞系(即，Lovo，HCT116，和A549)中減少的或低的表達(dá)。如先前使用化合物(1)的體內(nèi)研究所示，當(dāng)小鼠每天給藥21天后，關(guān)于腫瘤生長(zhǎng) 抑制，此處觀察到一般缺少劑量比例性。另一方面，關(guān)于按照間斷(7+/14-/7+)時(shí)間表給藥 的較高劑量，似乎確實(shí)存在劑量響應(yīng)。所認(rèn)知到的劑量響應(yīng)的缺少不能完全由藥物暴露解 釋。在用10mg/kg化合物(1)急性相對(duì)于長(zhǎng)期給藥的小鼠中的血漿暴露的比較表明相似的 暴露，這表明不存在暴露隨時(shí)間的減少，這可能解釋劑量比例性抗腫瘤響應(yīng)的缺乏。此外， 裸鼠中的另一個(gè)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究揭示關(guān)于至多30mg/kg劑量的血漿暴露的杰出劑量 比例性。因此，關(guān)于TGI缺少劑量比例性響應(yīng)不是由于血漿暴露藥物飽和。同樣地，這些研 究驗(yàn)證了％ TGI不總是與暴露成比例，并且暗示生物學(xué)閾值效應(yīng)。來(lái)自本文所述的體內(nèi)研究的結(jié)果表明Y.-分泌酶抑制劑化合物的抗腫瘤活性的廣度。每天口服施用或間斷(S卩，兩個(gè)周期)給藥可以有效抑制腫瘤生長(zhǎng)而沒(méi)有毒性。在4 種異種移植物模型中的3種中，化合物(1)是口服活性的。這些數(shù)據(jù)表明通過(guò)施用Y-分 泌酶抑制劑即化合物(1)產(chǎn)生的Notch抑制可能是一種有效的癌癥治療策略。Mrk化合物(1)是γ-分泌酶的一種有效的抑制劑，其阻斷腫瘤細(xì)胞中Notch信號(hào) 傳導(dǎo)的激活。在先前的研究中，對(duì)A549荷瘤小鼠口服施用化合物(1)導(dǎo)致持續(xù)的抗腫瘤 反應(yīng)。為了進(jìn)一步評(píng)估化合物⑴的抗腫瘤活性廣度，在Lovo和HCT116人結(jié)腸直腸，與 Calu-6和H460a NSCLC異種移植物模型中進(jìn)行4種功效研究。兩種劑量(3和10mg/kg)每 天給藥21天，而30和60mg/kg使用間斷時(shí)間表給藥(7天給藥，14天不給藥，然后7天給藥 (7+/14-/7+))。在兩種結(jié)腸直腸模型Lovo和HCTl 16中，化合物(1)表現(xiàn)出最大抗腫瘤活 性。在給藥21天后，與賦形劑治療的對(duì)照相比較，10mg/kg的化合物⑴劑量導(dǎo)致83%的腫 瘤生長(zhǎng)抑制(TGI)，而30和60mg/kg的化合物(1)劑量產(chǎn)生59%和85%的TGI。在HCTl 16 模型中，低如3mg/kg的劑量是有效的，與賦形劑對(duì)照相比較，具有85% TGI，并且10mg/kg 的劑量同樣是有效的。用30mg/kg和60mg/kg化合物(1)進(jìn)行兩輪7天的治療分別產(chǎn)生 63%和90%的TGIS。對(duì)于兩種所檢測(cè)的NSCLC異種移植物模型Calu_6和H460a，化合物 (1)是較不有效的。在Calu-6模型中，僅在以3mg/kg的最低劑量每天給藥21天獲得顯著 的生長(zhǎng)抑制(與賦形劑相比較，59% TGI)，而所有其它劑量和方案證明是較不有效的。對(duì)于 化合物(1)的抗腫瘤作用，H460a模型是完全難治愈的。所觀察到的抗腫瘤活性模式似乎 與細(xì)胞系N0tchl/N0tch3表達(dá)比例相關(guān)，然而，數(shù)據(jù)組較小，并且對(duì)于驅(qū)動(dòng)功效的因素仍然 理解很少。這些數(shù)據(jù)表明通過(guò)施用Y-分泌酶抑制劑化合物(1)產(chǎn)生的Notch抑制可能是 一種有效的癌癥治療策略。實(shí)施例2化合物(1)在A549 NSCLC腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞活性化合物(1)在細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞測(cè)定中的IC5tl在低的納摩爾范圍內(nèi)，關(guān)于不同類型 (受體、離子通道、酶)的75種其它結(jié)合位點(diǎn)觀察到具有>2 log單位的選擇性。化合物 (1)的生長(zhǎng)抑制活性是復(fù)雜的?；衔?1)不阻止腫瘤細(xì)胞增殖，也不誘導(dǎo)凋亡，而是產(chǎn)生 較少轉(zhuǎn)化的、更扁平、更緩慢的生長(zhǎng)表型。這種機(jī)制與Notch抑制相一致，并且排除了收集 標(biāo)準(zhǔn)(collecting standard)的EC50值。如通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)量ICN表達(dá)的減少，化合物 (1)減少Notch加工。這導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄靶基因產(chǎn)物Hesl減少的表達(dá)，其同樣通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)
Mo在發(fā)育和組織重建過(guò)程中，多能干細(xì)胞作為分化細(xì)胞的來(lái)源，以產(chǎn)生非專門增殖 的細(xì)胞類型。這些干細(xì)胞的特征和腫瘤的快速不可控增殖之間的聯(lián)系逐漸變得清楚。一種 主要的發(fā)育信號(hào)傳導(dǎo)軸是Notch途徑。Notch信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)在成體多能干細(xì)胞的發(fā)育和自 我更新過(guò)程中介導(dǎo)祖細(xì)胞的分化而調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)。Notch起作用保持祖細(xì)胞處于多能快速 增殖狀態(tài)。Notch基因擴(kuò)增、染色體易位或突變導(dǎo)致升高的Notch信號(hào)傳導(dǎo)，由此通過(guò)將腫 瘤細(xì)胞保持在干細(xì)胞樣增殖狀態(tài)而給予腫瘤生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。膜內(nèi)加工是膜受體激活和信號(hào)傳導(dǎo)的發(fā)生主題。Y -分泌酶是包括Notch的幾種 信號(hào)傳導(dǎo)受體(其它由Y-分泌酶加工的蛋白的實(shí)例為淀粉樣前體蛋白[APP]，CD44干細(xì) 胞標(biāo)記，和HER4[ErbB4])膜內(nèi)蛋白水解加工中的關(guān)鍵酶。Notch的Y -分泌酶加工產(chǎn)生稱
21為ICN的活性形式。該蛋白易位至核，并且形成包括直接改變關(guān)鍵的增殖-和分化_特異性 基因的表達(dá)的CSL轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的大轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的一部分。通過(guò)Y-分泌酶抑制阻斷Notch 信號(hào)傳導(dǎo)在體內(nèi)在人類癌癥細(xì)胞中產(chǎn)生較緩慢的生長(zhǎng)、較少轉(zhuǎn)化的表型。這種類型的新型 治療途徑具有使癌癥成為更易處理的疾病的潛力，而沒(méi)有傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物的強(qiáng)副作用。材料和方法細(xì)胞系和培養(yǎng)A549 細(xì)胞系獲自美國(guó)組織培養(yǎng)物中心(American Tissue CultureCollection) (ATCC)，ManassasVA并且保持在Ham培養(yǎng)基中，所述Ham培養(yǎng)基補(bǔ)充了 10%熱滅活的胎牛 血清(HI-FBS ；GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD)和 2mM L-谷氨酰胺(GIBC0/BRL)。將 IxlO6 A549細(xì)胞接種在IOcm3板中用于FACS分析，并且將3xl05細(xì)胞/孔接種在6孔板中用于蛋 白質(zhì)印跡分析。允許細(xì)胞附著24小時(shí)，然后用化合物(1)以下述濃度0. 1,0. 25,0.5,1,2.5 和5 μ M處理。將細(xì)胞溫育72或120小時(shí)，并且收集用于FACS分析。檢測(cè)套裝將測(cè)試化合物(1)以IOmM溶解在100% 二甲亞砜(DMSO) (Sigma(西格瑪))中，并 且在玻璃小瓶中在_20°C保存。5-點(diǎn)給藥和蛋白質(zhì)印跡分析通過(guò)用冷PBS洗滌板并且直接向板添加樣品緩沖液(1 1水2X含有5%2-β 巰基乙醇的Tris-甘氨酸SDS樣品緩沖液(Invitrogen，Carlsbad, CA))而收集A549細(xì)胞。 所用的裂解緩沖液的體積約為ΙΟΟμΙ/ΙΧΙΟ5個(gè)細(xì)胞。通過(guò)煮沸5分鐘變性蛋白，通過(guò)使用 4-20% Tris-甘氨酸凝膠(Invitrogen)進(jìn)行的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并且電轉(zhuǎn) 到0.45μπι硝基纖維素膜(Invitrogen)上。將膜在室溫下在封閉緩沖液(PBS/0. 吐溫 20中的5%牛奶)中封閉1小時(shí)，然后用一級(jí)抗體在4°C溫育過(guò)夜。洗滌膜，并用二級(jí)抗體 在室溫下溫育30分鐘。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL Plus, Amersham Pharmacia Biotech (安 瑪西亞法瑪西亞生物技術(shù))，Piscataway，NJ)進(jìn)行免疫檢測(cè)。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡，使用處于 1 1000稀釋的來(lái)自細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)(Cell Signaling)的分裂的Notch-I (vall744)抗體 (#2421)檢測(cè)總ICN，使用處于1 1000稀釋的來(lái)自US Biological (美國(guó)生物學(xué))的Hesl 抗體(#H2034-35)檢測(cè)Hesl，并且使用處于1 10，000稀釋的來(lái)自Sigma (西格瑪)的肌 動(dòng)蛋白抗體(#5316)檢測(cè)肌動(dòng)蛋白。細(xì)胞周期分析將細(xì)胞用化合物(1)溫育72或120小時(shí)，通過(guò)刮擦收集，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中 洗滌兩次，以1.5xl03rpm離心，并且用70%乙醇在_20°C固定過(guò)夜。然后，使用MPM2-FITC 和碘化丙啶(PI)雙重染色(Becton Dickinson, San Jose, CA)分析細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將細(xì) 胞用冰冷的包含0. 05%吐溫-20的PBS(PBST)洗滌兩次，用抗-磷Ser/Thr MPM2抗體 (#05-368,Upstate/Mi 11 ipore,BulIerica,ΜΑ)溫育 2 小時(shí)，再次用 PBST 洗滌，在暗處用二 級(jí) IgG-FITC 抗體(#AP308F，Chemicon, Temecula, CA)溫育，用 PBST 洗滌并再用 PI/RNA 酶 溶液(Becton Dickinson, San Jose, CA)在 37°C溫育另外 30 分鐘。在裝配有488nm氬離子激光的FACScan流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Becton Dickinson, San Jose, CA)上分析樣品。使用對(duì)數(shù)放大用530/30nm通帶濾光片(bandpass filter)收集綠 色熒光素異硫氰酸鹽(FITC)熒光，并且使用線性放大通過(guò)585/42nm通帶濾光片濾過(guò)來(lái)自碘化丙啶(PI)的橙色發(fā)射。每份樣品最少收集20，000個(gè)事件。使用Flowjo軟件(Tree Star Inc.