專利名稱：魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)生物技術(shù)和水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治領(lǐng)域。特別涉及利用分子生物學(xué)技 術(shù)重組表達(dá)的一種魚類白細(xì)胞介素-4樣(IL-4-like，IL-4-L)細(xì)胞因子在魚類病害防治中 作為免疫增強(qiáng)劑的新用途。
背景技術(shù)：
隨著漁業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，水產(chǎn)動(dòng)物病害日益突出，已成為嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè) 健康可持續(xù)發(fā)展的世界性難題，在我國尤其突出。近年來，我國因病害導(dǎo)致的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)直 接經(jīng)濟(jì)損失每年超過百億元，而且逐年攀升。但長期以來，一直缺乏有效的病害防治方法； 各種抗生素、殺蟲劑濫用，造成養(yǎng)殖環(huán)境和水產(chǎn)品嚴(yán)重污染，水產(chǎn)食品安全受到嚴(yán)重威脅， 同時(shí)抗生素產(chǎn)生的耐藥性又加劇了水產(chǎn)動(dòng)物病害的發(fā)生，形成惡性循環(huán)。隨著我國加入WTO 和食品安全法的頒布，對環(huán)境和食品安全的標(biāo)準(zhǔn)越來越高，當(dāng)前一大批抗生素已被明令禁 用，水產(chǎn)動(dòng)物病害防治已面臨無藥可施的困境，因此研制開發(fā)包括各種免疫增強(qiáng)劑(佐劑) 在內(nèi)的天然、安全、高效的水產(chǎn)動(dòng)物病害防治制劑已迫在眉睫，它對支撐我國水產(chǎn)業(yè)健康持 續(xù)發(fā)展，確保我國食物安全，提高國民健康素質(zhì)，引領(lǐng)我國漁業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和水產(chǎn)科學(xué)的創(chuàng)新 都非常重要和十分緊迫，具有重大的經(jīng)濟(jì)社會(huì)意義。 目前，對水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病控制的方法主要有三種，即藥物療法、疫苗預(yù)防接種和 使用免疫增強(qiáng)劑。藥物療法主要是使用抗生素、殺蟲劑等藥物，但由于抗生素等的使用造成 諸多問題和健康安全隱患已被許多國家禁止。疫苗雖然可以成為控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病最 直接有效的方法，但是目前疫苗的開發(fā)和廣泛應(yīng)用也有困難，由于疫苗反應(yīng)具有特異性，一 種疫苗只能特異性地預(yù)防相應(yīng)的某種疾病，所以實(shí)際應(yīng)用也受到限制。免疫增強(qiáng)劑則能彌 補(bǔ)藥物治療法和疫苗法的不足，被認(rèn)為是一種比藥物療法更安全、比疫苗法有更廣泛效力 的防治方法。免疫增強(qiáng)劑通常指單獨(dú)或聯(lián)合抗原(疫苗)使用均能增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的 物質(zhì)，它通過提高動(dòng)物的天然或特異性免疫功能來增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的抗病能力。白細(xì)胞介素 4(Interleukin-4， IL-4)是由Howard等于1982年首次在人類中發(fā)現(xiàn)的一種由T細(xì)胞分泌 的細(xì)胞因子，由于最初發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)B細(xì)胞增殖而被命名為B細(xì)胞生長因子-1 (BCGF-1)， 1986年被更名為白細(xì)胞介素4。目前在人類和高等動(dòng)物中的研究顯示，IL-4可由Th2細(xì) 胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和NKT等多種細(xì)胞產(chǎn)生，具有促進(jìn)B細(xì)胞表達(dá)MHC II類抗原、 促進(jìn)抗原遞呈、活化B細(xì)胞分泌抗體、促進(jìn)抗體類別轉(zhuǎn)化等生物學(xué)功能。