專利名稱：：慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過慢病毒基因轉(zhuǎn)移治療遺傳性或增生性失明癥的新方法。因此，本發(fā)明包括攜帶編碼有助于治療這種疾病的基因的DNA序列的慢病毒載體。例子包括但不限于以上討論的外周蛋白基因，組成型活化形式的rb基因和各種治療性基因。本發(fā)明涉及抑制眼病患者中眼內(nèi)細(xì)胞增殖的方法，此方法包括給予所述患者藥理學(xué)上有效量含有抑制眼內(nèi)細(xì)胞增殖的治療性基因的的慢病毒載體。采用本發(fā)明方法可治療的眼病的代表性例子包括老年相關(guān)性黃斑退變、增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、青光眼和增生性玻璃體視網(wǎng)膜病。該治療性基因可能是組成型活化形式的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因、P16基因或P21基因。優(yōu)選地，在囊、玻璃體或視網(wǎng)膜下間隙內(nèi)，以約106_109轉(zhuǎn)導(dǎo)單位劑量給與該慢病毒載體。本發(fā)明還涉及抑制眼病患者眼內(nèi)新血管形成的方法，此方法包括給予所述患者含藥理學(xué)上有效量的有抑制眼內(nèi)新血管形成的治療性基因的慢病毒載體的步驟。采用本發(fā)明方法可治療的眼病的代表性例子包括老年相關(guān)性黃斑退變、增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、青光眼和增生性玻璃體視網(wǎng)膜病。該治療性基因可以是調(diào)節(jié)血管生成或細(xì)胞凋亡的基因。調(diào)節(jié)血管生成的基因通常包括編碼金屬蛋白酶的組織抑制劑(TMP)-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、內(nèi)皮生長抑素、血管生長抑素、內(nèi)皮生長抑素XVIII、內(nèi)皮生長抑素XV、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的C-末端血色素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域、人纖溶酶原的Kringle5結(jié)構(gòu)域、內(nèi)皮生長抑素和血管生長抑素的融合蛋白、內(nèi)皮生長抑素和人纖溶酶原Kringle5結(jié)構(gòu)域的融合蛋白、r-干擾素誘導(dǎo)的單核因子(Mig)、a-干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP10)、Mig和IP10的融合蛋白、可溶性FLT-1(fms樣酪氨酸激酶1受體)，和激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(KDR)的基因，而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的基因包括編碼BCl-2、Bad、Bak、Bax、Bik、Bcl-X短同種型和Gax。優(yōu)選在囊、玻璃體或視網(wǎng)膜下間隙間，以約106-109轉(zhuǎn)導(dǎo)單位劑量給與此慢病毒載體。以下給出的例子是為了說明本發(fā)明的各種實施例，不意味以任何方式限制本發(fā)明。實施例1細(xì)胞和組織建立了人脈絡(luò)膜成纖維細(xì)胞(HCF)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(HRPE)的原代外植體，并置于促進(jìn)或不促進(jìn)有絲分裂活動的條件中。還培養(yǎng)了穩(wěn)定的光感受器衍生的細(xì)胞(Y-79和Weri-Rb-l)。在摘除視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤時得到的人視網(wǎng)膜和RPE，用來證明慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)這些有絲分裂無能細(xì)胞和誘導(dǎo)外源性人外周蛋白轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。在角膜移植手術(shù)時得到的人角膜，用來證明慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)這些具有標(biāo)記基因增強的綠色熒光蛋白基因的有絲分裂無能細(xì)胞的能力。實施例2慢病毒載體用水泡性口炎病毒(VSV)包膜偽裝配了三種以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的慢病毒載體系統(tǒng)，其含有綠色熒光蛋白(GFP)基因用作標(biāo)記(圖1)。如Naldini等所述產(chǎn)生了重組慢病毒。巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因啟動子指導(dǎo)eGFP在質(zhì)粒KlR'-CMV-eGFP中的表達(dá)。