(三星公司)，Ashland, OR)進(jìn)行DNA柱狀圖的細(xì)胞周期分析。Notch加工的蛋白質(zhì)印跡分析通過(guò)Y-分泌酶進(jìn)行Notch受體分裂后的ICN蛋白形成是Notch信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān) 鍵步驟。ICN遷移至核，成為調(diào)控包括Hesl的各種靶基因的轉(zhuǎn)錄的較大轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的一部 分。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞系中ICN表達(dá)和Notch靶基因產(chǎn)物Hesl的減少。在人 NSCLC A549細(xì)胞中在處理5天后的組織培養(yǎng)物中，化合物(1)抑制ICN產(chǎn)生，所述ICN誘導(dǎo) 扁平且更少轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞表型。這種形態(tài)與在組織培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的非轉(zhuǎn)化原代支氣管上 皮細(xì)胞相似。由Clonetics網(wǎng)站獲得用于視覺(jué)比較的比較。這一數(shù)據(jù)與抑制腫瘤細(xì)胞中的 Y“分泌酶相一致。沒(méi)有觀察到在化合物處理后的凋亡表型的出現(xiàn)。細(xì)胞周期分析利用FACS分析獲得對(duì)化合物(1)處理后的細(xì)胞周期抑制作用的理解。用增加濃 度的化合物⑴處理A549細(xì)胞72和120小時(shí)。FACS分析表明對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展的非常小的 作用，在72和120小時(shí)使用5μ M具有中等細(xì)胞周期減緩，如下文所述。FACS分析的量化
化合物(1)，μΜ時(shí)間，hrssubGl，%Gl, %G2/M, %05.260.123.50.106.563.123.30.25725.964.820.30.504.366.619.41.06.66421.55.08.464.92007.258.2590.106.859.024.10.251206.761.123.80.509.658.623.31.08.060.919.85.013.758.718.3化合物(1)不阻斷腫瘤細(xì)胞增殖，也不誘導(dǎo)凋亡，而是相反產(chǎn)生較少轉(zhuǎn)化的、更扁 平的且更緩慢的生長(zhǎng)表型。這一機(jī)制與Notch抑制相一致。如通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)量ICN表 達(dá)的減少，化合物(1)減少Notch加工。這導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄靶基因產(chǎn)物Hesl減少的表達(dá)，其同樣 通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)量。
23
實(shí)施例3在化合物(1)給藥后的A549異種移植物蛋白質(zhì)印跡分析化合物(1)是Y-分泌酶的有效且選擇性的抑制劑，其在腫瘤細(xì)胞中對(duì)Notch信 號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生抑制活性(1)。化合物(1)在細(xì)胞和不含細(xì)胞的測(cè)定中的IC5tl在低的納摩爾范 圍內(nèi)，關(guān)于不同類型(受體、離子通道、酶)的75種其它結(jié)合位點(diǎn)觀察到具有>2 log單位 的選擇性?；衔?1)的生長(zhǎng)抑制活性是復(fù)雜的?；衔?1)不阻止腫瘤細(xì)胞增殖，也不誘 導(dǎo)凋亡，而是產(chǎn)生較少轉(zhuǎn)化的、更扁平、更緩慢的生長(zhǎng)表型。這種機(jī)制與Notch抑制相一致。 化合物(1)治療的腫瘤具有降低的胞外基質(zhì)蛋白5型膠原蛋白水平和升高的MFAP5水平。 另外，如通過(guò)ICN和Notch-I受體表達(dá)的減少測(cè)量的，腫瘤細(xì)胞中的Notch加工被抑制。當(dāng) 對(duì)攜帶A549異種移植物的小鼠每天給藥化合物(1)至多60mg/kg時(shí)，ICN和Notch-I是變 化的。這可能是由于在功效研究過(guò)程中重復(fù)給藥后暴露的減少或在腫瘤內(nèi)極差的化合物分 布。在發(fā)育和組織重建過(guò)程中，多能干細(xì)胞作為分化細(xì)胞的來(lái)源，以產(chǎn)生非專門增殖 的細(xì)胞類型。這些干細(xì)胞的特征和腫瘤的快速不可控增殖之間的聯(lián)系逐漸變得清楚。一種 主要的發(fā)育信號(hào)傳導(dǎo)軸是Notch途徑。Notch信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)在成體多能干細(xì)胞的發(fā)育和自 我更新過(guò)程中介導(dǎo)祖細(xì)胞的分化而調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)。Notch起作用保持祖細(xì)胞處于多能快速 增殖狀態(tài)。Notch基因擴(kuò)增、染色體易位或突變導(dǎo)致升高的Notch信號(hào)傳導(dǎo)，由此通過(guò)將腫 瘤細(xì)胞保持在干細(xì)胞樣增殖狀態(tài)而給予腫瘤生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。膜內(nèi)加工是膜受體激活和信號(hào)傳導(dǎo)的發(fā)生主題。Y -分泌酶是包括Notch的幾種 信號(hào)傳導(dǎo)受體(其它由Y-分泌酶加工的蛋白的實(shí)例為淀粉樣前體蛋白[APP]，CD44干細(xì) 胞標(biāo)記，和HER4[ErbB4])膜內(nèi)蛋白水解加工中的關(guān)鍵酶。Notch的Y -分泌酶加工產(chǎn)生稱 為ICN的活性形式。該蛋白易位至核，并且形成包括直接改變關(guān)鍵的增殖-和分化_特異性 基因的表達(dá)的CSL轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的大轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的一部分。通過(guò)Y-分泌酶抑制阻斷Notch 信號(hào)傳導(dǎo)在體內(nèi)在人類癌癥細(xì)胞中產(chǎn)生較緩慢的生長(zhǎng)、較少轉(zhuǎn)化的表型。這種類型的新型 治療途徑具有使癌癥成為更易處理的疾病的潛力，而沒(méi)有傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物的強(qiáng)副作用。材料和方法檢測(cè)套裝將測(cè)試化合物(1)以IOmM溶解在100% 二甲亞砜(DMSO) (Sigma(西格瑪))中，并 且在玻璃小瓶中在_20°C保存。腫瘤收集和蛋白質(zhì)印跡分析對(duì)攜帶A549腫瘤的裸鼠按照每日口服時(shí)間表以指定劑量給藥21天。在尸體剖 檢時(shí)收集來(lái)自每組的三種A549腫瘤，并且急速冷凍。通過(guò)向腫瘤中直接添加樣品緩沖液 (1 1水2X含有5% 2-β巰基乙醇的Tris-甘氨酸SDS樣品緩沖液(Invitrogen， Carlsbad, CA))并且利用印pendorf研棒分解而制備蛋白提取物。所用的裂解緩沖液的體 積約為100 μ 1/1Χ106個(gè)細(xì)胞。通過(guò)煮沸5分鐘變性蛋白，通過(guò)使用4-20% Tris-甘氨酸凝 膠(Invitrogen)進(jìn)行的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并且電轉(zhuǎn)到0. 45 μ m硝基纖維素 膜(Invitrogen)上。將膜在室溫下在封閉緩沖液(PBS/0. 吐溫20中的5%牛奶)中封 閉1小時(shí)，然后用一級(jí)抗體在4°C溫育過(guò)夜。洗滌膜，并用二級(jí)抗體在室溫下溫育30分鐘。 使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL Plus,Amersham Pharmacia Biotech(安瑪西亞法瑪西亞生物技術(shù))，PiSCataWay，NJ)進(jìn)行免疫檢測(cè)。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡，使用處于1 1000稀釋的來(lái)自細(xì) 胞信號(hào)傳導(dǎo)(Cell Signaling)的分裂的Notch-1 (vall744)抗體(#2421)檢測(cè)總ICN，使用 處于 1 1000 稀釋的來(lái)自 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz 生物技術(shù))的 Notch-1 C-20抗體(#SC-6014)檢測(cè)總Notch-1，使用處于1 1000稀釋的來(lái)自US Biological (美 國(guó)生物學(xué))的Hesl抗體(#H2034-35)檢測(cè)Hesl，使用處于1 1000稀釋的來(lái)自Sigma (西 格瑪)的肌動(dòng)蛋白抗體(#5316)檢測(cè)肌動(dòng)蛋白，使用處于1 1000稀釋的來(lái)自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz生物技術(shù))的H-200抗體(#20648)檢測(cè)V型膠原蛋白，并且使 用處于1 1000稀釋的來(lái)自Abnova的MFAP5抗體(#H00008076_A01)檢測(cè)MFAP5。異種移棺物蛋白質(zhì)印跡分析γ -分泌酶抑制劑處理的A549異種移植物腫瘤的微陣列分析揭示RNA表達(dá)變化 與胞外基質(zhì)改變一致。制備化合物(1)處理的腫瘤用于蛋白質(zhì)印跡分析。V膠原蛋白表達(dá) 顯著減少，而MFAP5蛋白表達(dá)增加。Notch-I蛋白水平和ICN的表達(dá)在除最高劑量組外的 所有動(dòng)物組中減少。V型膠原蛋白和MFAP5是補(bǔ)充胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白。在更加分化的組 織中，V型膠原蛋白表達(dá)通常減少，MFAP5表達(dá)通常增加。這一數(shù)據(jù)與A549腫瘤細(xì)胞中的 Notch-I抑制導(dǎo)致更加分化的表型的發(fā)揮作用假說(shuō)相一致。Mrk化合物(1)處理的腫瘤具有減少的胞外基質(zhì)蛋白5型膠原蛋白水平和升高的 MFAP5水平。另外，如通過(guò)ICN和Notch-I受體表達(dá)減少測(cè)量的，腫瘤細(xì)胞中的Notch加工 被抑制。當(dāng)對(duì)攜帶A549異種移植物的小鼠每天給藥化合物(1)至多60mg/kg時(shí)，ICN和 Notch-I是變化的。這可能是由于在功效研究過(guò)程中重復(fù)給藥后暴露的減少或在腫瘤內(nèi)極 差的化合物分布。實(shí)施例4在化合物(1)給藥后，MDA-MB-468乳腺腫瘤細(xì)胞中軟瓊脂生長(zhǎng)潛能的喪失化合物(1)是Y-分泌酶的有效且選擇性的抑制劑，其在腫瘤細(xì)胞中對(duì)Notch信 號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生抑制活性?；衔?1)在細(xì)胞和不含細(xì)胞的測(cè)定中的IC5tl在低的納摩爾范圍 內(nèi)，關(guān)于不同類型(受體、離子通道、酶)的75種其它結(jié)合位點(diǎn)觀察到具有>2 log單位的 選擇性?；衔?1)的生長(zhǎng)抑制活性是復(fù)雜的?；衔?1)不阻止腫瘤細(xì)胞增殖，也不誘 導(dǎo)凋亡，而是產(chǎn)生較少轉(zhuǎn)化的、更扁平、更緩慢的生長(zhǎng)表型。這種機(jī)制與Notch抑制相一致， 并且排除收集標(biāo)準(zhǔn)的EC5tl值。在軟瓊脂中，化合物(1)減小MDA-MB-468群落的尺寸。在發(fā)育和組織重建過(guò)程中，多能干細(xì)胞作為分化細(xì)胞的來(lái)源，以產(chǎn)生非專門增殖 的細(xì)胞類型。