專利名稱：：制備流感疫苗組合物的方法制備流感疫苗組合物的方法本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)PCT/US2004/005697，國(guó)際申請(qǐng)日2004年2月25日，中國(guó)國(guó)家階段申請(qǐng)?zhí)?00480011005.9，名稱“制備流感疫苗組合物的方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)的交叉參照本申請(qǐng)要求2003年2月25日提交的題為“制備流感疫苗組合物的方法(METHODSOFPRODUCINGINFLUENZAVACCINECOMPOSITIONS)”的第60/450，181號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。這個(gè)在先申請(qǐng)已被完整納入本文作為參考。
背景技術(shù)：
：制備抗不同流感病毒及其進(jìn)化株的疫苗不僅從公眾健康的角度來(lái)看是十分重要的，而且還具有巨大的商業(yè)利益，因?yàn)槊磕暧袩o(wú)數(shù)人感染不同株和不同型的流感病毒。嬰幼兒、老年人、以及那些未得到適當(dāng)健康護(hù)理和免疫缺陷的人死于這種感染的風(fēng)險(xiǎn)很高。由于流感病毒的感染問(wèn)題是因?yàn)樾滦土鞲胁《局暌子谕蛔円鸬?，因此迫切需要不斷地研發(fā)新的疫苗。在過(guò)去的50年中，能產(chǎn)生抗不同流感病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)的多種疫苗被制備出來(lái)，其中包括全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和減毒活病毒疫苗。雖然這些疫苗類型的合適制劑都可以激發(fā)系統(tǒng)免疫反應(yīng)，但是減毒活病毒疫苗具有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檫@種疫苗還可以在呼吸道內(nèi)刺激局部粘膜免疫。含減毒活病毒的疫苗還具有制備快速而經(jīng)濟(jì)、易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)膬?yōu)點(diǎn)，因此是十分適宜的疫苗。到目前為止，所有上市的流感疫苗都是在含胚雞蛋內(nèi)繁殖的。由于雞蛋的供應(yīng)必須是有組織的，制備疫苗用的病毒株在下一次流感季節(jié)到來(lái)之前幾個(gè)月就要篩選出來(lái)，因此這種制備方法的靈活性較低，常常導(dǎo)致疫苗制備和分配的延遲和疫苗短缺。因此，急需找到提高用雞蛋生產(chǎn)疫苗的效率和/或提高疫苗產(chǎn)量的方法。最近幾年有人開(kāi)發(fā)出用細(xì)胞培養(yǎng)物制備流感病毒的系統(tǒng)(見(jiàn)Furminger的“疫苗制備”(VaccineProduction),摘自Nicholson等編的《流感病毒教材》(TextbookofInfluenza)第324-332頁(yè):Merten等(1996)“在細(xì)胞培養(yǎng)物中擴(kuò)增流感病毒用于疫苗制備，，(Productionofinfluenzavirusincellculturesforvaccinepreparation),Jjt自Cohen&Shafferman編的《疫苗設(shè)計(jì)和制備新策略》(NovelstrategiesinDesignandProductionofVaccines)第141-151頁(yè))。雖然利用這些方法可以解決用雞蛋制備流感疫苗所面臨的許多困難，但是并不是所有的流感病毒致病株都可以在細(xì)胞培養(yǎng)物上良好生長(zhǎng)，或者可以用已有的組織培養(yǎng)方法制備。另外，許多具有我們所期望的特性如減毒活性、溫敏和冷適應(yīng)能力的病毒株雖然適于制備減毒活疫苗，但是根據(jù)已有的方法培養(yǎng)卻不能在組織培養(yǎng)物上成功生長(zhǎng)。因此，找到提高用細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)疫苗的效率和/或提高疫苗產(chǎn)量的方法也是急需的。本發(fā)明的發(fā)明者及其同事在擴(kuò)增用于疫苗制備的流感病毒方面作了大量的工作。見(jiàn)“制備流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)(Multi-PlasmidsystemfortheProductionofInfluenzaVirus)”，USSN60/375，675，申請(qǐng)日為2002年4月26日；USSN10/423,828，申請(qǐng)日為2003年4月25日，等等。本發(fā)明提供了改善/優(yōu)化這種用于疫苗組合物制備的病毒以及其他流感病毒生產(chǎn)(從量/質(zhì)和效率兩個(gè)方面)的方法。本發(fā)明的方法適用于傳統(tǒng)的用雞蛋制備疫苗的模式和新型的用細(xì)胞培養(yǎng)物制備疫苗的模式(以及混合系統(tǒng))，本發(fā)明的方法還有其他的多種優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)閱讀下文就會(huì)了解這些優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種或多種流感病毒組合物制備方法的實(shí)施方式，該方法包括用雞蛋將流感病毒(如A型病毒株、B型病毒株等)傳代、加熱病毒以及通過(guò)濾膜過(guò)濾病毒。在某些實(shí)施方式中，過(guò)濾是指將組合物通過(guò)一個(gè)孔徑約為0.2μm到0.45μm的微孔濾器。另夕卜，在其他的多個(gè)實(shí)施方式中，加熱溫度可以選擇為約28°C到約40°C或更高，而在另外一些實(shí)施方式中，加熱溫度為31°C或約30°C到32°C。在這些實(shí)施方式中，加熱可選擇在過(guò)濾前或過(guò)濾過(guò)程中進(jìn)行，也可以在過(guò)濾前和過(guò)濾過(guò)程中都加熱，加熱時(shí)間可選擇約50到100分鐘、約60到90分鐘、或者約60分鐘。本發(fā)明還提供了根據(jù)這種方法制備的流感病毒組合物(其中包括是疫苗組合物的組合物)。在其他方面，本發(fā)明包括制備一種或多種流感病毒組合物的方法，該方法包括用雞蛋傳代流感病毒、加熱病毒和純化病毒。這些實(shí)施方式也可以加上用濾膜過(guò)濾組合物的步驟，其中的組合物包括通過(guò)這種實(shí)施方式制備的疫苗組合物和實(shí)際應(yīng)用的疫苗組合物。在一些相關(guān)的方面，本發(fā)明包括通過(guò)在雞蛋內(nèi)傳代流感病毒來(lái)制備一種或多種流感病毒組合物的方法，該方法在傳代過(guò)程中需要搖動(dòng)雞蛋。搖動(dòng)過(guò)程可以是以每分鐘約一圈的速度轉(zhuǎn)動(dòng)雞蛋，可以連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)約12小時(shí)。這種實(shí)施方式可以使用A流感病毒株和/或B流感病毒株，其中用這種搖動(dòng)的雞蛋制備出的病毒的TCID5tl可以比用未搖動(dòng)的雞蛋制備出的同種病毒的TCID5tl高出0.41og。用這種實(shí)施方式制備出的病毒組合物也是本發(fā)明的特征，其中的組合物包括疫苗組合物。本發(fā)明還包括制備一種或多種流感病毒組合物的方法(如偏重于將這些病毒重新分類)，該方法包括將一組含流感病毒基因組的載體導(dǎo)入到一群雞蛋宿主內(nèi)(這些雞蛋可支持病毒的復(fù)制)，在低于或等于35°C的溫度下孵育雞蛋，以及收獲一批流感病毒。這種病毒還可以包括減毒病毒、冷適應(yīng)病毒、溫度敏感病毒或冷適應(yīng)的溫度敏感減毒病毒，還可以包括B型流感病毒。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方式制備出的病毒組合物也是本發(fā)明的特征(包括疫苗組合物)。本發(fā)明的這些方面還可以包括篩選含野生型HA和NA基因的流感病毒的步驟(如通過(guò)將一組病毒與一種或多種非野生型HA和NA基因的特異性抗體共孵育(例如在一個(gè)或多個(gè)雞蛋內(nèi)進(jìn)行))。根據(jù)這種方法制備出的組合物也是本發(fā)明的特征，其中包括疫苗組合物。本發(fā)明的其他方面包括制備一種或多種流感病毒組合物的方法，該方法包括將一組含流感病毒基因組的載體導(dǎo)入到一群雞蛋宿主內(nèi)(這些雞蛋可支持病毒的復(fù)制)，在低于或等于35°C的溫度下孵育雞蛋，收獲一批流感病毒，將這批病毒與一種或多種非野生型HA和NA基因的特異性抗體共孵育，用雞蛋(這些雞蛋是搖動(dòng)的)傳代病毒，以及加熱病毒和通過(guò)濾膜過(guò)濾病毒。根據(jù)這種方法制備出的組合物也是本發(fā)明的特征(其中包括疫苗組合物)。在本文所提供的各種方法中，流感病毒組合物還可以通過(guò)熒光聚焦試驗(yàn)進(jìn)行分析。這種病毒組合物可以包含約10%到60%的未分餾正常尿囊液(還可以包含約到5%的精氨酸)。組合物可以用實(shí)質(zhì)不含正常尿囊液的緩沖液稀釋。本文的組合物可以是實(shí)質(zhì)不含明膠的。這些組合物在約2°C到8°C的條件下、或者在4°C的條件下是穩(wěn)定的。在本文的某些組合物和方法中，病毒是流感病毒，而在本文的另外一些組合物和方法中(如那些包括微孔過(guò)濾和/或超聲過(guò)濾和/或加熱和/或搖動(dòng)的方法)，病毒可以是非流感病毒(例如通過(guò)在雞蛋內(nèi)培養(yǎng)制備出的病毒，如粘液病毒、副粘液病毒、RSV、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、Sendi病毒、黃熱病毒、pIV等)。本發(fā)明的方法和組合物也適用于這些病毒和/或非流感病毒。在其他一些方面，本發(fā)明包括流感病毒組合物，其中的組合物是通過(guò)如下步驟制備的在雞蛋內(nèi)傳代流感病毒、加熱病毒以及通過(guò)濾膜過(guò)濾病毒，這種組合物具有第一TCID50,這個(gè)第一TCID5tl大于第二TCID5tl，第二TCID5tl來(lái)自于不是通過(guò)如下過(guò)程制備的流感病毒在雞蛋內(nèi)傳代流感病毒、加熱病毒以及通過(guò)濾膜過(guò)濾病毒。本發(fā)明的其他方面包括流感病毒組合物，其中的組合物是通過(guò)如下步驟制備的在雞蛋內(nèi)傳代流感病毒，其中雞蛋在所述的傳代過(guò)程中搖動(dòng)，這種組合物具有第一TCID5tl，這個(gè)第一TCID5tl大于第二TCID5tl，第二TCID5tl來(lái)自于不是通過(guò)如下過(guò)程制備的流感病毒在雞蛋內(nèi)傳代流感病毒，其中雞蛋在所述的傳代過(guò)程中搖動(dòng)。本文的其他實(shí)施方式包括流感病毒組合物，其中的組合物是通過(guò)如下步驟制備的將一組含流感病毒基因組的載體導(dǎo)入到一群雞蛋宿主內(nèi)，這些雞蛋可支持流感病毒的復(fù)制，在低于或等于35°C的溫度下孵育雞蛋，以及收獲一批流感病毒，這種組合物具有第一TCID50,這個(gè)第一TCID5tl大于第二TCID5tl，第二TCID5tl來(lái)自于不是通過(guò)如下過(guò)程制備的流感病毒將一組含流感病毒基因組的載體導(dǎo)入到一群雞蛋宿主內(nèi)，這些雞蛋可支持流感病毒的復(fù)制，在低于或等于35°C的溫度下孵育雞蛋，以及收獲一批流感病毒。通過(guò)閱讀下面的詳細(xì)描述并結(jié)合附圖就可以更全面地理解本發(fā)明的這些目的和特征以及其他目的和特征。附圖簡(jiǎn)述圖1描述的是在33°C和25°C的條件下感染DEKTC-24后的M基因分型。圖2描述的是噬菌斑試驗(yàn)，圖中顯示的是在33°C的條件下53和62重配株的不同滴度。圖3描述的是62對(duì)53重配株的生長(zhǎng)曲線。圖4描述的是MDV-B和野生型B病毒的Ml序列。圖5描述的是MDV-B和野生型B病毒的M2序列。圖6描述的是MDVB-Ml兩個(gè)保守位點(diǎn)上的突變。圖7描述的是B/HK62M1突變株的生長(zhǎng)曲線。圖8顯示的是以不同MOI感染的各種CEK細(xì)胞。圖9顯示的是在疫苗制備過(guò)程中可能出現(xiàn)微生物污染的流程圖。圖10說(shuō)明的是通過(guò)紅外線成像技術(shù)觀察到的各個(gè)雞蛋的溫度衰減速率。圖11顯示的是活雞蛋、不孕雞蛋和死雞蛋的熱成像圖。圖12顯示的是病毒收獲濃縮的流程圖。圖13描述的是用NAF蛋白進(jìn)行第5次洗滌后的比較。圖14描述的是濃縮前N/NewCaledonia/20/991-X-Neat樣品的分析。圖15描述的是A/NewCaledonia/20/9910X濃縮樣品的分析。圖16圖A-B顯示的是IX禾口10XA/NewCaledonia/20/99的比較；以及經(jīng)5次洗滌后的IX-W樣品。圖17描述的是A/NewCaledonia/20/991X禾ΠIX-W樣品的比較。圖18圖A-C描述的是10X禾口10X-WA/NewCaledonia/20/99的比較；A/NewCaledonia/20/99的滲透液；以及經(jīng)5次洗滌后的A/NewCaledonia/20/99。圖19顯示的是通過(guò)SEC分析比較洗滌的時(shí)間和去除的雜質(zhì)。圖20顯示的是IX-W和10X-WA/NewCaledonia/20/99的比較。圖21顯示的是A/NewCaledonia/20/99的96孔板分析。圖22顯示的是滲余物和滲透液中神經(jīng)酰胺酶活性/病毒純化圖。圖23顯示的是對(duì)照、10X、10X-W和1X-W的RHPLC。圖24顯示的是對(duì)照、10X、1X-W和10X-W樣品的圖。圖25顯示的是滲透液和洗滌1到6次的RHPLC。圖26顯示的是去除卵類黏蛋白的RHPLC圖(峰面積)。圖27顯示的是去除溶菌酶的RHPLC圖(峰面積)。圖28顯示的是去除伴清蛋白的RHPLC圖(峰面積)。圖29顯示的是去除卵清蛋白的RHPLC圖(峰面積)。圖30顯示的是通過(guò)Agilent2100進(jìn)行卵清蛋白分析的圖。圖31顯示的是抗A/NewCaledonia抗體的Western印跡SDS-PAGE凝膠圖。圖32顯示的是10X-W樣品、經(jīng)5次洗滌的A/NewCaledonia/20/99樣品的分析。圖33顯示的是通過(guò)RT-PCR進(jìn)行RNA分析的圖。圖34描述的是通過(guò)SEC監(jiān)測(cè)A/Beijing病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中的繁殖情況。圖35顯示的是A/Beijing病毒在Vero細(xì)胞內(nèi)繁殖后收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物。圖36顯示的是2升A/Panama細(xì)胞培養(yǎng)物的濃縮。圖37顯示的是2升B/HongKong細(xì)胞培養(yǎng)物濃縮到IOml的情況。圖38顯示的是典型的病毒儲(chǔ)藏制劑穩(wěn)定性的4個(gè)圖。圖39顯示的是不同病毒株的儲(chǔ)藏制劑穩(wěn)定性的圖。圖40顯示的是不同病毒株的儲(chǔ)藏制劑穩(wěn)定性的圖。圖41圖A-C含不同濃度檸檬酸鹽的病毒儲(chǔ)藏制劑的穩(wěn)定性。圖42圖A-C含不同濃度EDTA的病毒儲(chǔ)藏制劑的穩(wěn)定性。圖43顯示的是不同病毒株的未純化病毒收獲制劑在9個(gè)月內(nèi)的穩(wěn)定性。圖44說(shuō)明的是磷酸緩沖液制劑的初始毒力損失。圖45描述的是各種制劑在6個(gè)月時(shí)的穩(wěn)定性斜率全圖。圖46描述的是各種制劑在6個(gè)月時(shí)的穩(wěn)定性斜率全圖。圖47描述的是含明膠和PVP/EDTA的各種制劑的穩(wěn)定性。圖48描述的是含組氨酸的各種制劑在不同pH下的穩(wěn)定性。圖49描述的是含不同量蔗糖的各種制劑的穩(wěn)定性。圖50通過(guò)各孔的吸光度值對(duì)該值出現(xiàn)的頻率(具有該吸光度值的孔數(shù))繪圖得到的直方圖。圖51通過(guò)吸光度值對(duì)該值出現(xiàn)的頻率繪圖得到的直方圖。圖52描述的是制備62流感病毒重配株的通用過(guò)程。發(fā)明詳述本發(fā)明包括提高病毒和病毒組合物制備效率和產(chǎn)量的方法和組合物，這些病毒和病毒組合物適于疫苗的制備/使用。本發(fā)明所包括的方法和組合物可用于在病毒制備、溫度調(diào)節(jié)/過(guò)濾、搖動(dòng)、抗體篩選、毒力分析過(guò)程中篩選所需要的重配株，本發(fā)明的其他特征將在本文中作詳細(xì)描述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該了解本文所描述的各個(gè)步驟在同一制備系列中并不要求都要執(zhí)行或存在。因此，在某些實(shí)施方式中本文所描述的所有步驟和/或組合物，都要求執(zhí)行或存在，如表1所列出的那些步驟和組合物，而在另外一些實(shí)施方式中，可以選擇性地去掉、改變(規(guī)模、順序、位置等)一個(gè)或多個(gè)步驟。本文用于病毒制備的方法和組合物簡(jiǎn)要概述于表1中。正如自始至終都需要強(qiáng)調(diào)的一樣，需要再次強(qiáng)調(diào)的是，本發(fā)明的每個(gè)步驟，如表1所列出的那些步驟并不一定要求彼此依存。例如，在某些實(shí)施方式中，含適當(dāng)重配病毒溶液的雞蛋在孵育期間需要搖動(dòng)(見(jiàn)下)，而在其他的實(shí)施方式中則不需要如此；步驟10中的加熱和過(guò)濾也不依賴于步驟13中的通用試劑的使用；等等。本發(fā)明的任何一個(gè)步驟/方法/組合物的存在都不依賴于本發(fā)明其他任何步驟/方法/組合物的存在。因此，本發(fā)明的不同實(shí)施方式可能只包含步驟之一、不同步驟的組合或者所有步驟。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)該理解的是典型的實(shí)施方式中包含了本領(lǐng)域熟知的一些步驟/方法/組合物，如照光檢查含病毒的雞蛋、用病毒接種雞蛋等。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易地就可以為這些熟知的步驟確定合適的條件、分步驟、步驟的細(xì)節(jié)等以制備出合適的病毒、病毒液、組合物等。各個(gè)步驟將在下文作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。見(jiàn)表1所列的典型實(shí)施方式中的主要步驟。為了便于討論和描述，本發(fā)明的各個(gè)步驟，如各種方法和組合物，可以被認(rèn)為包含在4個(gè)大組中。第一組包括這些方面，如共轉(zhuǎn)染、重配、重配株的篩選和重配株的克隆(大致相當(dāng)于表1的步驟1到步驟3)。第二組包括這些方面，如重配株的純化和擴(kuò)增，大致相當(dāng)于表1中的步驟4到步驟6。第三組包括在雞蛋中進(jìn)一步擴(kuò)增重配株，以及收獲和純化收獲的病毒液(大致相當(dāng)于表1中的步驟7到步驟11)。第四組包括所收獲病毒液的穩(wěn)定化和病毒液的毒力/感染性分析(大致相當(dāng)于表1中的步驟12到步驟15)。但是，應(yīng)當(dāng)理解的是將本發(fā)明的方面分為上述四大類只是為了解釋/組織的目的，并不意味著各步驟之間是相互依存的。步驟的詳細(xì)描述如上所述，為了便于討論和描述，本發(fā)明的各個(gè)步驟可以被認(rèn)為包含在4個(gè)大組中。第一組包括這些方面，如共轉(zhuǎn)染、重配、重配株的篩選和重配株的克隆(大致相當(dāng)于表1的步驟1到步驟3)。第二組包括這些方面，如重配株的純化和擴(kuò)增，大致相當(dāng)于表1中的步驟4到步驟6。第三組包括在雞蛋中進(jìn)一步擴(kuò)增重配株，以及收獲和純化收獲的病毒液(大致相當(dāng)于表1中的步驟7到步驟11)。第四組包括所收獲病毒液的穩(wěn)定化和病毒液的毒力/感染性分析(大致相當(dāng)于表1中的步驟12到步驟15)。但是，需要強(qiáng)調(diào)的是將本發(fā)明的方面分為上述四大類只是為了解釋/組織的目的，并不意味著各步驟之間是相互依存的。第一組在本文中被大致分類為第一組的本發(fā)明的方面包括與優(yōu)化細(xì)胞系共轉(zhuǎn)染相關(guān)的方法和組合物，如利用主供體病毒和一種或多種野生型病毒優(yōu)化細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染以制備出特別適宜的重配病毒；適宜重配病毒的篩選；以及篩選出的重配病毒的克隆。流感病毒株的重配方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。曾在細(xì)胞培養(yǎng)物和雞蛋中重配A型流感病毒和B型流感病毒以制備重配的病毒株。見(jiàn)Tarmock等，"A/Leningrad/134/17/57供體病毒株來(lái)源的冷適應(yīng)性減毒A型流感病毒重配株的制備和特征”(Pr印arationandcharacterisationofattenuatedcold-adaptedinfIuenzaAreassortantsderivedfromthedonorstrain),Vaccine(2002)20:2082_2090。流感病毒株的重配過(guò)程已經(jīng)用質(zhì)粒構(gòu)建的方法表示出來(lái)，見(jiàn)“用于流感病毒制備的多質(zhì)粒系統(tǒng)”，引用文獻(xiàn)同上。簡(jiǎn)單地說(shuō)，重配一般包括不同病毒來(lái)源的基因片段的混合(如在雞蛋內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi))。例如，典型的8片段B型流感病毒就可以通過(guò)如含有目的表位的野生型病毒株和“供體”病毒株如冷適應(yīng)病毒株混合而成。因此兩個(gè)類型的病毒之間的重配可以產(chǎn)生出含有一個(gè)片段編碼野生型表位而另一個(gè)片段編碼冷適應(yīng)性的病毒。但是不幸的是，制備出預(yù)期的重配株有時(shí)需要進(jìn)行大量的重配。重配以后還需要篩選病毒(如，找到需要的重配株)。然后將預(yù)期的重配株克隆(如數(shù)量上的擴(kuò)增)。因此，急需找到降低重配株構(gòu)建的時(shí)間和提高制備出預(yù)期重配株的效率的方法。優(yōu)化、篩選和克隆所需要的B型流感病毒重配株的傳統(tǒng)方法一般是通過(guò)將病毒株共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞培養(yǎng)物(如CEK細(xì)胞)內(nèi)，然后用適當(dāng)?shù)目贵w篩選，如抗親本病毒之一的抗體(通常在雞蛋內(nèi)進(jìn)行)，再進(jìn)行病毒的克隆或擴(kuò)增等，病毒的克隆或擴(kuò)增一般在細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)進(jìn)行。但是，這種傳統(tǒng)的重配方法存在一些缺點(diǎn)，因?yàn)樾枰M(jìn)行數(shù)千次重配才能使所需要的片段組合在一起。當(dāng)進(jìn)行這種重配時(shí)，很明顯真正的隨機(jī)重配并不是我們所需要的最終結(jié)果。換言之，偏向過(guò)程的壓力存在于該系統(tǒng)中。但是對(duì)于A型流感病毒來(lái)說(shuō)，該過(guò)程未顯示出這種偏向。對(duì)于A型病毒株來(lái)說(shuō)，病毒株共轉(zhuǎn)染(一般轉(zhuǎn)染到細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)，如CEK細(xì)胞)后同時(shí)進(jìn)行篩選和克隆，同樣也是在細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)進(jìn)行。因此如本文所詳細(xì)描述的，本發(fā)明的許多實(shí)施方式都包括降低重配偏向的步驟。也就是說(shuō)，重配株的克隆是在雞蛋內(nèi)(如在33°C)而不是在細(xì)胞系內(nèi)進(jìn)行，或者在細(xì)胞系內(nèi)進(jìn)行，但是溫度是25°C。重配的優(yōu)化本發(fā)明利用第一組的步驟來(lái)優(yōu)化重配過(guò)程以減少所需的重配次數(shù)(以及因此可以提高疫苗制備過(guò)程的效率)。利用這種優(yōu)化技術(shù)的步驟一般適用于B型流感病毒株的重配，通常是在細(xì)胞培養(yǎng)物如CEK細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。重配流感病毒的其他方法是將主供體病毒(MDV)和野生型病毒的稀釋液混合，如不論每種溶液的濃度是多少都按15進(jìn)行稀釋，然后在25°C和33°C的條件下分別孵育24和48小時(shí)。但是，這種方法通常只適用于A型流感病毒株，而對(duì)于B型流感病毒株來(lái)說(shuō)利用這種方法常常得不到陽(yáng)性的結(jié)果。例如，為了達(dá)到正確的62的分配(即MDV的6個(gè)基因和野生型病毒的2個(gè)基因NA和HA)，常常需要進(jìn)行數(shù)千次重配。因此，本發(fā)明第一組步驟的典型實(shí)施方式包括確定MDV和野生型病毒株的MOI(感染復(fù)數(shù))(特別適用于B型流感病毒株)，然后進(jìn)行表2中所列的那些重配步驟。這種優(yōu)化的重配混合物在雞蛋內(nèi)33°C孵育24小時(shí)。在類似于這樣的實(shí)施方式中，通過(guò)篩選數(shù)百個(gè)重配混合物就可以得到正確的62的重配，而在非優(yōu)化系統(tǒng)中則需要篩選數(shù)千個(gè)重配混合物。重配的篩詵和克降第一組的步驟還包括重配的流感病毒的篩選。本發(fā)明的方法和組合物特別適用于(通常用于)篩選正確的重配的B型流感病毒。重配的A型流感病毒株可在細(xì)胞培養(yǎng)物(如CEK細(xì)胞)內(nèi)篩選，也可以在雞蛋內(nèi)篩選。但是，當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)重配時(shí)(如在CEK細(xì)胞內(nèi)篩選時(shí))，重配的B型流感病毒株就會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。研究認(rèn)為這是因?yàn)镃EK細(xì)胞會(huì)干擾B型流感病毒的M基因，因此會(huì)降低病毒的總產(chǎn)量。見(jiàn)下。