專利名稱：：無熒光化合物丹皮酚的熒光掃描定量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種無熒光化合物丹皮酚的熒光掃描定量測定方法
背景技術(shù)：
：丹皮酚為中藥牡丹皮中的主要活性成分，具有抗心律失常，抗動(dòng)脈粥樣硬化，抗高血壓及抗菌、抗變態(tài)反應(yīng)和增強(qiáng)免疫的藥理作用。牡丹皮為一種常用中藥材，配伍在多種成方制劑中，僅《中國藥典》2005年版一部收載的成方制劑中含牡丹皮的品種就有35種。目前對(duì)丹皮酚的含量測定方法主要有紫外薄層掃描法和高效液相法，高效液相法使用頻率最高。紫外薄層掃描法是依據(jù)丹皮酚在紫外區(qū)274nm處的吸收，采用雙波長掃描法，測量對(duì)照品與供試品色譜斑點(diǎn)的吸收峰面積，在線性范圍內(nèi)，以外標(biāo)兩點(diǎn)法，進(jìn)行定量測定。薄層掃描法的靈敏度較差，要求對(duì)照品與供試品溶液濃度相對(duì)都較高，對(duì)含量低微的樣品是難以進(jìn)行準(zhǔn)確定量測定的。高效液相法與薄層掃描法相比，靈敏度要高的多，但與其他有熒光的化合物相比，其要求供試品溶液的進(jìn)樣濃度還是相對(duì)較高，尤其對(duì)雜質(zhì)峰干擾嚴(yán)重，丹皮酚含量低微的樣品，高效液相法有時(shí)也難以達(dá)到要求。本發(fā)明就是針對(duì)上述丹皮酚在定量測定中存在的不足，提供一種簡便、快捷、低成本、高靈敏度的熒光掃描定量測定方法。
發(fā)明內(nèi)容無熒光化合物丹皮酚，通過薄層展開，將展開的斑點(diǎn)與增熒光劑三氯化鋁反應(yīng)，斑點(diǎn)呈現(xiàn)出很強(qiáng)的亮藍(lán)色熒光，該熒光強(qiáng)度積分值與點(diǎn)樣量，在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，而用于丹皮酚的定量測定。該發(fā)明方法有效提高了丹皮酚的檢測靈敏度，可達(dá)高效液相法的約3倍，紫外薄層掃描法的25倍。點(diǎn)樣量只需0.04iig即可準(zhǔn)確定量，擴(kuò)大了丹皮酚的定量范圍，使樣品中的微量丹皮酚有了檢測手段，有效排除了非熒光物質(zhì)的干擾。通過方法學(xué)考察，點(diǎn)樣量在0.0402-0.1809iig范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度積分值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=27.89X+982.79，r=0.9997。采用加樣回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明9次回收率的平均值為101.80X，RSD為1.58%(見表1)。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性與專屬性實(shí)驗(yàn)均符合規(guī)定。適用于樣品中微量丹皮酚樣品的測定。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為1.對(duì)照品溶液的制備取丹皮酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每lml含1020iig的溶液，即得。2.供試品溶液的制備取樣品粉末或蜜丸碎粒適量(約相當(dāng)牡丹皮藥材0.050.2g)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇1025ml，密塞，搖勻，稱定重量，如為蜜丸浸泡10小時(shí)以上，用玻棒研磨使樣品溶散，用數(shù)滴甲醇沖洗玻棒于錐形瓶中，超聲處理(功率300W，頻率50KHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足或揮散至原重量，減失的重量，濾過。精密量取續(xù)濾液12ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。3.薄層色譜掃描條件熒光法單波長線性掃描；激發(fā)波長292±lnm，1號(hào)濾光片，線性化參數(shù)SX=3;線性回歸二點(diǎn)法計(jì)算含量。4.