這些干細(xì)胞的特征和腫瘤的快速不可控增殖之間的聯(lián)系逐漸變得清楚。一種 主要的發(fā)育信號(hào)傳導(dǎo)軸是Notch途徑。Notch信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)在成體多能干細(xì)胞的發(fā)育和自 我更新過(guò)程中介導(dǎo)祖細(xì)胞的分化而調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)。Notch起作用保持祖細(xì)胞處于多能快速 增殖狀態(tài)。Notch基因擴(kuò)增、染色體易位或突變導(dǎo)致升高的Notch信號(hào)傳導(dǎo)，由此通過(guò)將腫 瘤細(xì)胞保持在干細(xì)胞樣增殖狀態(tài)而給予腫瘤生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。膜內(nèi)加工是膜受體激活和信號(hào)傳導(dǎo)的發(fā)生主題。Y -分泌酶是包括Notch的幾種 信號(hào)傳導(dǎo)受體(其它由Y-分泌酶加工的蛋白的實(shí)例為淀粉樣前體蛋白[APP]，CD44干細(xì) 胞標(biāo)記，和HER4[ErbB4])膜內(nèi)蛋白水解加工中的關(guān)鍵酶。Notch的Y -分泌酶加工產(chǎn)生稱 為ICN的活性形式。該蛋白易位至核，并且形成包括直接改變關(guān)鍵的增殖-和分化_特異性基因的表達(dá)的CSL轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的大轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的一部分。通過(guò)Y-分泌酶抑制阻斷Notch 信號(hào)傳導(dǎo)在體內(nèi)在人類癌癥細(xì)胞中產(chǎn)生較緩慢的生長(zhǎng)、較少轉(zhuǎn)化的表型。這種類型的新型 治療途徑具有使癌癥成為更易處理的疾病的潛力，而沒(méi)有傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物的強(qiáng)副作用。材料和方法細(xì)胞系和培養(yǎng)MDA-MB-468細(xì)胞系獲自美國(guó)組織培養(yǎng)物中心(American Tissue Culture Collection) (ATCC)，Manassas, VA并且保持在RPMI培養(yǎng)基中，所述RPMI培養(yǎng)基補(bǔ)充 7 10%熱滅活的胎牛血清(HI-FBS ；GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD)和 2mM L-谷氨酰胺 (GIBC0/BRL)。檢測(cè)套裝將測(cè)試化合物(1)以IOmM溶解在100% 二甲亞砜(DMSO) (Sigma(西格瑪))中，并 且在玻璃小瓶中在_20°C保存。軟瓊脂群落形成測(cè)定對(duì)于不依賴錨定性生長(zhǎng)測(cè)定，向6孔板的每個(gè)孔中傾倒2ml包含0. 5%低熔點(diǎn) SeaPlaque瓊脂糖(#50100，Cambrex, Rockland, ME)的細(xì)胞型特異性完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充了 20%胎牛血清(FBS)，1%青霉素/鏈霉素，丙酮酸鈉，HEPES的RPMI培養(yǎng)基)的底 層。待瓊脂培養(yǎng)基在室溫下固化后，加入處于0. 5ml如上述包含0. 3% SeaPlaque瓊脂糖 的完全培養(yǎng)基中的3xl03個(gè)細(xì)胞/孔。次日，向每個(gè)孔中加入包含0，100，或250nM化合物 (1)的Iml培養(yǎng)基。溫育細(xì)胞4周，以允許群落形成，包含化合物的培養(yǎng)基每周更換兩次。軟瓊脂生長(zhǎng)化合物(1)是Y-分泌酶的有效且選擇性的抑制劑，其在腫瘤細(xì)胞中對(duì)Notch信 號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生抑制活性(1)。化合物(1)的生長(zhǎng)抑制活性是復(fù)雜的?；衔?1)不阻止腫瘤 細(xì)胞增殖，也不誘導(dǎo)凋亡，而是產(chǎn)生較少轉(zhuǎn)化的、更扁平、更緩慢的生長(zhǎng)表型。在軟瓊脂中形 成群落的能力表示腫瘤細(xì)胞進(jìn)展中的重要事件。不轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和極差致瘤性的細(xì)胞在接種 在軟瓊脂中時(shí)不能生長(zhǎng)。相反，高致瘤性細(xì)胞在軟瓊脂條件下快速生長(zhǎng)，產(chǎn)生大的群落。在 人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468中通過(guò)測(cè)量在軟瓊脂中的生長(zhǎng)潛能，而評(píng)估化合物(1)對(duì)轉(zhuǎn)化 的表型的作用?；衔?1)以劑量依賴性方式(250nM> 100nM>對(duì)照)減少群落生長(zhǎng)。Mrk化合物(1)不阻止腫瘤細(xì)胞增殖，而是減小MDA-MB-468群落在軟瓊脂中的尺寸。 這與化合物(1)在MDA-MB-468乳腺腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)較少轉(zhuǎn)化的表型相一致。實(shí)施例5在攜帶A549非小細(xì)胞肺癌異種移植物的裸鼠中每天一次或兩次口服施用γ-分 泌酶抑制劑化合物(1)的耐受性和功效化合物(1)是Y-分泌酶的有效且高度選擇性的抑制劑，其最初用于治療阿爾茨 海默病。在體外，化合物(1)以納摩爾濃度抑制Notch激活和加工，并且向培養(yǎng)物中的腫瘤 細(xì)胞添加化合物(1)誘導(dǎo)較少轉(zhuǎn)化的表型，并且阻止在軟瓊脂中的生長(zhǎng)。在體內(nèi)，化合物 (1)在嚙齒動(dòng)物、狗和人類中具有良好的口服生物利用度和有利的藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式。在 本研究中，將攜帶A549非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)異種移植物的裸鼠在21天治療周期中的7、 14或21天口服每日或每日兩次(qd or bid)給藥化合物(1)。對(duì)于每日兩次(bid)給藥，
26鑒定最大耐受劑量(MTDs)為60mg/kg 7天，30mg/kg 14天，和10mg/kg 21天。對(duì)于每日 (qd)給藥，注意到最大耐受劑量為60mg/kg 14天或30mg/kg 21天。當(dāng)僅在21天周期中的 7天(7+/14-)施用60mg/kg的化合物(1)時(shí)，開(kāi)始時(shí)觀察到腫瘤消退，并且在不進(jìn)行治療的 14天后，％腫瘤生長(zhǎng)抑制(TGI)與賦形劑治療的對(duì)照動(dòng)物相比仍然為91%。另外，每日給 藥一次或兩次較低劑量的化合物(1) (3mg/kg, 10mg/kg和30mg/kg) 14(14+/7_)或21天在 21天周期結(jié)束時(shí)導(dǎo)致顯著且持續(xù)的腫瘤生長(zhǎng)抑制，％ TGIs在66-83%范圍內(nèi)。每天施用 化合物(1) 一次與使用14+/7-或21天治療時(shí)間表每天兩次治療一樣有效，具有劑量依賴 性。此外，較短的給藥持續(xù)時(shí)間(7+/14-或14+/7-)與完整的21天給藥一樣有效抑制A549 腫瘤生長(zhǎng)。這一數(shù)據(jù)支持通過(guò)施用Y分泌酶抑制劑化合物(1)進(jìn)行的Notch抑制可能是 治療癌癥的一種有效的臨床治療法的觀點(diǎn)。Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑在發(fā)育過(guò)程中通過(guò)調(diào)控祖細(xì)胞和多能干細(xì)胞的分化、增殖和 凋亡而參與決定細(xì)胞的命運(yùn)。由于基因擴(kuò)增、染色體易位或突變導(dǎo)致的Notch信號(hào)傳導(dǎo)元 件的失調(diào)參與多種類型的惡性病，包括白血病(Leukemia)，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞
(medullo-and glioblastoma), ？L (breast carcinoma)，Lf^ (head and neck cancer)，和胰腺癌(pancreatic carcinoma)。例如，Notch在造血系統(tǒng)中起決定細(xì)胞世系 的作用，并且已表明激活Notch-I突變負(fù)責(zé)所有T細(xì)胞ALLs (急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia))中的大約一半。Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑由Notch受體(Notch受 體1-4)構(gòu)成，其在與配體(δ -樣-1，-3，-4，Jagged-I和_2)結(jié)合并且通過(guò)蛋白水解分裂 激活時(shí)，易位至核，在核中它們作用為靶基因的轉(zhuǎn)錄激活劑。γ -分泌酶是負(fù)責(zé)Notch受體分裂和激活的兩種重要酶中的一種，并且已經(jīng)提議 其為癌癥治療的靶標(biāo)。由Y-分泌酶酶促分解胞內(nèi)Notch(ICN)允許ICN易位至核，導(dǎo)致 下游致癌性靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄，所述下游致癌性靶標(biāo)包括Hes，Hes相關(guān)的bHLH受體，Hey, HERP, 細(xì)胞周期調(diào)控子(P21，細(xì)胞周期蛋白A，細(xì)胞周期蛋白D1)，SKP2，NF-kB的轉(zhuǎn)錄因子，AKT， PI-3K，erbB2, β -聯(lián)蛋白和凋亡過(guò)程的調(diào)控劑。Ras癌基因可以激活野生型Notch信號(hào)傳 導(dǎo)，其是Ras-介導(dǎo)的向惡性病轉(zhuǎn)化的明顯需要。最近的證據(jù)表明來(lái)自腫瘤細(xì)胞的Notch信 號(hào)傳導(dǎo)可以引發(fā)鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞的Notch激活，因此促進(jìn)腫瘤發(fā)生和血管生成。因此，靶向 Notch活性的Y-分泌酶抑制劑可能在不同癌癥類型中具有多效性作用。除了加工Notch，Y-分泌酶還負(fù)責(zé)加工β-淀粉樣前體肽(APP)，其是阿爾茨海 默病治療中的靶標(biāo)。已經(jīng)表明靶向Y-分泌酶的小分子在某種選擇性程度上能夠相對(duì)于 Notch阻斷APP的加工。當(dāng)前臨床前沿，開(kāi)發(fā)化合物(1)用于阿爾茨海默病，但是相對(duì)于 Y-分泌酶缺乏抑制APP的充分的特異性。認(rèn)為靶向正常細(xì)胞中的Notch的后果不適于阿爾 茨海默病適應(yīng)征，但是對(duì)于腫瘤學(xué)是可接受的。例如，在給藥Y-分泌酶抑制劑的Fischer 大鼠中的毒性研究揭示Notch途徑激活的阻斷導(dǎo)致粘膜分泌的杯形細(xì)胞尺寸和數(shù)量的增 加?；衔铫攀歉叨冗x擇性且有效的Y -分泌酶抑制劑(ICsi = 4nM)。認(rèn)識(shí)到聯(lián)系 Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的失調(diào)和癌癥的mounting數(shù)據(jù)，利用一種交叉治療策略將Y -分泌酶 抑制劑用作癌癥治療。在細(xì)胞報(bào)告子測(cè)定(IC5tl = 5nM)中，化合物(1)以納摩爾范圍抑制 人Αβ蛋白生產(chǎn)(IC5tl = 4-14ηΜ)，和Notch活性/加工?；衔?1)在小鼠中具有有利的 藥物代謝動(dòng)力學(xué)，具有中等至高的口服生物利用度。