本發(fā)明注意到了這種抑制作用，因此在某些實(shí)施方式中篩選B型流感病毒重配株是在33°C的雞蛋內(nèi)進(jìn)行的(雞蛋可中和抗B型流感病毒株M基因的篩選壓力)，或者在CEK細(xì)胞內(nèi)、25°C進(jìn)行。見(jiàn)圖52。第一組中的本發(fā)明實(shí)施方式包括在篩選過(guò)程中使用抗HA(MDV的)和抗NA(MDV的)抗血清，這樣就可以達(dá)到較強(qiáng)的篩選效果。第一組的本發(fā)明的其他實(shí)施方式還包括所制備的重配株的克隆。正如通過(guò)上面的討論所了解到的，在CEK細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)克隆B型流感病毒重配株被證明是有問(wèn)題的，因?yàn)榇嬖谪?fù)篩選壓力。因此在本文的某些實(shí)施方式中，B型流感病毒株的重配株是用雞蛋在33°C的條件下進(jìn)行的。另一方面，A型流感病毒株的重配株可以在CEK細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)同時(shí)克隆和篩選。雖然本文的某些實(shí)施方式利用了雞蛋對(duì)重配沒(méi)有偏向或沒(méi)有壓力的優(yōu)點(diǎn)(見(jiàn)上)，但是本文的其他實(shí)施方式也利用細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行重配株的篩選/克隆，但是是在25°C下進(jìn)行的。因此，本發(fā)明的某些方面包括的實(shí)施方式利用了MDVB(B型主供體病毒)M基因和B型野生型病毒M基因的不同特性。例如，可以選擇進(jìn)行62和53共轉(zhuǎn)染來(lái)制備目的重配株。因此在B/HongKong/330/OlMVS的制備過(guò)程中，通過(guò)有限稀釋從CEK細(xì)胞內(nèi)、33°C克隆混合的野生型和冷適應(yīng)性M基因的病毒RNA所得到的主要是野生型M基因的病毒RNA。在雞蛋和CEK細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)62重配株和53重配株(含野生型M基因)在33°C共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，野生型M基因vRNA相對(duì)于MDV來(lái)源的M基因vRNA是占優(yōu)勢(shì)的，盡管在雞蛋內(nèi)得到野生型M基因的vRNA的幾率更高。但是，當(dāng)62重配株和53重配株在25°C共轉(zhuǎn)染CEK細(xì)胞時(shí)，MDV來(lái)源的M基因的vRNA和野生型M基因的vRNA大致相同。因此，在本文的某些實(shí)施方式中，MVS過(guò)程中從CEK細(xì)胞內(nèi)克隆62重配株時(shí)所用的溫度是25°C。見(jiàn)圖1到圖8。從圖中可以看到，噬菌斑試驗(yàn)的結(jié)果表明，在33°C時(shí)，62重配的B型病毒的滴度至少比53重配株低2個(gè)數(shù)量級(jí)，而在25°C時(shí)二者的生長(zhǎng)處于同一水平。62重配株在33°C的條件下出現(xiàn)生長(zhǎng)缺陷可以解釋在MVSCEK克隆過(guò)程中62重配株所受到的篩選壓力。MDVB和62重配株的不同生長(zhǎng)特性說(shuō)明HA和NA參與形成了M基因的優(yōu)勢(shì)地位。MDVB和野生型B病毒之間只有兩個(gè)保守氨基酸是不同的。62M1基因上的纈氨酸單個(gè)突變成野生型保守的蛋氨酸就可以反轉(zhuǎn)62重配株在33°C、CEK細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)缺陷。重配株的特征本發(fā)明還有一些實(shí)施方式利用高通量的單鏈構(gòu)象多態(tài)性/毛細(xì)管電泳(SSCP/CE)技術(shù)來(lái)確定本文所用的流感病毒基因的排列方式。應(yīng)當(dāng)理解的是這些特征也可以歸類到10本文的其他“組”，但是在此處討論只是為了便于組織的目的。流感病毒含有8個(gè)基因，如上所述，兩種不同的流感病毒株共轉(zhuǎn)染一個(gè)細(xì)胞可以產(chǎn)生出具有不同于任何一個(gè)親本病毒的新型基因排列的重配株。因此，本文的某些實(shí)施方式利用SSCP/CE技術(shù)來(lái)快速地確定大量流感病毒樣本的基因片段的排列方式。還可以利用8個(gè)片段特異性的熒光標(biāo)記引物通過(guò)TR-PCR來(lái)擴(kuò)增流感病毒的基因片段。見(jiàn)Arvin等，(2000)T.Clin.Micro.38(2)=839-845,本文已納入作為參考。為了減少分型流感病毒所有8個(gè)片段所需要的RT-PCR反應(yīng)的次數(shù)，可以選擇復(fù)合反應(yīng)從而可以在一次反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)片段。每個(gè)片段的RT-PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度、遷移模式和熒光顏色都是不同的。單鏈DNA片段在非變性基質(zhì)上的遷移模式不僅是由其長(zhǎng)度決定的，也是由其序列組成決定的。細(xì)胞可以用冷適應(yīng)性的B/ArmArbor/1/66(M0V-ES)或相似的病毒共轉(zhuǎn)染，也可以用幾種B型野生型流感病毒中的一種轉(zhuǎn)染。共轉(zhuǎn)染后繁殖的病毒通過(guò)有限稀釋方法克隆出來(lái)，核酸通過(guò)復(fù)合反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增。選擇引物并在18°C的條件下通過(guò)SSCP/CE分離產(chǎn)物，可以提高M(jìn)DVB和野生型病毒株8個(gè)基因片段的分辨效率。例如，為了證明SSCP/CE的精確度，從大約50株不同的重配株中挑選400個(gè)基因片段來(lái)進(jìn)行SSCP/CE分析，所得到的結(jié)果與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的分析結(jié)果相比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)之間具有高度的一致性(約98%)，從而證明了SSCP/CE技術(shù)的可靠性。另外，SSCP/CE技術(shù)還能用于檢測(cè)B型流感病毒M基因上的單個(gè)核苷酸替代。細(xì)菌污染的預(yù)防本發(fā)明的某些實(shí)施方式包含檢測(cè)和/或預(yù)防/檢測(cè)用于制備流感病毒的雞蛋發(fā)生微生物污染的步驟。這些步驟可用于表1所列的幾個(gè)領(lǐng)域，第一組、第二組和第三組都包括，但是為了文章組織的目的只把這些步驟列在第一組中。本發(fā)明的微生物檢測(cè)方法可用于微生物的快速/高通量檢測(cè)，因此和本文的許多其他步驟一樣，可以提高病毒/疫苗制備的效率。本發(fā)明的許多流感病毒制備策略，包括本發(fā)明的某些實(shí)施方式，利用在無(wú)特殊病原的含胚雞蛋內(nèi)擴(kuò)增流感病毒的傳統(tǒng)方法作為本發(fā)明的一部分。用雞蛋制備流感病毒的過(guò)程中有幾個(gè)點(diǎn)可能會(huì)發(fā)生微生物污染。見(jiàn)圖9，該圖列出了一個(gè)病毒制備流程圖的例子以及可能發(fā)生污染的環(huán)節(jié)。但是不幸的是，在雞蛋的外殼上就可能有某些微生物存在，這也是其天然菌群的一部分。在雞胚發(fā)育過(guò)程中也有可能有微生物被包裹到雞蛋殼內(nèi)。為了使雞蛋發(fā)育成胚胎需要將受精雞蛋置于37°C、高濕度的環(huán)境下孵育，但這也為多種微生物的繁殖提供了適宜的條件。微生物污染的另外一種可能發(fā)生在穿刺蛋殼進(jìn)行接種時(shí)。雖然在接種前常常在雞蛋上噴灑酒精，但是微生物依然有機(jī)會(huì)進(jìn)入雞蛋內(nèi)。病毒在雞蛋內(nèi)擴(kuò)增2到3天后，通常要去掉蛋殼的頂部以便于收集雞蛋內(nèi)含病毒的尿囊液。這是發(fā)生微生物污染的另一個(gè)點(diǎn)。不幸的是發(fā)生這種污染的雞蛋往往會(huì)逃脫過(guò)檢測(cè)，這樣就迫使我們?cè)诓杉蚰乙簳r(shí)需要將液體裝到多個(gè)容器內(nèi)以使由于MPA試驗(yàn)失敗而造成整批樣品被污染的幾率降到最低。因?yàn)橛糜谝呙缰苽涞牧鞲胁《局晖ǔＳ腥N，因此需要將三株病毒混合形成最后的接種液。在混合和添加前的病毒收獲環(huán)節(jié)(見(jiàn)圖9)需要進(jìn)行MPA(微生物純度檢測(cè))試驗(yàn)以確保產(chǎn)物無(wú)微生物污染。孵育以后可以用傳統(tǒng)的照光法來(lái)鑒定不孕的雞蛋和死雞蛋，這些死雞蛋可能是由11于自然的原因，也可能是由于微生物污染引起的(如，由于病毒的感染和/或微生物的擴(kuò)增引起的雞蛋死亡，這種雞蛋必須要加以檢測(cè)并剔除之)。照光檢查是指在暗室內(nèi)將雞蛋置于光源前觀察發(fā)育的胚胎。死雞蛋不能用于病毒接種。從上面幾點(diǎn)可以看出，在制備流感病毒的過(guò)程中有多個(gè)步驟需要檢測(cè)微生物的污染。需要去除或減少家禽的微生物和環(huán)境微生物，也要去除或減少引入的環(huán)境微生物和人的微生物。因此需要找到一種無(wú)損傷而且快速的雞蛋篩選方法以便于鑒別和剔除不孕的、死的或污染微生物的雞蛋。這種方法最好是非創(chuàng)傷性的，而且是快速的。目前用于檢測(cè)微生物污染的方法包括簡(jiǎn)便方法(MPA和Bioburden)。目前所用的方法有接種前/后對(duì)雞蛋進(jìn)行照光檢查(使用這種方法一般每人每小時(shí)可檢查約500個(gè)雞蛋)；MPA試驗(yàn)和BioBurden試驗(yàn)，MPA試驗(yàn)一般約進(jìn)行14天，BioBurden試驗(yàn)一般約進(jìn)行3天(在病毒收獲時(shí)進(jìn)行)；支原體檢查，一般約進(jìn)行28天(病毒收獲時(shí)進(jìn)行)；分支桿菌檢測(cè)，一般進(jìn)行約56天(在收獲病毒時(shí)進(jìn)行)。由此看來(lái)是有機(jī)會(huì)顯著縮短傳統(tǒng)方法的完成時(shí)間的。新方法最好能夠?qū)@得結(jié)果的時(shí)間縮短到數(shù)天到24小時(shí)或更短(工序中的檢測(cè)時(shí)間最后能在4小時(shí)或更短的時(shí)間內(nèi)完成)放行檢測(cè)的時(shí)間縮短到數(shù)周到數(shù)天。其他需要改進(jìn)的地方包括減少中間環(huán)節(jié)占用時(shí)間/庫(kù)存時(shí)間、加快出貨速度以及減少成本/勞動(dòng)力/管理費(fèi)用?？傊?，不論選擇何種方法來(lái)檢測(cè)微生物污染都應(yīng)該考慮如下因素科學(xué)上的要求，如用途、獲得結(jié)果所需要的時(shí)間、樣品的類型、設(shè)備的容量等；法規(guī)要求，如FDA的指導(dǎo)原則(如FDA要求生物負(fù)荷量試驗(yàn)必須作為活微生物總量的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo))、回顧、預(yù)期/可接受性；順應(yīng)性要求，如售主核查(vendoraudits)、售主支持(vendorsupport)(I0PQ或可通過(guò)儀器觀察的透視質(zhì)量)、軟件的可靠性和文件；以及商業(yè)要求如產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)、制造成本、每次試驗(yàn)的成本等。存在于本發(fā)明各實(shí)施方式中的檢測(cè)微生物污染的幾種潛在替代方法列于表3中。其中一種替代雞蛋照光檢查的方法和本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是病毒接種前/后的熱成像技術(shù)。在這些實(shí)施方式中，用紅外攝像機(jī)捕獲孵育雞蛋所發(fā)出的紅外線。利用軟件將捕獲的圖像轉(zhuǎn)換成雞蛋的溫度讀數(shù)。攝像機(jī)能夠分辨出小于或等于o.ore的溫度差異。代謝活躍的正在發(fā)育的胚胎熱量丟失的速度要慢于未受精雞蛋或死胚胎，因此就會(huì)出現(xiàn)較大的溫度差異。例如，可以設(shè)計(jì)一種病毒接種前/后的熱成像試驗(yàn)來(lái)代替雞蛋照光檢查，捕獲一盤雞蛋的熱成像圖像(將一紅外攝像機(jī)置于一盤雞蛋的下方(如有底孔的托盤))。然后利用軟件分析每個(gè)雞蛋的底部溫度(或者側(cè)面溫度、頂部溫度等)。每個(gè)雞蛋的溫度衰減速率就可以計(jì)算出來(lái)，據(jù)此就可以顯示出問(wèn)題雞蛋的最大溫度差異。通過(guò)這種熱成像技術(shù)就可以了解活胚胎和未受精雞蛋及死雞蛋之間的溫度差異。見(jiàn)圖10和圖11。在本文的另外一些實(shí)施方式中，本發(fā)明利用另外一種方法來(lái)代替病毒收獲時(shí)進(jìn)行的生物負(fù)荷最檢測(cè)，這種方法被稱為MPN或最大JL率數(shù)檢測(cè)，該方法的根據(jù)是《細(xì)菌學(xué)在線分析手冊(cè)》(BacteriologicalAnalyticalManualOnline),2001年1月附錄2的“系列稀釋的最大幾率數(shù)”(MostProbableNumberfromSerialDilutions)，F(xiàn)DA/CFSA-BAM。例如，一次MPN試驗(yàn)可進(jìn)行3個(gè)重復(fù)的96孔板試驗(yàn)，其中在一個(gè)96孔板上就可以進(jìn)行一系列的10倍稀釋(如110、1100、11K、110K、1100KU1000K)，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，帶陰性對(duì)照。TSB作為稀釋液和濃縮培養(yǎng)基在開(kāi)始時(shí)就加到每個(gè)孔中以支持微生物的生長(zhǎng)。肉眼觀察培養(yǎng)板或在600nm處檢測(cè)。對(duì)于微生物污染的檢測(cè)來(lái)說(shuō)，MPN生物負(fù)荷量試驗(yàn)與膜過(guò)濾試驗(yàn)相比更加實(shí)用。膜過(guò)濾試驗(yàn)需要15個(gè)TSA板(3個(gè)樣品)，所需要的樣品量要大，耗費(fèi)的時(shí)間和精力很多，很難自動(dòng)化，樣品只能進(jìn)行110和1100的稀釋，而96孔板MPN試驗(yàn)只需要一個(gè)96孔板(3個(gè)樣品)，所需要的樣品量少，只需幾個(gè)簡(jiǎn)單的一次性耗材和試劑，稀釋范圍從110到1100，000，結(jié)果可用肉眼觀察，也可用96孔板記錄儀自動(dòng)讀數(shù)。利用常規(guī)的生物負(fù)荷量檢測(cè)方法和96孔板MPN試驗(yàn)分別進(jìn)行了70個(gè)樣品的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)試驗(yàn)所得到的結(jié)果完全一致。值得注意的是，為了其應(yīng)用目的，96孔板MPN提供了較高通量的可比較結(jié)果。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，利用廣泛應(yīng)用的商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)核酸快速擴(kuò)增試劑盒(如PCR)來(lái)代替用于病毒收獲時(shí)檢測(cè)支原體的傳統(tǒng)簡(jiǎn)明方法。目前所用的簡(jiǎn)明方法(直接的和間接的)可以檢測(cè)所有可能產(chǎn)生污染的株(包括鳥(niǎo)類的滑液霉形體和敗血霉形體，人的肺炎支原體，即鳥(niǎo)類和人的所有分支桿菌株)?？商娲?jiǎn)明方法的PCR檢測(cè)方法包括研究者開(kāi)發(fā)的用于實(shí)時(shí)PCR的引物/探針對(duì)，可特異性地檢測(cè)一組支原體，根據(jù)靶基因如結(jié)核桿菌和非結(jié)核性分支桿菌(如膿腫分支桿菌和鳥(niǎo)型分支桿菌)的序列同源性(如16s和/或23srRNA上的屬和/或種特異性序列)能夠檢測(cè)的物種可能超過(guò)40種。本文的某些實(shí)施方式利用了可快速檢測(cè)結(jié)核桿菌和非結(jié)核性分支桿菌等的標(biāo)準(zhǔn)核酸擴(kuò)增試劑盒。第二組包含在第二組中的本發(fā)明的某些方面包括相當(dāng)于表1所列的步驟4到步驟6。經(jīng)過(guò)正確的重配過(guò)程并且將重配株(如62重配病毒)克隆出來(lái)以后，這些重配病毒需要在含胚雞蛋內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步純化，正確的克隆需要被擴(kuò)增(通過(guò)在雞蛋內(nèi)的生長(zhǎng))以制備主病毒株(MVS)或主病毒種子，這種種子再進(jìn)一步擴(kuò)增形成主工作病毒株(MWVS)或生產(chǎn)者的工組病毒種子。從雞蛋內(nèi)純化病毒顆粒和利用這種純化的病毒接種更多的雞蛋以擴(kuò)大病毒顆粒的量的許多方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。許多這樣的技術(shù)在目前病毒顆粒的制備中是很常用的，并且已經(jīng)應(yīng)用了至少40年。見(jiàn)Reimer等，“利用帶狀超離心技術(shù)純化流感病毒”，Science1966，1521379-81。例如，常用的純化方法包括蔗糖梯度超離心(如10-40%的蔗糖)等。如本文所強(qiáng)調(diào)的，列在其他組中的其他方法也可以存在于第二組中，如防止微生物的污染等。第三組包含在第三組中的本發(fā)明的某些方面包括表1所列的步驟7到步驟11。這些步驟主要用于調(diào)整含胚雞蛋的孵育條件(如，在病毒感染雞蛋孵育過(guò)程中的特殊處理和環(huán)境條件)以及從雞蛋的尿囊液中收集和澄清流感病毒。例如，本發(fā)明包括選擇、洗滌、照光和孵育含用于疫苗制備的重配病毒的雞蛋；這種雞蛋的接種、加封等；照光檢查這種雞蛋；從雞蛋內(nèi)收獲病毒液(即尿囊液)；以及病毒液的澄清。還應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，適用于第二組步驟的幾種技術(shù)同樣也適用于第三組的步驟(如照光檢查等)。包含在第三組中的本發(fā)明的幾個(gè)方面是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在病毒制備過(guò)程中照光檢查雞蛋以及用病毒接種雞蛋和洗滌、孵育雞蛋的各個(gè)方面都是用雞蛋制備病毒/疫苗中熟知的技術(shù)。當(dāng)然，這些熟知的技術(shù)與本發(fā)明的獨(dú)特技術(shù)和創(chuàng)新技術(shù)結(jié)合使用將是更好的。M^l培養(yǎng)某些類型的流感病毒株(特別是B型流感病毒株如Victoria/504/2000)的一個(gè)缺陷是在雞蛋內(nèi)培養(yǎng)時(shí)無(wú)法獲得和其他病毒株一樣高的病毒滴度。例如，如果第一株病毒(如A型流感病毒株)制備的滴度達(dá)到108或109log(即每毫升含108或109病毒顆粒)，而第二株病毒(如B型流感病毒株)制備的滴度只能達(dá)到每毫升107病毒顆粒，那么必須用更多的雞蛋來(lái)培養(yǎng)第二株病毒，或者把第一株病毒儲(chǔ)存起來(lái)等待第二株病毒的制備。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是搖動(dòng)或溫和轉(zhuǎn)動(dòng)孵育病毒的雞蛋(即雞蛋接種病毒以后)。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是用于搖動(dòng)雞蛋的裝置不受限制。例如，可在晃動(dòng)平臺(tái)或搖動(dòng)平臺(tái)上搖動(dòng)雞蛋(如用于孵育細(xì)菌培養(yǎng)瓶的搖床、雞蛋孵育器等)。在某些實(shí)施方式中，搖動(dòng)雞蛋的速度約為每分鐘1圈或1圈以下到2圈或2圈以上。在這里“圈”應(yīng)當(dāng)理解為雞蛋完成一個(gè)全范圍活動(dòng)的過(guò)程。在另外的實(shí)施方式中，搖動(dòng)雞蛋的速度約為每分鐘0.5圈或0.5圈以下到5圈或5圈以上。在某些實(shí)施方式中，雞蛋每分鐘搖動(dòng)1圈。當(dāng)?shù)谌M的孵育步驟(即接種后)也加上搖動(dòng)時(shí)，B-Victoria流感病毒株的滴度可以高出未搖動(dòng)的對(duì)照雞蛋0.41og。過(guò)濾和加溫本發(fā)明第三組的另一個(gè)方面是測(cè)定在無(wú)菌過(guò)濾(一般通過(guò)0.2ym的濾膜)過(guò)程中病毒尿囊液(VAF)對(duì)病毒毒力丟失的影響。在本發(fā)明的不同實(shí)施方式中，從尿囊液中收集病毒顆粒以后都要經(jīng)過(guò)加溫尿囊液然后過(guò)濾尿囊液的過(guò)程。見(jiàn)表1的步驟10到11。只所以需要這些步驟有幾個(gè)理由。例如，如本文所指出的，疫苗制劑中存在尿囊液和碎片可能導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)。另外更重要的是過(guò)濾可除去溶液中的生物負(fù)荷(細(xì)菌)。所有含生物負(fù)荷的VH(病毒收獲物)液必須丟棄。但是減毒活病毒疫苗用于鼻內(nèi)時(shí)卻不需如此。因此，本發(fā)明過(guò)濾和澄清減毒活病毒以除去和/或減少這種生物負(fù)荷的步驟是十分必要的。本文的一個(gè)實(shí)施例描述的是以可接受的毒力損失通過(guò)無(wú)菌梯級(jí)濾膜過(guò)濾冷適應(yīng)性(ca)病毒株(如A/Sydney/05/97，H3N2型)所需要的病毒尿囊液(VAF)溫度和加熱時(shí)間的影響?？山邮艿倪^(guò)濾A/Sydney/05/97的條件以及在相同的條件下過(guò)濾其他5株冷適應(yīng)性流感病毒(即2XHmi、lXH3N2、2XB)所得到的結(jié)果在此進(jìn)行了描述。三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)(TCID5(1、神經(jīng)酰胺酶檢測(cè)和血凝素試驗(yàn))用于在過(guò)濾全過(guò)程中分析病毒尿囊液的特征。所得到的數(shù)據(jù)表明，對(duì)于A/Sydney/05/97來(lái)說(shuō)，過(guò)濾過(guò)程中加上加溫步驟(過(guò)濾前31士3°C加溫，最長(zhǎng)可加溫60分鐘)與無(wú)加溫步驟的無(wú)菌梯級(jí)過(guò)濾相比，可使毒力損失降低到可接受的水平(0-0.31ogl0TCID50)。在另外的實(shí)施方式中，加溫所用溫度可選擇28°C以上，或者28到36°C，加溫時(shí)間至少30分鐘，而在其他實(shí)施方式中，加溫時(shí)間可以達(dá)到約60到240分鐘。應(yīng)當(dāng)了解的是，雖然加溫步驟確實(shí)可以持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間，但是經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的加溫以后，在此較高溫度下因病毒穩(wěn)定性下降而導(dǎo)致的毒力損失就可能達(dá)到可測(cè)量的水平，并且是有害的。添加加溫步驟對(duì)于所檢測(cè)的其他病毒株來(lái)說(shuō)在試驗(yàn)期間不會(huì)導(dǎo)致毒力的額外損失，說(shuō)明對(duì)于冷適應(yīng)性流感病毒(CAIV)的無(wú)菌梯級(jí)過(guò)濾來(lái)說(shuō)加溫步驟是可以接受的處理步驟。如本文所描述，目前的FluMist制備過(guò)程利用含胚雞蛋擴(kuò)增主病毒種子(MVS)、廠家的工作病毒種子(MWVS)和病毒收獲物(VH)。見(jiàn)表1的步驟6。種子和病毒收獲物可能含有生物負(fù)荷(一般是細(xì)菌污染物)，這些生物負(fù)荷可能會(huì)引起種子或病毒產(chǎn)物無(wú)法用于疫苗制備。通過(guò)上述試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)含病毒尿囊液的過(guò)濾效果證明在制備過(guò)程中加上過(guò)濾步驟可減少生物負(fù)荷。但是，根據(jù)以前的研究工作我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于特定的病毒株來(lái)說(shuō)(如A/Sydney/05/97)這種過(guò)濾方法是有問(wèn)題的?；谶@些研究結(jié)果，我們?yōu)檫^(guò)濾裝置設(shè)計(jì)了新的操作方法，包括將一個(gè)無(wú)菌塑料介質(zhì)袋連接到前濾膜上，將一個(gè)0.2毫米的無(wú)菌梯級(jí)濾膜14與各種填充、分配和加樣線(見(jiàn)下)相結(jié)合。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解的是，除非特別說(shuō)明，對(duì)所使用的特定產(chǎn)品的類型、尺寸等的羅列或描述都不能被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。從這些試驗(yàn)中可以看出，大多數(shù)進(jìn)行檢測(cè)的冷適應(yīng)性(ca)病毒株被過(guò)濾后的毒力損失都很小，雖然以SartoriusSartocleanCA前濾膜加上SartoriusSartopore2作為無(wú)菌梯級(jí)濾膜。但是，利用A/Sydney/05/97進(jìn)行過(guò)濾試驗(yàn)的結(jié)果卻是導(dǎo)致毒力損失在0.7到1.410g1(1TCID5Q/mL之間。其他的研究表明這種損失發(fā)生在透過(guò)SartoriusSartopore2無(wú)菌梯級(jí)濾膜時(shí)。另外，還應(yīng)該注意的是其他品牌和/或類型的濾膜也可用于此步驟中，特定的濾膜名稱/類型不應(yīng)看作是對(duì)本發(fā)明的限制。下面第一組試驗(yàn)的目的在于測(cè)定過(guò)濾過(guò)程中VAF溫度對(duì)病毒毒力損失的影響。試驗(yàn)的第二部分用于確定過(guò)濾前加溫VAF的合適時(shí)間。冷適應(yīng)性的(ca)A/Sydney/05/97病毒(H3N2型)作為模型株來(lái)確定加溫的條件，因?yàn)檎缟厦嫠枋龅?，該株病毒在過(guò)濾過(guò)程中有較大的毒力損失。