病毒的貯存物接以下方法產(chǎn)生。將人腎293T細(xì)胞(5X106)接種于10cm平板上，次日用10ygpCMVAR8.91(包裝功能質(zhì)粒)、10iigpHR2-CMV-eGFP(標(biāo)記基因質(zhì)粒)和2ygpMD.G(含VSV-G包膜的質(zhì)粒)在D10生長培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM)和抗生素中用磷酸鈣沉淀進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。37°C、12-16小時后，移去培養(yǎng)基并加入新鮮的DIO生長培養(yǎng)基。細(xì)胞再培養(yǎng)10小時。細(xì)胞中加入含10mM丁酸鈉和20mMH印es緩沖劑的新鮮D10培養(yǎng)基，細(xì)胞再培養(yǎng)12小時。用含20mMH印es緩沖劑的新鮮D10培養(yǎng)基替換此培養(yǎng)基，12小時后收集含病毒的培養(yǎng)基。加入新鮮培養(yǎng)基，4天后每24小時收集上清液。收集后的病毒上清液立即貯存于-8(TC。上清液于室溫超離心(19，OOOrpm，BechmanSW28轉(zhuǎn)頭)140分鐘，濃縮病毒貯存物，將得到的病毒沉淀重懸于l-3ml磷酸緩沖鹽溶液中。用293T細(xì)胞滴定等份的病毒貯存物，剩余的樣品貯存于-80°C。通過感染經(jīng)植物凝集素剌激的人外周血單個核細(xì)胞來測定所有慢病毒載體上清液存在有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)，隨后用ELISA分析培養(yǎng)基的p24gag。在產(chǎn)生的任何病毒上清液中末檢測到RCR。實施例3'瞎驢謝本鮮用上述慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生含2X106復(fù)制-缺損型慢病毒顆粒/毫升的上清液。細(xì)胞與病毒顆粒培養(yǎng)24小時，然后在用熒光激活細(xì)胞分選測定GFP表達(dá)之前，在正常培養(yǎng)基中恢復(fù)4天(圖2-3)。測定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率作為感染復(fù)數(shù)(MOI)范圍1-1000的函數(shù)。許多人細(xì)胞系的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)果證明MOI和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率之間為正相關(guān)，慢病毒顆粒的數(shù)量愈增加，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞愈多(圖2)。檢測了慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞的能力。用慢病毒或鼠白血病病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)了人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。在接觸載體時細(xì)胞是有絲分裂無能(匯合)或有絲分裂活躍的(生長)。圖4所示結(jié)果表明，慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞的能力優(yōu)于其它逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。與非慢病毒逆轉(zhuǎn)病毒載體相比，慢病毒載體在轉(zhuǎn)導(dǎo)人胎兒細(xì)胞中也是高度有效的(圖6)。為了測定eGFP轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持續(xù)時間，在120天中測試了慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。對轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的克隆群體進(jìn)行Southern印跡分析的結(jié)果表明，慢病毒-eGFP載體已整合入宿主基因組中(圖5B)。整合的eGFP轉(zhuǎn)基因的表達(dá)穩(wěn)定120天以上，且對被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞無選擇性優(yōu)點或抵抗(圖5A)。實施例4原位角膜轉(zhuǎn)導(dǎo)在角膜移植手術(shù)時得到的人角膜紐狀體用來證明慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)這些具有標(biāo)記基因增強的綠色熒光蛋白基因的有絲分裂無能細(xì)胞的能力(圖7)。在遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)導(dǎo)的角膜組織處剝下附著于德期密膜的內(nèi)皮細(xì)胞，并用光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡檢查。