但由于魚類是低等 脊椎動(dòng)物，其免疫系統(tǒng)組成和免疫應(yīng)答機(jī)制與人類和高等動(dòng)物存在很大的差異，如參與魚 類獲得性免疫保護(hù)的主要球蛋白類型(IgM)就不同于人類和高等物種的免疫球蛋白類型 (IgG)，因此對于魚類確切的免疫學(xué)機(jī)制，包括哪些因子參與魚類的免疫調(diào)控，它們又如何 參與魚類的免疫調(diào)控等問題，均有待深入研究。 近年來，申請人所在的實(shí)驗(yàn)室較系統(tǒng)地開展了魚類白細(xì)胞介素等免疫細(xì)胞因子的 分離鑒定與功能研究，其中首次在河豚(Tetraodon nigroviridis)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)IL-4樣基 因(J.-H丄iet al./Molecular Immunology 44 (2007) 2078-2086)，此后，日本M. 0htani實(shí)驗(yàn)室和申請人所在的實(shí)驗(yàn)室又相繼在斑馬魚中預(yù)測到了第二個(gè)類似IL-4的基因序列。但 由于它們與高等物種的IL-4序列的同源性很低(11-15% )，目前又缺乏功能方面的研究， 因此，其相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，還不能真正確認(rèn)其就是IL-4(目前僅稱之為IL-4 樣因子)。 如序列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO : 2)是預(yù)測的斑馬魚IL-4樣基因序列(基因庫登錄號(hào)AB375404)，它與其他物種的IL_4同 源性為11_15%，其功能和作用在本發(fā)明以前是未知的。 由嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila， AH)引起的魚類病害在水產(chǎn)養(yǎng)殖中最 為常見。嗜水氣單胞菌是一種普遍存在于淡水、海水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，對水 產(chǎn)動(dòng)物、畜禽和人類均有致病性的一種典型人_獸_魚共患病病原，可引起多種水產(chǎn)動(dòng)物的 傳染性出血性敗血癥，病魚的臨床癥狀常表現(xiàn)為局部損傷出血、壞死、水腫、眼突、及腹部膨 脹、另外可能產(chǎn)生腹水、貧血及破壞內(nèi)臟器官，脾、腎顏色變黑，肝變白，膽汁變黃等，對水養(yǎng) 殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。 目前現(xiàn)有的魚類出血性敗血癥的預(yù)防方法是使用嗜水氣單胞菌全細(xì)胞疫苗，該疫 苗一般是采用注射形式，注射魚體采用劑量一般為1X108 1X109cfu/尾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白的用途。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白的用途， 用于制備能提高魚類的免疫能力的免疫增強(qiáng)劑，該魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白具有如 SEQ IDN0 :2所示的氨基酸序列。 本發(fā)明還同時(shí)提供了一種魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白的用途用于制備預(yù)防 魚類疾病的制劑。 作為本發(fā)明的魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白的用途的改進(jìn)用于制備預(yù)防魚類 出血性敗血癥的制劑，該制劑由嗜水氣單胞菌全細(xì)胞疫苗和具有如SEQ ID N0:2所示的氨 基酸序列的魚類白細(xì)胞介素_4樣重組蛋白組成。 本發(fā)明的魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白作為一種增強(qiáng)魚類抗病能力的免疫增強(qiáng) 劑，給藥途徑可采用注射的方式，注射劑量為0. 025 0. 25 ii g/g體重；一般能在28天內(nèi)持 續(xù)產(chǎn)生效力。 本發(fā)明的魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白能與嗜水氣單胞菌全細(xì)胞疫苗配合使 用，從而提高預(yù)防魚類出血性敗血癥的效果。其給藥途徑可采用注射的方式，注射劑量一 般為嗜水氣單胞菌全細(xì)胞疫苗1 X 108 1 X 109cfu/尾，且魚類白細(xì)胞介素_4樣重組蛋白 0. 025 0. 25 ii g/g ;嗜水氣單胞菌全細(xì)胞疫苗和魚類白細(xì)胞介素_4樣重組蛋白在注射時(shí)， 兩者可以同時(shí)注射，也可以前后分別注射。 