本實(shí)施例的第三部分用于評(píng)價(jià)加溫病毒尿囊液(VAF)對(duì)其他幾株單價(jià)病毒的因過(guò)濾引起的毒力損失的影響。本試驗(yàn)包括5株CAIV(2XHmi、lXH3N2和2XB)。所有試驗(yàn)都以CAIV種子規(guī)模(MVS和MWVS)進(jìn)行，使用1.0-3.0L蔗糖磷酸鹽谷氨酸鹽(SPG)穩(wěn)定的VAF和相應(yīng)規(guī)模的濾器，即去除檢測(cè)樣品前的推薦最大VH處理規(guī)模的130到110。一般的處理規(guī)?？梢赃_(dá)到每個(gè)過(guò)濾裝置約33L經(jīng)穩(wěn)定的VH。這種體積的液體一般用帶50L袋的過(guò)濾裝置就可以完成。用標(biāo)準(zhǔn)的10”過(guò)濾囊過(guò)濾這個(gè)體積的液體具有相當(dāng)大的安全邊緣。但是，對(duì)于開(kāi)發(fā)/研究工作來(lái)說(shuō)這個(gè)體積太大了，因此所用的是l/10th規(guī)模的過(guò)濾(即約3L)。用于此加溫/過(guò)濾步驟的病毒的繁殖可按照本領(lǐng)域常用的方法和/或本領(lǐng)域的其他方法進(jìn)行(見(jiàn)上文和下文)，所用的病毒株為表4所列的冷適應(yīng)性(ca)流感病毒株。試驗(yàn)各個(gè)階段的樣品都要通過(guò)操作試驗(yàn)(見(jiàn)下面有關(guān)其他TCID5(i測(cè)定方法的描述)測(cè)定組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5(i)以分析其毒力。神經(jīng)酰胺酶活性(NA)和血凝素活性(HA)也要測(cè)定。通過(guò)SartoriusSartocleanCA/SartoriusSartopore2復(fù)合濾膜進(jìn)行一系列過(guò)濾以評(píng)價(jià)過(guò)濾前的VAF溫度對(duì)毒力(TCID5(l/mL)、神經(jīng)酰胺酶活性(NA)和血凝素活性(HA)丟失的影響。在收獲病毒期間，將VAF置于1LPETG瓶?jī)?nèi)，收集到所需體積的未穩(wěn)定化的VAF以后進(jìn)行過(guò)濾。此階段未穩(wěn)定化的VAF的溫度是15士3°C。總的加溫時(shí)間定義為VAF處于33士10°C水浴中的時(shí)間，包括升溫時(shí)間(從15士3°C升到28士3°C)和保溫時(shí)間(溫度高于28°C，即設(shè)定溫度的時(shí)間)。第一部分的VAF溫度影響試驗(yàn)(見(jiàn)下)用的是冷適應(yīng)性(ca)A/Sydney/05/97病毒株(H3N2型)。本實(shí)施例的第二部分主要用于確定最佳的保溫時(shí)間(“在此溫度下的持續(xù)時(shí)間”)。在第三部分中測(cè)定了通過(guò)上述試驗(yàn)確定的保溫時(shí)間對(duì)5株其他病毒(表5)的影響。在實(shí)施例的各個(gè)部分中，1.0-3.0L蔗糖磷酸鹽谷氨酸鹽(SPG)穩(wěn)定的VAF通過(guò)過(guò)濾裝置進(jìn)行過(guò)濾，該體積是典型的病毒種子規(guī)模，約等于推薦mVH處理規(guī)模的130到110。.目前常用的制備過(guò)程是VH收獲以后進(jìn)行離心、穩(wěn)定化、冷凍，以便于下一步的運(yùn)輸。在這些實(shí)施例中，從未經(jīng)穩(wěn)定的樣品中取出一部分VAF進(jìn)行離心，然后用SPG穩(wěn)定，經(jīng)目前常用的制備過(guò)程處理，作為本實(shí)施例所有部分中經(jīng)過(guò)濾的VAF的對(duì)照。H一部分溫度對(duì)過(guò)i虎過(guò)蔣中A/Svdnev/05/97病毒滴Itg^奪的影口向?yàn)榱舜_定溫度對(duì)毒力損失的影響，進(jìn)行了兩組在不同溫度下的過(guò)濾試驗(yàn)。每組都包括3個(gè)平行試驗(yàn)，用同一批雞蛋收集的VAF在同一天進(jìn)行。在這些試驗(yàn)中，VAF收集后用SPG穩(wěn)定，然后分為三份，在過(guò)濾前分別于5士3°C(冰箱)、20士3°C(工作臺(tái)上)和31士3°C(水浴)放置60分鐘。在此期間，瓶?jī)?nèi)的VAF每10分鐘顛倒混合一次。保溫完成以后用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾。在對(duì)照試驗(yàn)中，VAF只進(jìn)行離心穩(wěn)定化處理。不同條件下所得到的TCID5tl值互相比較并與對(duì)照組比較。為了確定VAF溫度對(duì)毒力損失的影響，VAF在過(guò)濾前分別于5士3°C、20士3°C和31士3°C放置60分鐘。經(jīng)離心、穩(wěn)定化處理的樣品和經(jīng)不同溫度處理的過(guò)濾后樣品的毒力變化、神經(jīng)酰胺酶活性和血凝素活性差異列在表5-10中。從表中可以看出，經(jīng)冷處理(5士3°C)和室溫處理(20士3°C)的VAF經(jīng)過(guò)濾后的毒力損失在0.7到LOlogiciTCID50/rnL(見(jiàn)表5和表8)。但是當(dāng)VAF在31士3°C保溫60分鐘(升溫時(shí)間30分鐘，在設(shè)定溫度保溫30分鐘)后再過(guò)濾則其滴度無(wú)明顯下降(與經(jīng)離心、穩(wěn)定化處理的VAF相比)。見(jiàn)表5和表8。另外，當(dāng)VAF升溫到31士3°C后與經(jīng)冷處理和室溫處理的樣品相比，經(jīng)過(guò)濾后的神經(jīng)酰胺酶活性要高。見(jiàn)表6和表9。加上加溫步驟也可以減少血凝素活性的損失。見(jiàn)表7和表10。Il二部分石角定A/Svdney/05/97經(jīng)過(guò)濾后毒力損失達(dá).到丨可接警伯7k平所需要白勺加溫時(shí)間為了確定所需的加溫時(shí)間，過(guò)濾前在31士3°C水浴中加溫VAF，然后進(jìn)行一系列試驗(yàn)。在對(duì)照試驗(yàn)中，VAF用SPG穩(wěn)定后立即過(guò)濾。在所有試驗(yàn)中，加溫時(shí)間定義為VAF處于水浴(即31士3°C)中的總時(shí)間(升溫時(shí)間加上保溫時(shí)間)。瓶?jī)?nèi)的VAF每10分鐘顛倒混合一次。保溫完成以后用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾。在對(duì)照試驗(yàn)中，VAF只進(jìn)行離心穩(wěn)定化處理，這代表了目前常規(guī)的制備過(guò)程。不同條件下所得到的TCIDki值互相比較并與對(duì)照組比較。為了確定過(guò)濾caA/Sydney/05/97前所需要的加溫時(shí)間進(jìn)行了一系列試驗(yàn)，其中VAF在過(guò)濾前加溫到31士3°C，一組試驗(yàn)分別保持30、90和180分鐘，另一組試驗(yàn)分別保持30,60和90分鐘。在對(duì)照試驗(yàn)中，VAF在用SPG穩(wěn)定后不經(jīng)加溫直接過(guò)濾。經(jīng)過(guò)濾的VAF和對(duì)照組的病毒毒力、神經(jīng)酰胺酶活性和血凝素活性列于表11-16中。試驗(yàn)結(jié)果表明VAF保溫于31士3°C可降低過(guò)濾后的病毒毒力損失，并且可部分恢復(fù)神經(jīng)酰胺酶和血凝素的活性。見(jiàn)表11-13。在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(收獲后、加溫前)未進(jìn)行穩(wěn)定化處理的VAF的溫度是15士2°C。1-1.5LVAF加溫到31士3°C所需要的時(shí)間大約為20-30分鐘。因此，30分鐘的VAF總加溫時(shí)間中在31士3°C的保溫時(shí)間為0_10分鐘。使過(guò)濾導(dǎo)致的毒力損失降到最低所需要的最短加溫時(shí)間由第二個(gè)系列的試驗(yàn)確定。見(jiàn)表14-16(第一組)和表17-19(重復(fù)試驗(yàn))。測(cè)定O和30分鐘總加溫試驗(yàn)中的過(guò)濾后毒力損失、HA和NA下降水平。在60分鐘和90分鐘總加溫時(shí)間(31士3°C下的保溫時(shí)間分別為30-40分鐘和60-70分鐘)試驗(yàn)中，過(guò)濾后病毒的毒力、HA和NA水平與對(duì)照樣品(只經(jīng)過(guò)離心和穩(wěn)定化的VAF)相同。見(jiàn)表14-19。第三部分加溫對(duì)其他病毒株的影響利用A/Sydney/05/97以外的其他5株病毒，即2XH1N1、1XH3N2和2XB進(jìn)行一系列試驗(yàn)以評(píng)價(jià)加溫步驟對(duì)A/Sydney/05/97之外的其他病毒株過(guò)濾的影響。VAF在過(guò)濾前加溫到31士3°C，持續(xù)60分鐘(升溫時(shí)間30分鐘，保溫時(shí)間30分鐘)。經(jīng)加溫處理以后，用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾。在對(duì)照試驗(yàn)中，VAF在室溫下用SPG穩(wěn)定后馬上過(guò)濾。不同條件下所得到的TCID5tl值互相比較并與對(duì)照組比較。對(duì)于所檢測(cè)的5株其他冷適應(yīng)性流感病毒來(lái)說(shuō)，與不經(jīng)加溫處理的樣品相比，短時(shí)間(總加溫時(shí)間為60分鐘)置于31士3°C(在設(shè)定的溫度下保溫30-40分鐘)可使A/Sydney/05/97和B/Victoria/504/2000經(jīng)過(guò)濾后的毒力損失減少，但是對(duì)于其他病毒株的毒力沒(méi)有影響。這些試驗(yàn)所測(cè)得的毒力(TCID5ciAiL)、神經(jīng)酰胺酶活性和血凝素活性總結(jié)在下面的表20-25中。從表中可以看出，在用SartocleanCA前濾膜和Sartopore2無(wú)菌梯級(jí)濾膜過(guò)濾前通過(guò)本發(fā)明的方法將穩(wěn)定化的病毒收獲物加溫到31士3°C、甚至到36°C(1-1.5LVAF置于瓶中，保溫60-90分鐘)所導(dǎo)致的A/Sydney/05/97毒力下降水平(0-0.31og10TCID50/ml)是可以接受的。在對(duì)照試驗(yàn)中，穩(wěn)定化的A/Sydney/05/97病毒收獲物不經(jīng)加溫就進(jìn)行過(guò)濾，其毒力損失可達(dá)1.01og10TCID50/mL·從這些表中還可以看出，所檢測(cè)的所有6株冷適應(yīng)性流感病毒短時(shí)間(升溫和保溫時(shí)間共60分鐘)置于31士3°C(在31士3°C保溫30-40分鐘)或者可以使過(guò)濾過(guò)程中的毒力損失降低，或者對(duì)過(guò)濾過(guò)程中額外的毒力損失沒(méi)有影響。在所有的試驗(yàn)中，過(guò)濾后的滴度下降都不超過(guò)0.31ogTCID50/mlo與未加溫的樣品相比，加溫的VAF經(jīng)過(guò)濾后的病毒表面蛋白(神經(jīng)酰胺酶和血凝素)的活性損失減少，這個(gè)結(jié)果支持TCID5tl試驗(yàn)所得到的毒力損失數(shù)據(jù)。因此，這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明包含過(guò)濾CAIV(MVS、MWVS或VH)所需的加溫時(shí)間的某些實(shí)施方式中，經(jīng)60分鐘加溫(將VAF升溫到31士3°C的時(shí)間和保溫時(shí)間(處于設(shè)定溫度的時(shí)間)至少30分鐘)后再過(guò)濾所導(dǎo)致的毒力損失是可以接受的。這種對(duì)加溫的耐受性是未預(yù)料到的新結(jié)果，特別是與其他過(guò)濾方法相比時(shí)。見(jiàn)上。另外，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是含加溫/過(guò)濾步驟的本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制。換言之，只要不偏離本發(fā)明的精神，也可以選擇其他的過(guò)濾裝置和過(guò)濾方法。第四組本發(fā)明的第四組包括表1中的步驟12-15。這些步驟主要涉及含病毒液體的穩(wěn)定化(通過(guò)添加組分、改變緩沖液/NAF比例等)和毒力/無(wú)菌分析。在某些實(shí)施方式中，含活病毒的病毒溶液/疫苗是以液體形式穩(wěn)定存在的，在4°C條件下保持穩(wěn)定性的時(shí)間足以保證在整個(gè)流感病毒免疫季節(jié)(在北半球一般是指9月到4月)能以液體的形式儲(chǔ)存(如冷藏在4°C的條件下銷售和分銷等)。因此，病毒/疫苗組合物需要在儲(chǔ)存期內(nèi)保持其毒力，或者毒力即使下降也是以可接受的速率下降。例如，如果可接受的毒力損失是0.31og，儲(chǔ)存期是9個(gè)月，那么毒力以每月0.051og的速率下降是可以接受的。另外，使用FFA可使可接受的毒力損失幅度更大。例如，如果毒力損失允許到0.751og，那么低于或等于每月0.091og的毒力下降速率就足以保證置于冰箱內(nèi)(如4°C)的材料的穩(wěn)定性。在其他實(shí)施方式中，這種以液體形式存在的溶液/疫苗在約2°C到8°C的條件下是穩(wěn)定的。在另外的實(shí)施方式中，溶液/疫苗在室溫下是穩(wěn)定的。由于用NAF稀釋(見(jiàn)下)，本文的典型實(shí)施方式不會(huì)出現(xiàn)免疫原性的下降(或者微小幅度的下降)。病毒收獲物的濃縮/滲濾在本文的某些實(shí)施方式中，病毒收獲物還可以選擇用適當(dāng)?shù)闹訚饪s。流感病毒溶液被濃縮后可以達(dá)到不出現(xiàn)明顯的病毒毒力/活性的損失。這種不出現(xiàn)毒力損失的濃縮是很令人驚奇的，因?yàn)橐郧暗难芯勘砻鏉饪s會(huì)導(dǎo)致毒力的下降。病毒的濃縮可在純化/制備過(guò)程的很多點(diǎn)上進(jìn)行，如表1所描述的，其目的在于提高病毒顆粒的濃度并去除其他蛋白、RNA等。例如，濃縮可在毒力分析前、甚至毒力分析后進(jìn)行，但是在許多實(shí)施方式中是在第四組的步驟內(nèi)/步驟間進(jìn)行。病毒顆粒濃縮液可用于純化、疫苗制備和特征分析。見(jiàn)《病毒學(xué)方法禾口技術(shù)》(MethodsandTechniquesinVirology),PierrePayment禾口MichelTrudel,MarcelDekker，Inc.，(1993)。由于某些VAF樣品內(nèi)的病毒量可能很少，因此某些分析技術(shù)如分析超離心(AUC)、圓盤式離心、襯質(zhì)輔助激光解吸與電離(MALDI)、顆粒計(jì)數(shù)等就無(wú)法用于病毒顆粒的直接分析。以前從雞蛋NAF等中濃縮病毒的傳統(tǒng)方法是通過(guò)梯度純化離心技術(shù)進(jìn)行的。見(jiàn)“從尿囊液中濃縮和純化流感病毒”Arora等，《分析牛物化學(xué)》(AnalyticalBiochemistry),144:189-192(1985)。但是本文的實(shí)施方式用的是尺寸排斥色譜柱。不論是通過(guò)雞蛋制備方法、細(xì)胞培養(yǎng)物制備方法(如Vero細(xì)胞)還是質(zhì)?；厥罩苽浞椒ǖ戎苽涞牟《径伎梢员粷饪s。另外，不同的病毒和/或病毒株(如A型流感病毒和B型流感病毒都適用此處理方法)以及同一病毒株的不同批次都可進(jìn)行濃縮以確保產(chǎn)物的質(zhì)量。另外，通過(guò)尺寸排斥色譜柱進(jìn)行的濃縮常常作為檢測(cè)雞蛋等的收獲物內(nèi)病毒顆粒量的指標(biāo)。因此，峰面積(從色譜柱上洗脫下來(lái)的病毒的峰面積)可替代這種溶液的TCID5tl值，或者作為TCID5tl值之外的一個(gè)指標(biāo)。這種指標(biāo)特別適用于用雞蛋制備的病毒。另外，濃縮和純化的病毒材料還可以作為制備純的HA、NA和其他病毒成分的起始材料用于進(jìn)一步的研究。還有就是SEC純化的病毒使我們可以更好地了解病毒的結(jié)構(gòu)及其與宿主細(xì)胞的結(jié)合機(jī)制。由于在大多數(shù)VAF(病毒尿囊液)材料中病毒顆粒的量都低于UV的檢測(cè)下限，因此病毒的濃縮對(duì)進(jìn)一步了解病毒的特征是很有幫助的。在病毒收獲物的濃縮過(guò)程中，尺寸排斥色譜柱如帶加壓的中空纖維過(guò)濾器的MidGee或QuixStand(Amersham)可用于去除雜質(zhì)和/或不想要的緩沖液/液體。因此濃縮的病毒還可以很容易地被懸浮或儲(chǔ)存在特殊的緩沖液/穩(wěn)定劑中。見(jiàn)下。為了說(shuō)明病毒收獲物樣品的濃縮過(guò)程，濃縮和分析通過(guò)交叉流動(dòng)過(guò)濾VAF得到的A/NewCaledonia流感病毒收獲物。當(dāng)然，需要再次強(qiáng)調(diào)的是本部分的技術(shù)并不限定只能用于特定的病毒株/特定類型的病毒。這種濃縮方法可濃縮病毒顆粒、去除大部分的雜質(zhì)，并且能保持病毒的感染性。如本文所描述，病毒的感染性通過(guò)CELISA(TCID5ci)來(lái)檢測(cè)。血凝素活性通過(guò)HA試驗(yàn)來(lái)測(cè)定，神經(jīng)酰胺酶活性通過(guò)SEC試驗(yàn)來(lái)測(cè)定，NAF通過(guò)RHPLC來(lái)檢測(cè)，RNA通過(guò)RT-PCR來(lái)檢測(cè)。下面實(shí)施例中病毒的濃縮是禾丨J用Amersham的CrossFlowFiltrationUnitMidGee來(lái)完成的。MidGee在2-3小時(shí)內(nèi)可將100或200ml的溶液濃縮到10ml。同樣，利用QuixStand可在4到6小時(shí)內(nèi)將病毒顆粒從2L濃縮到100ml。病毒的濃縮不僅可以提高病毒顆粒計(jì)數(shù)，而且可以去除大部分雜質(zhì)如雞蛋蛋白、RNA和小分子物質(zhì)如尿酸。用于下述實(shí)施例的病毒是A/NewCaledonia/20/99。NAF含有冷適應(yīng)性的流感病毒。雞血來(lái)自ColoradoSerum公司(Denver，CO)。濃縮用的設(shè)備來(lái)自AmershamBiosciences(A/GTechnologyCorporation)禾口一個(gè)帶螺動(dòng)泵的MidJet%統(tǒng)(WatsonMarlowe)。iHfffi白勺fei普f(shuō)eJfe自AmershamBiosciences(A/GTechnologyCorporation)，是一個(gè)額定截留分子量為750，OOO的MidGeeHoopCrossFlowFilter。但是，需要再次強(qiáng)調(diào)的是使用或引用特定模式、特定廠家等的設(shè)備并不意味著對(duì)本發(fā)明的限制。本實(shí)施例所用的洗滌緩沖液是IX-SPG。SEC所用的設(shè)備是HewelttPackardHP1100HPLC系統(tǒng)，色譜柱是Waters的Ultrahydrogel1000，尺寸為7.8X300mm。SEC所用的緩沖液是HycloneSolvent的Dulbecco磷酸緩沖鹽水，方法中包括的等位條件為流速0.5ml/min，在210和280nm處監(jiān)測(cè)。RHPLC所用設(shè)備來(lái)自Waters，色譜柱是YMCC4(反向)，2.1X250mm,5um,300A。RHPLC的方法是流動(dòng)相-A0.1%TFA水溶液；B95%CAN0.09%TFA；洗脫條件-梯度變量，13-100%B；流速0.2ml/min；柱溫，45°C；加樣體積-50μ1；檢測(cè)波長(zhǎng)_214nm。如圖12所示，步驟1是在室溫下用MidJet設(shè)備濃縮150mlA/NewCaledonia/20/99。出入口之間的壓力維持在5到IOPSI之間。通過(guò)交叉濾膜循環(huán)2小時(shí)以后，150mlIX的樣品減少為15ml10X的濃縮樣品(步驟2)。分別收集滲透出的液體儲(chǔ)存起來(lái)作進(jìn)一步的分析。進(jìn)行特征分析時(shí)去掉4ml10X的樣品(步驟3)。剩余的Ilml10X的樣品用IX的SPG稀釋到110ml，然后通過(guò)滲透去除IX的SPG使其再濃縮到11ml。滲透出的液體攜帶了回流液的大部分雜質(zhì)。如步驟4和步驟5所示，此步驟用IX的SPG重復(fù)5次。經(jīng)洗滌的滲透液儲(chǔ)存起來(lái)作進(jìn)一步分析。第一次和第二次的洗滌液呈黃色。這是因?yàn)槿コu蛋蛋白和其他小分子雜質(zhì)造成的。經(jīng)第三次和第四次洗滌后滲透液的黃色消失。經(jīng)第五次洗滌以后，樣品用IX-SPG稀釋到IlOml使其濃度變回IX。在步驟6中，保存IOmllX-W用于分析。剩余的100ml1X-W進(jìn)一步濃縮成1X-W(步驟7)。這個(gè)濃縮的樣品分裝成Iml的小管用于進(jìn)一步的分析。利用SEC色譜技術(shù)分析所有的樣品。色譜柱為Ultrphydrogel100，溶劑為DPBS。即使采集了220、260、280nm處的數(shù)據(jù)，為了討論還需要比較220nm處的峰面積。色譜峰主要分為三大類一種是病毒的(滯留時(shí)間約為10.6min)，一種是第一組雜質(zhì)的(滯留時(shí)間為18到21min)，一種是第二組雜質(zhì)的(滯留時(shí)間為21到27min)。三種NAF蛋白-卵清蛋白、伴清蛋白和卵類黏蛋白約在18-21min時(shí)被洗脫。見(jiàn)圖13。溶菌酶的洗脫時(shí)間約為27.Omin。我們認(rèn)為第二組的雜質(zhì)由小分子如尿酸和其他未知的分子組成。所有洗脫下來(lái)的液體都以和病毒分析相同的條件用分析SEC色譜法進(jìn)行檢測(cè)。分組進(jìn)行CELISA、HA試驗(yàn)、NA試驗(yàn)和RT-PCR。SEC分析和CELLSAIX的樣品在11.1分鐘時(shí)出現(xiàn)病毒峰，峰面積為1221。見(jiàn)圖14。而濃縮的10X樣品的峰面積為11192，見(jiàn)圖15，與IX的樣品相比峰面積增加約9.16倍。見(jiàn)表26，11192/1221。這是根據(jù)以前的試驗(yàn)證明峰面積與注射的病毒樣品量成線性關(guān)系而計(jì)算出來(lái)的。在濃縮過(guò)程中，如果不進(jìn)行洗滌，雖然某些雜質(zhì)可以被去除，但是并不明顯。見(jiàn)表26、圖16a-b。從峰面積上看，10X樣品內(nèi)的第一組和第二組的雜質(zhì)與IX的樣品相比是增加的(表26)。相應(yīng)的，TCID5tl從log9.1升高到logl0.0(表27)。經(jīng)過(guò)此步驟，95.9%的感染性得以保留。這些結(jié)果說(shuō)明IX的樣品濃縮成10X的樣品可以完好地保留其感染性。用IX-SPG進(jìn)行第五次洗滌以后，樣品IX-W的病毒峰面積為1005，而洗滌前的病毒峰面積是1221(表26)。按照峰面積計(jì)算，IX和IX-W之間的回收率約為82%(1005/1221)。通過(guò)比較IX和IX-W的色譜圖(見(jiàn)圖17)，可以發(fā)現(xiàn)第一組和第二組雜質(zhì)顯著減少(表26)。IX-W的TCID5tl值有一個(gè)小的降低(表27，IX9.1，lX_W:log8.9)。IX和IX-W之間的感染性回收率約為98.99%(log8.9/log9.1)。洗滌步驟通過(guò)去除NAF蛋白和其他成分提高了病毒材料的質(zhì)量。同樣，通過(guò)比較IOX和10X-W發(fā)現(xiàn)第一組和第二組的雜質(zhì)大部分被去除(表26、圖18)。經(jīng)過(guò)5次洗滌以后，IOX的病毒峰面積為11，192，而10X-W的峰面積則降低到10，282(表26，按峰面積計(jì)回收率為91.86%)0TCID50從loglO.O(IOX)降低到log9.9(10X-W)，回收率為99.56%(表27)。通過(guò)比較IX-W和10X-W的色譜圖發(fā)現(xiàn)峰面積增加了10倍。見(jiàn)表26，1X_W的峰面積為1005，10X-W的峰面積為10，282。TCID5tl值也增加了1個(gè)log(表27，1X-W:log8.9，10X-W=Iog9.9)。通過(guò)一個(gè)步驟將IX-W濃縮成10X-W，無(wú)論從活性來(lái)看還是從峰面積來(lái)看都沒(méi)有損失(10X-W的峰面積為10282，IX-W的峰面積為1005)。滲透液的檢測(cè)結(jié)果表明在10.4min時(shí)出現(xiàn)一個(gè)病毒峰，峰面積為25。這可能是由于很少量的病毒顆粒丟失造成的，或者是某些其他蛋白與IX樣品內(nèi)的病毒一起被洗脫出來(lái)造成的。第一組和第二組的大部分雜質(zhì)被洗脫出來(lái)。見(jiàn)表26。CELISA值表明其感染性低于檢測(cè)的下限。這說(shuō)明在濃縮過(guò)程中沒(méi)有多少病毒顆粒能夠通過(guò)膜被洗脫出來(lái)。經(jīng)過(guò)5次洗滌可去除第一組和第二組的大部分雜質(zhì)，因而提高了病毒的質(zhì)量。這一點(diǎn)可從表26和圖19中看出來(lái)。經(jīng)過(guò)第二次洗滌以后第一組和第二組的大部分雜質(zhì)顯著減少。經(jīng)過(guò)第五次洗滌以后，曲線達(dá)到平臺(tái)期。但是，即使經(jīng)過(guò)第五次洗滌，樣品IX-W和10X-W內(nèi)仍然含有極少量的第一組和第二組雜質(zhì)。見(jiàn)圖20。峰在19.208min時(shí)的一致性通過(guò)從10X-W樣品中分離的卵清蛋白得到確證。SDS-PAGE也證明了這個(gè)結(jié)果。HA分析樣品1X和1X-W的HAU為1024。見(jiàn)圖21。濃縮的但沒(méi)有經(jīng)洗滌的10X的HAU為8192。但是，10X-W在HAU2和4處出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這可能是與雞RBC相比病毒量很大造成的。大量的神經(jīng)酰胺酶可反轉(zhuǎn)血凝素試驗(yàn)的結(jié)果。見(jiàn)《病毒培養(yǎng)、檢測(cè)和遺傳》(Viruscultivation,Detection,andGenetics),S.J.Flint,L.W.Enquist,R.M.Krug,V.R.Racaniello和A.M.Skalka，“病毒學(xué)原理”(PrinciplesofVirology),ASMPress,Washington，34頁(yè)，(2000)。滲透液內(nèi)沒(méi)有HAU的存在說(shuō)明在步驟1內(nèi)洗脫的病毒不多。見(jiàn)圖12。NA分析神經(jīng)酰胺酶活性分析結(jié)果表明10X稀釋回IX后的活性與IX相比下降。見(jiàn)圖22。這被認(rèn)為是由于VAF內(nèi)游離的NA蛋白丟失引起的。滲透液內(nèi)含有少量的NA也支持這一解釋。樣品IX-W和由10X-W稀釋成的IX-W的活性處于同一水平。