在本研究中，針對(duì)裸鼠中的A549 NSCLC人異種移植物模型，評(píng)估化合物(1)的抗 腫瘤活性。由于表達(dá)受體、配體和下游效應(yīng)子如Hes-I和Hey-I (如通過(guò)基于PCR的基因表 達(dá)模式評(píng)估)，A549細(xì)胞似乎具有功能性Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑。A549細(xì)胞在Notch途徑中 具有至少一種可以確認(rèn)的缺陷；負(fù)調(diào)控子Numb僅以低水平表達(dá)。在體外，nM濃度的化合物 (1)在Α549細(xì)胞中誘導(dǎo)較少轉(zhuǎn)化的表型以及MDA-MB-468乳腺腫瘤細(xì)胞失去在軟瓊脂中的 生長(zhǎng)，這與Notch激活的機(jī)制性抑制相一致。為了檢驗(yàn)化合物(1)的體內(nèi)抗腫瘤作用，在 本研究中，在21天的時(shí)間表中的7，14或21天向攜帶A549異種移植物的雌性無(wú)胸腺nu/ nu(裸)小鼠每天一次(qd)或兩次(bid)施用化合物(1)。材料和方法使用獲自查理斯河實(shí)驗(yàn)室(CharlesRiver Laboratories) (Wilmington,ΜΑ)的雌 性裸鼠(10只/組)，此時(shí)它們約為13-14周齡，并且重約23-25克。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的總 體觀察和通過(guò)分析籠養(yǎng)在共用架臺(tái)上的崗哨動(dòng)物(sentinel animal)的血液樣品而每天確 定所有動(dòng)物的健康狀況。在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用之前，允許所有動(dòng)物適應(yīng)并且由任何運(yùn)輸相關(guān)的壓力 恢復(fù)最少72小時(shí)。隨意提供高壓滅菌的水和照射過(guò)的食物[5058-ms Pico chow(小鼠) Purina, Richmond, IN]，并且保持動(dòng)物為12小時(shí)光照和黑暗的周期。在使用之前將籠、草墊 和水瓶高壓滅菌，并且每周更換。腫瘤A549 人 NSCLC 細(xì)胞購(gòu)自 ATCC (Manassas, VA)，并且培養(yǎng)在具有 10 % (v/v) FBS 的 RPMI 1640培養(yǎng)基中。生長(zhǎng)細(xì)胞，并且由腫瘤學(xué)體內(nèi)組(Oncology In Vivo Section) (OIVS) 的成員收集。每只小鼠接受在0.2mlPBS(磷酸鹽緩沖液)中的7.5xl06個(gè)細(xì)胞，所述細(xì)胞 于8/17/06由OIVS成員皮下植入在右后腰窩處。檢測(cè)藥劑將化合物(1)用0. 2%吐溫-80配制為在水中的1. 0% Klucel中的混懸液用于口 服(PO)施用。在停止和施用之前劇烈混合化合物(1)。每周制備配制的化合物和賦形劑， 并且保存在4°C，如下文所述。藥物配制 隨機(jī)化在腫瘤植入后第25天，將動(dòng)物按照腫瘤體積隨機(jī)化，從而所有組具有約 100-150mm3的相似的起始平均腫瘤體積。研究設(shè)計(jì)
劑量組在下述文列出。研究設(shè)計(jì)7和14天給藥的組 21天給藥的組 治療治療開(kāi)始于9/12/06 (腫瘤細(xì)胞植入后第26天)。在21天時(shí)間表的7、14或21天， 使用無(wú)菌1 cc注射器和18 口徑的管飼針頭(0. 2ml/動(dòng)物)每天一次(qd)或兩次(bid) (間隔8小時(shí))將化合物(1)和賦形劑作為混懸液給藥。對(duì)于給藥7天的動(dòng)物(7+/14-)，治療于9/19/06 (腫瘤細(xì)胞植入后第33天)結(jié)束。這些小鼠在第67天再次用相同劑量的化 合物(1)治療另外7天至第74天。對(duì)于給藥14天(14+/7-)的動(dòng)物，治療于9/26/06 (腫 瘤細(xì)胞植入后第40天)結(jié)束，并且對(duì)于給藥21天的動(dòng)物，治療于10/3/06 (腫瘤細(xì)胞植入 后第47天)結(jié)束·病理學(xué)/尸體剖檢在處死之前2小時(shí)對(duì)動(dòng)物注射在Iml無(wú)菌水中的Img BrdU (溴脫氧尿苷)來(lái)評(píng)估 腫瘤細(xì)胞增殖。通過(guò)用CO2誘導(dǎo)然后斷頸而處死動(dòng)物。收集來(lái)自賦形劑處理的組和所選化 合物(1)處理的組的腫瘤，并且在鋅-福爾馬林中固定過(guò)夜，處理，石蠟包埋，并且切片，用 于組織病理學(xué)(蘇木精和曙紅(H & E)染色用于形態(tài)學(xué)評(píng)估，和BrdU染色)。收集脾和胃 腸道部分，福爾馬林固定，處理，石蠟包埋，切片，并且用H&E染色，分別用于評(píng)估邊緣區(qū)域B 細(xì)胞消耗，和杯形細(xì)胞形成，因?yàn)檫@些是Y-分泌酶抑制劑的兩種已知的靶標(biāo)-相關(guān)的作 用。結(jié)果在下文描述。尸體剖檢/病理學(xué)總結(jié) 每周測(cè)量腫瘤和小鼠體重兩次。所有的動(dòng)物分別進(jìn)行整個(gè)實(shí)驗(yàn)。計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析體重減少使用下式以平均組體重變化百分?jǐn)?shù)繪圖表示=((W-Wci)ZX)X 100，其中 ‘W’表示在具體某一天治療組的平均體重，%’表示同一治療組在治療開(kāi)始時(shí)的平均體重。 最大體重減少也使用上式表示，并且表示在關(guān)于具體某一組的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的任意時(shí)間 觀察到的最大體重減少百分?jǐn)?shù)。在給定組中，定義毒性為> 20%的小鼠表現(xiàn)出> 20%的體 重減少和/或死亡率。功效數(shù)據(jù)以平均腫瘤體積+平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)繪圖表示。治療組的腫瘤體 積利用下式表示為對(duì)照組的腫瘤體積的百分?jǐn)?shù)(％T/c) 100 X(CT-Ttl)/(C-Ctl)),其中T表 示治療組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中具體某一天的平均腫瘤體積，T0表示同一治療組在治療的第一天的 平均腫瘤體積；C表示對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中具體某一天的平均腫瘤體積，Ctl表示同一治療組 在治療的第一天的平均腫瘤體積。使用橢圓體式(ellipsoid formula)計(jì)算腫瘤體積(單 位為立方毫米)(D x(d2))/2，其中‘D’表示腫瘤的大直徑，‘d’表示小直徑。在一些情形 中，使用下式計(jì)算腫瘤消退和/或腫瘤體積的百分?jǐn)?shù)改變=(CT-TciVTci)x 100，其中‘T’表 示治療組在具體某一天的平均腫瘤體積，‘IV表示同一治療組在開(kāi)始治療時(shí)的平均腫瘤體 積。通過(guò)秩和檢驗(yàn)和單向Anova和post-hoc Bonferroni t_檢驗(yàn)(SigmaStat，版本2. 0， Jandel Scientif ic，San Francisco, CA)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。當(dāng)概率值(P)彡0.05時(shí)，認(rèn)為 組間差異是顯著的。
藥物暴露為了評(píng)估長(zhǎng)期藥物暴露，在最后一次給藥后0. 5，1，2，4，8，和24小時(shí)從10mg/kg化 合物(1)組(qd χ 21天)收集血液樣品，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2只小鼠。為了評(píng)估急性藥物暴露， 在研究的最后一天，對(duì)首次用于實(shí)驗(yàn)的裸鼠組施用單次劑量為10mg/kg的化合物(1)。制備 血漿樣品，并且通過(guò)LC/MS/MS分析化合物(1)。由2只動(dòng)物/組/時(shí)間點(diǎn)計(jì)算平均血漿濃度。將具有低于量化界限(< 12. 5ng/ ml)的濃度的血漿樣品設(shè)定為零。由平均血漿濃度數(shù)據(jù)估算藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。取樣 時(shí)間報(bào)告為名義上的時(shí)間(nominal time)。報(bào)告的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)為最大血漿濃度 (Cmax)，0-8小時(shí)在血漿濃度-時(shí)間曲線下的面積(AUCch8J，和劑量標(biāo)準(zhǔn)化的AUC (AUC0_8hr/ 劑量)。Cmax值直接取自在第一時(shí)間點(diǎn)的血漿濃度-時(shí)間曲線，無(wú)需任何外推。AUC利用線 性梯形法則計(jì)算。在長(zhǎng)期給藥的小鼠中，10mg/kg的劑量產(chǎn)生708ng*小時(shí)/ml的Cmax和923ng*小 時(shí)/ml的AUCup在首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠中的單次劑量提供相似的暴露，Cmax和AUCQ_8to 分別為559ng*小時(shí)/ml和1279ng*小時(shí)/ml，這表明在長(zhǎng)期給藥時(shí)既不存在藥物累積也不 存在減少的暴露。結(jié)果在下文列出。藥物暴露總結(jié)使用10mg/kg劑量的平均血漿暴露 結(jié)果毒性在先前的最大耐受劑量(MTD)研究中，對(duì)首次用于實(shí)驗(yàn)的裸鼠每天兩次給藥 90mg/kg化合物(1) 14天是有毒的，并且導(dǎo)致顯著的體重減少，而每天一次給藥90mg/kg是 耐受的。在本研究中，每天兩次給藥60mg/kg化合物(1)超過(guò)7天不被耐受，并且每天一次 超過(guò)14天不被耐受。當(dāng)動(dòng)物被60mg/kg每天兩次給藥21天或14天時(shí)，每個(gè)治療組分別死 亡7只和4只小鼠，大部分動(dòng)物在死亡前表現(xiàn)出前述體重減少。當(dāng)動(dòng)物每天一次給藥21天 時(shí)，3只小鼠死亡。60mg/kg qd 14天或bid 7天的劑量是很好耐受的，沒(méi)有可評(píng)估的體重 減少或其它臨床毒性跡象。每天一次30mg/kg的劑量21天是耐受的，然而，每天兩次30mg/kg的劑量21天是 有毒性的，有2只動(dòng)物死亡。30mg/kg的劑量每天給藥一次或兩次14天是很好耐受的，沒(méi)有 可評(píng)估的體重減少或其它臨床毒性跡象。使用所有的給藥時(shí)間表，低于30mg/kg(即，IOmg/ kg或3mg/kg)的劑量是很好耐受的，并且沒(méi)有觀察到總體臨床毒性跡象?？鼓[瘤功效在21天時(shí)間表的7天、14天或21天中向攜帶A549 NSCLC異種移植物的裸鼠每 天一次或兩次口服施用化合物(1)，與賦形劑治療的動(dòng)物相比較，導(dǎo)致顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制 (TGI)，生長(zhǎng)抑制充分持續(xù)至治療期間之后。在第47天，即21-天治療組的最后一個(gè)治療日，14-天治療組(14+/7-)的治療后7天，或7-天治療組(7+/14-)的治療后14天，計(jì)算腫瘤 生長(zhǎng)抑制百分?jǐn)?shù)。按照14+/7-時(shí)間表每天一次或每天兩次治療的所有組導(dǎo)致顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑 制，生長(zhǎng)抑制持續(xù)至治療后至多23天(第63天)。當(dāng)在腫瘤植入后第47天結(jié)束21天的 周期時(shí)，與賦形劑治療的動(dòng)物相比較(P < 0. 001)，每天一次施用的最低劑量3mg/kg化合 物(1)導(dǎo)致66% TGI (ρ < 0. 001)，而每天兩次給藥相同劑量將得到的TGI增加為83%。每 天一次10mg/kg的劑量產(chǎn)生77% TGI (ρ < 0. 001)，并且每天兩次給藥相同劑量導(dǎo)致80% TGI (ρ < 0. 001)。在最大耐受劑量60mg/kg qd或30mg/kg bid,分別觀察到88%和79% 的TGIs (ρ <0.001)。當(dāng)給與30mg/kg qd的劑量時(shí)，與賦形劑治療的對(duì)照動(dòng)物相比較，獲得 79% 的 TGI (ρ < 0. 