本發(fā)明利用原核表達(dá)系統(tǒng)，以斑馬魚中的IL-4樣基因序列為代表，首次研制出 魚類IL-4樣因子的重組蛋白，在此基礎(chǔ)上，深入研究了其免疫生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)其具有促 進(jìn)魚類淋巴細(xì)胞增殖分化、特別是促進(jìn)IgM抗體產(chǎn)生等新功能，這與人類和高等物種中的 IL-4主要參與二次免疫應(yīng)答過程中抗體的類別轉(zhuǎn)化以及過敏反應(yīng)等的功能有很大的區(qū) 別，表明魚類IL-4樣分子具有與魚類免疫系統(tǒng)相適應(yīng)的特殊功能和調(diào)節(jié)機(jī)制，特別是研究揭示了其可以作為魚類的免疫佐劑或免疫增強(qiáng)劑，提高魚體對疫苗(魚類嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila滅活疫苗)的應(yīng)答效果，提高病害防治的免疫保護(hù)率。該魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白作為免疫增強(qiáng)劑的發(fā)現(xiàn)及其開發(fā)應(yīng)用，可望為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的感染性疾病預(yù)防與治療提供一種新途徑。 本發(fā)明以魚類常見的敗血癥病原菌嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，AH)為對象，以斑馬魚和養(yǎng)殖鯽魚為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯苛唆~類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白促進(jìn)魚類獲得性體液免疫應(yīng)答以及促進(jìn)嗜水氣單胞菌疫苗對斑馬魚和鯽魚的免疫保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)該因子能有效地促進(jìn)魚類B淋巴細(xì)胞增殖和IgM類抗體的產(chǎn)生，從而顯著提高斑馬魚和鯽魚的抗病能力，提高成活率。因此本發(fā)明的魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害防治具有重要意義。 本發(fā)明選擇上述疾病作為研究和應(yīng)用模型，并結(jié)合典型的蛋白抗原血藍(lán)蛋白(keyholelimpet hemocyanin，KLH)，研究重組表達(dá)的魚類IL-4樣細(xì)胞因子對抗原誘發(fā)的體液免疫的調(diào)節(jié)作用，以及生產(chǎn)性應(yīng)用的嗜水氣單胞菌疫苗對魚類敗血癥的免疫保護(hù)的促進(jìn)和增強(qiáng)功能。 綜上所述，本發(fā)明的魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白作為魚類疫苗的免疫增強(qiáng)劑的優(yōu)勢表現(xiàn)在能顯著增強(qiáng)疫苗接種后魚體的抗病原的能力，提高成活率，從而增強(qiáng)魚類抵抗病害發(fā)生的能力；同時(shí)可降低疫苗的使用劑量，減少疫苗的毒副作用。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。 圖1是pUCM-T-IL-4-L重組質(zhì)粒示意圖； 圖2是重組質(zhì)粒pET41a-IL-4-L的構(gòu)建圖； 圖3是重組蛋白srIL-4-L的SDS-PAGE分析圖； 圖4是流式分析重組sIL-4-L對B細(xì)胞增殖試驗(yàn)效果圖； 圖5是流式分析統(tǒng)計(jì)淋巴細(xì)胞增殖的剌激/轉(zhuǎn)化指數(shù)； 圖6是重組IL-4-L增強(qiáng)魚類抗體產(chǎn)生試驗(yàn)效果圖； 圖7是重組IL-4-L增強(qiáng)魚類免疫抗病能力的試驗(yàn)效果具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、斑馬魚IL-4樣基因(以下稱IL-4-L)的獲得方法 首先用大腸桿菌內(nèi)毒素LPS(英文全稱，Sigma， 055 :B5 E. coli)按1 ii g/尾
的劑量預(yù)注射斑馬魚(學(xué)名Danio rerio，體長3-4cm，體重3-4g)進(jìn)行IL-4-L mRNA
的誘導(dǎo)表達(dá)，注射了 LPS的實(shí)驗(yàn)魚置26-28 t:水溫下飼養(yǎng)，12小時(shí)后取斑馬魚腎臟或