這是因?yàn)闃悠?0X-W是由IX-W直接濃縮而成的。所有洗滌液的活性都處于檢測(cè)下限以下。RHPLC通過(guò)RHPLC分析雞蛋蛋白已經(jīng)找到了最佳的條件，因此，本實(shí)施例的所有材料都用相同的條件進(jìn)行分析，如C4色譜柱、0.TFA/乙睛梯度、214nm處監(jiān)測(cè)。卵類黏蛋白、溶菌酶、伴清蛋白和卵清蛋白的洗脫模式見(jiàn)圖23所示。在洗滌前10X樣品含有所有的雞蛋蛋白。這與對(duì)照樣品的滯留時(shí)間相匹配。10X還顯示出含有未知的病毒蛋白峰，分別標(biāo)記為U1、U2和U3。完全洗滌的樣品10X-W和1X-W依然保留了病毒蛋白Ul、U2和U3。由于這些蛋白的比例是相同的，因此這些蛋白可能來(lái)自與乙睛接觸時(shí)的病毒顆粒。但是，用1X-SPG洗滌5次以后10X樣品內(nèi)的卵類黏蛋白、溶菌酶和伴清蛋白被完全去除。與此相對(duì)應(yīng)，大多數(shù)可見(jiàn)的蛋白峰都是卵清蛋白，它還能隨10X-W和1X-W樣品一起被洗脫出來(lái)。即使10X-W和1X-W被洗滌6次和5次，還有與病毒結(jié)合的卵清蛋白。這可能是由于HA蛋白與卵清蛋白之間有較強(qiáng)的相互作用造成的。這些數(shù)據(jù)以柱形圖的形式顯示在圖24中。用RHPLC檢測(cè)滲透液和所有的洗出液。見(jiàn)圖25。滲透液含有所有種類的NAF蛋白和其他未知峰。卵類黏蛋白經(jīng)兩次洗滌后可被除去(見(jiàn)圖26)；溶菌酶經(jīng)兩次洗滌后也可被除去(見(jiàn)圖27)；伴清蛋白經(jīng)兩次洗滌后也可被除去(見(jiàn)圖28)；卵清蛋白逐漸耗竭，但是經(jīng)6次洗滌后依然有約5%的剩余。見(jiàn)圖29。AgilentBioanalyzer同時(shí)我們用AgilentBioanalyzer評(píng)估卵清蛋白的量，如圖30所示。樣品從IX濃縮到10X，只通過(guò)濃縮無(wú)需洗滌就可以將其中相當(dāng)數(shù)量的卵清蛋白去除。第一滲透液攜帶大部分的卵清蛋白，RHPLC結(jié)果顯示所有洗滌液中都含有卵清蛋白，但是用Bioanalyzer分析時(shí)其濃度卻在檢測(cè)限以下。10X-W樣品和1X-W樣品，檢測(cè)結(jié)果表明還是含有少量的卵清蛋白。從這些數(shù)據(jù)中可以看出通過(guò)濃縮和洗滌步驟可以去除95%的雞蛋蛋白。SDS-PAGE和蛋白印跡雜交IX(2道)，10X(9道)樣品含有多個(gè)顏色較深的銀染條帶。見(jiàn)圖31。與10X樣品相比，10X-W(10道)的條帶數(shù)較少。這是因?yàn)槿コ薔AF蛋白和其他雜質(zhì)。同樣，1X-W(8道)比IX干凈。樣品1X、10X稀釋成的IX(3道)和10XW稀釋成的1X-W(4道)含有相同數(shù)量的病毒，只是雜質(zhì)去除程度有不同程度的提高。顯然10X-W稀釋成的1X-W含有更清楚的病毒蛋白條帶。但是這個(gè)樣品依然含有卵清蛋白條帶，與6道的NAF相似。10X-W樣品通過(guò)分析SEC色譜柱進(jìn)一步純化，收集組分。見(jiàn)圖32。19.lmin時(shí)收集的組分通過(guò)SDS-PAGE分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這個(gè)組分含有大部分的卵清蛋白(5道)。這一點(diǎn)通過(guò)抗NAF的蛋白印跡雜交試驗(yàn)得到進(jìn)一步證實(shí)。這些結(jié)果表明即使經(jīng)過(guò)6次洗滌，卵清蛋白依然能夠與病毒緊密結(jié)合。切下抗NAF凝膠，與雞抗A/NewCaledonia抗體雜交，可以觀察到代表病毒蛋白撤(1和撤1或11蛋白的不同條帶。見(jiàn)圖31。RTPCRRTPCR結(jié)果表明10X樣品擴(kuò)增出的RNA比IX樣品高一個(gè)數(shù)量級(jí)。見(jiàn)圖33。同樣，10X-W樣品擴(kuò)增出的RNA也比1X-W高10倍。這說(shuō)明濃縮步驟可以保留大部分病毒。滲透液內(nèi)未檢測(cè)到病毒RNA，但是1X-SPG洗出液含有極少量的RNA，這可能是由于循環(huán)過(guò)程中少量病毒被剪切造成的，或者是在洗滌循環(huán)中某些病毒RNA與濾膜結(jié)合釋放較晚造成的?？傊?，利用交叉流動(dòng)過(guò)濾裝置可以達(dá)到濃縮A/NewCaledonia/20/99的目的。在此過(guò)程中病毒顆粒的感染性得以保持，這點(diǎn)可被CELISA試驗(yàn)證實(shí)。用1X-SPG洗滌濃縮的材料可去除其他雜質(zhì)，改善樣品的質(zhì)量。即使經(jīng)過(guò)第五次洗滌依然有少量的卵清蛋白與病毒緊密結(jié)合，這可能是由于卵清蛋白與HA或NA蛋白之間的強(qiáng)相互作用造成的。RHPLC、SDS-PAGE和蛋白印跡雜交結(jié)果支持這一蛋白-蛋白相互作用的觀點(diǎn)。原始和濃縮樣品之間RNA量的提高說(shuō)明通過(guò)此過(guò)程可回收大部分病毒。其他相似的技術(shù)也可用于分析細(xì)胞培養(yǎng)物制備的病毒樣品，例如在細(xì)胞如Vero細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的流感病毒樣品。為了說(shuō)明這一點(diǎn)，用Vero細(xì)胞培養(yǎng)3株病毒，分別是A/Beijing(A/H1N1)；A/Panama(A/H3N2)從2L濃縮成IOOml或20X；以及B/HongKongJA2L濃縮成IOml或200X。應(yīng)當(dāng)了解的是，由于Vero細(xì)胞產(chǎn)生的病毒量一般很低，因此本部分實(shí)施方式還適用于濃縮病毒樣品。與上面所描述的一樣，AmershamMidGee和QuixStandInstrument可用于病毒濃縮。圖34-35顯示了A/Beijing細(xì)胞培養(yǎng)物病毒擴(kuò)增情況(圖34)和A/BeijingVero細(xì)胞收獲物(圖35)的SEC監(jiān)測(cè)結(jié)果。從中可以看出SEC是短期監(jiān)測(cè)病毒擴(kuò)增情況的有效技術(shù)。這種監(jiān)測(cè)所需要的樣品量一般很少(如100μ1)。圖36顯示的是2LA/Panama細(xì)胞培養(yǎng)物樣品的濃縮情況。用QuixStand將2L病毒收獲物濃縮成100ml。見(jiàn)上。IX混合物的TCID5tl檢測(cè)不到，但是20X混合物的TCID5tl為4.4。這是20X對(duì)IX的峰面積比。Panama細(xì)胞培養(yǎng)物樣品的濃縮結(jié)果說(shuō)明了交叉流動(dòng)過(guò)濾方法的優(yōu)點(diǎn)，如病毒顆粒濃度可有效提高，低分子量的雜質(zhì)可被從溶液中去除以及可進(jìn)行滲濾以進(jìn)一步“清潔”溶液。圖37顯示的是2LB/HongKongVero細(xì)胞培養(yǎng)物濃縮成IOml的情況。IX的l0g1(1TCID5(1/ml是4.7，而18.8X的log10TCID50/ml是5.8(理論值是5.95)，200X的log10TCID50/ml是6.95(理論值是7.00)。從上面的圖中可以看出，SEC是一種有用的監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒生長(zhǎng)的技術(shù)；可用于分析經(jīng)濃縮后的極低滴度的病毒；也可用于分析經(jīng)濃縮后的低滴度病毒。穩(wěn)定劑/緩沖液本發(fā)明包括病毒溶液組合物和制備該組合物的方法。這種組合物還可以包含各種稀釋液用于稀釋含目的病毒的NAF(—般是指未分離的NAF)以及蔗糖、精氨酸、明膠、EDTA等的混合物，如本文所詳細(xì)描述的。如本文所指出的，各種組合物含有10%到60%的NAF。NAF可能含有各種酶如核酸酶、溶菌酶等，這些酶可破壞病毒組合物的穩(wěn)定性。這些方法和組合物在特定的溫度(如一般為4°C、5°C、8°C，約2°C到8°C或高于2°C等)下在所選定的時(shí)間段(一般至少6個(gè)月、至少9個(gè)月、至少12個(gè)月、至少15個(gè)月、至少18個(gè)月、至少24個(gè)月等)內(nèi)最好是穩(wěn)定的(即，不會(huì)出現(xiàn)不可接受的毒力損失)。優(yōu)選的實(shí)施方式顯示在預(yù)定儲(chǔ)存期內(nèi)毒力是沒(méi)有損失的。其他的實(shí)施方式顯示毒力的損失低于10%、5%、4%、3%、2%或1%。本文的病毒組合物的毒力可用FFU或熒光聚焦單位(見(jiàn)下文關(guān)于FFA分析的描述)表示。靶FFU—般根據(jù)O時(shí)間點(diǎn)時(shí)的病毒濃度來(lái)設(shè)定(如，由于NAF的稀釋等)。因此，優(yōu)選的實(shí)施方式應(yīng)該是起始值降低很少或沒(méi)有降低。在本文的許多組合物中，病毒溶液含有約5%到10%的蔗糖、約到4%的精氨酸和約到4%的明膠。某些優(yōu)選的實(shí)施方式含有約7%-10%的蔗糖、約2%的精氨酸和約2%的明膠。在某些實(shí)施方式中，在預(yù)定溫度下將病毒制劑儲(chǔ)存以后需要用FluMist的涂布/噴灑(applicator/accuspray)裝置或其他類似裝置測(cè)定組合物的穩(wěn)定性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含穩(wěn)定劑如精氨酸(pH約為7.0-7.2)的組合物，中的穩(wěn)定劑與明膠一起使用，或者替代明膠或者明膠相關(guān)的和/或來(lái)源的產(chǎn)物(如明膠水解物)。見(jiàn)表1的步驟12和15。但是，目前的法規(guī)考慮到動(dòng)物和動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)品如明膠、膠原等可能造成非故意的污染(如引入朊病毒、支原體或宿主病毒的問(wèn)題)，以及考慮到動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)物可能會(huì)產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)，因此需要使用非動(dòng)物性穩(wěn)定劑。精氨酸單獨(dú)使用或者和其他賦形劑如金屬離子螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA)和/或其鹽)或其他氨基酸(如組氨酸和/或其鹽)一起使用能夠穩(wěn)定含非動(dòng)物性賦形劑的冷適應(yīng)性流感病毒制劑。在許多實(shí)施方式中，精氨酸還可以包含無(wú)機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽。當(dāng)然，鹽一般是指藥用鹽，因?yàn)樗幱名}可用作疫苗的組分。通常優(yōu)選的鹽包括鹽酸鹽、檸檬酸鹽和硫酸鹽。這類穩(wěn)定劑的使用量并無(wú)特殊限制，但是一般的用量范圍為1ml病毒溶液約含5mg到60mg。優(yōu)選用量約為1ml病毒溶液含10mg到50mg，更優(yōu)選的用量約為1ml病毒溶液含10mg到25mg。在其他實(shí)施方式中，精氨酸用量約為病毒溶液的；1.5%；2%；3%；4%到5%。本發(fā)明的不同實(shí)施方式穩(wěn)定劑的用量是不同的。在本發(fā)明的另外一些實(shí)施方式中，病毒溶液/疫苗溶液還可以包含磷酸鉀。在某些實(shí)施方式中，溶液含有約llmM的磷酸鉀。在另外一些實(shí)施方式中，溶液含有約10mM到12mM的磷酸鉀。組合物制劑還可以含有實(shí)質(zhì)量的雞蛋尿囊液成分(如蛋白質(zhì)和代謝物)和/或緩沖稀釋劑。另外，藥用疫苗組合物可以含有緩沖鹽，如5到200mM的一價(jià)的或二價(jià)磷酸鈉或磷酸鉀，或者含有25到100mM的組氨酸和/或其鹽。在優(yōu)選實(shí)施方式中，蔗糖含量約為100mM到350mM。許多病毒溶液/疫苗溶液還可以使用SPG堿溶液(蔗糖、磷酸鉀和一價(jià)谷氨酸鈉)。但是，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，病毒/疫苗溶液不含MSG。在另外一些實(shí)施方式中，MSG的含量是減少的。可用于本文實(shí)施方式中的蔗糖含量范圍很寬。一般的實(shí)施方式所含的蔗糖為0.2M(7%W/V)，但是，組合物中的蔗糖含量即使高達(dá)20%也不會(huì)對(duì)病毒活性/毒力造成損害。組合物的各種實(shí)施方式所含有的表面活性劑包括Poloxamer188(聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段共聚物，如PluronicF68)和Tween20(聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯)，濃度范圍為0.01%到0.(ff/V%)在某些實(shí)施方式中，含Poloxamer、明膠水解物和精氨酸的溶液優(yōu)于只含一種組分的溶液，含穩(wěn)定劑的溶液都要比不添加任何額外成分的溶液更穩(wěn)定。在另外的實(shí)施方式中，第四組的步驟(如表1的步驟15)包括更換全部或部分正常尿囊液(NAF)，其中病毒用蔗糖、磷酸鉀和一價(jià)谷氨酸鈉緩沖液(SPG)或其他簡(jiǎn)單溶液，如含減量MSG的溶液等懸浮。利用SPG更換部分或全部NAF稀釋液可使病毒在溶液中更穩(wěn)定。這種穩(wěn)定性也是本發(fā)明實(shí)施方式的一個(gè)未預(yù)料到的新優(yōu)點(diǎn)。我們制備了可體現(xiàn)制劑的上述部分或全部特性的典型制劑，并且評(píng)價(jià)了其組分冷適應(yīng)性病毒的穩(wěn)定性。典型制劑組合物列在表28中。制劑在5°C下的穩(wěn)定性見(jiàn)表29。我們測(cè)定了本發(fā)明的各種制劑在不同月內(nèi)和不同溫度下的穩(wěn)定性。例如，表30闡述了12種不同的制劑。制劑10和11是利用干病毒制備物制備的制劑。該表中的制劑涵蓋了各種組分，如蔗糖和明膠。表31-34描述的是含4種不同病毒株的制劑在6個(gè)月內(nèi)的穩(wěn)定性(每種制劑取兩個(gè)樣品點(diǎn))。圖38用圖表描述了含B/HongKong病毒株的4種典型制劑。表35描述的是其他制劑的組合物。表15中的組合物檢測(cè)了在基礎(chǔ)組合物(即，一般為10/2/2，是指約含10%的蔗糖、2%的精氨酸和2%的明膠)添加各種化合物對(duì)抑制NAF內(nèi)有害成分如溶菌酶等的作用。表35中制劑的穩(wěn)定性結(jié)果列于表36到表39和圖39到40中。表40和41及圖41a-c描述的是改變制劑(這里是指約含10%蔗糖、明膠和2%精氨酸的基礎(chǔ)制劑)內(nèi)檸檬酸鹽的濃度所產(chǎn)生的影響。含檸檬酸鹽的制劑在儲(chǔ)存約7-8個(gè)月23時(shí)會(huì)出現(xiàn)沉淀。表42和43及圖42a-c描述的是一個(gè)類似的試驗(yàn)結(jié)果，但是其中EDTA的濃度是不同的。上述實(shí)施例中典型制劑的進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表44和圖45a-d。含不同濃度蔗糖、明膠、精氨酸和EDTA的其他制劑見(jiàn)表46到48的描述。為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的幾種單價(jià)制劑的穩(wěn)定性，我們檢測(cè)了含60%尿囊液的組合物的穩(wěn)定性。樣品儲(chǔ)存于5°C，通過(guò)FFA試驗(yàn)進(jìn)行分析。頭兩個(gè)月內(nèi)每?jī)芍苋∫淮螛?，然后每月取一次樣，共?個(gè)月。利用含60%AF的組合物制備出具有所需毒力的VH的可能性很高，即使是低滴度的病毒株在幾年內(nèi)依然能保持所需的毒力。某些使用未純化VH的制劑也具有足夠的穩(wěn)定性，對(duì)于所有檢測(cè)的病毒株來(lái)說(shuō)，幾乎都符合在5°C的條件下7個(gè)月內(nèi)毒力下降0.51og的標(biāo)準(zhǔn)。流感病毒株B/HongKong/330/01可能是進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)的所有病毒株中最容易出問(wèn)題的。見(jiàn)表30，該表給出了13種不同制劑內(nèi)蔗糖、精氨酸、明膠和其他組分的百分含量。圖43描述的是4種病毒株在這種制劑中9個(gè)月后的穩(wěn)定性。未純化病毒組合物的典型制劑含有VH、10%蔗糖、2%精氨酸、2%明膠；VH、10%蔗糖、2%精氨酸；VH、10%蔗糖、2%精氨酸、右旋糖酐；VH、10%蔗糖、2%精氨酸、0.5%PVP；VH、10%蔗糖、2%精氨酸、2%明膠、2.5mMEDTA；VH、10%蔗糖、2%精氨酸、2%明膠、檸檬酸鹽緩沖液；以及VH、10%蔗糖、2%精氨酸、2%明膠、組氨酸緩沖液。病毒/疫苗溶液純化(如為了穩(wěn)定化等)的其他方法包括這類技術(shù)如通過(guò)分餾去除所有的NAF(—道添加穩(wěn)定劑)以提高溶液的穩(wěn)定性。但是本發(fā)明的許多實(shí)施方式包括將含病毒/疫苗的NAF稀釋出來(lái)。例如，在本文的許多實(shí)施方式中，NAF的濃度一般約占溶液的10%到60%。在另外一些實(shí)施方式中，NAF約占溶液的20%到50%、或30%到40%。對(duì)NAF的這種稀釋可提高病毒/疫苗溶液的穩(wěn)定性，尤其是以液體形式保存在需要的溫度下(如4°C、約2°C到8°C等)。另外，本發(fā)明的某些實(shí)施方式包括降低NAF的濃度并且使用精氨酸(見(jiàn)上)。比較本發(fā)明的不同制劑和病毒組合物的無(wú)NAF純化制劑或低NAF(但還是NAF純化的)制劑的穩(wěn)定性。表49描述的是本發(fā)明組合物的各種制劑以及含有以各種方式從NAF中純化出的VH的制劑。應(yīng)當(dāng)理解的是表49中所描述的基礎(chǔ)制劑一般含有約2%的精氨酸、約2%的明膠、約的PVP、約的優(yōu)選糖酐、約2.7mMEDTA和約IOOmM的組氨酸。表49中的數(shù)字與圖44-46所示的制劑相對(duì)應(yīng)。本發(fā)明經(jīng)稀釋的NAF實(shí)施方式與其他的穩(wěn)定化方法相比較，即其最終制劑中含有10-25%的分餾NAF、甚至5%或更少的分餾NAF。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為某些實(shí)施方式中存在的NAF不含這類分餾NAF而是用未分餾的NAF代替是最好的。本發(fā)明的制劑在穩(wěn)定性方面與目前所用的純化NAF(如分餾的NAF等)制備的其他病毒溶液是不同的。比較的目的在于在2°C到8°C、如4°C的條件下儲(chǔ)存時(shí)病毒在12個(gè)月內(nèi)的毒力損失低于或等于1.0log，或者低于或等于每月0.080log。目前所用的其他用作本發(fā)明制劑對(duì)照品的病毒制劑是通過(guò)分餾、滲濾等方法純化的。3株不同的流感病毒用來(lái)測(cè)試不同的制劑形式H1N1株(A/NewCaledonia/20/99或A/NC)、H3N2株(A/Panama/2007/99或A/Pan或Α/ΡΑ)和B株(B/HongKong/330/01或Β/ΗΚ)。制劑加入到Accusprayers(即FluMist的轉(zhuǎn)移裝置)內(nèi)。為了模擬可能的制備過(guò)程，樣品于_25°C冷凍6天作為試驗(yàn)的第一步。在第一組比較試驗(yàn)中，比較NAF純化的冷適應(yīng)性三價(jià)制劑和本發(fā)明的未純化NAF制劑的穩(wěn)定性。本發(fā)明的制劑含有7%的蔗糖、的明膠、的精氨酸(這是作為對(duì)照的三價(jià)制劑的標(biāo)準(zhǔn))和60%的AF(尿囊液)。本發(fā)明的制劑經(jīng)過(guò)6個(gè)月后，其含有的A/NC的毒力損失速度為-O.035士0.016，A/Pan的毒力損失速度為-0.079士0.035，B/HK的毒力損失速度為-0.151士0.018。而純化組合物的測(cè)定值分別為A/NC的毒力損失速度為-O.020士0.027，A/Pan的毒力損失速度為-0.011士0.020，B/HK的毒力損失速度為-0.138士0.022。上述數(shù)值的單位是IogFFU/月。見(jiàn)表50。表51描述的是純化的制劑和本發(fā)明的制劑之間的比較，本發(fā)明的制劑用的是上述的10/2/2組合物。所觀察到的較高初始毒力損失被認(rèn)為是由于凍融和/或混合造成的。表52描述的是相似的比較，只是FluMist制劑包含的是組氨酸，組氨酸可以提供更好的穩(wěn)定性，并且不會(huì)造成初始的毒力損失。圖44說(shuō)明了上面所觀察到的初始毒力損失(冷凍和/或混合損失)只存在于磷酸鹽緩沖制劑。組氨酸緩沖制劑無(wú)初始毒力損失，組氨酸對(duì)穩(wěn)定性有促進(jìn)作用。圖44所顯示的制劑是表49所列的那些制劑。圖45描述的是經(jīng)過(guò)6個(gè)月后表49所示制劑的穩(wěn)定性斜率的“球形”圖。如圖所示，組氨酸緩沖的10/2/2制劑展示了穩(wěn)定性和符合靶目標(biāo)的最佳組合。見(jiàn)上。圖46從不同角度展示了同一數(shù)據(jù)(即以每周的變化代替每月的變化)。圖47描述的是第二組試驗(yàn)，其結(jié)果說(shuō)明了含明膠(L106)或PVP/EDTA(L104)的10/2/2+組氨酸制劑的穩(wěn)定性。從圖中可以看出用PVP/EDTA代替明膠所產(chǎn)生的穩(wěn)定性幾乎與明膠相同。圖48描述的是本發(fā)明的含組氨酸的10/2/2制劑的最佳pH。如圖所示，pH7.0是優(yōu)選的實(shí)施方式。本發(fā)明的實(shí)施方式還包括PH約為6.8到7.2的含IOOmM組氨酸的10/2/2制劑。圖49描述的是本發(fā)明的實(shí)施方式中優(yōu)選的蔗糖濃度。某些優(yōu)選的實(shí)施方式約含10%的蔗糖，而另一些實(shí)施方式含有的蔗糖約為7%。圖49中的基礎(chǔ)制劑是上述的10/2/2加上蔗糖和組氨酸。在本文描述的各種實(shí)施方式中，某些實(shí)施方式包含作為緩沖添加劑的組氨酸和/或作為穩(wěn)定劑的精氨酸和/或右旋糖酐和/或替代明膠的PVP。本發(fā)明的其他實(shí)施方式還可以通過(guò)超濾/濃縮病毒/疫苗溶液進(jìn)行穩(wěn)定。這種超濾一般作為達(dá)到溶液穩(wěn)定性的減少/稀釋NAF的替代方法。例如，如果在某些情況下特定病毒株/溶液的滴度或毒力較低，那么可用超濾方法來(lái)代替NAF稀釋(NAF稀釋會(huì)進(jìn)一步降低溶液的病毒滴度/毒力)。第四組步驟中的超濾與上述的微孔過(guò)濾稍微有些不同。上一組中的過(guò)濾步驟是用于除菌，而本組中的過(guò)濾步驟涉及穩(wěn)定性等，過(guò)濾過(guò)程中的病毒得以保留。見(jiàn)上。毒力分析在本文的某些實(shí)施方式中，病毒/疫苗的毒力是通過(guò)細(xì)胞ELISA(即以細(xì)胞為基礎(chǔ)的ELISA或CELISA，用于FluMist(一種減毒活流感疫苗)或此類的其他疫苗的毒力測(cè)定)測(cè)定的。這種方法簡(jiǎn)單而快速，可替代更傳統(tǒng)的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)分析用于測(cè)定活病毒的毒力。簡(jiǎn)言之，在96孔微滴定板上生長(zhǎng)的匯合單層Madin-Darby犬腎細(xì)胞(MDCK)用含活病毒的樣品感染，感染后16-18小時(shí)用甲醛固定，與流感病毒特異性的單克隆抗體(Mab)反應(yīng)，然后利用抗鼠IgG-過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化物酶底物檢測(cè)結(jié)合Mab的病毒抗原，形成可溶性的有色產(chǎn)物，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定產(chǎn)物的光密度(OD)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解各種亞型的流感病毒株所共有的表位/抗原(如各種HA等)。用經(jīng)驗(yàn)證有效的TCID5tl毒力分析法測(cè)定活流感病毒標(biāo)準(zhǔn)品的IogltlTCID5tl值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出樣品中活病毒的毒力。已知在4.9-6.71og10TCID50的范圍內(nèi)CELISA的測(cè)定值是線性的(r2大于或等于9.95)。天與天之間、不同批次的試驗(yàn)之間、不同板之間以及板內(nèi)(殘留的)的變異性(以IogltlTClD5tl表示的標(biāo)準(zhǔn)差)分別是0.06,0.02,0.05和0.03。利用CELISA測(cè)定的幾種疫苗和野生型流感病毒株A/Hmi、A/H3N2和B的毒力與平行進(jìn)行的通過(guò)確認(rèn)有效的TCID5tl毒力分析法測(cè)定的毒力是一致的(士0.31og10TCID50)。CELISA能夠在2天內(nèi)測(cè)定高達(dá)10個(gè)樣品/培養(yǎng)板，而確認(rèn)有效的TCID5tl毒力分析法在6天內(nèi)只能測(cè)定2個(gè)樣品/培養(yǎng)板。CELISA可以替代其他毒力分析法或與其他毒力分析法聯(lián)合使用(如FFA和TCID5tl，見(jiàn)下)。半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)分析(見(jiàn)下文的詳細(xì)描述)是被廣泛應(yīng)用的活病毒和活病毒疫苗的毒力測(cè)定方法。但是，在某些實(shí)施方式中，以細(xì)胞為基礎(chǔ)的ELISA(CELISA)作為一種簡(jiǎn)單快速的方法可替代傳統(tǒng)的費(fèi)時(shí)費(fèi)力的TCID分析法來(lái)測(cè)定FluMist(—種減毒活疫苗)或其他類似疫苗內(nèi)流感病毒的毒力。在其他典型的實(shí)施方式中，病毒溶液的毒力分析法還包括熒光聚焦分析(FFA)，這種分析法與本領(lǐng)域常用的TCID5tl分析法是不同。這種FFA有一些特殊的優(yōu)點(diǎn)，如更適于自動(dòng)化，因此可使疫苗制備的效率更高。TCID5tl分析法通常測(cè)定可感染50%特定細(xì)胞培養(yǎng)物所需要的病毒懸液或溶液的量。測(cè)定結(jié)果是很精確的，但是其速度比FFA慢，因此在制備疫苗過(guò)程中會(huì)浪費(fèi)寶貴的時(shí)間。FFA分析一般用型和/或亞型(甚至通用抗原)特異性的抗流感病毒抗體(一般是看HA抗體)來(lái)檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原。