001)。當(dāng)按照7+/14-時(shí)間表每天兩次用60mg/kg化合物⑴治療小鼠時(shí)，治療最初引起 建立的A549腫瘤的消退，而在21天周期結(jié)束時(shí)，即腫瘤植入后第47天，與賦形劑對(duì)照小 鼠相比較，腫瘤生長(zhǎng)抑制仍為91%。腫瘤生長(zhǎng)抑制保持為長(zhǎng)久的，并且持續(xù)至治療后34天 (第67天)。在第67天，這些小鼠用相同劑量的化合物(1)再治療第二個(gè)周期(7天)至 第74天。腫瘤生長(zhǎng)繼續(xù)被抑制，直至第90天。當(dāng)每天一次或兩次連續(xù)施用化合物(1)21天時(shí)，在腫瘤植入后第47天停止治療， 觀察到相似的結(jié)果，在治療21天后，最低劑量3mg/kg每天一次化合物(1)產(chǎn)生76%的 TGI (ρ = 0.002)，而每天兩次給藥導(dǎo)致83%的TGI (ρ < 0.001)。與14+/7-時(shí)間表相似，與 賦形劑治療的對(duì)照相比，對(duì)于每天一次和每天兩次治療組，用10mg/kg治療小鼠21天分別 導(dǎo)致70% (ρ = 0. 004)和72% (ρ = 0. 003)的TGIs。盡管30mg/kg每天兩次的劑量是有 毒的，但是每天一次給藥是很好耐受的，并且與賦形劑治療的小鼠相比較，A549腫瘤生長(zhǎng)被 抑制66% (p = 0. 009)。對(duì)于所有21-天治療的組，腫瘤生長(zhǎng)抑制保持為長(zhǎng)久的，并且持續(xù) 至治療后最多16天(第63天)。注意的是，不管按照14+/7-還是完整的21天治療時(shí)間每天一次或每天兩次給藥 Y-分泌酶抑制劑化合物(1)，關(guān)于腫瘤生長(zhǎng)抑制觀察到普遍的劑量響應(yīng)缺乏。例如，當(dāng)化 合物(1)以3或10mg/kg每天一次給藥21天時(shí)，得到的％TGIs非常相似，并且不是劑量成 比例的，分別具有76%和70%的TGI。當(dāng)每天兩次(每天給與的藥物量加倍)給藥相同劑 量的化合物(1)21天時(shí)，％ TGIs沒(méi)有成比例增加，相對(duì)于76%和70% TGI，分別具有83% 和 72% TGI。增加的臨床前證據(jù)已經(jīng)證明通過(guò)靶向Y-分泌酶而使Notch途徑失活可能是癌癥 治療的一種可行且可信的策略。已經(jīng)在白血病、T-ALL、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳 腺癌、頭頸癌、胰腺癌和許多其它惡性病中觀察到Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的失調(diào)?；衔?1) 最初開(kāi)發(fā)用于阿爾茨海默病作為APP的有效抑制劑，然而，此處我們報(bào)道該化合物通過(guò)抑 制Y -分泌酶介導(dǎo)的Notch加工和活化對(duì)癌癥治療的交叉-治療應(yīng)用。在體外向A549 NSCLC細(xì)胞中添加化合物(1)導(dǎo)致較少轉(zhuǎn)化的表型和在軟瓊脂中 生長(zhǎng)能力的喪失。為了確定化合物(1)的體內(nèi)抗腫瘤潛能，使用7+/14-，14+/7_，或完整的
21天治療時(shí)間表，對(duì)攜帶A549 NSCLC異種移植物的裸鼠每天一次或兩次口服給藥化合物 ⑴。對(duì)于每天兩次給藥，鑒定的最大耐受劑量(MTDs)為60mg/kg 7天，30mg/kg 14天，和10mg/kg 21天。對(duì)于每天一次給藥，注意到最大耐受劑量為60mg/kg 14天或30mg/kg 21天。上述MTDs的劑量和時(shí)間表產(chǎn)生與靶標(biāo)-相關(guān)的胃腸毒性相一致的體重減少和死亡 率。早期使用Y-分泌酶抑制劑治療的腸陷凹(intestinal crypts)組織學(xué)檢驗(yàn)揭示杯形 細(xì)胞分化的急劇增加，其為靶向Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一種已知作用。當(dāng)使用7+/14-給藥時(shí)間表，以60mg/kg每天兩次給藥Y -分泌酶抑制劑化合物 (1)時(shí)，開(kāi)始時(shí)觀察到腫瘤消退，在21天周期結(jié)束時(shí)具有91%的TGI，并且生長(zhǎng)抑制繼續(xù)持 續(xù)數(shù)周。在結(jié)束治療34天后，給藥化合物(1)重新開(kāi)始第二個(gè)周期繼續(xù)抑制腫瘤生長(zhǎng)。另 外地，按照14+/7-或完整的21天時(shí)間表每天給與一次或兩次的所有其它化合物(1)劑量 (3mg/kg，10mg/kg和30mg/kg)導(dǎo)致顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制，其分別充分持續(xù)至治療結(jié)束之 后，即第40天或47天。這些數(shù)據(jù)表明較短的化合物⑴給藥持續(xù)時(shí)間(即7或14天)可 以與較長(zhǎng)的時(shí)間間隔(即21天)給藥一樣有效地抑制A549腫瘤生長(zhǎng)。在多種情形中，化合物(1)的最大抗腫瘤作用被延遲，并且在該化合物給藥停止 后，更明顯。這種臨床前抗腫瘤模式非常不同于經(jīng)典的細(xì)胞毒性藥劑，其中通常在治療期間 觀察到最大腫瘤生長(zhǎng)抑制，并且在治療停止時(shí)腫瘤迅速開(kāi)始繼續(xù)生長(zhǎng)。已知Notch在正常 和癌癥干細(xì)胞中表達(dá)，并且當(dāng)靶向癌癥干細(xì)胞時(shí)，本文觀察到的延遲的抗腫瘤作用聯(lián)想到 腫瘤收縮中的理論預(yù)測(cè)的延遲。由于僅靶向少部分(但是為關(guān)鍵的部分)的腫瘤細(xì)胞群 體，一旦腫瘤中的癌癥干細(xì)胞最終分化或被殺死，其余的細(xì)胞缺乏自我更新的能力，并且腫 瘤體積保持為穩(wěn)定的或逐漸減小。關(guān)于腫瘤生長(zhǎng)抑制觀察到普遍缺少劑量比例性，以3，10，或30mg/kg每天一次給 藥21天具有相似的％ TGIs。當(dāng)在每天兩次組中加倍每日劑量時(shí)，僅觀察到TGI的適度增 加。在本研究結(jié)束時(shí)，在用10mg/kg化合物(1)急性相對(duì)于長(zhǎng)期給藥的小鼠中血漿暴露的 比較表明相似的暴露，這表示不存在暴露隨時(shí)間的減少，這可能解釋劑量比例性的缺乏。此 外，在裸鼠中的獨(dú)立的PK研究(PK#1128)表明關(guān)于至多30mg/kg劑量的血漿暴露存在極佳 的劑量比例性[18]。因此，關(guān)于腫瘤生長(zhǎng)抑制缺少劑量比例性不可能是由于血漿暴露的飽 和導(dǎo)致的。這些結(jié)果表明％ TGI不與暴露成比例，相反可能反映靶向癌癥干細(xì)胞而不是快 速增殖細(xì)胞的獨(dú)特性質(zhì)，或者僅是存在生物學(xué)閾值效應(yīng)。用H & E染色的腫瘤切片的組織學(xué)分析沒(méi)有揭示用化合物⑴治療的腫瘤細(xì)胞表 型的任何差異，然而，與來(lái)自賦形劑治療的小鼠的腫瘤相比較，來(lái)自用10mg/kg化合物⑴ 處理21天的小鼠的腫瘤具有增加的壞死面積和細(xì)胞基質(zhì)。本研究的結(jié)果揭示，按照14+/7-或21天治療時(shí)間表，每日一次施用化合物(1)與 每日兩次治療一樣有效，沒(méi)有劑量依賴性。此外，較短的給藥持續(xù)時(shí)間(7+/14-或14+/7-) 與完全的21天給藥一樣有效抑制A549腫瘤生長(zhǎng)，并且抗腫瘤效果充分延長(zhǎng)至治療結(jié)束后。 這些數(shù)據(jù)表明通過(guò)施用Y-分泌酶抑制劑化合物(1)進(jìn)行的Notch抑制可能是一種有效的 癌癥治療策略。實(shí)施例6非臨床藥理學(xué)總結(jié)化合物(1)是Y _分泌酶的有效且選擇性的抑制劑，其在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生對(duì)Notch 信號(hào)傳導(dǎo)的抑制活性?；衔?1)產(chǎn)生在停止給藥后得到保持的良好的體內(nèi)抗腫瘤活性， 組織學(xué)分析表明與Notch信號(hào)傳導(dǎo)抑制相一致的獨(dú)特的腫瘤表型。
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化合物(1)在細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞測(cè)定中的IC5tl在低的納摩爾范圍內(nèi)，關(guān)于不同類型 (受體、離子通道、酶)的75種其它結(jié)合位點(diǎn)觀察到具有>2 log單位的選擇性?；衔?(1)的生長(zhǎng)抑制活性是復(fù)雜的?；衔?1)不阻止腫瘤細(xì)胞增殖，也不誘導(dǎo)凋亡，而是產(chǎn)生 較少轉(zhuǎn)化的、更扁平、更緩慢的生長(zhǎng)表型。這種機(jī)制與Notch抑制相一致，并且排除了選擇 標(biāo)準(zhǔn)的EC50值。如通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)量ICN表達(dá)的減少，化合物(1)減少Notch加工。這 導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄靶基因產(chǎn)物Hesl減少的表達(dá)，其同樣通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)量。在體內(nèi)應(yīng)用中，化合物(1)在口服給藥后有活性。按照間斷的或每日時(shí)間表，在5 種異種移植物中的3種中表現(xiàn)出抗腫瘤活性，沒(méi)有體重減少。重要的是，在停止給藥時(shí)功效 得以維持。治療的A549 NSCLC腫瘤的組織學(xué)分析表現(xiàn)出以大面積壞死、增加的胞外基質(zhì)為 特征的腫瘤表型。這與膠原蛋白V和MFAP5蛋白表達(dá)中的改變相一致。這些非臨床病理學(xué)結(jié)果支持在腫瘤學(xué)臨床研究中進(jìn)一步評(píng)估化合物(1)。初級(jí)藥效學(xué)體外詵擇件多種體外測(cè)定用來(lái)表征化合物(1)的效力和選擇性。初級(jí)體外測(cè)定使用不含細(xì)胞 的膜制備物來(lái)提供Y-分泌酶的酶復(fù)合物作為體外測(cè)定?；衔?1)強(qiáng)抑制Y-分泌酶的 酶活性，具有4nM的效力。在基于細(xì)胞的報(bào)道子測(cè)定中，這轉(zhuǎn)化為對(duì)淀粉樣前體蛋白(APP ； 14ηΜ)和NotCh(5nM)的有力的加工抑制。APP的細(xì)胞加工使用基于ELISA的讀數(shù)測(cè)量。已 經(jīng)改造HEK293細(xì)胞來(lái)過(guò)表達(dá)APP。通過(guò)A 1-40 γ -分泌酶產(chǎn)物的基于ELISA的量化測(cè)量 加工。細(xì)胞Notch抑制活性使用穩(wěn)定表達(dá)截短的人Notch 1的HEK293細(xì)胞系測(cè)量，所述截 短的人Notch 1在其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與VP16/Gall4轉(zhuǎn)錄激活子融合，所述VP16/Gall4轉(zhuǎn)錄激 活子驅(qū)動(dòng)螢火蟲(chóng)螢光酶基因。當(dāng)通過(guò)其化學(xué)熒光測(cè)定時(shí)，抑制Notch加工產(chǎn)生螢光酶報(bào)道 子活性的減少。機(jī)制研究在由γ -分泌酶分裂Notch受體后形成ICN蛋白是Notch信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵步驟。 ICN遷移至核，成為調(diào)控包括Hesl的多種靶基因的轉(zhuǎn)錄的較大轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的一部分。通過(guò) 蛋白質(zhì)印跡監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞系中ICN表達(dá)和Notch靶基因產(chǎn)物Hesl的減少。在人NSCLC A549 細(xì)胞中，在處理5天后，在組織培養(yǎng)物中，化合物(1)抑制ICN的產(chǎn)生，誘導(dǎo)扁平的更少轉(zhuǎn)化 的腫瘤細(xì)胞表型。在組織培養(yǎng)物中，用化合物(1)處理產(chǎn)生扁平的、不轉(zhuǎn)化的表型。這一數(shù) 據(jù)與抑制腫瘤細(xì)胞中的Y-分泌酶相一致。沒(méi)有觀察到在化合物處理后出現(xiàn)凋亡表型。在軟瓊脂中形成群落的能力代表在腫瘤細(xì)胞進(jìn)展中的重要事件。不轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和 極差致瘤性細(xì)胞在接種在軟瓊脂中時(shí)不能生長(zhǎng)。相反，高致瘤性細(xì)胞在軟瓊脂條件下快速 生長(zhǎng)，產(chǎn)生大的群落。在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468中通過(guò)測(cè)量在軟瓊脂中的生長(zhǎng)潛能， 而評(píng)估化合物(1)對(duì)轉(zhuǎn)化的表型的作用?；衔?1)以劑量依賴性方式(250nM> IOOnM >對(duì)照)減少群落生長(zhǎng)。體內(nèi)評(píng)估在數(shù)種異種移植物模型中，使用不同劑量和時(shí)間表，檢測(cè)臨產(chǎn)前抗腫瘤活性。在 A549 NSCLC模型中，在每天一次治療21天的裸鼠中，化合物(1)產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的腫瘤生 長(zhǎng)抑制(70% TGI)(表5)。在功效檢測(cè)過(guò)程中，體重減少用作長(zhǎng)期給藥后化合物(1)的總 體耐受性的替代。按照10mg/kg的口服每日給藥時(shí)間表，產(chǎn)生暴露的功效(AUC24/天)約