脾臟組織，用TRizol(Invetigen)提取總RNA，提取方法按說明書進(jìn)行。然后用逆轉(zhuǎn)
錄試劑盒RNA PCR kit (AMV) Ver3. 0 (TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。引物序列為
F15' -GAAGACACTTCTGCTGCTCGC-3' ， R15' -CAAATTGTCT TCAGGTAGAAC-3'，該引物由上海英俊
公司合成。優(yōu)化的PCR條件為94t:預(yù)變性4min，94t:變性40s，52t:退火lmin，72t:延伸
30s，72t:延伸10min，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 結(jié)果表明，按上述方法進(jìn)行誘導(dǎo)和RT-PCR，可以擴(kuò)增出預(yù)期880bp的IL-4-L cDNA
5特異性片段，用PCR產(chǎn)物回收Kit進(jìn)行IL-4-L cDNA的分離純化，具體方法按Axygen公司提供的操作手冊進(jìn)行，然后進(jìn)行T-A克隆，將PCR產(chǎn)物直接鏈接于pUCM-T質(zhì)粒(參見圖2)，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)于含有Amp、 IPTG和X-gal的LB平板上，挑取白色陽性重組子菌落，分別進(jìn)行PCR和酶切鑒定，并進(jìn)行序列分析(由上海英俊公司進(jìn)行)。結(jié)果表明，所克隆的斑馬魚IL-4-L cDNA全長為887個(gè)核苷酸(如SEQ ID NO :1所示)，編碼157個(gè)氨基酸(如SEQ ID NO :2所示)。將上述由T載體和目的基因所構(gòu)建成的重組質(zhì)粒命名為T-IL-4-L(參見圖1)。 實(shí)施例2、斑馬魚IL-4-L基因原核表達(dá)質(zhì)粒的獲得方法 首先在IL-4-L基因的上下游引物兩端分別引入BamH I和Xhol I酶切位點(diǎn)，重新設(shè)計(jì)的兩個(gè)引物序列分別為F25' -CTAGCTAGCGGATCCGGGATGGAACATAAGACTGTATTAAAGG-3'，
俊公司合成。然后以T-IL-4-L重組質(zhì)粒為模板，F(xiàn)2和R2為引物，按以下PCR循環(huán)程^擴(kuò)增IL-4-L的cDNA :94。C預(yù)變性4min，94。C變性40s，52。C退火lmin，72。C延伸30s，72。C延伸10min，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。然后回收PCR產(chǎn)物，具體方法按Axygen提供的操作手冊進(jìn)行，用BamHI和Xhol I雙酶切后，重組連接到表達(dá)載體pET41a中。經(jīng)重組子篩選后，分別用BamH I和Xhol I雙酶切和PCR進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，用雙酶切鑒定，能得到預(yù)期5. 8kb和880bp大小的片斷，此外，用載體和片段上的引物同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出預(yù)期的887bp大小的條帶。結(jié)果表明，通過上述方法，獲得了包含887bp的IL-4-L的原核表達(dá)質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pET41a-IL-4-L(參見圖2)。
實(shí)施例3、可溶性重組IL-4-L蛋白的獲得 將PET41a-IL-4-L陽性克隆接種于5ml含氨芐青霉素(50 y g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，置37t:搖床，以250rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5小時(shí)，再將培養(yǎng)物以l : 100比例加入含氨芐青霉素(50yg/ml)的LB液體培養(yǎng)基，置37t:搖床，以250rpm轉(zhuǎn)速繼續(xù)培養(yǎng)。測定細(xì)菌生長曲線，待0D600至0. 6 1. 0時(shí)，加入IPTG，使終濃度為0. 1 lmM，然后轉(zhuǎn)入20°C的低溫培養(yǎng)箱，100rpm過夜，以誘導(dǎo)可溶性重組蛋白的表達(dá)。然后離心收集細(xì)菌(5000Xg，15min)，棄上清，用適量的PBS重懸細(xì)菌后，用超聲波破裂細(xì)菌，直至溶液變成半透明。收集上清液與細(xì)菌沉淀，采用GST親和層析柱分離純化重組蛋白，純化的重組蛋白用SDS-PAGE鑒定。結(jié)果表明，重組表達(dá)的IL-4-L(帶GST標(biāo)簽)的分子量約為50KDa(參見圖3，其中列1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，列2為純化的帶GST標(biāo)簽的可溶性IL-4-L重組蛋白，列3為pET41a空質(zhì)粒表達(dá)的GST蛋白)。 實(shí)施例4、驗(yàn)證本發(fā)明提供的重組IL-4-L蛋白(即實(shí)施例3所得的IL_4_L重組融合蛋白)增強(qiáng)魚體的免疫功能，進(jìn)而增強(qiáng)了魚類疫苗的免疫效果和魚對病原的抵抗能力