在使用過(guò)程中抗體不會(huì)與其他型/亞型的流感病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，因此可用于定量分析多病毒制劑(如三價(jià)疫苗制劑)中不同型的病毒。FFA試驗(yàn)還可用于分析特定病毒株的一致性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很熟悉FFA及其在病毒/疫苗檢測(cè)中的應(yīng)用。另一方面，熒光聚焦分析不依賴于細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)(或者是被感染的細(xì)胞，或者是指示細(xì)胞)，而是利用抗體染色方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞單層中被感染細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原。然后利用病毒抗體上的熒光標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)和定量這些被感染的細(xì)胞。本發(fā)明的典型FFA利用型和亞型特異性的抗流感病毒HA抗體來(lái)檢測(cè)被感染細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原。在其他的實(shí)施方式中，F(xiàn)FA(以及本文描述的其他方法)還可以使用流感病毒共有抗原特異性的通用抗體而不是特定型/亞型流感病毒抗原的特異性抗體。這樣，F(xiàn)FA使用這種通用抗體就可以篩選多種不同類型的病毒，也不用每次在分析不同的病毒時(shí)都要開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)型/亞型的特異性抗體。本文的其他實(shí)施方式包括通過(guò)以細(xì)胞為基礎(chǔ)的熒光測(cè)定方法(CFA)來(lái)確定病毒毒力。雖然FFA可用于許多實(shí)施方式中，但是CFA卻適用于其他實(shí)施方式。FFA分析的圖像處理和數(shù)據(jù)讀取速度約為20板/人/天(或圖像處理速度約為5板/小時(shí))，而CFA的圖像處理和數(shù)據(jù)讀取速度可高達(dá)FFA的4倍。另外，通過(guò)FFA測(cè)定的B型流感病毒株的滴度可能與TCID5tl滴度不同；而通過(guò)CFA測(cè)定的滴度與TCID5tl(或FFA)滴度沒(méi)有顯著差異，這是因?yàn)樵摲治鍪褂昧藰?biāo)準(zhǔn)或校正?？傊?，CFA可用于測(cè)定96孔板內(nèi)生長(zhǎng)的MDCK細(xì)胞內(nèi)的感染性流感病毒。與FFA—樣，CFA檢測(cè)的也是在第一輪感染期間感染病毒的MDCK細(xì)胞表達(dá)的病毒蛋白。CFA利用校正或分析標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行病毒滴度的計(jì)算。CFA常用的抗體包括HA或A型病毒株和B型病毒株(流感病毒)特異性的一抗和二抗，如連接有Alexa488的羊抗鼠IgG。CFA所用的分析標(biāo)準(zhǔn)包括與已知FFA或TCID滴度的樣品相同的病毒株的病毒收獲物。CFA所用的分析參照包括已知FFA或TCID滴度和已知線性斜率的病毒收獲物(不一定是與已檢測(cè)樣品相同的病毒株)。樣品一抗包括Α/Hmi或A/H2N2病毒株的特異性抗體(如Takara的抗體)，工作稀釋度為12000；A/H3N2病毒株的特異性抗體(如Takara的抗體)，工作稀釋度為11000;以及B型病毒株的特異性抗體(如Chemicon的抗體)，工作稀釋度為11000。典型的CFA分析過(guò)程包括病毒接種，33°C孵育18小時(shí)，然后固定，在室溫下孵育15分鐘，加入一抗后在37°C孵育60分鐘，然后加入二抗在37°C孵育60分鐘。用熒光計(jì)數(shù)儀測(cè)定培養(yǎng)板，分析得到的數(shù)據(jù)。在CFA的某些實(shí)施方式中，一個(gè)孔的感染水平是通過(guò)測(cè)定其蛋白表達(dá)來(lái)確定的(而典型的FFA分析測(cè)定的是被感染的細(xì)胞數(shù))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該了解典型的FFA和熒光計(jì)數(shù)分析，這些試驗(yàn)應(yīng)注意的問(wèn)題同樣也適用于CFA分析。半自動(dòng)TCID=分析如上所述，本發(fā)明的某些實(shí)施方式包括TCID5tl分析以及由其改進(jìn)的分析法。例如，某些實(shí)施方式包括如下文所描述的該分析法的半自動(dòng)化版本。這一部分比較了手工操作的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)分析法和半自動(dòng)的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)分析法，所用的樣品為減毒活流感疫苗，如FluMist或其他類似的疫苗。TCID5tl毒力分析法還可用于測(cè)定FluMist或其他類似疫苗的毒力。本文描述了半自動(dòng)的TCID5tl毒力分析法，其中改進(jìn)了確認(rèn)有效的手工毒力分析法中的兩個(gè)費(fèi)力步驟，它們是⑴利用自動(dòng)加樣儀進(jìn)行樣品稀釋和MDCK細(xì)胞單層的感染，代替多次的手工重復(fù)稀釋步驟，()在感染后6天，用96孔板讀數(shù)儀測(cè)定MTT產(chǎn)物的吸光度來(lái)代替在光鏡下人工觀察所有96孔分析板的每一個(gè)孔以評(píng)價(jià)MDCK細(xì)胞是否存在流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑)是一種廣泛應(yīng)用的活細(xì)胞染料，可作為細(xì)胞健康/死亡的指示劑。我們?cè)O(shè)計(jì)并驗(yàn)證了可用于本文實(shí)施方式中的半自動(dòng)TCID5tl毒力分析法以確定其精密度(可重復(fù)性<0.251og10TCID50；中間精密度SD(天)<0.31oglJCID50；SD(分析員)和SD(設(shè)備)<0.41og10TCID50；90%置信區(qū)間時(shí)的重現(xiàn)性為士0.3IogltlTCID5ci)、線性、準(zhǔn)確度和線性范圍(斜率1士0.1)。利用自動(dòng)加樣儀和MTT染料進(jìn)行的半自動(dòng)TCID5tl毒力分析結(jié)果與確認(rèn)有效的手工TCID5tl毒力分析結(jié)果是等效的(90%置信區(qū)間時(shí)重現(xiàn)性為1士0.31og10TCID50)。總之，本文的結(jié)果為使用自動(dòng)加樣儀和MTT測(cè)定FluMist制劑內(nèi)流感病毒的毒力提供了支持。這些改進(jìn)的方面也可以提高檢測(cè)的效率。感染件/毒力(單價(jià))分析法驗(yàn)證目前常用的單價(jià)流感病毒毒力檢測(cè)手工操作方法的半自動(dòng)版本還可用于FluMist和其他類似疫苗的制備。半自動(dòng)毒力分析法采用了自動(dòng)洗板和自動(dòng)進(jìn)行系列稀釋的技術(shù)，以及自動(dòng)檢測(cè)病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的技術(shù)，代替了人工鏡檢。洗板和系列稀釋步驟的自動(dòng)化可以提高分析的效率，降低由于重復(fù)操作造成的質(zhì)量下降。該方法采用對(duì)照分析。自動(dòng)檢測(cè)病毒誘導(dǎo)的CPE因省略了鏡檢使本方法的一致性和效率得到提高。半自動(dòng)分析法的某些步驟/方面與較傳統(tǒng)的TCID5tl分析法一樣，而其他步驟/方面是完全不一樣的。試驗(yàn)步驟包括含Madm-Darby犬腎細(xì)胞(MDCK)單層的制備、孵育和洗滌、分析板的感染和感染后孵育、以及根據(jù)兩個(gè)試驗(yàn)中的CPE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和樣品檢測(cè)情況計(jì)算毒力。發(fā)明者及其同事已驗(yàn)證了半自動(dòng)毒力分析法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)與目前常用的手工分析法一樣。這種半自動(dòng)分析法還可作為測(cè)定擴(kuò)增的野生型流感病毒(eWT)主病毒種子(MVS)、廠家的工作病毒種子(MWVS)和病毒收獲物(VH)樣品感染性/毒力的主要方法。手工操作方法可作為備份在半自動(dòng)分析法無(wú)法使用的情況下，如設(shè)備長(zhǎng)時(shí)間處于停工期的情況下使用。傳統(tǒng)的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)分析法是以細(xì)胞為基礎(chǔ)的測(cè)定感染性細(xì)胞自殺病毒顆粒的方法。在96孔板內(nèi)培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，其匯合單層用系列稀釋的病毒樣品感染。病毒在MDCK細(xì)胞內(nèi)復(fù)制可導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。子代病毒又會(huì)感染其他細(xì)胞，最終導(dǎo)致細(xì)胞單層的毀壞。感染所導(dǎo)致的CPE在6天的孵育期內(nèi)不斷發(fā)展。在顯微鏡下觀察每一個(gè)孔以確定各孔內(nèi)是否存在CPE。通過(guò)這種方法在3天內(nèi)每天進(jìn)行一次試驗(yàn)，重復(fù)檢測(cè)4次得到4個(gè)數(shù)值，所得到的12個(gè)數(shù)值平均得到一個(gè)檢測(cè)值。除了樣品以外，每個(gè)分析員還要檢測(cè)一個(gè)單價(jià)對(duì)照品，也是在3天內(nèi)每天檢測(cè)一次，重復(fù)測(cè)定4次。手工操作法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測(cè)樣品的效率不高。每次測(cè)定都需要多次細(xì)胞洗滌和系列稀釋步驟，因?yàn)槭怯檬謩?dòng)加樣器操作的。96孔分析板上的每一個(gè)孔都需要在顯微鏡下觀察以確定CPE是否存在。培養(yǎng)板進(jìn)行多次洗滌和稀釋會(huì)對(duì)分析結(jié)果造成重復(fù)操作損害。另外，在顯微鏡下觀察96孔板的每一個(gè)孔容易使人疲勞，因此限制了每個(gè)分析員分析的數(shù)量，一個(gè)分析員一天只能分析20個(gè)板左右。在3天的檢測(cè)期內(nèi)檢測(cè)到的12個(gè)數(shù)值的平均值作為一個(gè)檢測(cè)結(jié)果，除了樣品以外每個(gè)分析員還要進(jìn)行一次單價(jià)對(duì)照品分析。這就使每個(gè)分析員在一個(gè)為期3天的檢測(cè)期內(nèi)只能分析9個(gè)樣品(每個(gè)分析員平均每天分析3個(gè)樣品)。因?yàn)閱蝺r(jià)疫苗收獲物的每個(gè)亞批(一批疫苗約有40-50亞批)都要用這種方法檢測(cè)，因此有限的檢測(cè)效率導(dǎo)致了對(duì)疫苗(如FluMist等)全規(guī)模商業(yè)化能力的限制。傳統(tǒng)分析法，尤其是洗板和加樣步驟以及CPE的MTT(3-(4，5_二甲基-2-噻唑)-2，5_二苯基溴化四唑)染料檢測(cè)步驟的自動(dòng)化產(chǎn)生出了單價(jià)流感病毒的半自動(dòng)TCID5tl毒力分析技術(shù)。半自動(dòng)分析技術(shù)利用SkatronCellWasher進(jìn)行洗滌步驟，其中碎片和廢液從細(xì)胞培養(yǎng)板中去掉，換成新鮮的培養(yǎng)基。MatrixSerialMate多道加樣儀用于病毒的連續(xù)10倍稀釋以及稀釋樣品向96孔分析板內(nèi)細(xì)胞單層上的轉(zhuǎn)移。當(dāng)然，具有相似功能的其他裝置也可以使用，除非特別說(shuō)明，提及特定品牌或型號(hào)的裝置并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。經(jīng)過(guò)6天的孵育以后，96孔培養(yǎng)板與MTT染料孵育6小時(shí)，MTT是一種應(yīng)用廣泛的細(xì)胞代謝和存活能力指示劑。在孵育過(guò)程中，完整而健康的細(xì)胞單層可處理染料形成不溶于水的藍(lán)紫色甲臘產(chǎn)物，這種產(chǎn)物可在細(xì)胞內(nèi)積聚。在細(xì)胞單層被破壞的孔內(nèi)，無(wú)藍(lán)紫色甲產(chǎn)物形成。然后加入含20%表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的0.01N鹽酸溶解液，培養(yǎng)板孵育過(guò)夜可將不溶性的染料產(chǎn)物溶解掉。測(cè)定570nm處的吸光度值就可以測(cè)得不溶性染料產(chǎn)物的量。利用MicrosoftExcelMacro程序(或其他類似的程序)處理測(cè)得的吸光度值以鑒定和計(jì)數(shù)CPE陽(yáng)性或CPE陰性孔，計(jì)算出TCID5tl滴度。與預(yù)設(shè)的截留值相比，含完整細(xì)胞單層的孔具有更高的吸光度值，被認(rèn)為是CPE陰性的，而CPE陽(yáng)性孔的吸光度值在截留值以下(見(jiàn)圖50)。根據(jù)經(jīng)Karber修飾的Reed-Muench方法利用每個(gè)稀釋度下的CPE陽(yáng)性孔數(shù)計(jì)算滴度(IogltlTCID5(l/mL)。細(xì)胞洗滌、系列稀釋和病毒接種步驟以及MTT染料法檢測(cè)CPE的自動(dòng)化在下文有詳細(xì)描述。利用Skatron1"CellWasher講行自動(dòng)化的細(xì)胞洗滌在手工分析法中，含MDCK細(xì)胞單層的96孔板在接種稀釋的病毒樣品前需洗滌兩次。經(jīng)過(guò)4天的孵育以后含廢物和胎牛血清(FBS)的廢液需要被去掉換成不含F(xiàn)BS的新鮮病毒生長(zhǎng)培養(yǎng)基(VGM)。細(xì)胞在33士1°C和5士C02中至少孵育10分鐘，然后去掉VGM，再次更換新鮮的VGM。在進(jìn)行每一個(gè)洗滌步驟時(shí)，需要將每塊板反轉(zhuǎn)置于衛(wèi)生紙上，溫和洗干以去掉孔內(nèi)的培養(yǎng)基，然后用手動(dòng)多道加樣器在每個(gè)孔內(nèi)加入200μ1新鮮VGM。如果很多板需要處理，那么這一過(guò)程是相當(dāng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的。SkatronSkanwasher(Series300，Model12010)是微處理器控制的96道細(xì)胞洗滌儀，可自動(dòng)完成這些洗滌步驟。Skanwasher體積較小，一個(gè)6英尺大小的層流生物安全通風(fēng)廚就足以放下。利用SkatronSkanwasher進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)板洗滌步驟的自動(dòng)化包括一個(gè)洗滌程序，其中廢液被從板上吸去，然后新鮮VGM被分散加入到空孔內(nèi)。將培養(yǎng)板放到Skanwasher上，完成一輪洗滌后取下移到33士1°C、5士1%C02孵育箱內(nèi)，在孵育箱內(nèi)孵育至少10分鐘后再放到Skanwasher上進(jìn)行第二次洗滌，洗滌完以后移回孵育箱內(nèi)。SkatronSkanwasher在這些洗滌步驟中的表現(xiàn)證明其可用于細(xì)胞洗滌步驟。200μ1液體的加樣精密度相當(dāng)于CV<10%，加樣準(zhǔn)確度在10%以內(nèi)。吸除液體步驟中殘留的液體體積<1%。因此，SkatronSkanwasher的表現(xiàn)是可以接受的，并且提高了其使用的簡(jiǎn)便性和細(xì)胞洗滌步驟的效率。另外，應(yīng)該了解的是能在同一標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)完成洗滌步驟的其他類似裝置也可用于本發(fā)明。利用MatrixSerialMateMultichannelPipettingStation講行自動(dòng)系列稀釋和病毒接種手工操作的傳統(tǒng)TCID5tl分析法的系列稀釋和病毒接種步驟是用手動(dòng)的多道加樣器完成的。系列稀釋分兩步完成。第一組的5個(gè)系列稀釋是在0.5mL稀釋管內(nèi)進(jìn)行的，然后從第一管中取適量稀釋液加入到2mL稀釋管內(nèi)，然后進(jìn)行最后5個(gè)稀釋系列的稀釋。系列稀釋過(guò)程的關(guān)鍵在于仔細(xì)操作，因?yàn)槿魏我粋€(gè)稀釋度的加樣誤差都通過(guò)隨后的稀釋被傳遞和放大。隨后的病毒接種步驟包括將稀釋的病毒重復(fù)加樣到含匯合細(xì)胞單層的培養(yǎng)板的不同行或不同列中。為了保持加樣的準(zhǔn)確度需要長(zhǎng)時(shí)間使用手動(dòng)加樣器，這樣可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肌肉疲勞和肌腱炎，限制了每個(gè)分析員每天操作的板數(shù)，因此會(huì)影響整個(gè)過(guò)程的效率。使用MatrixSerialMate加樣儀進(jìn)行系列稀釋和病毒接種可提高使用的簡(jiǎn)便性和分析的效率，減少操作員損傷的發(fā)生，同時(shí)還能提供必須的精密度和準(zhǔn)確度。MatrixSerialMate加樣儀是一種臺(tái)式液體處理工作站，配備一個(gè)12道的噴頭，能吸取和分配5-225μL體積的樣品。該儀器體積小，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的4英尺或6英尺生物安全櫥柜就可以放下，并且便于使用。轉(zhuǎn)移5-225μL體積的液體時(shí)MatrixSerialMate的精密度超過(guò)0.5μL，準(zhǔn)確度超過(guò)1.0μL。在系列稀釋步驟轉(zhuǎn)移30μL體積的液體時(shí)這相當(dāng)于精密度超過(guò)士1.7%，準(zhǔn)確度超過(guò)士3.3%。自動(dòng)分析法和目前常用的手工操作方法所得結(jié)果的可比性將在下文進(jìn)行確證。另外，應(yīng)當(dāng)理解的是能在同一標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)完成同樣操作的其他類似裝置也可用于本發(fā)明。MTT檢測(cè)法描沭TCID50分析法的最后一步是檢測(cè)CPE和定量病毒。利用目前所用的(手工操作的)TCID50分析法，需要在顯微鏡下觀察每一個(gè)孔以確定每個(gè)孔內(nèi)是否有CPE信號(hào)。這些信號(hào)包括細(xì)胞單層的局灶、部分或全部塌陷的面積以及被破壞的細(xì)胞單層上部是否有圓形的和發(fā)暗的細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)分析員數(shù)的培養(yǎng)板過(guò)多時(shí)會(huì)發(fā)生眼疲勞，因此每個(gè)分析員分析的培養(yǎng)板數(shù)應(yīng)限定在20個(gè)左右。這一步是手工操作方法的限速步驟。四唑染料是一種廣泛應(yīng)用的細(xì)胞存活能力指示劑。最常用的染料是黃色MTT染料。具有活線粒體的活細(xì)胞可將MTT降解成不溶于水的藍(lán)紫色甲產(chǎn)物，經(jīng)溶解步驟以后可在570nm處檢測(cè)到。在CPE陽(yáng)性孔內(nèi)大量的細(xì)胞被破壞，形成的染料產(chǎn)物很少或沒(méi)有，所檢測(cè)到的吸光度值就會(huì)很低。在半自動(dòng)TCID5tl分析中，培養(yǎng)板感染并孵育6天后，去掉廢液，在每一孔中加入100μL含0.5mg/mLMTT染料的新鮮病毒生長(zhǎng)培養(yǎng)基，置于37士1°C、5士1%C02孵育6小時(shí)。通過(guò)在37士1°C過(guò)夜孵育使染料產(chǎn)物溶解，然后加入100μL溶解試劑(含20%SDS的0.OlN鹽酸)，在培養(yǎng)板計(jì)數(shù)儀上測(cè)定藍(lán)紫色甲產(chǎn)物在570nm處的吸光度值。吸光度數(shù)據(jù)輸入經(jīng)確認(rèn)有效的MicrosoftExcelMacro程序(或其他類似程序)中，根據(jù)預(yù)設(shè)的截留值將吸光度值轉(zhuǎn)化成CPE計(jì)數(shù)。根據(jù)經(jīng)Karber修飾的Reed-Muench方法用每個(gè)稀釋度下的CPE陽(yáng)性孔數(shù)計(jì)算滴度(IogltlTCID5cZmL)。以染料為基礎(chǔ)的自動(dòng)化檢測(cè)方法可提高CPE讀數(shù)的一致性和分析的效率。通過(guò)大量的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證以染料為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法和人工顯微鏡CPE檢測(cè)方法的可比性，其中分析所用的樣品是不同的疫苗和野生型病毒株，以及用不同代數(shù)的細(xì)胞和不同的接種密度制備的培養(yǎng)板。在這些試驗(yàn)中，首先在顯微鏡下人工觀察培養(yǎng)板，然后再用以染料為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法測(cè)定吸光度。分析這些試驗(yàn)的結(jié)果以確定通用吸光度截留值，該值可為兩種檢測(cè)方法提供可比較的CPE計(jì)數(shù)。根據(jù)更詳細(xì)的研究結(jié)果(見(jiàn)下)確定這個(gè)通用截留值等于0.5254，是指在570nm處的吸光度值，其中9個(gè)不同的分析員在3臺(tái)不同的儀器上進(jìn)行了6天的試驗(yàn)，共使用了573塊分析板。首先在顯微鏡下人工觀察培養(yǎng)板上的每一孔(每個(gè)培養(yǎng)板有80個(gè)病毒接種孔，總共45840孔)是否存在CPE，然后再用以染料為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法測(cè)定吸光度。圖50顯示的是不同孔的吸光度值對(duì)該值出現(xiàn)的頻率(讀出該吸光度值的孔數(shù))所做的直方圖。頻率測(cè)定結(jié)果表明A570=0.5254的吸光度截留值位于CPE陰性孔分布區(qū)的最左側(cè)尾部(概率=0.007%)和CPE陽(yáng)性孔分布區(qū)的最右側(cè)尾部(概率=0.02%)0利用這個(gè)截留值比較兩種方法所檢測(cè)到的每孔的CPE數(shù)值，結(jié)果表明無(wú)論是CPE陽(yáng)性孔還是CPE陰性孔，用以染料為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法和顯微鏡檢查方法所得到的結(jié)果在大多數(shù)孔(45840孔中的45279孔，98.78%)上都是——對(duì)應(yīng)的。半自動(dòng)毒力分析法的驗(yàn)證用于分析單價(jià)流感疫苗病毒的半自動(dòng)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)毒力分析法適用于測(cè)定擴(kuò)增的野生型病毒(eWT)、主病毒種子(WVS)、廠家的工作病毒種子(MWVS)和病毒收獲物(VH)樣品的感染性/毒力。對(duì)半自動(dòng)TCID5tl分析法進(jìn)行驗(yàn)證以確定其精密度(可重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性)、線性、準(zhǔn)確度和適用范圍，結(jié)果表明該方法所得到的結(jié)果與手工操作的TCID5tl分析法一致。驗(yàn)證試驗(yàn)用三株不同單價(jià)疫苗進(jìn)行，分別是一株A/HlNl型病毒、一株A/H3N2型病毒和一種B型病毒。驗(yàn)證試驗(yàn)在兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室分兩組進(jìn)行以檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性。半自動(dòng)分析法和手工操作分析法之間的精密度(試驗(yàn)之間的變異性)、線性、準(zhǔn)確度和適用范圍的比較結(jié)果列于表53中。半自動(dòng)分析法進(jìn)行的試驗(yàn)之間的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)通過(guò)6次試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，這6次試驗(yàn)在三株疫苗上分別進(jìn)行，由同一組人員操作，在同一臺(tái)加樣儀上進(jìn)行(每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果都是通過(guò)平均3天內(nèi)得到的12個(gè)數(shù)據(jù)獲得的)。半自動(dòng)分析法試驗(yàn)之間變異性的接受標(biāo)準(zhǔn)為0.251oglJCID5ciAil，這一數(shù)值是基于手工分析法的最大變異性(0.11Iog10TCID5tl單位)所得到的單次檢測(cè)結(jié)果95%置信區(qū)間的一半。利用半自動(dòng)分析法得到的三株病毒的實(shí)際SD值在0.06-0.09Iog10TCID5QmL的范圍內(nèi)。這些數(shù)值在接受標(biāo)準(zhǔn)SD<0.251og1(1TCID50/ml之內(nèi)，與手工操作TCID5tl分析法所得到的試驗(yàn)之間的變異性(0.07-0.Illog10TCID5tl單位)一致，后者是用三個(gè)獨(dú)立批次的三株病毒進(jìn)行了9次試驗(yàn)而得到的。試驗(yàn)證明該分析法在IO5倍的稀釋范圍內(nèi)(滴度范圍為4.2-9.31og10TCID50/mL)是成線性的，這一點(diǎn)可通過(guò)一個(gè)試驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)計(jì)算出的TCID5tl滴度與測(cè)得的TCID5tl滴度之間的關(guān)系是否符合顯著水平下的線性模型來(lái)確定。該分析法是準(zhǔn)確的，三株病毒的斜率在1.00-1.02之間，完全符合1士0.1的接受標(biāo)準(zhǔn)。