角膜內(nèi)皮為eGFP陽性，表明基因轉(zhuǎn)移有效和獲得表達(dá)(圖7B)。還觀察到在上皮層中原位轉(zhuǎn)導(dǎo)和eGFP表達(dá)有效(圖7C)。總之，這些結(jié)果表明復(fù)制缺損型慢病毒載體能有效地將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到人角膜內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中，并獲得長期轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此載體可用于治療角膜內(nèi)皮或上皮疾患和移植前用于液體外修飾來供體角膜組織的遺傳組成，以這樣的方式永久地調(diào)節(jié)同種異體移植排斥的過程。實施例5目艮腫,翩衩翻細(xì)鮒人外周蛋白基因用作治療性基因的一個實施例。已知人體內(nèi)外周蛋白基因的遺傳缺損可產(chǎn)生多種多樣的殘疾表型。使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤摘除時手術(shù)切除的正常視網(wǎng)膜或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)組織接觸缺乏治療性基因或含有人外周蛋白基因的慢病毒載體。圖8中的結(jié)果表明通過慢病毒載體外周蛋白基因被有效地轉(zhuǎn)移到人視網(wǎng)膜組織中。作為治療性基因轉(zhuǎn)移的另一實施例，采用了組成型活化形式的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因(CA-rb)。本文披露的慢病毒載體介導(dǎo)了該組成型活化形式的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因的有效轉(zhuǎn)移(圖9)。轉(zhuǎn)移的CA-rb基因顯示對人視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜細(xì)胞(圖10)和人晶狀體上皮細(xì)胞(圖11)的增值的劑量依賴性抑制作用。慢病毒載體轉(zhuǎn)移的組成型活化形式的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因，還能抑制體內(nèi)眼內(nèi)細(xì)胞的增殖。在體內(nèi)測試了兩種模型的眼內(nèi)增生性疾病(增生性玻璃體視網(wǎng)膜病和晶狀體摘除術(shù)后后囊渾濁)。在3組家兔中誘發(fā)了增生性玻璃體視網(wǎng)膜病(圖12)。一組末治療，一組用缺乏CD-rb基因的慢病毒載體治療，最后一組用玻璃體內(nèi)遞送的慢病毒CA-rb治療。在前兩組中注意到增生性玻璃體視網(wǎng)膜病和視網(wǎng)膜剝脫頻率高(>90%)，而在用CA-rb治療的組中，視網(wǎng)膜剝脫的動物百分率明顯較低(26%)。圖13顯示的結(jié)果表明，體內(nèi)慢病毒CA-rb對晶狀體摘除術(shù)后后囊渾濁的過程有抑制作用。對3組家兔進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的晶狀體乳化以摘除天然晶狀體。第1組(組1)接著不作任何治療，另2組用空的慢病毒構(gòu)建物治療(無治療性基因，組2)或在白內(nèi)障傷口縫合時將慢病毒CA-rb(組3)遞送入完整的晶狀體囊袋中。逐次檢查動物后囊渾濁的存在。對存在的渾濁以1-5標(biāo)度分級，1代表無渾濁，5代表渾濁嚴(yán)重足以妨礙用間接雙目檢查用眼鏡看見視網(wǎng)膜。組1和組2(末處理和空載體)之間沒有獲得統(tǒng)計學(xué)上不同的結(jié)果，而觀察到慢病毒CA-rb對后囊渾濁的產(chǎn)生有顯著的抑制作下用。截止第28天，對照動物的平均渾濁評分為4.4，而用慢病毒CA-rb治療的動物的平均渾濁得評為2.1。實施例6"雙基因"慢病毒構(gòu)建了在兩個克隆位點之間摻入IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點)元件的一種新的慢病毒載體。IRES元件允許mRNA-核糖體結(jié)合和蛋白質(zhì)合成。此主鏈可容納兩種不同的可表達(dá)基因。但在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中產(chǎn)生單一信息，系IRES元件所致，所以該信息在功能上是雙順反子的，并可驅(qū)動兩種不同蛋白質(zhì)的合成。用這種方式，可將上述每種潛在的治療性基因與一標(biāo)記基因(如增強的綠色熒光基因-eGFP基因)連接，這樣轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞將同時被標(biāo)記，并能表達(dá)感興趣的治療性基因。標(biāo)記的細(xì)胞易于體外分離和體內(nèi)觀察。圖15-31顯示一些攜帶各種治療性基因的慢病毒載體的基因圖譜。