34為IlOOh. ng/ml，并且不導(dǎo)致體重減少或不表現(xiàn)出臨床毒性跡象。在連續(xù)每日給藥后第1天 和第21天之間沒(méi)有觀察到暴露的減少。在本研究結(jié)束時(shí)收集的腫瘤的組織學(xué)分析揭示大 面積的壞死，胞外基質(zhì)的增加。在按照每日時(shí)間表低于MTD給藥21天的裸鼠中，在4種預(yù)測(cè)是敏感的(基于內(nèi)源 性Notch信號(hào)傳導(dǎo)的水平)建立的腫瘤模型中的3種，化合物(1)是口服活性的(表5)。在 預(yù)測(cè)是不敏感的1種模型中的1種中是無(wú)活性的。有效的響應(yīng)可能與腫瘤N0tchl/N0tch3 表達(dá)比例相關(guān)。據(jù)報(bào)道Notch3通過(guò)與Notchl ICN競(jìng)爭(zhēng)核轉(zhuǎn)錄因子作用為Notchl的負(fù)調(diào) 控子。初級(jí)數(shù)據(jù)表明Notch3蛋白在不響應(yīng)異種移植物細(xì)胞系中升高的表達(dá)和在敏感細(xì)胞 系中減少的表達(dá)?；衔?1)在4種預(yù)測(cè)是敏感的異種移植物模型中的3種中是口服活性的，在1 種預(yù)測(cè)是不敏感的模型中的1種中是無(wú)活性的
H460a NSCLC0000NSCLC =非小細(xì)胞肺癌.功效=% TGI彡60且ρ彡0. 05，與賦形劑對(duì)照組比較。*當(dāng)21-天的治療結(jié)束時(shí)的最大TGI。t在21天治療結(jié)束后一周(21+/7-)的最大TGI。#在第二輪7天的治療后(7+/14-/7+)的最大TGI。1在第二輪7天的治療后5天(7+/14-/7+/5-)的最大TGI。在A549模型中的另外劑量和時(shí)間表的研究在21天治療周期中的7天或14天每 天兩次治療后產(chǎn)生79-91%的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制，沒(méi)有體重減少。對(duì)7天的治 療組再監(jiān)測(cè)43天。在整個(gè)觀察期間腫瘤生長(zhǎng)保持穩(wěn)定。在第66天重新開(kāi)始7天給藥，至 第90天產(chǎn)生腫瘤生長(zhǎng)抑制。與使用其它癌癥治療觀察到的功效模式相比較，在使用化合物 (1)的小鼠中觀察到的功效模式是獨(dú)特的，其中最大功效在治療停止后有時(shí)延長(zhǎng)一周或兩 周，并且在治療后還觀察到延長(zhǎng)的功效。這種類型的響應(yīng)與Notch抑制相一致。連續(xù)的每 日和間斷的時(shí)間表都是有效的，沒(méi)有體重減少?；衔?1)適于循環(huán)給藥。這一數(shù)據(jù)支持 關(guān)于1期提議的間斷給藥的觀念。這樣的時(shí)間表可以幫助減小在人類中由每日給藥預(yù)測(cè)的 潛在的毒性和CYP3A4影響。按照10mg/kg的口服每日給藥時(shí)間表，暴露(AUC24h)產(chǎn)生的功效約為1100ng*hr/ mL，并且不導(dǎo)致體重減少，或不表現(xiàn)出臨床毒性跡象。在連續(xù)每日給藥后第1天和第21天
35之間沒(méi)有觀察到暴露的減少，在重復(fù)給藥后缺乏新陳代謝誘導(dǎo)。在大鼠和狗的研究中，也觀 察到在長(zhǎng)期給藥后暴露缺少改變。體內(nèi)機(jī)制研究γ -分泌酶抑制劑治療的A549異種移植物腫瘤的微陣列分析揭示RNA表達(dá)的改 變，這與胞外基質(zhì)改變相一致。制備化合物(1)治療的腫瘤用于蛋白質(zhì)印跡分析。V型膠原 蛋白表達(dá)顯著減少，而MFAP5蛋白表達(dá)升高。Notch-I蛋白水平和ICN的表達(dá)在除最高劑量 組外的所有動(dòng)物組中減少。V型膠原蛋白和MFAP5是補(bǔ)充胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白。在更加分 化的組織中，V型膠原蛋白表達(dá)通常減少，MFAP5表達(dá)通常增加。這一數(shù)據(jù)與A549腫瘤細(xì)胞 中的Notch-I抑制導(dǎo)致更加分化的表型的發(fā)揮作用假說(shuō)相一致。實(shí)施例7在人胰腺癌異種移植物中的抗腫瘤活性動(dòng)物雌性(無(wú)胸腺nu/nu)裸鼠獲自理斯河實(shí)驗(yàn)室(Charles River Laboratories) (Wilmington，MA)，而雌性 SCID-beige 小鼠購(gòu)自 Taconic (Germantown，NY)。使用約為 8-12 周齡(裸鼠)或8-10周齡(SCID-beige)且重約23_25克的小鼠。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的總體 觀察和通過(guò)分析籠養(yǎng)在共用架臺(tái)上的崗哨動(dòng)物的血液樣品而每天確定所有動(dòng)物的健康狀 況。在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用之前，允許所有動(dòng)物適應(yīng)并且由任何運(yùn)輸相關(guān)的壓力恢復(fù)最少72小時(shí)。隨 意提供高壓滅菌的水和照射過(guò)的食物[5058-ms Pico chow (小鼠)Purina，Richmond，IN]， 并且保持動(dòng)物為12小時(shí)光照和黑暗的周期。在使用之前將籠、草墊和水瓶高壓滅菌，并且 每周更換。腫瘤MiaPaca2, AsPCl 和 BxPC3 人胰腺癌細(xì)胞購(gòu)自 ATCC(Manassas，VA)。BxPC3 和 AsPCl細(xì)胞生長(zhǎng)在RPMI培養(yǎng)基中，并且MiaPaCa2細(xì)胞生長(zhǎng)在Dulbecco改良的基本培養(yǎng)基 (Dulbecco' s Modified Essential Medium) (DMEM)中。所有的培養(yǎng)基補(bǔ)充有 10% (ν/ν) FBS和(ν/ν) 200nM L-谷氨酰胺。在1/22/07和3/14/07分別對(duì)裸鼠的每只小鼠在右 后腰窩處皮下植入在體積為0. 2ml的PBS中的6xl06 MiaPaca2細(xì)胞或5xl06 AsPCl細(xì)胞。 于5/22/07對(duì)SCID-biege小鼠的每只小鼠在右后腰窩處皮下植入體積為0.2ml的在1 1 matrigel PBS 混合物中的 5xl06 BxPC3 細(xì)胞。檢測(cè)藥劑將化合物(1)用0. 2%吐溫-80配制為在水中的1. 0% Klucel中的混懸液用于口 服(Po)施用。配制的化合物和賦形劑保存在4°C并且每周制備[表1]。在施用前劇烈混合 該混懸液。用無(wú)菌鹽水重建吉西他濱(Gemzar ,Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, USA)以產(chǎn)生38mg/ml的儲(chǔ)液，用于整個(gè)3-4周的研究。在給藥當(dāng)天用無(wú)菌鹽水進(jìn)一步 稀釋吉西他濱，以產(chǎn)生用于體內(nèi)施用所需要的濃度。隨機(jī)化將植入MiaPaCa2或AsPCl異種移植物的裸鼠分別在細(xì)胞植入后第17天和第9天 隨機(jī)化。將攜帶BxPC3異種移植物的SCID-beige小鼠在植入后8天隨機(jī)化。所有小鼠按 照腫瘤體積隨機(jī)化，從而所有組具有約100-150mm3的相似的起始平均腫瘤體積。治療起始
對(duì)于MiaPaCa2研究的治療于2/8/07 (腫瘤植入后第17天)開(kāi)始，對(duì)于AsPCl于 3/23/07 (腫瘤植入后第9天)開(kāi)始，并且對(duì)于BxPC3研究于5/30/07 (腫瘤植入后第8天) 開(kāi)始。使用無(wú)菌Icc注射器和18 口徑的管飼針頭(0. 2ml/動(dòng)物)每天一次(qd)給藥口服 賦形劑或化合物(1)混懸液21-28天，或使用間斷的時(shí)間表(7天給藥，14天不給藥，7天 給藥(7+/7-/7+)，7天給藥，7天不給藥(7+/7_)，3天給藥，4天不給藥(3+/4_)，或14天給 藥，14天不給藥(14+/14-))給藥。使用Icc注射器和26 口徑的針頭將吉西他濱q3d(每3 天)腹膜內(nèi)(ip)施用給小鼠。對(duì)于MiaPaCa2和AsPCl研究，qd化合物(1)混懸液或q3d吉西他濱治療在腫瘤 細(xì)胞植入后第37天結(jié)束，而對(duì)于BxPC3研究，qd化合物(1)混懸液或q3d吉西他濱治療在 腫瘤細(xì)胞植入后第35天結(jié)束。對(duì)于在MiaPaCa2研究中使用7+/7_/7+時(shí)間表間斷給藥化合物(1)混懸液，治療 在第23天結(jié)束，在第31天重新開(kāi)始，并且在第37天結(jié)束。在組合組(見(jiàn)表2A，組9和10) 中，使用7+/7-/7+時(shí)間表，順序地給予化合物(1)混懸液與吉西他濱，從而化合物(1)僅在 第一周和第三周每日給藥，而吉西他濱僅在第二周q3d給藥。對(duì)于在AsPCl研究中使用7+/7_時(shí)間表x2周期間斷給藥化合物(1)混懸液，治療 在第15天結(jié)束，在第23天重新開(kāi)始，并且最后在第29天結(jié)束。對(duì)于使用3+/4_時(shí)間表χ 4周期間斷給藥，治療在第11天結(jié)束，在第16天重新開(kāi)始，在第18天結(jié)束，在第23天重新 開(kāi)始，在第25天結(jié)束，在第30天重新開(kāi)始，并且最后在第32天結(jié)束。在第一組合組(見(jiàn)表 2Β，組7)，同時(shí)給予每日化合物(1)與q3d吉西他濱總共4周。對(duì)于其余的組合組，化合物 (1)和吉西他濱順序地給予而不是同時(shí)給予。在組8中(見(jiàn)表2B)，吉西他濱在第1周和第 3周q3d給藥，而化合物(1)僅在第2周和第4周每日給予。在組9中，化合物給藥的順序 相反，化合物(1)混懸液在第1周和第3周每日給予，而吉西他濱在第2周和第4周q3d給 予。在組10中(見(jiàn)表2B)，吉西他濱在第1周和第2周q3d給予，而化合物(1)今在第3周 和第4周每日給予。在組11中，化合物給藥的順序相反，化合物(1)在第1周和第2周每 日給予，而吉西他濱在第3周和第4周q3d給予。當(dāng)終止治療時(shí)，在所有三種研究中，在另外的隨訪期間用卡鉗測(cè)量荷瘤小鼠，以評(píng) 估腫瘤的再生長(zhǎng)。對(duì)于MiaPaCa2研究，隨訪期間持續(xù)至第63天(治療后26天)，對(duì)于AsPCl 至第48天(治療后11天)，并且對(duì)于BxPC3至第50天(治療后15天)。