半自動(dòng)分析法的線性、準(zhǔn)確度和適用范圍與手工分析法一樣。見(jiàn)表53。兩組分析員在9天內(nèi)用一株A型疫苗病毒和一株B型疫苗病毒進(jìn)行了18次試驗(yàn)，檢驗(yàn)這18次試驗(yàn)的結(jié)果是否與隨機(jī)效應(yīng)模型相符合，依次來(lái)確定半自動(dòng)分析法的中間精密度。所測(cè)得的天與天之間的變異性(SD($)、不同分析員組之間的變異性(SDaffin)以及設(shè)備之間的變異性(SD(設(shè)備))的標(biāo)準(zhǔn)差范圍分別是0.04-0.08,0.14-0.16和0.000-0.03，這一范圍符合SD(天)<0·3、SD(分析員)<0·4禾口SD(^i)<0.4的接受標(biāo)準(zhǔn)。在兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室用一株A/Hmi型病毒、一株A/H3N2病毒和一株B型病毒進(jìn)行試驗(yàn)以證明該分析法在實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)室之間重現(xiàn)性的接受標(biāo)準(zhǔn)要求兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室所得結(jié)果的差異的雙側(cè)90%置信區(qū)間應(yīng)該在士0.31Og1QTCID5(1/mL之內(nèi)。所有3株病毒的90%置信區(qū)間的上限和下限分別為大于-0.05和小于+0.15，符合接受標(biāo)準(zhǔn)。為了證明手工操作分析法和半自動(dòng)分析法的可比性，我們進(jìn)行了詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。通過(guò)手工操作分析法檢測(cè)兩株疫苗，一株為A/Hmi型(A/NewCaledonia/20/99)，一株為B型(B/Yamanashi/166/98)，每株病毒得到18個(gè)檢測(cè)結(jié)果。所有這些結(jié)果匯總起來(lái)與通過(guò)半自動(dòng)分析法測(cè)定的匯總結(jié)果(每株18個(gè)檢測(cè)結(jié)果)進(jìn)行精密度和中間精密度的比較。SAS內(nèi)的ProcMixed方法用于測(cè)算分析法之間的平均差異及其90%置信區(qū)間(Cl)。接受標(biāo)準(zhǔn)為90%CI必須在士0.31oglOTCID50/mL,即90%CI的下限(LB)大于-0.3，上限(UB)小于0.3。結(jié)果在分析法驗(yàn)證報(bào)告里，下面的表54中也有總結(jié)。從結(jié)果中可以看出，兩株病毒的雙側(cè)90%置信區(qū)間都在接受標(biāo)準(zhǔn)士0.31oglOTCID5Q/mL之內(nèi)，下限和上限的實(shí)際計(jì)算值都在-0.05到0.101ogl0TCID50/mL之間?？傊糜诜治鰡蝺r(jià)流感病毒的手工TCID5tl毒力分析法是一種經(jīng)驗(yàn)證有效的傳統(tǒng)方法，可用于分析擴(kuò)增的野生型流感病毒(eWT)、主病毒種子(MVS)、廠家的工作病毒種子(MWVS)和病毒收獲物(VH)樣品中單價(jià)流感疫苗病毒株的感染性/毒力，這是一種很費(fèi)力的方法，包括許多手工操作的加樣步驟，會(huì)因重復(fù)操作而對(duì)分析員造成損害。另外，由于該方法通過(guò)人工在顯微鏡下讀取CPE數(shù)據(jù)，因此將分析效率限制在每人每天進(jìn)行3個(gè)試驗(yàn)的水平上。洗板和手工加樣步驟的自動(dòng)化以及用CPE的MTT染料檢測(cè)法代替人工鏡檢讀取數(shù)據(jù)導(dǎo)致了單價(jià)流感病毒的半自動(dòng)TCID5tl毒力分析法的誕生。利用半自動(dòng)分析法檢測(cè)單價(jià)材料可將分析的效率提高2-3倍，因而可使疫苗如FluMist疫苗實(shí)現(xiàn)真正商業(yè)化的目的，以預(yù)期的劑量水平為市場(chǎng)提供疫苗。另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是能夠降低質(zhì)控分析員因重復(fù)操作而導(dǎo)致的損傷風(fēng)險(xiǎn)。半自動(dòng)分析法用于在一個(gè)組內(nèi)分析滴度范圍為4.2-9.31og10TCID50/mL的病毒材料時(shí)其可重復(fù)性、中間精密度、線性和準(zhǔn)確度都已得到確認(rèn)。該方法在實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性也得到確認(rèn)。利用半自動(dòng)分析法和手工操作方法重復(fù)測(cè)定一株A型病毒和一株B型病毒的毒力，所得到的結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，結(jié)果表明兩種方法得到了一致的結(jié)果。因此，半自動(dòng)分析法在用于測(cè)定擴(kuò)增的野生型病毒(eWT)、FlUMiSt主病毒種子(WVS)、廠家的工作病毒種子(MWVS)和病毒收獲物(VH)樣品的毒力時(shí)比得上手工操作方法。半自動(dòng)TCID=分析法中的CPE通用截留倌在本文的另外一些實(shí)施方式中，經(jīng)修改或調(diào)整的TCID5tl分析法用于測(cè)定疫苗/病毒的毒力。一種調(diào)整是為了確定利用TCID5tl半自動(dòng)毒力分析法分析單價(jià)流感病毒時(shí)測(cè)定CPE所用的通用截留值。“單價(jià)流感病毒的半自動(dòng)TCID5tl毒力分析法”(見(jiàn)上)利用活細(xì)胞染料MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑)來(lái)評(píng)價(jià)MDCK感染細(xì)胞單層的CPE分?jǐn)?shù)。為了便于利用MTT比色終點(diǎn)來(lái)檢測(cè)CPE陽(yáng)性孔數(shù)從而很容易地確定病毒的毒力數(shù)值，需要確定一個(gè)可重復(fù)區(qū)分CPE陽(yáng)性孔和CPE陰性孔的吸光度截留值。如發(fā)明者在其他文獻(xiàn)中所描述的，確定的“通用截留吸光度(A570)值為0.5254。在“單價(jià)流感病毒的半自動(dòng)TCID5tl毒力分析法”中，當(dāng)一個(gè)孔的A570吸光度值<0.5254時(shí)被認(rèn)為是CPE陽(yáng)性的；當(dāng)一個(gè)孔的A570吸光度值>0.5254時(shí)被認(rèn)為是CPE陰性的。本部分所總結(jié)的數(shù)據(jù)確證了以前所確定的通用截留值的有效性。利用冷適應(yīng)性流感病毒株A/NewCaledonia/20/99(A/H1N1型)、A/Sydney/05/97(A/H3N2型)和B/Yamanashi/166/98(B型)進(jìn)行的大量試驗(yàn)不僅可以為通用截留值的驗(yàn)證提供更多的支持?jǐn)?shù)據(jù)，而且還可用于分析員之間的和設(shè)備之間的比較。本文所提供的數(shù)據(jù)證實(shí)了半自動(dòng)TCID5tl分析法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和可靠性，證明該方法與經(jīng)確認(rèn)有效的手工毒力分析法是一樣準(zhǔn)確的。因而說(shuō)明了包含這些測(cè)量方法的實(shí)施方式的證明力。正如上面所解釋的，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)分析法是一種以細(xì)胞為基礎(chǔ)的分析法，用于測(cè)定感染性細(xì)胞自殺病毒顆粒的毒力。將系列稀釋的病毒加入到生長(zhǎng)在96孔板上的Madin-Darby犬腎細(xì)胞MDCK)匯合單層上。病毒在MDCK細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制可影響細(xì)胞的代謝，最終導(dǎo)致子代病毒釋放進(jìn)入培養(yǎng)上清液，細(xì)胞死亡。子代病毒又會(huì)感染其他細(xì)胞，最終導(dǎo)致細(xì)胞單層的破壞。在6天的孵育期內(nèi)因感染造成的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)得以顯現(xiàn)。經(jīng)過(guò)這一段時(shí)間之后，利用MTT檢測(cè)細(xì)胞單層上是否存在CPE?；铙w染料如MTT已被大量用在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物分析試驗(yàn)中作為細(xì)胞健康和死亡的指示劑。(見(jiàn)Denizotet等，J.Immun.Methods(1986)89271~277；Gerlier等，(1986)J.Immuno.Methods94:57_63；Heeg等，J.ImmunoMethods(1985)77237246；Mooseman,J.Immuno.Methods(1983)65:55_63；Tada等，J.Immuno.Methods(1986)93:147_165以及Vistica，CancerResearch(1991)51=2515-2520)。含完整活細(xì)胞單層的孔(CPE陰性的)可將染料轉(zhuǎn)化成藍(lán)紫色甲染料產(chǎn)物，在570nm處產(chǎn)生高吸光度值，而CPE陽(yáng)性孔因部分或整個(gè)細(xì)胞單層被病毒破壞所產(chǎn)生的吸光度值較低。為了便于利用比色終點(diǎn)來(lái)檢測(cè)CPE陽(yáng)性細(xì)胞孔數(shù)從而很容易地確定病毒的毒力數(shù)值，需要確定一個(gè)可重復(fù)區(qū)分CPE陽(yáng)性孔和CPE陰性孔的吸光度截留值。結(jié)合通用吸光度值，根據(jù)病毒檢測(cè)樣品的吸光度值就可以判斷是CPE陽(yáng)性還是CPE陰性的。CPE陽(yáng)性孔數(shù)用于計(jì)算病毒滴度(l0glOTCID5(1/mL)。本發(fā)明的發(fā)明者及其同事根據(jù)多個(gè)分析員用三株流感病毒在幾天內(nèi)所做的兩個(gè)研究結(jié)果確定了通用截留值的起始推薦值。如本文所描述，被認(rèn)為是CPE陽(yáng)性的孔的A570吸光度值<0.5254；被認(rèn)為是CPE陰性的孔的A570吸光度值>0.5254。本部分描述了另外一些試驗(yàn)用于驗(yàn)證以前所確定的吸光度截留值。兩個(gè)不同研究組的多位分析員利用半自動(dòng)TCID5tl分析法測(cè)定三株參照病毒的毒力。如本文所描述，利用已驗(yàn)證有效的人工鏡檢方法確定的CPE被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”，與MTT法確定的CPE—致。利用病毒株A/NewCaledonia/20/99(A/H1N1型)、A/Sydney/05/97(A/H3N2型)和B/Yamanashi/166/98(B型)進(jìn)行的大量試驗(yàn)不僅可以為通用截留值的驗(yàn)證提供更多的支持?jǐn)?shù)據(jù)，而且還可用于分析員之間的和設(shè)備之間的比較。本文所提供的數(shù)據(jù)證實(shí)了半自動(dòng)TCID5tl分析法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和可靠性，證明該方法與已驗(yàn)證有效的手工毒力分析法是一樣準(zhǔn)確的。設(shè)計(jì)半自動(dòng)毒力分析法需要使用已知毒力值的參照病毒株，其毒力值是以前用已驗(yàn)證有效的手工毒力分析法確定的。作為參照病毒的冷適應(yīng)性病毒株如下AlNewCaledonia/20/99,一種A/Hmi型病毒；A/Sydney/05/97，一種A/H3N2型病毒和B/Yamanashi/166/98,一種B型病毒。冷適應(yīng)性對(duì)照病毒株A/Sydney/05/97用于確定系統(tǒng)適應(yīng)性。本發(fā)明的發(fā)明者及其同事已設(shè)計(jì)出了半自動(dòng)TCID5tl毒力分析單價(jià)流感病毒的方法以及半板重復(fù)的整體分析格局和病毒CPE計(jì)分方法。見(jiàn)上。簡(jiǎn)言之，利用SkatronTMCellWasher用病毒生長(zhǎng)培養(yǎng)基(VGM)洗滌96孔板上的MDCK匯合細(xì)胞單層兩次。利用MatrixTMSerialMatePipettingStation和96孔稀釋管用含TPCK-胰蛋白酶的VGM制備10倍系列稀釋的病毒樣品。將最后5個(gè)稀釋度(10_5到10_9)的稀釋液轉(zhuǎn)移到含MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)板上，病毒終濃度為10_6到10,，這是病毒的起始滴度。從每個(gè)培養(yǎng)板上采集兩個(gè)毒力數(shù)據(jù)點(diǎn)。由于每個(gè)樣品都在兩個(gè)培養(yǎng)板上進(jìn)行分析，因此可得到4個(gè)重復(fù)的毒力數(shù)值。16個(gè)對(duì)照孔(培養(yǎng)板上的第6列和第7列)內(nèi)加入無(wú)病毒的VGM作為細(xì)胞對(duì)照。經(jīng)過(guò)6天孵育(33士1°C、5士1%C02)以后，用顯微鏡檢查所有孔，觀察是否存在CPE。因此，如果一個(gè)孔內(nèi)的細(xì)胞單層出現(xiàn)病毒破壞的跡象則記錄為CPE陽(yáng)性。相反，CPE陰性孔內(nèi)的細(xì)胞單層是完整的。在顯微鏡下觀察培養(yǎng)板上的細(xì)胞單層并記錄每個(gè)孔是否是CPE陽(yáng)性孔以后，去掉培養(yǎng)基，將磷酸鹽緩沖液制備的MTT(0.5mg/mL)(USBiochemicalCorporation,Cleveland,OH)加入到每一孔內(nèi)(每孔100μ1)。細(xì)胞單層與MTT在37士1°C、5士1%CO2中孵育6士0.5小時(shí)。將溶解緩沖液(100μ1含20%SDS&0.01NHCl)加入到每一孔中，37士1°C、5士C02中孵育16到20小時(shí)。用PerkinElmer-ffallac1420MultilabelCounterSpectrophotometer測(cè)定570nm處的吸光度值，數(shù)值輸入到MicrosoftExcelmacro內(nèi)，這是一個(gè)根據(jù)CPE陽(yáng)性孔數(shù)計(jì)算病毒滴度(Iog1QTCID5(l/mL)的程序。接受標(biāo)準(zhǔn)適用于本部分的實(shí)施方式。相應(yīng)的，如果每個(gè)板上的16個(gè)細(xì)胞對(duì)照孔中出現(xiàn)CPE、細(xì)胞毒效應(yīng)或微生物污染跡象的孔數(shù)不超過(guò)1個(gè)，則認(rèn)為這個(gè)培養(yǎng)板是有效的。另外，得自單價(jià)病毒對(duì)照樣品(A/Sydney/05/97)的4個(gè)重復(fù)TCID5tl滴度值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)都必須位于質(zhì)控證明所報(bào)告的質(zhì)量范圍之內(nèi)。下文所描述的是根據(jù)“金標(biāo)準(zhǔn)”CPE和MTT法測(cè)定的CPE之間的關(guān)系計(jì)算出的敏感性和特異性數(shù)據(jù)。TP表示“真陽(yáng)性”，F(xiàn)P表示“假陽(yáng)性”，F(xiàn)N表示“假陰性”，TN表示“真陰性”。因此，“全部陽(yáng)性”是指TP+FN的和，“全部陰性”是指FP+TN的和。見(jiàn)表55。計(jì)算公式為每個(gè)復(fù)值的敏感性=(TP)/(全部的CPE陽(yáng)性數(shù))，每個(gè)復(fù)值的敏感性=(TN)/(全部的CPE陰性數(shù))。為了確定設(shè)備與設(shè)備之間的可比性，第一組的6位分析員利用半自動(dòng)TCID50分析法測(cè)定了三株參照病毒樣品的毒力。在3天的試驗(yàn)期內(nèi)用了兩套試驗(yàn)設(shè)備AZ-039和AZ-040。第二組的分析員用另一套設(shè)備AZ-036。這一組的3位分析員利用半自動(dòng)TCID5tl分析法在3天內(nèi)檢測(cè)了三株參照病毒樣品。為了確定分析員與分析員之間的可比性，第一組的每位分析員(分析員#1-6)根據(jù)半自動(dòng)TCID5tl分析法用AZ-039在3天內(nèi)檢測(cè)了三株參照病毒。在第二組中，3位分析員(分析員#7-9)分別根據(jù)半自動(dòng)TCID5tl分析法用AZ-036在3天內(nèi)檢測(cè)了相同的三株參照病毒。為了可靠地分辨利用MTT的半自動(dòng)TCID5tl分析法所檢測(cè)的CPE陽(yáng)性和CPE陰性孔，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理確定一個(gè)通用截留值。在驗(yàn)證這個(gè)截留值有效性的試驗(yàn)中，兩個(gè)研究組還進(jìn)行了另外的一些試驗(yàn)，又得到了45840個(gè)吸光度值。結(jié)果在下文描述。利用人工鏡檢方法計(jì)算出的敏感性和特異性數(shù)據(jù)作為參考標(biāo)準(zhǔn)。兩組的總數(shù)據(jù)(η=45840)列于表56中。利用推薦的截留值0.5254計(jì)算出的敏感性為98.45%，特異性為99.12%。另外，根據(jù)第二組數(shù)據(jù)計(jì)算出的敏感性和特異性分別為99.15%和99.99%。同樣，根據(jù)第一組數(shù)據(jù)計(jì)算出的敏感性和特異性分別為98.13%和98.71%。上面的所有數(shù)據(jù)(敏感性>95%，特異性>95%)都與計(jì)算出的數(shù)據(jù)有關(guān)，其中所計(jì)算出的敏感性為99.05%，特異性為99.99%。圖51顯示的是吸光度值對(duì)該值出現(xiàn)的頻率(N=45，840)作圖所得到直方圖，兩組數(shù)據(jù)結(jié)合以后顯示通用截留值0.5254位于CPE陽(yáng)性孔和CPE陰性孔分布區(qū)之間的中點(diǎn)附近。頻率分布圖顯示推薦的截留值位于對(duì)照孔分布區(qū)的最左側(cè)尾部，相當(dāng)于位于延伸向左側(cè)的尾部?jī)?nèi)的可能性為0.007%。在利用所有CPE陽(yáng)性孔的吸光度值估計(jì)截留值時(shí)，0.5254的截留值相當(dāng)于位于尾部的可能性為0.02%。另外，圖51所示的分布形態(tài)表明CPE陽(yáng)性孔的吸光度值分布區(qū)域與CPE陰性孔的吸光度值分布區(qū)域分離的是相當(dāng)開(kāi)的。CPE陰性對(duì)照孔的平均吸光度值比較。以前根據(jù)6720個(gè)對(duì)照孔的吸光度值計(jì)算出了一個(gè)0.5254的截留值。對(duì)照孔的平均吸光度值為1.261，標(biāo)準(zhǔn)差為0.15。如表57所示，本試驗(yàn)又做了9168個(gè)對(duì)照孔；其中2880個(gè)對(duì)照孔來(lái)自第二組，6288個(gè)對(duì)照孔來(lái)自第一組。第二組和第一組的平均吸光度值分別為1.226和1.235，總的平均吸光度值為1.231。總的平均吸光度值和以前報(bào)道的平均吸光度值的差只有0.03(見(jiàn)表57)。雖然這兩組數(shù)據(jù)是在6個(gè)月內(nèi)獲得的，但是它們之間的差異還是很小的。以前的試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行了2個(gè)月，而本文描述的第二組試驗(yàn)是在進(jìn)行第一組試驗(yàn)前4個(gè)月進(jìn)行的。表58總結(jié)了利用兩組的不同設(shè)備檢測(cè)三株參照病毒所獲得的毒力數(shù)據(jù)，用于確定設(shè)備與設(shè)備之間的可比性。第一組的6位分析員利用兩套設(shè)備(命名位ΑΖ-039和ΑΖ-040)進(jìn)行了半自動(dòng)TCID50分析試驗(yàn)。A/NewCaledonia/20/99的總平均毒力在9.2-9.31og1QTCID5Q/mL之間，AZ039和AZ-040所測(cè)定滴度值差異不超過(guò)0.091og10TCID50/mL(見(jiàn)表58)。A/Sydney/05/97的總平均毒力在8.5-8.61og10TCID50/mL之間，AZ039和AZ-040所測(cè)定滴度值差異不超過(guò)0.021og1(1TCID5(1/mL。B/Yamanashi/166/98的總平均毒力在8.3-8.41og1(1TCID5(1/mL之間，AZ039和AZ-040所測(cè)定滴度值差異不超過(guò)0.Hlog10TCID50/mL。第二組試驗(yàn)使用一套設(shè)備(AZ-036)。3位分析員在三天內(nèi)利用半自動(dòng)TCID5tl分析法檢測(cè)了三株參照病毒樣品。對(duì)于A/NewCaledonia/20/99來(lái)說(shuō)，第二組的設(shè)備所測(cè)定的數(shù)據(jù)與質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備所測(cè)定的數(shù)據(jù)之間的平均差值不超過(guò)0.091Og1(lTCID5(l/mL，對(duì)于A/Sydney/05/97來(lái)說(shuō)平均差值不超過(guò)0.081og1(1TCID5(1/mL，對(duì)于B/Yamanashi/166/98來(lái)說(shuō)平均差值不超過(guò)0.1210g1QTCID5Q/mL。第一組兩套設(shè)備(AZ-039和AZ-040)之間以及第一組和第二組(AZ-036)之間的平均差值也被計(jì)算出來(lái)。為了確定分析員與分析員之間的可比性，第一組的每位分析員(1號(hào)到6號(hào)分析員)于3天內(nèi)在設(shè)備AZ-039上利用半自動(dòng)TCID5tl毒力分析法檢測(cè)了A/NewCaledonia/20/99,A/NewSydney/05/97和B/Yamanashi/166/98。第二組的3位分析員(7到9號(hào)分析員)分別于3天內(nèi)在設(shè)備AZ-036上利用半自動(dòng)TCID5tl毒力分析法檢測(cè)了相同的病毒株。計(jì)算每株病毒的毒力值，結(jié)果列在表59中。對(duì)于所檢測(cè)的三株病毒來(lái)說(shuō)，第一組結(jié)果之間的變異性都小于或等于0.310g1(lTCID5(l/mL。與此相類似的是，第二組的毒力值之間的變異性小于或等于0.21og1(lTCID5(l/mL。對(duì)于三株參照病毒樣品來(lái)說(shuō)，兩組分析員之間的總變異性小于士0.31Og1QTCID5Q/mL。檢測(cè)結(jié)果(三天內(nèi)得到4個(gè)重復(fù)數(shù)值)的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)在0.11到0.27之間。由于標(biāo)準(zhǔn)差低于0.50的接受標(biāo)準(zhǔn)，因此所有的數(shù)據(jù)都是有效的。本部分所提供的結(jié)果驗(yàn)證了“通用吸光度截留值(0.5254)。這個(gè)通用截留值的可信度很高，因?yàn)檫@些試驗(yàn)得到了高度一致的數(shù)據(jù)，盡管這些試驗(yàn)是由不同研究組的多位分析員在一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)完成的?？傊瑑山M試驗(yàn)所得到的對(duì)照(CPE陰性)吸光度值不僅彼此一致，而且與以前所報(bào)道的平均值幾乎相同(見(jiàn)表57)。兩組試驗(yàn)的敏感性和特異性數(shù)值非常接近，并且與以前的研究結(jié)果一致(見(jiàn)圖51和表57)。在兩組試驗(yàn)中，利用MTT評(píng)價(jià)CPE的半自動(dòng)TCID5tl毒力分析法所產(chǎn)生的結(jié)果彼此一致，并且與確認(rèn)有效的手工TCID5tl毒力分析法所得到的結(jié)果也一致。最后，半自動(dòng)系統(tǒng)相比手工操作方法有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。利用設(shè)備來(lái)代替手工加樣和顯微鏡檢查培養(yǎng)板這樣的費(fèi)力步驟可提高分析能力，因此檢測(cè)效率較高。另外，分光光度計(jì)檢測(cè)CPE以及隨后進(jìn)行的自動(dòng)毒力計(jì)算可使結(jié)果被打印出來(lái)，和/或進(jìn)行電子記錄。^X除非另外定義，否則所有的科技術(shù)語(yǔ)都被認(rèn)為與其所述領(lǐng)域的意義相同。為了本發(fā)明的目的特將下列術(shù)語(yǔ)定于如下。術(shù)語(yǔ)“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”是指單鏈的或雙鏈的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物、及其嵌合體或類似物。這個(gè)術(shù)語(yǔ)用于本文中時(shí)還包括具有天然核苷酸性質(zhì)的天然核苷酸類似物的聚合物，這種類似物可以天然核苷酸相同的方法與單鏈核酸雜交(如肽核酸)。除非另外說(shuō)明，一個(gè)特定核酸序列除了清楚說(shuō)明的序列以外還包括其互補(bǔ)序列。術(shù)語(yǔ)“基因”是一個(gè)被廣泛應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)，是指任何具有生物功能的核酸。因此，基因包括編碼序列和/或其表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)“基因”適用于描述特定的基因組序列以及該基因組序列所編碼的cDNA或mRNA?；蜻€包括非表達(dá)的核酸片段，如其他蛋白質(zhì)的識(shí)別序列。非表達(dá)的調(diào)節(jié)序列包括“啟動(dòng)子”和“增強(qiáng)子”，調(diào)節(jié)蛋白如轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合到這些調(diào)節(jié)序列上導(dǎo)致其相鄰或附近序列的轉(zhuǎn)錄?！