因為近年來遺傳工程和克隆領(lǐng)域中的普通科學(xué)家的總體技術(shù)水平有顯著提高，所以此領(lǐng)域中普通技術(shù)人員能夠不難地構(gòu)建含有感興趣的其它治療性基因的慢病毒載體。實施例7抗新血管形成的某因治療使天然細(xì)胞(已知不表達(dá)治療性基因的細(xì)胞)接觸上述慢病毒載體24小時。接觸2天后，從這些細(xì)胞中分離RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄酶輔助的聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測試轉(zhuǎn)基因17的表達(dá)。圖32顯示從人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞中分離的mRNA的內(nèi)皮生長抑素-18/血管生長抑素融合基因的陽性RT-PCR產(chǎn)物。證明了以上所示的體外慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移后，然后檢測其抑制體內(nèi)新血管形成的能力。用以下方式誘發(fā)兔角膜組織中的新血管形成爐緒力,i、劍勺^禾口雜'瞎驢白勺尼掘mA用異氟醚(4升/分鐘)和氧(2升/分鐘)通過面罩麻醉家兔。將一滴丙美卡因置于大腦彎窿中用于局部麻醉。異氟醚減少到2.5升/分鐘。將貝塔定(Betadine)置于大腦彎窿中30秒，用BBS(平衡鹽溶液，Alcon公司)淋洗。將眼瞼窺鏡置于眼中。在12點鐘2.8mm微角膜刀用來進(jìn)入角膜間質(zhì)。用Mcpherson鉗將此間質(zhì)內(nèi)切口擴成5X5mm的間質(zhì)袋，并用Iris掃描儀來回掃描。在兩側(cè)之一撐開12點鐘切口，用Va皿as剪刀作4.5mm開口。將浸有10ul慢病毒的4X4Amersham雜交尼龍網(wǎng)(AmershamBioscientistRPN2519)插入事先形成的袋中。將一滴妥布霉素滴于角膜上。停止異氟醚，鼻給氧增加到4升/分鐘。這樣20分鐘后家兔成功地解除全身麻醉，送回具有正常生活功能的籠內(nèi)給家兔子每日兩次皮下注射0.2cc丁丙諾啡(buprenex)(0.3mg/cc)2天，用于鎮(zhèn)痛。家兔還接受一滴阿托品和一滴妥布霉素2天，用于術(shù)后睫狀肌麻痹和抗生素治療。術(shù)后第l天，每只家兔接受一滴局部丙美卡因麻醉，用O.12鉗從角膜間質(zhì)內(nèi)袋中取出尼龍網(wǎng)。在兩周后每天監(jiān)測術(shù)后疼痛控制和護(hù)理。堿遊隨血，艦最初手術(shù)后兩周，使角膜接觸浸有20OMNaOH的6mmWhatman#3濾紙圓片1分鐘。所有角膜用BSS充分洗滌。家兔接受一滴阿托品和一滴妥布霉素2天，用于術(shù)后睫狀肌麻醉和抗生素治療。進(jìn)行數(shù)字文件照相記錄新血管反應(yīng)。用裂縫燈檢查測量新血管反應(yīng)，在創(chuàng)傷后第1、3、5、7和10天記錄鐘點時間和血管的長度。通過如下所述的計算血管生長面積來定量測定新血管形成。就評價角膜新血管形成的標(biāo)準(zhǔn)方法而言，設(shè)計了以下方案和公式來記錄和比較堿灼傷后的新血管形成。新血管形成的面積的公式是這樣得出的計算以半徑RT為邊界的較大扇形面積，減去以被半徑R2為邊界的較小扇形面積。以半徑RT為邊界的較大扇形面積是鐘點時間數(shù)除以12，并乘以jiRT2。以半徑R2為邊界的較小扇形面積是鐘點時間除以12，再乘以Ji(R2)2。兩個扇形相減所得面積即是新血管形成的面積。進(jìn)行了共焦顯微鏡觀察以記錄增強的綠色熒光蛋白，包含在慢病毒雙順反子信息中的標(biāo)記基因的表達(dá)。圖33顯示，證明在用慢病毒載體治療的動物角膜小袋內(nèi)存在eGFP的顯微照相。為了證明對新血管形成的抑制作用，如上述在動物中誘導(dǎo)新血管形成。用含Mig/IP10融合基因的慢病毒載體治療后，觀察到了抑制作用(圖34)。如表l所示，在用Mig/IP10融合基因或用慢病毒轉(zhuǎn)移的Kringle1_5基因治療的動物中，觀察到新血管形成明顯減少。表1慢病毒基因轉(zhuǎn)移后新血管形成的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本用引用下列參考文獻(xiàn)Naldini等;(1996)Science272:263-267Miyoshi等;(1997)Pro.Natl.Acad.Sci.USA94:10319-10323。本說明書中提及的任何專利和出版物表示與發(fā)明有關(guān)的領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員的水平。此外，本文在相同程度上納入這些專利和出版物作為參考，各單獨的出版物是特別地和逐一指明有待納入作為參考。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員容易理解的是，本發(fā)明很適合實現(xiàn)目的和獲得提及的結(jié)果和優(yōu)點，以及本文原有的那些目的、結(jié)果和優(yōu)點。本實施例與本文描述的方法、步驟、治療、分子和特定化合物同時是優(yōu)選實施例的代表，是示范性例子，不意味限制發(fā)明的范圍。