1、重組IL-4-L蛋白提高魚類B淋巴細(xì)胞增殖能力的試驗(yàn) 將斑馬魚(體重3 4g)置26-28。C循環(huán)水條件下飼養(yǎng)一周以上，確認(rèn)健康后，進(jìn)行體內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。取實(shí)驗(yàn)魚100余尾，分成5組，每組20尾，分別注射不同濃度(1 y g/ml、10 ii g/ml和100 ii g/ml，每尾注射10 y 1)的重組IL-4-L蛋白，同時(shí)設(shè)不注射重組IL-4-L蛋白的正常對照組(僅注射PBS)以及GST標(biāo)簽蛋白對照組，3 6天后收集斑馬魚脾臟淋巴細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)，測定體內(nèi)增殖的B淋巴細(xì)胞(mlg,細(xì)胞)數(shù)量。淋巴細(xì)胞標(biāo)記方法采用間接免疫標(biāo)記法，首先用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞(2500rpm離心25min)，用5X山羊血清于37。C作用1小時(shí)后，與兔抗斑馬魚mlgM抗體(anti-mlgM，使用濃度l : 100)于37t:孵育45分鐘，經(jīng)PBS清洗3次后，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔第二抗體(羊抗兔IgG， Chemicon， 1 : 400) ， 37。C避光孵育30分鐘，PBS清洗3次，經(jīng)標(biāo)記的B淋巴細(xì)胞用流式細(xì)胞儀(Bection-Dickinson， San Jose， CA)檢測，發(fā)射光波長為525nm，上述實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果以M士SD表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)，P < 0. 01被定為顯著差異。結(jié)果顯示，在正常對照組斑馬魚脾臟組織中，B淋巴細(xì)胞的含量/比例占淋巴群體的4. 37% ±0. 62X，而注射重組IL-4-L蛋白后B細(xì)胞的含量顯著(P < 0. 01)增加，表現(xiàn)為注射1 y g/ml組的B細(xì)胞含量為7. 26% ±0. 71 % ，注射10 y g/ml組的B細(xì)胞含量為21. 89%±0. 91 % ，而注射100 ii g/ml組的B細(xì)胞含量達(dá)到21. 41 % ±0. 73% ，可見隨著IL-4-L重組蛋白注射劑量的增加，B細(xì)胞增殖效應(yīng)逐步增強(qiáng)，三組實(shí)驗(yàn)組的B淋巴細(xì)胞含量分別比正常對照組提高了 3%， 17. 5%和17%，而注射GST標(biāo)簽蛋白(劑量1 P g/尾)的陰性對照組，其B細(xì)胞的含量與正常對照組相比，無明顯差異，表明GST標(biāo)簽蛋白沒有對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響(參見圖4，左側(cè)圖代表未進(jìn)行FITC抗體標(biāo)記的對照組，右側(cè)圖代表用FITC抗體標(biāo)記后所得數(shù)據(jù))。通過進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)淋巴細(xì)胞增殖的剌激/轉(zhuǎn)化指數(shù)(stimulation index, SI， SI=實(shí)驗(yàn)組含量/對照組含量)，可見注射不同濃度重組IL-4-L蛋白的實(shí)驗(yàn)組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率顯著(P < 0. 01)高于對照組(參見圖5)。