敖M織特異性的”啟動(dòng)子或增強(qiáng)子是指可在特定類型的組織或細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。術(shù)語(yǔ)“載體”是指能擴(kuò)增核酸和/或可使核酸在有機(jī)體、細(xì)胞或細(xì)胞組分之間轉(zhuǎn)移的方式。載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、原病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子和人工染色體等，載體可自主復(fù)制或者可以整合到宿主細(xì)胞染色體上。載體還可以是不能自助復(fù)制的裸RNA、裸DNA、在同一條鏈上即有DNA又有RNA的多核苷酸、多聚賴氨酸連接的DNA或RNA、肽連接的DNA或RNA、脂質(zhì)體連接的DNA等。本文所述的載體最常見(jiàn)的是指質(zhì)粒?！氨磉_(dá)載體”是指能夠啟動(dòng)其所含核酸的表達(dá)以及復(fù)制的載體，如質(zhì)粒。一般來(lái)說(shuō)，被表達(dá)的核酸以“可調(diào)控的方式連接”啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，其轉(zhuǎn)錄受啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的調(diào)控?！半p向表達(dá)載體”的特征是含有兩個(gè)啟動(dòng)子，其方向相對(duì)于兩個(gè)啟動(dòng)子之間的核酸來(lái)說(shuō)是相對(duì)的，這樣表達(dá)可在兩個(gè)方向上起始，即可以轉(zhuǎn)錄出正(+)鏈或正義鏈RNA，也可以轉(zhuǎn)錄出負(fù)㈠鏈或反義鏈RNA。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“游離的”是指生物材料如核酸或蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上不含其在天然環(huán)境下與其正常伴隨或相互作用的成分。游離的材料還包括在其所處的天然環(huán)境如細(xì)胞內(nèi)不存在的材料。例如，如果材料處于其天然環(huán)境如細(xì)胞中，那么游離的材料就是指該材料在細(xì)胞內(nèi)所處的位置(如基因組或遺傳元件)對(duì)于該細(xì)胞來(lái)說(shuō)是非天然的。例如，天然核酸(如編碼序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)如果以非自然的方式被插入到對(duì)該核酸來(lái)說(shuō)是非天然的基因組(例如載體，如擴(kuò)增子的質(zhì)粒或病毒載體)內(nèi)，則該核酸就成為游離的了。這種核酸也被稱為“異源”核酸。術(shù)語(yǔ)“重組子”是指通過(guò)人工方法或合成方法(非天然的)進(jìn)行改變的生物材料(如核酸或蛋白質(zhì))。對(duì)生物材料的改變可在其天然環(huán)境中或在其天然狀態(tài)下進(jìn)行，或者從其天然環(huán)境中去除。當(dāng)指病毒如流感病毒時(shí)，如果該病毒是通過(guò)重組核酸的表達(dá)制備的，那么該病毒就是重組病毒。術(shù)語(yǔ)“重配株”用于指病毒時(shí)表示該病毒包含來(lái)源于一個(gè)以上親本病毒株或資源的遺傳和/或多肽組分。例如，71重配株包含第一親本病毒來(lái)源的7個(gè)基因組片段(或基因片段)和第二親本病毒來(lái)源的一個(gè)補(bǔ)充病毒基因組片段，如編碼血凝素或神經(jīng)酰胺酶的片段。62重配株包含第一親本病毒來(lái)源的6個(gè)基因組片段(最常見(jiàn)的6個(gè)內(nèi)部基因)和其他親本病毒來(lái)源的2個(gè)補(bǔ)充片段，如編碼血凝素和神經(jīng)酰胺酶的片段。術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入的”用于指異源核酸或游離核酸時(shí)表示核酸被引入到真核或原核細(xì)胞內(nèi)，其中核酸被插入到細(xì)胞的基因組內(nèi)(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，轉(zhuǎn)變成自主復(fù)制子或被瞬時(shí)表達(dá)(如轉(zhuǎn)染的mRNA)。該術(shù)語(yǔ)包括這些方法如“感染”、“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。在本發(fā)明中，許多方法都可用于將核酸導(dǎo)入到原核細(xì)胞內(nèi)，其中包括電穿孔、鈣磷酸鹽沉淀、脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)等。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指含有外源核酸如載體，并且能支持核酸的復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌，也可以是真核細(xì)胞如酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、兩棲類動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明中典型的宿主細(xì)胞包括Vero(非洲綠猴腎)細(xì)胞、BHK(幼倉(cāng)鼠腎)細(xì)胞、原代雞腎(PCK)細(xì)胞、Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞、Madin-Darby牛腎(MDBK)細(xì)胞、293細(xì)胞(如293T細(xì)胞)和COS細(xì)胞(如COS1、C0S7細(xì)胞)。流感病毒本文的組合物和方法主要用于制備生產(chǎn)疫苗的流感病毒。流感病毒包含一個(gè)含片段狀單鏈RNA基因組的內(nèi)部核糖核蛋白核心和一個(gè)由基質(zhì)蛋白組成的外層脂蛋白包膜。A型和B型流感病毒都含有8個(gè)單鏈反義RNA片段。A型流感病毒的基因組編碼11個(gè)多肽。片段1-3編碼3個(gè)多肽，組成RNA依賴的RNA聚合酶。片段1編碼聚合酶復(fù)合物蛋白PB2。剩余的聚合酶蛋白PB1和PA分別是由片段2和片段3編碼的。另外，某些流感病毒株的片段1還編碼一個(gè)小蛋白PB1-F2，這是由PB1編碼區(qū)內(nèi)的另外一個(gè)閱讀框架編碼的。片段4編碼血凝素(HA)表面糖蛋白，參與感染期間病毒與細(xì)胞的粘附和病毒向細(xì)胞內(nèi)的進(jìn)入。片段5編碼核外殼核蛋白(NP)多肽，這是與病毒RNA相連的主要結(jié)構(gòu)成分。片段6編碼神經(jīng)酰胺酶(NA)包膜糖蛋白。片段7編碼兩個(gè)基質(zhì)蛋白，被稱為Ml和M2，這兩個(gè)蛋白翻譯自經(jīng)過(guò)不同剪接的mRNA。片段8編碼NS1和NS2，這是兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，也是翻譯自經(jīng)過(guò)不同剪接的mRNA。B型流感病毒的8個(gè)基因組片段編碼11個(gè)蛋白質(zhì)。三個(gè)最大的基因編碼RNA聚合酶的組分PB1、PB2和PA。片段4編碼HA蛋白。片段5編碼NP。片段6編碼NA蛋白和NB蛋白。NA蛋白和NB蛋白翻譯自mRNA順?lè)醋拥闹丿B閱讀框架。B型流感病毒的片段7也編碼兩個(gè)產(chǎn)物M1和BM2。最小的片段編碼兩個(gè)產(chǎn)物，其中NS1翻譯自全長(zhǎng)RNA，NS2翻譯自經(jīng)間接的mRNA。流感病毒疫苗從歷史上看，流感病毒疫苗主要是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)預(yù)測(cè)即將流行的病毒株來(lái)選擇何種類型的病毒株在含胚雞蛋內(nèi)制備的。最近已經(jīng)制備出了重配病毒，該病毒含有已獲批準(zhǔn)的溫敏減毒主病毒株的血凝素抗原和神經(jīng)酰胺酶抗原。在雞蛋內(nèi)經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)以后收獲病毒，另外還可以選擇將病毒滅活，如使用甲醛和/或P丙內(nèi)酯滅活(或者用作減毒活疫苗)。但是，以這種方式制備的流感疫苗在幾個(gè)方面引起了廣泛的關(guān)切。例如，來(lái)源于雞蛋的污染殘留物可能是高抗原性的和/或易引起高熱的，在注射時(shí)常常會(huì)導(dǎo)致明顯的副作用。因此，如本文所描述，本發(fā)明的一個(gè)方面包括用無(wú)動(dòng)物源性物質(zhì)的介質(zhì)來(lái)替換一定比例的雞蛋組分。更重要的是，必須在下一個(gè)流感病毒季節(jié)到來(lái)之前幾個(gè)月開(kāi)始篩選和分布用于制備疫苗的病毒株以便于有足夠的時(shí)間制備和滅活流感疫苗。因此，能縮短制備時(shí)間的任何改進(jìn)，如通過(guò)使用本發(fā)明的方法和組合物，都是很受歡迎的。但是，由于被批準(zhǔn)用于疫苗制備的某些病毒株不能在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，因此阻礙了用細(xì)胞培養(yǎng)物制備重組疫苗和重配疫苗的企圖。本發(fā)明的發(fā)明者及其同事在以前的研究工作中設(shè)計(jì)出了一個(gè)載體系統(tǒng)和在細(xì)胞培養(yǎng)物中制備重組和重配病毒的方法，因此有可能通過(guò)這個(gè)載體系統(tǒng)和這些方法快速制備出一種或多種所選抗原性病毒株相應(yīng)的疫苗。見(jiàn)，“用于流感疫苗制備的多質(zhì)粒系統(tǒng)”，引用文獻(xiàn)如上。當(dāng)然，這種重組病毒還可以在雞蛋內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)增。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)是在一個(gè)系統(tǒng)如細(xì)胞培養(yǎng)孵育器內(nèi)進(jìn)行，控制濕度和C02，利用溫度調(diào)節(jié)器如恒溫器使溫度恒定，不要超過(guò)35°C。這種前沿的研究工作以及其他疫苗制備方法也可以通過(guò)部分或全部使用本發(fā)明的方法來(lái)加以優(yōu)化和改進(jìn)。通過(guò)將一個(gè)亞組的編碼主流感病毒基因組片段和目的病毒株(如抗原性目的突變株)來(lái)源的補(bǔ)充基因組片段的載體導(dǎo)入到細(xì)胞培養(yǎng)物中就可以很容易地獲得重組流感病毒。一般而言，主病毒株要根據(jù)所制備疫苗所要求的特性來(lái)選擇。例如，要制備減毒活疫37苗，主病毒株要選擇具有減毒活性、冷適應(yīng)性和/或溫敏表型的病毒株。FluMist如上所述，現(xiàn)有的流感疫苗有多種類型。其中一種典型的流感疫苗是FluMist，這是一種減毒活疫苗，可預(yù)防兒童和成年人發(fā)生流感(Belshe等，(1998)，“冷適應(yīng)性的三價(jià)減毒活流感疫苗鼻內(nèi)制劑用于兒童的效果”(Theefficacyofliveattenuated,cold-adapted,trivalent,intranasalinfluenzavirusvaccineinchildren),N.EnRl.T.Med.3381405-12；Nichol等，(1999)，“減毒活流感疫苗鼻內(nèi)制劑在健康工作人群中的雙果^jH/LX^Mi^^"(Effectivenessoflive,attenuatedintranasalinfluenzavirusvaccineinhealthy,workingadults:arandomizedcontrolledtrial),JAMA282137-44)。在典型的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法和組合物優(yōu)選用于FluMist的制備。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是本文的步驟/組合物也適用于類似的、甚至是不同類型的病毒疫苗的制備。FluMist疫苗病毒株含有野生型病毒株來(lái)源的HA和NA基因片段，這兩個(gè)片段與常用主供體病毒(MDV)來(lái)源的6個(gè)基因片段，PB1、PB2、PA、NP、M和NS—起組成疫苗。用于制備FluMistA型流感病毒株的MDV(MDV-A)是通過(guò)野生型A/AnnArbor/6/60(A/AA/6/60)病毒株在原代雞腎組織培養(yǎng)物中在較低溫度下系列傳代得到的(Maassab，(1967)，“流感病毒在25°C條件下的適應(yīng)性和生長(zhǎng)特性”(Adaptationandgrowthcharacteristicsofinfluenzavirusat25degreesC),Nature213:612_4)。MDV-A在25°C可有效復(fù)制(ca,冷適應(yīng)性)，但是在38°C和39°C的條件下生長(zhǎng)受到限制(ts，溫敏)。另外，這個(gè)病毒在被感染的雪貂的肺內(nèi)不復(fù)制(att，減毒的)。這種ts表型被認(rèn)為促成了疫苗在人體內(nèi)的減毒活性，這種疫苗的復(fù)制并不是在整個(gè)呼吸道內(nèi)，而是在最冷的區(qū)域都受到限制。這種特性的穩(wěn)定性已在動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中得到證明。與通過(guò)化學(xué)突變方法得到流感病毒株的ts表型不同，MDV-A的ts特性經(jīng)過(guò)在感染倉(cāng)鼠體內(nèi)傳代以后不會(huì)還原，從兒童體內(nèi)分離出的病毒株其ts特性也不會(huì)減弱(最近的有關(guān)綜述見(jiàn)Murphy&Coelingh，(2002)，“開(kāi)發(fā)和使用冷適應(yīng)性減毒活流感病毒A型和B型疫苗的原理”(Principlesunderlyingthedevelopmentanduseofattenuatedcold-adaptedinfluenzaAandBvirusvaccines)，ViralImmunol.15:295_323)。使用12株不同的62重組病毒進(jìn)行了超過(guò)20000個(gè)成人和兒童的臨床試驗(yàn)，結(jié)果表明這些疫苗是減毒的、安全的和有效的(Belshe等，(1998)，“冷適應(yīng)性的三價(jià)減毒活流感疫苗鼻內(nèi)制劑用于兒童的效果”，N.EhrI.J.Med.3381405-12；Boyce等，(2000)，“含佐劑的和不含佐劑的亞單位流感疫苗健康成人鼻內(nèi)給藥的安全性和免疫原t生”(Safetyandimmunogenicityofadjuvantedandunadjuvantedsubunitinfluenzavaccinesadministeredintranasallytohealthyadults)，Vaccine19:217_26；Edwards等，(1994)，“用于預(yù)防A型流感疾病的冷適應(yīng)性和滅活疫苗的隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)，，(ArandomizedcontrolledtrialofcoldadaptedandinactivatedvaccinesforthepreventionofinfluenzaAdisease)，J.Infect.Pis.169:68_76；Nichol等，(1999)，“減毒活流感疫苗鼻內(nèi)制劑在健康工作人群中的效果隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)”，JMA282137-44)。含MDV-A的6個(gè)內(nèi)部基因和野生型病毒的HA和NA基因的重配株(即62重配株)可始終如一地保持其ca、ts和att表型(Maassab等，(1982)，“在雪貂體內(nèi)評(píng)價(jià)冷重組流感疫苗，，(Evaluationofacold-recombinantinfluenzavirusvaccineinferrets)，T.Infect.Pis.146=780-900)。但是，利用流感病毒B株制備這種重組病毒更困難一些。最近的文獻(xiàn)描述了一種用于制備B型流感病毒的完全來(lái)自于克隆cDNA的8質(zhì)粒系統(tǒng)和適用于疫苗制劑，如用于鼻內(nèi)給藥的活病毒疫苗制劑的減毒A型和B型活流感病毒的制備方法。見(jiàn)“用于制備流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)”，引用文獻(xiàn)如上。以前描述的系統(tǒng)和方法可用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中快速制備重組和重配的A型和B型流感病毒，其中包括適宜作為疫苗、包括減毒活疫苗的病毒，例如適于鼻內(nèi)給藥的疫苗如FluMist。本文所描述的本發(fā)明的方法還可與以前的此類研究結(jié)果如重組流感病毒結(jié)合應(yīng)用以制備疫苗，以更穩(wěn)定、更均勻和效率更高的方式生產(chǎn)出可用作疫苗的病毒。細(xì)胞培養(yǎng)物如前所述，流感病毒還可以在細(xì)胞培養(yǎng)物上生長(zhǎng)。一般來(lái)說(shuō)，病毒的擴(kuò)增是在培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基組合物內(nèi)進(jìn)行的。適于流感病毒復(fù)制的宿主細(xì)胞包括Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞和COS細(xì)胞，如293T、C0S7細(xì)胞。通常情況下，用包含上述兩種細(xì)胞系如MDCK細(xì)胞和293T或COS細(xì)胞的共培養(yǎng)物以11的比例來(lái)提高病毒的復(fù)制效率。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)的商用培養(yǎng)基如添加血清(如10%胎牛血清)或無(wú)血清的DMEM、在適于維持中性緩沖PH(如pH在7.0到7.2之間)的可控濕度和C02濃度下培養(yǎng)。培養(yǎng)基中還可以添加抗生素以阻止細(xì)菌的生長(zhǎng)，如青霉素、鏈霉素等，和/或其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如L谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必須氨基酸、添加劑如胰蛋白酶、0巰基乙醇等以改善細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法已多有報(bào)道，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通用培養(yǎng)技術(shù)見(jiàn)Freshney，(1983)，《動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基本技術(shù)操作方法》(CultureofAnimalCells:ManualofBasicTechnique),AlanR.Liss,NewYork；Paul,(1975),《細(xì)胞和組織培養(yǎng)》(CellandTissueCulture)，第5版，Livingston,Edinburgh；Adams,(1980)，《生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-細(xì)胞培養(yǎng)》(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-CellCultureforBiochemists),Work禾口Burdon(編)，Elsevier,Amsterdam。有關(guān)于為了流感病毒體外制備過(guò)程中的特定目的而進(jìn)行的組織培養(yǎng)過(guò)程的其他詳細(xì)描述參見(jiàn)Merten等，(1996)，“在細(xì)胞培養(yǎng)物中制備、流感病毒用于疫苗的帝[J備，，(Productionofinfluenzavirusincellculturesforvaccinepreparation),Cohen和Shafferman(編輯)，《疫苗設(shè)計(jì)和制備的新策略》(NovelStragetiesinDesignandProductionofVaccines)，本文都已完整納入作為參考。另夕卜，本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解如何通過(guò)常規(guī)的試驗(yàn)確定對(duì)這些方法的改動(dòng)以適應(yīng)本發(fā)明。制備流感病毒用的細(xì)胞可在含血清或無(wú)血清的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。在某些情況下，如用于制備純化病毒時(shí)，一般希望宿主細(xì)胞能在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)。細(xì)胞可在小規(guī)模培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶，如含25ml以下培養(yǎng)基的培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，也可在振搖瓶、旋轉(zhuǎn)瓶或微載體珠(例如DEAE-右旋糖酐微載體珠，如Dormacell，Pfeifer&Langen；Superbead,FlowLaboratories；苯乙烯共聚物三甲胺微載體珠，如Hillex，SoloHill,AnnArbor)反應(yīng)器內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)。微載體珠是小球(直徑在100-200微米之間)，可為單位體積的細(xì)胞培養(yǎng)物粘附生長(zhǎng)提供很大的表面積。例如，1升培養(yǎng)基包含的微載體珠數(shù)量超過(guò)2千萬(wàn)個(gè)，提供的生長(zhǎng)表面面積超過(guò)8000cm2。在制備商業(yè)病毒，如疫苗時(shí)，通常希望在生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞。目前可用的生物反應(yīng)器1升以下到100升以上的都39有，如Cyto3Bioreactor(Osmonics,Minnetonka,MN;NBSbioreactors(NewBrunswickScientific,Edison,N.J.)；B.BraunBiotechInternational的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模和商用規(guī)模的生物反應(yīng)器(B.BraunBiotech,Melsungen，德國(guó))。在本發(fā)明的許多優(yōu)選方面，無(wú)論培養(yǎng)體積大小，在適當(dāng)?shù)臏囟认屡囵B(yǎng)都是十分重要的，這樣才能確保利用溫度依賴性的多質(zhì)粒系統(tǒng)(見(jiàn)“用于流感病毒制備的多質(zhì)粒系統(tǒng)”，引用文獻(xiàn)如上)有效地回收重組和/或重配的流感病毒、加熱病毒溶液便于過(guò)濾等。一般來(lái)說(shuō)，需要有探測(cè)和維持細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和/或其他溶液溫度的調(diào)節(jié)器如恒溫器或其他裝置在適當(dāng)時(shí)期內(nèi)(如病毒復(fù)制期間等)將溫度校正在正確的水平上。在本文的某些實(shí)施方式(例如，其中的重配的病毒是由載體上的片段制備的)中，按照本領(lǐng)域熟知的方法將含有流感病毒基因組片段的載體導(dǎo)入(或轉(zhuǎn)染)到宿主細(xì)胞內(nèi)以使外源核酸進(jìn)入到真核細(xì)胞內(nèi)，如鈣磷酸鹽共沉淀技術(shù)、電穿孔技術(shù)、微注射技術(shù)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)以及利用多胺轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染的技術(shù)。例如，根據(jù)廠家提供的說(shuō)明書利用多胺轉(zhuǎn)染試劑TransFT-LTl(Minis)可將載體如質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞如COS細(xì)胞、293T細(xì)胞或COS細(xì)胞與293T或MDCK細(xì)胞的混合培養(yǎng)物內(nèi)，制備出重配的病毒等。將約Iyg載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞群內(nèi)需要約2μITransIT-LTl，稀釋到160μ1培養(yǎng)基內(nèi)，優(yōu)選無(wú)血清培養(yǎng)基，總體積為200μ1。DNA:轉(zhuǎn)染試劑混合物在室溫下孵育45分鐘，然后加入800μ1培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染混合物加到宿主細(xì)胞上，細(xì)胞按照上述條件或者本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他方法培養(yǎng)。相應(yīng)的，在用細(xì)胞培養(yǎng)物制備重組病毒或重配病毒時(shí)，將帶有8個(gè)基因組片段(ΡΒ2、PBUΡΑ、NP、M、NS、HA和NA)中不同片段的載體分別與約2μ1TransIT-LTl混合物，轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)。另外，在轉(zhuǎn)染前還可以用無(wú)血清培養(yǎng)基如Opti-MEMI替換含血清的培養(yǎng)基，然后孵育4-6小時(shí)。另外，也可以利用電穿孔技術(shù)將含有流感病毒基因組片段的這種載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)。例如，含A型或B型流感病毒基因組片段的質(zhì)粒載體適于通過(guò)如下過(guò)程利用電穿孔技術(shù)導(dǎo)入到Vero細(xì)胞內(nèi)。