如權(quán)利要求范圍限定的那樣，在本發(fā)明的思路內(nèi)，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可對其中內(nèi)容和其它用途作修改。權(quán)利要求用于治療患者中角膜疾病的組合物，其特征在于，含有藥物學(xué)上有效量的重組慢病毒載體，所述慢病毒載體含有第一治療性基因。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述角膜疾病是與角膜新血管生成有關(guān)的疾病。3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述角膜新血管生成是眼內(nèi)角膜新血管生成。4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述角膜疾病是堿灼傷。5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述角膜疾病是與角膜細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病。6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述患者是人。7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述治療性疾病與已知在人角膜細(xì)胞中有活性的啟動子可操縱性連接。8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述第一治療性基因編碼第一多肽，選自金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、血管生長抑素、內(nèi)皮生長抑素XVIII、內(nèi)皮生長抑素XV、Kringlel-5、PEX、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的C-末端血色素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域、人纖溶酶原的Kringle5結(jié)構(gòu)域、1-干擾素誘導(dǎo)的單核因子(Mig)、a-干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP10)、可溶性FLT-1(fms-樣酪氨酸激酶1受體)和激酶插入結(jié)構(gòu)域(KDR)。9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述重組慢病毒載體還含有第二治療性基因，其編碼抑制血管生成的第二多肽，其中所述第一治療性基因與第二治療性基因不同。10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述第一多肽和第二多肽分別選自金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)-1、TMP-2、TMP-3、TMP-4、血管生長抑素、內(nèi)皮生長抑素XVIII、內(nèi)皮生長抑素XV、Kringlel-5、PEX、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的C-末端血色素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域、人纖溶酶原的Kringle5結(jié)構(gòu)域、1-干擾素誘導(dǎo)的單核因子(Mig)、a-干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP10)、可溶性FLT-1(fms-樣酪氨酸激酶1受體)和激酶插入結(jié)構(gòu)域(KDR)。11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述第一多肽是Mig，所述第二多肽是IplO。12.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述第一多肽是內(nèi)皮生長抑素XVIII，所述第二多肽是血管生長抑素。13.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述第一多肽是內(nèi)皮生長抑素XVIII，所述第二多肽是人纖溶酶原的Kringle5結(jié)構(gòu)域。14.如權(quán)利要求IO所述的組合物，其特征在于，所述慢病毒載體在第一治療性基因與第二治療性基因之間包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)元件，從而使第一多肽和第二多肽由一個轉(zhuǎn)錄物編碼。15.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述慢病毒載體編碼含有第一多肽和第二多肽的融合蛋白。16.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，在第一多肽和第二多肽之間還含有接頭。