測定方法精密吸取供試品溶液231、對(duì)照品溶液3ill與61，分別交叉點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷_乙酸乙酯_丙酮_甲酸(412:13:0.51.5:0.10.3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液進(jìn)行增熒光反應(yīng)，置紫外光燈(365nm)下定位，采用激發(fā)波長A=292nm，進(jìn)行熒光掃描，用外標(biāo)二點(diǎn)法計(jì)算含量。樣品和牡丹皮藥材的測定結(jié)果見表2。本發(fā)明的原理如下丹皮酚與增熒光劑三氯化鋁反應(yīng)后，即產(chǎn)生很強(qiáng)的亮藍(lán)色熒光，該熒光強(qiáng)度積分值與丹皮酚的點(diǎn)樣量在一定范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，而用于定量測定。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)及有益效果如下(1)通過丹皮酚與增熒光劑三氯化鋁反應(yīng)，能使無熒光化合物丹皮酚呈現(xiàn)出很強(qiáng)的亮藍(lán)色熒光，利用該熒光的高靈敏性，可進(jìn)行樣品中微量丹皮酚的定性檢查和定量測定(見圖16)。對(duì)低微成分的質(zhì)量監(jiān)督，具有重要意義。(2)通過丹皮酚無熒光到有熒光的質(zhì)變，有效提高了丹皮酚的檢測靈敏度，點(diǎn)樣量只需O.04iig即可準(zhǔn)確定量，擴(kuò)大了丹皮酚的定量范圍，使樣品中的微量丹皮酚有了檢測手段，有效排除了非熒光物質(zhì)的干擾。(3)本測定方法與中國藥典2005年版牡丹皮項(xiàng)下的高效液相法相比，檢測靈敏度為藥典法的3倍，簡便、快捷、檢測成本低、靈敏度高，彌補(bǔ)了高效液相法對(duì)某些樣品難以達(dá)到測定要求的欠缺之處。(4)本測定方法與濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2004.27(2)刊載的"薄層掃描法測定牡丹皮中丹皮酚含量"與湖北中醫(yī)雜志2005.27(7)刊載的"薄層掃描法測定知柏地黃丸中丹皮酚含量"方法相比，本發(fā)明的檢測靈敏度是報(bào)道方法的25倍，也就是說雜質(zhì)干擾降低到報(bào)道方法的1/25，使一些因丹皮酚含量低微，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重的樣品能得以準(zhǔn)確定量測定。(5)本發(fā)明方法的問世，不但解決了丹皮酚的高靈敏度測定問題，還為同行提供了無熒光化合物的定量測定新途徑，具表帥與示范作用。圖1為丹皮酚對(duì)照品與清胃黃連丸的TLC圖(254nm下檢視)圖2為丹皮酚對(duì)照品與清胃黃連丸的TLC圖(365nm下檢視)圖3為增熒光后丹皮酚對(duì)照品與清胃黃連丸的TLC圖(365nm下檢視)其中圖13為同一塊薄層板，不同條件下的檢視圖，其中1.3.5.7.9.11為樣品，2.4.6.8.IO為丹皮酚對(duì)照品。圖4為丹皮酚對(duì)照品與養(yǎng)陰請(qǐng)肺丸的TLC圖(254nm下檢視)圖5為丹皮酚對(duì)照品與養(yǎng)陰請(qǐng)肺丸的TLC圖(365nm下檢視)圖6為增熒光后丹皮酚對(duì)照品與養(yǎng)陰請(qǐng)肺丸的TLC圖(365nm下檢視)其中圖46為同一塊薄層板，不同條件下的檢視圖，其中1.3.5.7.9.11為樣品，2.4.6.8.IO為丹皮酚對(duì)照品。從照片可以看到丹皮酚對(duì)照品與兩種樣品，在未增熒光之前，不論是254nm，還是365nm下檢視，樣品與相應(yīng)位置的丹皮酚對(duì)照品都無任何信息斑點(diǎn)，無法檢出，但增熒光后，樣品和對(duì)照品都出現(xiàn)了非常清晰的亮蘭色熒光斑點(diǎn)，信息增強(qiáng)，可用于微量定性鑒別和定本發(fā)明具體實(shí)施方式如下1.對(duì)照品溶液的制備取丹皮酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含1020iig的溶液，即得。2.供試品溶液的制備取樣品粉末或蜜丸碎粒適量(約相當(dāng)牡丹皮藥材0.050.2g)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇1025ml，密塞，搖勻，稱定重量，如為蜜丸浸泡10小時(shí)以上，用玻棒研磨使樣品溶散，用數(shù)滴甲醇沖洗玻棒于錐形瓶中，超聲處理(功率300W，頻率50KHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足或揮散至原重量，減失的重量，濾過。