簡(jiǎn)言之，收獲約5XIO6在添加10%胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Vero細(xì)胞，懸浮于0.4mlOptiMEM中，然后加入到電穿孔槽內(nèi)，通過(guò)輕叩溫和混勻。按照廠家的說(shuō)明書進(jìn)行電穿孔操作，300伏、950微法、持續(xù)時(shí)間28-30微秒。通過(guò)輕叩再次溫和混勻細(xì)胞，電穿孔后約1-2分鐘將0.7ml含10%FBS的MEM直接加入到電穿孔槽內(nèi)。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含2mlMEM、10%FBS的標(biāo)準(zhǔn)6孔組織培養(yǎng)板的2個(gè)孔內(nèi)。洗滌電穿孔槽回收槽內(nèi)剩余的細(xì)胞，洗滌的懸液再分成兩份加到上述2個(gè)孔內(nèi)，終體積約為3.5mL。然后在適于病毒生長(zhǎng)的條件下孵育細(xì)胞，例如，對(duì)于冷適應(yīng)性病毒株來(lái)說(shuō)孵育溫度約為330Cο試劑盒為了便于使用本發(fā)明的方法和組合物，疫苗和/或組合物的任何組分，如尿囊液和各種制劑中的重配病毒等，以及用于實(shí)驗(yàn)性或治療性疫苗所用的流感病毒的包裝和感染的其他組分，如緩沖液、細(xì)胞、培養(yǎng)基都可以包裝成試劑盒的形式。一般來(lái)說(shuō)，試劑盒除了包含上述組分以外，還包含其他材料，如操作本發(fā)明方法的說(shuō)明書、包裝材料和容器。雖然為了清楚理解的目的，在上文已對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)描述，但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚的是，只要不偏離本發(fā)明的真實(shí)范圍，通過(guò)閱讀本說(shuō)明書可以對(duì)本發(fā)明的形式和細(xì)節(jié)做出某些修改。例如，上面所描述的所有技術(shù)和設(shè)備都可以以各種組合方式使用。出于所有目的，本申請(qǐng)所引用的所有文獻(xiàn)、專利、專利申請(qǐng)或其他資料都已完整納入作為參考，其程度如果已將各個(gè)出版物、專利、專利申請(qǐng)或其它文獻(xiàn)單獨(dú)納入本文作為參考。表表1<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表4.<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>BD=檢測(cè)限以下(低于5μU/ml)表6中的所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾前VAF分別置于5士3°C、20士3°C和31士3°C保持60分鐘。表7.A/Sydney/05/97的血凝素活性[HA滴度].<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表7中的所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sart0p0re2濾器過(guò)濾前VAF分別置于5士3°C、20士3°C和31士3°C保持60分鐘。表8.A/Sydney/05/97病毒的毒力[log1(1TCID5(1/mL]·<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表8中的所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sart0p0re2濾器過(guò)濾前VAF分別置于5士3°C、20士3°C和31士3°C保持60分鐘*。表9.A7Sydney/05/97的神經(jīng)酰胺酶活性[μU/ml].<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>BD=檢測(cè)限以下(低于5μυ/πι1)表9中的所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sart0p0re2濾器過(guò)濾前VAF分別置于5士3°C、20士3°C和31士3°C保持60分鐘*。表10.A/Sydney/05/97的血凝素活性[HA滴度]<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>*所有試驗(yàn)都用10%的PBS調(diào)整體積表10中的所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sart0p0re2濾器過(guò)濾前VAF分別置于5士3°C、20士3°C和31士3°C保持60分鐘*。表11.A/Sydney/Q5/97病毒的毒力[IogltlTCID50/mL].<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sart0p0re2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3°C分別保持30、90、180分鐘。表12.A/Sydney/05/97的神經(jīng)酰胺酶活性[μU/ml].<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sart0p0re2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3°C分別保持30、90、180分鐘。表13.A/Sydney/05/97的血凝素活性[HA滴度].<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>*在將VAF分成4個(gè)試驗(yàn)(0、30、60、90分鐘加溫處理)前經(jīng)穩(wěn)定化處理的VAF和經(jīng)離心穩(wěn)定化處理的VAF(對(duì)照)取自樣品池。NA=未做所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sart0p0re2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3°C分別保持30、90、180分鐘。表14.A/Sydney/05/97病毒的毒力[log1(1TCID5(1/mL].<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sart0p0re2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3V分別保持0、30、60、90分鐘。表15.A/Sydney/05/97的神經(jīng)酰胺酶活性[μU/ml].<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sart0p0re2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3V分別保持0、30、60、90分鐘。表16.A/Sydney/05/97的血凝素活性[HA滴度]<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>*在將VAF分成4個(gè)試驗(yàn)(0、30、60、90分鐘加溫處理)前經(jīng)穩(wěn)定化處理的VAF和經(jīng)離心穩(wěn)定化處理的VAF(對(duì)照)取自樣品池。所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sart0p0re2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3V分別保持0、30、60、90分鐘。表17.病毒毒力[log1(1TCID5(1/mL]·<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3V分別保持0、30、60、90分鐘。表18.神經(jīng)酰胺酶活性[μU/ml].<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3V分別保持0、30、60、90分鐘。表19.血凝素活性<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>*在將VAF分成4個(gè)試驗(yàn)(0、30、60、90分鐘加溫處理)前經(jīng)穩(wěn)定化處理的VAF和經(jīng)離心穩(wěn)定化處理的VAF(對(duì)照)取自樣品池。所有過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3V分別保持0、30、60、90分鐘。表20.6株流感病毒的毒力[l0gl。TCID5。/mL].<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>*在將VAF分成2個(gè)試驗(yàn)(RT和31士3°C)前經(jīng)穩(wěn)定化處理的VAF和經(jīng)離心穩(wěn)定化處理的VAF(對(duì)照)取自樣品池。#RT室溫同一病毒株的兩種過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3°C分別保持0(RT)或60分鐘。表21.6株流感病毒的神經(jīng)酰胺酶活性[μU/ml]<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>*在將VAF分成2個(gè)試驗(yàn)(RT和31士3°C)前經(jīng)穩(wěn)定化處理的VAF和經(jīng)離心穩(wěn)定化處理的VAF(對(duì)照)取自樣品池。**RT室溫同一病毒株的兩種過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3°C分別保持0(RT)或60分鐘。表22.6株流感病毒的血凝素活性[HA滴度]<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>*在將VAF分成2個(gè)試驗(yàn)(RT和31士3°C)前經(jīng)穩(wěn)定化處理的VAF和經(jīng)離心穩(wěn)定化處理的VAF(對(duì)照)取自樣品池。**RT室溫同一病毒株的兩種過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3°C分別保持0(RT)或60分鐘。表23·6株流感病毒的毒力[log1(1TCID5(1/mL]<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>*在將VAF分成不同的穩(wěn)定化收集物(RT和31士3°C)前經(jīng)穩(wěn)定化處理的VAF和經(jīng)離心穩(wěn)定化處理的VAF(對(duì)照)取自樣品池。**RT室溫同一病毒株的兩種過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3°C分別保持0(RT)或60分鐘。表24.6株流感病毒的神經(jīng)酰胺酶活性[μU/ml]流感病毒株處理步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>*在將VAF分成不同收集物(RT和31士3°C)前經(jīng)穩(wěn)定化處理的VAF和經(jīng)離心穩(wěn)定化處理的VAF(對(duì)照)取自樣品池。#RT室溫同一病毒株的兩種過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3°C分別保持0(RT)或60分鐘。表25.6株流感病毒的血凝素活性[HA滴度]<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>*在將VAF分成不同收集物(RT和31士3°C)前經(jīng)穩(wěn)定化處理的VAF和經(jīng)離心穩(wěn)定化處理的VAF(對(duì)照)取自樣品池。#RT室溫同一病毒株的兩種過(guò)濾用的都是同一天的收獲物。在用SartocleanCA和Sartopore2濾器過(guò)濾前VAF置于31士3°C分別保持0(RT)或60分鐘。表26.SEC分析-峰面積比較<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表27.A/NewCaledonia-CELISA值<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表28.典型制劑的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>制劑第二滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>基礎(chǔ)制劑60%NAF、10%蔗糖、明膠、2%精氨酸表41:<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>表42:FFA分析得到的毒力結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>基礎(chǔ)制劑100mMKP04,60%NAF、10%蔗糖、1%明膠、2%精氨酸表43制劑第三滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>制劑P-B4-級(jí)定制篩選(P-B4-levelCustomScreen)<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表46<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>:8寸.VlaaeBνΜΜvafgg/liftlgt/KMMSOS--|9.9一8.916.91eggnV-LaM日eg/豳贓贓INl/趣櫸I11.8■①oogcr二VlaWII/瀣堿驄’島gl/jsmSI/KkHiosII^οο·9"τ^ZgCTnyla3Bsg/^w^0/glgvlil:SVMMI0sII^^9·995.5·vla3ES/..cvl/氍贓go/鏈EfBI/nmgvscHig^^\^卜.91SggHV1Q3SSZ,。饀贓軀芝盜gO/鵝解gl/SCMPOg^^6.9^^V1Q3昌I/趣賊o/jll:gvK}caiog,~scrnVg3昌Ζ..Z/饉Mgo]/^go/il;is/M}dMmog~~^^Ζ·98.9scrn■vlaw昌ζOj/氍nv^gg/te^ovscalg^^o.zCTldSCT^Vlaasfg/饀Mlgo/谿gg/鶼粗s/KMMmos^.Ii9.99.9SbnylQMs曰r—t/饀Mlgo/谿Sg/鵝爾3/·φοα·>προη,^^T^1.9^.φIVlg3sss/猶堿g-gl·/鏈gI/ISMS/KM箜eosI^9.99·9Ι8^Πν1α3·ζ..5/趦賊gag/lrfeo/sdlosI^ζ·9卜·9。-|-1Vlqasev氍MlgZ/島眵\鵝ijSAOdMEOS~I^.ε.91浮CJnV1Q3園/猶MgO/海ftl5/MMXios^■g.9Co.9淙.1V1Q3EES/饀Mllg/紹g0/lrfe5/M}dMM0s.-.^寸.9S.9H^nVlaamBg/趦堿g^s^0\盤眠Ocsio^^^"TiI9σ·πVlCmSSI/趦滅鵝^塔5;2/聽(tīng)；157/寸0自109^β.gI^CTnVlglg/氍wg0\鋁眵<盤樾g(shù)^no^^^ο.9習(xí).1vlQ3SEl--.g/趦Mr寸/^5:1/鵝樾g(shù)l>-'/sd_osIlI-^^^1--.90吝二vlQMir—ι/趦Mgo/鏈郜/鵝樁s_J^...^eecfn■VS3曰Ss/趦ggT島go/^Ms.z/gdtios,1卜.9Z.9I8εσ·τ1.VlQHmeZ.g/氍減獎(jiǎng)Csl/袋go/grfeg7/KM_gl,.^9.9卜.99.9^^V1Q3眉/籜tfjgz/鏈猙0/jrfeo/sdMSOSI■T^,g.9K99e._4.g~~^^~^ε~^ζ!zl■￡!-ι||1一0一ο|o|III_____(栽50。寸0.卜鈮el§d/vSgmds.-.·.■^...■■21304___<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>表50純化的VH與未純化的VH(FluMiSt)穩(wěn)定性比較二者都通過(guò)純化制劑進(jìn)行穩(wěn)定時(shí)4℃的穩(wěn)定性斜率(±SE)，在6個(gè)月時(shí)<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>制劑7%蔗糖、明膠、精氨酸[7/1/1制劑]*60%AF7ΚΨ表51純化的VH與FluMist穩(wěn)定性比較=FluMist通過(guò)10/2/2制劑進(jìn)行穩(wěn)定時(shí)<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>純化的VH制劑7%蔗糖、1%明膠、1%精氨酸[7/1/1制劑]，不另外添加AF*FluMist制劑10%蔗糖、2%明膠、2%精氨酸[10/2/2制劑]，60%AF水平**根據(jù)線性回歸表52純化的VH與FluMist穩(wěn)定性比較FluMist通過(guò)10/2/2組氨酸制劑進(jìn)行穩(wěn)定時(shí)<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>純化的VH制劑7%蔗糖、1%明膠、1%精氨酸[7/1/1制劑]，不另外添加AF*FluMist制劑組氨酸、10%蔗糖、2%明膠、2%精氨酸[10/2/2組氨酸制劑]，60%AF水平**根據(jù)線性回歸表53:比較方法的表現(xiàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>在1%顯著水平上不匹配線性模型在1%顯著水平上不匹配線性模型線性_______則通過(guò)試驗(yàn)__則通過(guò)試驗(yàn)3準(zhǔn)確度__斜率范圍0.986-1.007__斜率范圍1.0Q-1.Q23范圍__4.7-9.5log.oTCIDso/mL__4.2-9.3log.oTCIDso/niL31用同一種材料進(jìn)行9次試驗(yàn)得到的試驗(yàn)之間的SD(每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果是在3天內(nèi)測(cè)定的12個(gè)測(cè)定值的平均值)，由同一組分析員操作，用同一套加樣儀。所試驗(yàn)的材料包括每株病毒的3個(gè)不同制造批次，共3株病毒(H1N1、H3N2和B)。2用同一種材料進(jìn)行6次試驗(yàn)得到的試驗(yàn)之間的SD(每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果是在3天內(nèi)測(cè)定的12個(gè)測(cè)定值的平均值)，由同一組分析員操作，用同一套加樣儀。所試驗(yàn)的材料包括每株病毒的3個(gè)不同制造批次，共3株病毒(H1N1、H3N2和B)。3來(lái)自用單價(jià)流感病毒驗(yàn)證半自動(dòng)TCID5tl毒力分析法的報(bào)告。表54分析法之間的比較病毒株平均滴度(lo&。TCI!VmL)_<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>所有陽(yáng)性ι所有陰性~~表56.半自動(dòng)TCID5tl毒力分析法分析單價(jià)流感病毒根據(jù)“金標(biāo)準(zhǔn)”驗(yàn)證的手工操作CPE讀數(shù)和A570截留值為0.5254的MTT分析結(jié)果的敏感性和特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>a敏感性=(真陽(yáng)性)/所有陽(yáng)性b特異性=(真陰性)/所有陰性表57.兩組試驗(yàn)所得到的對(duì)照孔(CPE陰性)吸光度值和以前所報(bào)道的吸光度值比較<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>表58.設(shè)備與設(shè)備之間的比較半自動(dòng)TCID5tl毒力分析法測(cè)定的參照病毒株的毒力值<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>1試驗(yàn)次數(shù)(AZ-036,N=9；AZ-039，N=5；AZ-040，N=2)；2AZ-039組有1個(gè)試驗(yàn)結(jié)果因不符合天與天之間的SD接受標(biāo)準(zhǔn)而被排除3AZ-040組有4個(gè)試驗(yàn)結(jié)果因不符合天與天之間的SD接受標(biāo)準(zhǔn)或培養(yǎng)板的錯(cuò)誤處理而被排除表59.分析員與分析員之間的比較利用設(shè)備AZ-039或AZ-036測(cè)定參照病毒株的半自動(dòng)TCID5tl毒力值參照病毒(平均logwTCIDso/mL士SD)a_A/NewCaledonia/20/99A/Sydney/05/97B/Yamanashi/166/98第1組AZ-039___AZ-039AZ-Q39_1號(hào)分析員9.3±0.19_8.5±0.258.4士0.26_2號(hào)分析員9.1±0.17_8.5±0.278.4±0.16_3號(hào)分析員9.1士0.16_8.5±0.15_8·4±0.194號(hào)分析員9.2±0.24_8.6±0.218.6±0.24__5號(hào)分析員9.1±0.218.6±0.198.3±0.23_6號(hào)分析員9.4士0.21_8.7±0.208.6±0.21第2組ΑΖ-036__ΑΖ-036ΑΖ-036_7號(hào)分析員9.4±0.16_8.5±0.218.3±0.18_8號(hào)分析員9.2±0.21_8.5±0.18,8.2±0.15_9號(hào)分析員9.3±0.16_8.5±0.20+8.3±0.16_a平均毒力值得自3天試驗(yàn)期間的4次重復(fù)測(cè)定(η=12)權(quán)利要求一種制備冷藏穩(wěn)定的活流感病毒疫苗液體組合物的方法，所述方法包括(a)通過(guò)交叉流動(dòng)過(guò)濾濃縮活流感病毒收獲物，和(b)通過(guò)交叉流動(dòng)過(guò)濾用緩沖液洗滌濃縮病毒收獲物；其中，所述組合物包含約5％-10％蔗糖、約1％-2％精氨酸和約1％-4明膠；其中，所述組合物約2℃-8℃儲(chǔ)存時(shí)，12個(gè)月內(nèi)的毒力損失低于或等于1.0log，或者，毒力損失低于或等于每月0.080log。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述病毒收獲物是自蛋中收獲的。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述病毒收獲物是自細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲的。4.如權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其中，所述流感病毒收獲物濃縮10倍至200倍.5.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的方法，其中，用約5體積的緩沖液洗滌所述濃縮病毒收獲物，其中，1體積等于所述病毒收獲物濃縮前的體積。6.如權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中，洗滌后的體積與洗滌前濃縮病毒的體積相同。7.如權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中，所述緩沖液包含蔗糖、磷酸鉀和谷氨酸鹽(SPG)。8.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7所述的方法，其中，在濃縮前將所述病毒收獲物穩(wěn)定化。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，通過(guò)加入含SPG的緩沖液來(lái)將所述病毒收獲物穩(wěn)定化。10.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的方法，其中，濃縮前將所述病毒收獲物澄清。11.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10所述的方法，其中，所述組合物含有約1%精氨酸。12.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所述的方法，其中，所述流感病毒組合物含有約明膠。13.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12所述的方法，其中，所述組合物含有約7%-10%蔗糖。14.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13所述的方法，其中，所述組合物還含有約5mM-200mM的磷酸鉀緩沖液。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述組合物含有約IOOmM的磷酸鉀緩沖液。16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述組合物含有約10mM-12mM的磷酸鉀緩沖液。17.如權(quán)利要求14、15或16所述的方法，其中，所述磷酸鉀緩沖液的pH為7.2。18.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17所述的方法，其中，所述組合物所含NAF少于5%。19.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18所述的方法，其中，所述組合物的PH為7.2。20.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19所述的方法，其中，所述組合物不含EDTA。21.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20所述的方法，其中，所述流感病毒是冷適應(yīng)性流感病毒。22.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21所述的方法，其中，所述毒力用熒光聚焦單位衡量。全文摘要本發(fā)明提供了用于優(yōu)化流感病毒制備的方法和組合物，該流感病毒適于用作流感疫苗。文檔編號(hào)A61K39/145GK101804202SQ20091026680公開(kāi)日2010年8月18日申請(qǐng)日期2004年2月25日優(yōu)先權(quán)日2003年2月25日發(fā)明者G·R·特拉格,J·M·貝里,L·易,R·M·施瓦茨,V·特魯翁-勒,W·崔申請(qǐng)人:米迪繆尼有限公司