計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析體重減少使用下式以平均組體重變化百分?jǐn)?shù)繪圖表示=((W-Wci)ZX)XIOO,其中 ‘W’表示在具體某一天治療組的平均體重，%’表示同一治療組在治療開(kāi)始時(shí)的平均體重。 最大體重減少也使用上式表示，并且表示在關(guān)于具體某一組的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的任意時(shí)間 觀察到的最大體重減少百分?jǐn)?shù)。在給定組中，定義毒性為> 20%的小鼠表現(xiàn)出> 20%的體 重減少和/或死亡率。功效數(shù)據(jù)以平均腫瘤體積+平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)繪圖表示。治療組的腫瘤體 積利用下式表示為對(duì)照組的腫瘤體積的百分?jǐn)?shù)(％T/c) =IOOx(CT-Ttl)/(C-Ctl)),其中T表 示治療組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中具體某一天的平均腫瘤體積，T0表示同一治療組在治療的第一天的 平均腫瘤體積；C表示對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中具體某一天的平均腫瘤體積，Ctl表示同一治療 組在治療的第一天的平均腫瘤體積。使用橢圓體式計(jì)算腫瘤體積(單位為立方毫米)(Dx(d2))/2，其中‘D’表示腫瘤的大直徑，‘d’表示小直徑。在一些情形中，使用下式計(jì)算腫 瘤消退和/或腫瘤體積的百分?jǐn)?shù)改變=((T-Ttl)ZTtl)xIOO,其中‘T’表示治療組在具體某一 天的平均腫瘤體積，‘IV表示同一治療組在開(kāi)始治療時(shí)的平均腫瘤體積。通過(guò)秩和檢驗(yàn)和 單向 Anova 禾口 post-hoc Bonferroni t_ 檢驗(yàn)(SigmaStat,版本 2. O, Jandel Scientific, San Francisco, CA)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。當(dāng)概率值(ρ) ( 0. 05時(shí)，認(rèn)為組間差異是顯著的。對(duì)于存活評(píng)估，結(jié)果以存活百分?jǐn)?shù)針對(duì)腫瘤植入后的天數(shù)繪圖(Stat View, SAS Institute, Cary NC)。以100 χ [(治療組的中值存活天數(shù)-對(duì)照組的中值存活天數(shù))/對(duì)照 組的中值存活天數(shù)]計(jì)算％ ILS。中值存活使用Kaplan Meier存活分析確定。利用對(duì)數(shù)排列 檢驗(yàn)(log-rank test)比較治療組的存活與賦形劑組，并且通過(guò)Breslow-Gehan-Wilcoxon 檢驗(yàn)(Stat View, SAS, Cary, NC)分析組間存活比較。當(dāng)概率值(P) ( 0. 05時(shí)，認(rèn)為組間 差異是顯著的。結(jié)果毒件在所有三種研究(MiaPaCa2，AsPCl，和BxPC3)中，所有劑量和時(shí)間表的、單獨(dú)或組 合給予的化合物(1)或吉西他濱得到很好地耐受，其定義為< 20%的動(dòng)物表現(xiàn)出> 20% 的體重減少、死亡率或死亡。在MiaPaca2研究中，在60mg/kg q3d吉西他濱和30mg/kg 7+/7-/7+化合物(1)組的每一組中各有一只小鼠由于錯(cuò)誤給藥而死亡。在AsPCl研究中， 在90mg/kg吉西他濱單一藥劑組中有一只小鼠在第22天由于> 20%的體重減少而被處死， 由于在一周過(guò)程中進(jìn)展性的體重減少，其被認(rèn)為是毒性相關(guān)的。在BxPC3研究中，10mg/kg qd組中有一只小鼠在研究的最后一天表現(xiàn)出> 20%的體重減少(bwl)，由于該小鼠在研究 的最后幾周過(guò)程中表現(xiàn)出進(jìn)展性的體重減少，其也被認(rèn)為是毒性相關(guān)的.當(dāng)向攜帶MiaPaCa2人胰腺癌異種移植物的小鼠施用化合物(1)時(shí)，不管劑量 或時(shí)間表，單獨(dú)的還是與吉西他濱組合，不能獲得生物學(xué)顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制(TGI)(由 NCI ^60% TGI定義)[11]。當(dāng)與賦形劑治療的對(duì)照相比較時(shí)，向攜帶MiaPaCa2異種移植 物的裸鼠21天連續(xù)施用(qd)化合物(1)導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的、而非生物學(xué)顯著的腫瘤生長(zhǎng) 抑制(TGI)。在qd組之間，觀察到劑量響應(yīng)，其中與賦形劑治療相比較，lmg/kg導(dǎo)致39% 的 TGI (ρ = 0. 002)，3mg/kg 產(chǎn)生 42 % 的 TGI (ρ = 0. 002)，并且 10mg/kg 抑制腫瘤生長(zhǎng) 53 % (pSO.OOl)。在按照7+/7-/7+天的時(shí)間表(第1周和第3周每日給藥)間斷施用化合物 (1)的組中，所有三種劑量表現(xiàn)出相似的非生物學(xué)顯著的生長(zhǎng)抑制，這表明使用該時(shí)間表缺 少劑量響應(yīng)。最高劑量60mg/kg抑制腫瘤生長(zhǎng)48% (ρ彡0.001)，而化合物(1)的10mg/kg 和30mg/kg劑量分別導(dǎo)致51% TGI (ρ ( 0. 001)和58% TGI (ρ ( 0.001)。當(dāng)吉西他濱以 60mg/kgq3d施用時(shí)，與賦形劑治療的對(duì)照相比較，觀察到62% TGI (ρ彡0. 001)。在組合組 中，抗腫瘤活性既不是生物學(xué)顯著性的，也不統(tǒng)計(jì)學(xué)不同于各自化合物(1)的單一治療組， 在吉西他濱加化合物(l)10mg/kg或30mg/kg7+/7-/7+組中，具有57%或54%的TGI。在 停止治療后，在26天的隨訪期間(至第63天)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。在第63天，關(guān)于所有組的 TGI值低于第37天的，這表明MiaPaCa2腫瘤在治療后繼續(xù)生長(zhǎng)。與MiaPaCa2研究相似，當(dāng)向攜帶AsPCl人胰腺癌異種移植物的小鼠施用作為單 一治療的化合物(1)時(shí)，不管劑量或時(shí)間表，不能獲得生物學(xué)顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制。在另一方面，當(dāng)與吉西他濱組合給予化合物(1)時(shí)，在同時(shí)給予兩種藥物時(shí)，或在首先給予吉西 他濱兩周的順序給予時(shí)，獲得生物學(xué)顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制。當(dāng)與賦形劑治療的對(duì)照相比較 時(shí)，向攜帶AsPCl異種移植物的裸鼠連續(xù)28天施用(qd)化合物(1)導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的、 而非生物學(xué)顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制(TGI)。與賦形劑治療的小鼠相比較，以3mg/kg和IOmg/ kg qd 的劑量，分別觀察到 49% (ρ = 0. 004)和 58% 的 TGI (ρ = 0. 004)。當(dāng)間斷(3+/4_χ4 周期或7+/7-Χ2周期)給藥化合物(1) (10mg/kg)時(shí)，與連續(xù)每日給藥相比較，抗腫瘤活性 降低(TGI分別為32%和41%)。在AsPCl胰腺模型中，與賦形劑對(duì)照相比較，以90mg/kg q3d給藥的吉西他濱表現(xiàn)出非常少的抗腫瘤活性，TGI僅為39% (ρ = 0. 016)。相反，當(dāng) 化合物(1)與吉西他濱組合同時(shí)施用時(shí)，觀察到對(duì)抗腫瘤活性的增強(qiáng)的作用，具有77%的 TGI (ρ ( 0. 001)。這一結(jié)果與吉西他濱單一治療組相比是生物學(xué)顯著性和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的 (P = 0.005)，但與化合物(1)單一治療組相比不是(ρ = 0.251)。在每周順序組合組中， 盡管在化合物(1)之前施用吉西他濱對(duì)AsPCl腫瘤生長(zhǎng)的抑制優(yōu)于相反順序，(58% TGI, P^O. 001相對(duì)于37%，ρ = 0. 012)，但是結(jié)果都不是生物學(xué)顯著的。在兩周順序組合組中， 在化合物(1)之前施用吉西他濱對(duì)AsPCl腫瘤生長(zhǎng)的抑制同樣優(yōu)于相反順序，然而，在這一 情形中，抗腫瘤活性是生物學(xué)顯著的，70% TGI (ρ ^ 0. 001)相對(duì)于55% TGI (p ^ 0. 001)。 在停止治療后監(jiān)測(cè)AsPCl腫瘤生長(zhǎng)持續(xù)11天(至第48天)。在第48天，所有組的TGI值 低于第37天的，這表明AsPCl腫瘤在治療后繼續(xù)生長(zhǎng)。與在MiaPaCa2和AsPCl胰腺異種移植物模型中缺少由化合物(1)單一治療引 發(fā)的強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)抑制相反，BxPC3胰腺異種移植物模型對(duì)化合物(1)介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制敏 感。與賦形劑對(duì)照相比較，施用3mg/kg和10mg/kg的化合物(1)以劑量依賴性方式顯著 抑制BxPC3腫瘤生長(zhǎng)(生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)上)，分別具有72% (ρ <0.001)和82%的TGI (ρ <0. 001)。相似地，大部分間斷給藥組也產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物學(xué)顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制，盡管觀 察到缺少劑量響應(yīng)。當(dāng)化合物(1)使用7+/7_時(shí)間表給藥時(shí)，與賦形劑治療的對(duì)照小鼠相 比較，10mg/kg 和 20mg/kg 的劑量分別產(chǎn)生 74% (ρ ( 0. 001)和 63% 的 TGI (ρ = 0. 002)。 化合物(1)還使用3+/4_時(shí)間表給藥，其中10mg/kg，23mg/kg，和30mg/kg的劑量分別抑制 腫瘤生長(zhǎng)56% (ρ = 0. 002), 64% (ρ < 0. 001)，和50% (ρ = 0. 024)。在治療停止后監(jiān)測(cè) BxPC3腫瘤生長(zhǎng)持續(xù)15天(至第50天)。在第50天，每日給藥組的TGI值與第35天的相 似，這表明化合物(1)在BxPC3胰腺模型中引發(fā)持續(xù)的腫瘤生長(zhǎng)抑制。Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑已經(jīng)參與胰腺癌的發(fā)病機(jī)理。在本研究中，對(duì)攜帶sc建立的 MiaPaca2，AsPCl或BxPC3胰腺腫瘤的小鼠每日口服施用單獨(dú)的或與吉西他濱組合的、分 泌酶抑制劑(化合物1)至多4周。在所述三種胰腺腫瘤模型中的一種中，作為單一治療的 化合物(1)引發(fā)生物學(xué)顯著的抗腫瘤活性(由NCI > 60% TGI定義)。BxPC3模型對(duì)化合物 (1)介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制敏感，不管化合物是每日施用的還是使用7+/7_或3+/4_時(shí)間表間斷 施用的。當(dāng)化合物(1)每日給藥時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制的程度取決于劑量，而當(dāng)以間斷時(shí)間表給 藥時(shí)，抗腫瘤活性似乎不依賴于劑量。