17.如權(quán)利要求16所述的接頭是彈性蛋白肽接頭。18.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述第一治療性基因編碼選自Bcl-2、Bad、Bak、Bax、Bik、Bcl-x短同種型和Gax的第一多肽。19.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述第一治療性基因和第二治療性基因在已知在人角膜內(nèi)皮細(xì)胞中有活性的兩個獨立啟動子的控制下。20.—種角膜紐狀體，其含有用重組慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，其中所述重組慢病毒載體含有與在角膜細(xì)胞中有活性的啟動子可操縱性連接的第一治療性基因。21.如權(quán)利要求20所述的角膜紐狀體，其特征在于，所述角膜紐狀體是人角膜紐狀體。22.如權(quán)利要求18所述的角膜紐狀體，其特征在于，所述第一治療性基因編碼第一多肽，選自金屬蛋白酶的組織抑制劑(TMP)-l、TMP-2、TMP-3、TMP-4、血管生長抑素、內(nèi)皮生長抑素XVIII、內(nèi)皮生長抑素XV、Kringlel-5、PEX、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的C-末端血色素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域、人纖溶酶原的Kringle5結(jié)構(gòu)域、1-干擾素誘導(dǎo)的單核因子(Mig)、a-干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP10)、可溶性FLT-l(fms-樣酪氨酸激酶1受體)和激酶插入結(jié)構(gòu)域(KDR)。23.如權(quán)利要求20所述的角膜紐狀體，其特征在于，所述重組慢病毒載體還含有第二治療性基因，其編碼抑制血管生成的第二多肽，其中所述第一治療性基因與第二治療性基因不同。24.如權(quán)利要求23所述的角膜紐狀體，其特征在于，所述第一多肽和第二多肽分別選自金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)-l、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、血管生長抑素、內(nèi)皮生長抑素XVIII、內(nèi)皮生長抑素XV、Kringlel-5、PEX、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的C-末端血色素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域、人纖溶酶原的Kringle5結(jié)構(gòu)域、1-干擾素誘導(dǎo)的單核因子(Mig)、a-干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP10)、可溶性FLT-1(fms-樣酪氨酸激酶1受體)和激酶插入結(jié)構(gòu)域(KDR)。25.如權(quán)利要求24所述的角膜紐狀體，其特征在于，所述第一多肽是Mig，所述第二多肽是IplO。26.如權(quán)利要求24所述的角膜紐狀體，其特征在于，所述第一多肽是內(nèi)皮生長抑素XVIII，所述第二多肽是血管生長抑素。27.如權(quán)利要求24所述的角膜紐狀體，其特征在于，所述第一多肽是內(nèi)皮生長抑素XVIII，所述第二多肽是人纖溶酶原的Kringle5結(jié)構(gòu)域。28.如權(quán)利要求20所述的角膜紐狀體，其特征在于，包含轉(zhuǎn)導(dǎo)的角膜表皮細(xì)胞。29.如權(quán)利要求20所述的角膜紐狀體，其特征在于，包含轉(zhuǎn)導(dǎo)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞。30.—種原位轉(zhuǎn)導(dǎo)角膜細(xì)胞的方法，其特征在于，使角膜細(xì)胞原位與權(quán)利要求1-17任一所述的組合物接觸。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述角膜細(xì)胞是角膜表皮細(xì)胞。32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述角膜細(xì)胞是角膜內(nèi)皮細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明為遺傳和獲得性增生性眼病提供了一種人基因療法。該方法開發(fā)了慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)有絲分裂活躍和不活躍細(xì)胞的能力，因而可治療眼病。文檔編號A61P27/02GK101732731SQ20091026685公開日2010年6月16日申請日期2001年12月18日優(yōu)先權(quán)日2000年12月19日發(fā)明者B·阿普庫坦,J·T·斯托特申請人:研究發(fā)展基金會