精密量取續(xù)濾液12ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。3.薄層色譜掃描條件熒光法單波長線性掃描；激發(fā)波長292士lnm，l號(hào)濾光片，線性化參數(shù)SX=3;線性回歸二點(diǎn)法計(jì)算含量。4.測定方法精密吸取供試品溶液23ii1、對(duì)照品溶液3iU與6ii1，分別交叉點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷_乙酸乙酯_丙酮_甲酸(412:13:0.51.5:O.l0.3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液進(jìn)行增熒光反應(yīng)，置紫外光燈(365nm)下定位，采用激發(fā)波長入=292nm，進(jìn)行熒光掃描，用外標(biāo)二點(diǎn)法計(jì)算含量。樣品和牡丹皮藥材的測定結(jié)果見表2。表1丹皮酚含量回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2樣品與牡丹皮藥材含量測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>權(quán)利要求一種無熒光化合物丹皮酚的熒光掃描定量測定方法，其特征在于(1)對(duì)照品溶液的制備取丹皮酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含10～20μg的溶液，即得；(2)供試品溶液的制備，取樣品粉末或蜜丸碎粒適量，相當(dāng)牡丹皮藥材0.05～0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10～25ml，密塞，搖勻，稱定重量，如為蜜丸浸泡10小時(shí)以上，用玻棒研磨使樣品溶散，用數(shù)滴甲醇沖洗玻棒于錐形瓶中，超聲處理，功率300W，頻率50KHz，30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足或揮散至原重量，減失的重量，濾過；精密量取續(xù)濾液1～2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；(3)薄層色譜掃描條件熒光法單波長線性掃描，激發(fā)波長292±1nm，1號(hào)濾光片，線性化參數(shù)SX＝3，線性回歸二點(diǎn)法計(jì)算含量；(4)測定方法精密吸取供試品溶液2～3μl、對(duì)照品溶液3μl與6μl，分別交叉點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(4～12∶1～3∶0.5～1.5∶0.1～0.3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液進(jìn)行增熒光反應(yīng)，置紫外光燈(365nm)下定位，采用激發(fā)波長λ＝292nm，進(jìn)行熒光掃描，用外標(biāo)二點(diǎn)法計(jì)算含量。全文摘要本發(fā)明涉及一種無熒光化合物丹皮酚的熒光掃描定量測定方法。其特征在于通過將展開的丹皮酚斑點(diǎn)，與增熒光劑三氯化鋁反應(yīng)后，使其產(chǎn)生亮藍(lán)色熒光，該熒光強(qiáng)度積分值與點(diǎn)樣量，在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，而用于丹皮酚的定量測定。該發(fā)明方法有效提高了丹皮酚的檢測靈敏度，可達(dá)高效液相法的約3倍，紫外薄層掃描法的25倍。點(diǎn)樣量只需0.04μg即可準(zhǔn)確定量測定，擴(kuò)大了丹皮酚的定量范圍，使樣品中的微量丹皮酚有了檢測手段，有效排除了非熒光物質(zhì)的干擾。文檔編號(hào)A61P9/00GK101721492SQ20091017542公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2009年11月16日優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日發(fā)明者李向軍,李曉燕,許紅輝,韓桂茹申請(qǐng)人:李向軍