當(dāng)比較按照不同給藥時(shí)間表每月給予的藥物總量時(shí)， 每日給藥產(chǎn)生較好的功效。例如，當(dāng)總的月劑量280mg/kg分成qd給予10mg/kg、7+/7_給 予10mg/kg、或3+/4_給予23mg/kg的時(shí)間表時(shí)，每日給藥的抗腫瘤活性是較好的(分別為 82%相對(duì)于63%或64%的TGI)。在停止治療后監(jiān)測(cè)BxPC3腫瘤生長(zhǎng)持續(xù)15天，在這一時(shí) 間過(guò)程中，每日給藥組的TGI值保持穩(wěn)定，這表明化合物(1)在BxPC3胰腺模型中引發(fā)持續(xù)的腫瘤生長(zhǎng)抑制。盡管化合物(1)作為單一治療在MiaPaCa2或AsPCl胰腺腫瘤模型中不產(chǎn)生生物 學(xué)顯著的功效，但是當(dāng)在AsPCl模型中組合給予時(shí)，其的確增強(qiáng)吉西他濱的抗腫瘤活性。 10mg/kg qd化合物(1)加同時(shí)q3d給予的90mg/kg吉西他濱的組合產(chǎn)生77%的TGI，而化 合物(1)或吉西他濱單一治療分別產(chǎn)生58%或39%的TGI。當(dāng)化合物(1)和吉西他濱組合 順序給予而不是同時(shí)給予時(shí)，僅在化合物(1)之前給予吉西他濱的兩周順序組合產(chǎn)生生物 學(xué)顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制，觀察到70%的TGI。另一方面，當(dāng)這兩種藥物以相反順序給予時(shí)， 僅觀察到55%的TGI。盡管BxPC3，MiaPaca2，和AsPCl胰腺腫瘤模型在其Notch受體、配體、和下游靶 標(biāo)的表達(dá)中是不同的，沒(méi)有明顯的區(qū)別可能易于與其對(duì)Y分泌酶抑制劑的敏感性相關(guān)。 例如，所有三種細(xì)胞系表達(dá)低水平的Notch-1，BxPC3和AsPCl表達(dá)低水平的Notch_2，而 MiaPaca2表達(dá)非常高水平的Notch_2，并且還是表達(dá)Notch 3和4的唯一的細(xì)胞系[12]。 所有三種細(xì)胞系表達(dá)配體Jagged-Ι，其中AsPCl細(xì)胞表達(dá)最高水平，其次是BxPC3，并且 MiaPaca2表達(dá)最低水平。配體Jagged_2和δ-1在BxPC3和MiaPaca2細(xì)胞中表達(dá)，但不在 AsPCl細(xì)胞中表達(dá)[12]。盡管在參考文獻(xiàn)中存在一些數(shù)據(jù)表明激活K-Ras中的突變可以與 轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的Notch協(xié)作，但是在本研究中，對(duì)g分泌酶介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制敏感的唯一的腫瘤 模型關(guān)于K-Ras是野生型的(BxPC3)。在本體內(nèi)研究中，表明化合物(1)在一些胰腺腫瘤模型中作為單一治療或與吉西 他濱組合可以有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)，然而，對(duì)模型之間不同敏感性的機(jī)制的理解還很少。盡管已經(jīng)描述了多個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案，明顯的是，可以在不背離本發(fā)明的精神 和范圍的條件下改變基本結(jié)構(gòu)，從而提供利用本發(fā)明的其它實(shí)施方案。所有這樣的修改和 改變意欲被包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍是在后附的權(quán)利要求中限定的，而不是 在通過(guò)舉例方式描述的具體實(shí)施方案中限定的。
權(quán)利要求
化合物(1)或其藥用鹽用于制備治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥物的應(yīng)用。FPA00001178459900011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述治療包括施用約400ng-hr/ml-約 9000ng-hr/ml的治療有效量的化合物(1)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述化合物(1)的治療有效量為約llOOng-hr/ ml-約 4100ng-hr/mlo
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述化合物(1)的治療有效量為約1380ng-hr/ ml-約 2330ng-hr/mlo
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述化合物(1)的治療有效量為約400ng-hr/ ml-約9000ng-hr/ml，其在至多約21天的時(shí)期內(nèi)施用。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述化合物(1)的治療有效量為約llOOng-hr/ ml-約4100ng-hr/ml，其在至多約21天的時(shí)期內(nèi)施用。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述化合物(1)的治療有效量為約1380ng-hr/ ml-約2330ng-hr/ml，其在至多約21天的時(shí)期內(nèi)施用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10 天每天施用一次。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10 天以約400ng-hr/ml-約9000ng_hr/ml的量每天施用一次。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中化合物(1)在21天周期中的第1-7天每天施用一次。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其中化合物(1)在21天周期的第1-7天以約 400ng-hr/ml-約 9000ng_hr/ml 的量每天施用一次。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中化合物(1)以藥物口服單位劑型存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其包括另外對(duì)患者進(jìn)行放射治療。
14.式(1)的化合物 或其藥用鹽用于制備治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥物的應(yīng)用，其中所述治療包括在21 天周期中的第1，2，3，8，9和10天以約400ng-hr/ml-約9000ng_hr/ml的量每天施用化合 物⑴一次。
15.式(1)的化合物 或其藥用鹽用于制備治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥物的應(yīng)用，其中所述治療包括在21 天周期中的第1-7天以約400ng-hr/ml-約9000ng-hr/ml的量每天施用化合物(1) 一次。
16.用于制備目的是用于治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥物的方法，所述方法特征在于，以
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述化合物(1)的治療有效量為約400ng-hr/ ml-約 9000ng-hr/ml。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述化合物(1)的治療有效量為約llOOng-hr/ ml-約 4100ng-hr/mlo
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述化合物(1)的治療有效量為約1380ng-hr/ml-約 2330ng-hr/mlo
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述化合物(1)的治療有效量為約400ng-hr/ ml-約9000ng-hr/ml，其在至多約21天的時(shí)期內(nèi)施用。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述化合物(1)的治療有效量為約llOOng-hr/ ml-約4100ng-hr/ml，其在至多約21天的時(shí)期內(nèi)施用。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述化合物(1)的治療有效量為約1380ng-hr/ ml-約2330ng-hr/ml，其在至多約21天的時(shí)期內(nèi)施用。
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中化合物(1)在21天的周期中的第1，2，3，8，9和 10天每天施用一次。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和 10天以約400ng-hr/ml-約9000ng_hr/ml的量每天施用一次。
25.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中化合物(1)在21天周期中的第1-7天每天施用一次。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中化合物(1)在21天周期中的第1-7天以約 400ng-hr/ml-約 9000ng_hr/ml 的量每天施用一次。
27.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中化合物(1)以藥物口服單位劑型存在。
28.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其包括另外使患者進(jìn)行放射治療。
29.用于制備目的用于治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥物的方法，其特征在于，式(1)的化合物 或其藥用鹽，在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以約400ng-hr/ml-約9000ng-hr/ ml的量每天使用一次。
30.用于制備目的用于治療癌癥特別是實(shí)體瘤的藥物的方法，其特征在于，式(1)的化合物 或其藥用鹽，在21天周期中的第1-7天以約400ng-hr/ml-約9000ng-hr/ml的量每天使用一次。
31. 一種試劑盒，其包括一種以上口服單位劑型，每一單位包含約3mg-約300mg化合物 (1)，或其藥用鹽，所述化合物(1)具有下式
32.權(quán)利要求31的試劑盒，其中所述口服單位劑型包含足夠數(shù)量的單位，使得足以可 以在約21天的時(shí)期內(nèi)每天給患者施用約300mg的化合物(1)、或其藥用鹽。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)所述的方法和應(yīng)用，其中所述化合物(1)與治療有效 量的吉西他濱組合使用。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法和應(yīng)用，其用于治療胰腺癌。
35.基本如前文所述的新型方法和應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療癌癥患者的方法，所述方法包括給所述患者施用治療有效量的化合物(1)，或其藥用鹽，該化合物(1)具有下式本發(fā)明還提供包含上述化合物的試劑盒，以及化合物(1)用于制備治療癌癥的藥物的應(yīng)用，所述藥物按照本文具體公開(kāi)的劑量和時(shí)間表治療癌癥。
文檔編號(hào)A61K31/55GK101909633SQ200980101733
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月11日
發(fā)明者凱瑟琳·E·帕克曼, 約翰·弗雷德里克·博伊蘭, 萊奧波爾多·拉多里斯·盧斯特羅三世 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司