2、重組IL-4-L因子促進(jìn)魚體產(chǎn)生抗體能力的試驗(yàn) 取斑馬魚(體重3 4g) 100余尾，分成5組，每組20尾，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白抗原KLH免疫實(shí)驗(yàn)魚，同時(shí)聯(lián)合注射不同濃度的重組IL-4-L蛋白，抗原和因子導(dǎo)入采用腹腔注射的方法，KLH的注射濃度為lmg/ml (作為正常陽性對照組)，重組蛋白的注射濃度分別為0 y g/ml(空白PBS對照)、liig/ml、10iig/ml和100 y g/ml，每尾注射10 yl。同時(shí)設(shè)GST標(biāo)簽蛋白(劑量1P g/尾)對照組，4周后收集外周血，提取血清，采用ELISA的方法檢測血清中抗體(IgM抗體)的含量的變化。 結(jié)果顯示，在注射KLH四周后的斑馬魚外周血中，能檢測到相應(yīng)的IgM抗體，同時(shí)，在聯(lián)合注射KLH和不同劑量重組IL-4-L蛋白的實(shí)驗(yàn)魚外周血中，觀察到了 IgM含量隨著注射重組IL-4-L蛋白劑量的提高而明顯增加，當(dāng)注射濃度達(dá)到100ii g/ml時(shí)，實(shí)驗(yàn)魚外周血中的IgM含量與對照組相比，出現(xiàn)極顯著(P<0.01)增加(參見圖6)，這說明在合適的濃度范圍內(nèi)，IL-4-L蛋白具有顯著的增強(qiáng)魚體體液免疫功能的作用。而聯(lián)合注射KLH和GST標(biāo)簽蛋白或空白PBS的對照組，其IgM的含量與單獨(dú)注射KLH的正常免疫組相比，無明顯差異，表明GST標(biāo)簽蛋白和PBS沒有對重組IL-4-L蛋白的作用產(chǎn)生影響。在圖6中，第1列表示正常免疫KLH抗原的對照組中所檢測到的IgM的含量；第2列表示注射KLH和濃度為1 y g/ml IL-4-L蛋白的實(shí)驗(yàn)組中所檢測到的IgM的含量；第3列表示注射KLH和濃度為10 ii g/ml IL-4-L蛋白的實(shí)驗(yàn)組中所檢測到的IgM的含量；第4列表示注射KLH和濃度為100 ii g/ml IL-4-L蛋白的實(shí)驗(yàn)組中所檢測到的IgM的含量；第5列表示注射KLH和GST標(biāo)簽蛋白對照組中所檢測到的IgM的含量。
3、重組IL-4-L增強(qiáng)魚類免疫抗病能力的試驗(yàn)
(1)增強(qiáng)斑馬魚免疫抗病能力試驗(yàn) 取斑馬魚(體重3 4g) 150余尾，隨機(jī)分成3組，每組50尾，分別預(yù)先接種嗜水氣單胞菌全細(xì)胞疫苗。疫苗制備采用常規(guī)福爾馬林滅活法，所用嗜水氣單胞菌毒株是從
7患傳染性出血性敗血癥的鯽魚分離的野生型嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila， AH)BSK-10菌株，由浙江省淡水水產(chǎn)研究所提供，疫苗制備的福爾馬林濃度為0. 5% (V/V)，滅活時(shí)間為36小時(shí)，嗜水氣單胞菌經(jīng)滅活后，用PBS洗滌3次，每次4000rpm離心15分鐘沉淀收集菌體，-2(TC保存?zhèn)溆谩ＨM實(shí)驗(yàn)魚分別腹腔注射滅活A(yù)H(5.0X10Scfu/尾)、滅活A(yù)H(5.0Xl()Scfu/尾)聯(lián)合重組IL-4-L蛋白(0. 1 y g/尾)以及空白PBS(不免疫的對照組)，經(jīng)免疫接種后的實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)于26 28t:水溫中，30天后用嗜水氣單胞菌BSK-10菌株進(jìn)行感染攻毒試驗(yàn)，以評價(jià)疫苗的免疫保護(hù)效果以及重組IL-4-L因子對疫苗的免疫"佐劑"效應(yīng)。每尾實(shí)驗(yàn)魚感染2. 0X105cfu的嗜水氣單胞菌，72小時(shí)內(nèi)記錄死亡數(shù)，統(tǒng)計(jì)成活率，計(jì)算相對免疫保護(hù)率{Relative Percent Survival, RPS = 1_(免疫組死亡率/對照組死亡率)X100XM，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果顯示，未免疫的對照組(注射空白PBS)感染AH(2.0Xl()Scfu/尾)后，其死亡率平均為58% ±2%，而經(jīng)免疫(注射滅活A(yù)H)的實(shí)驗(yàn)組，其死亡率平均為44% ±2%，可見死亡率降低了 14X，而用重組IL-4-L聯(lián)合免疫(注射滅活A(yù)H+IL-4-L)的實(shí)驗(yàn)組，其死亡率平均只有26% ±2% ，可見死亡率進(jìn)一步得到降低，而其免疫保護(hù)率(55.2%)與單純注射滅活A(yù)H的實(shí)驗(yàn)組(24. 1%)相比，得到極顯著(P<0.01)的提高(參見圖7-A)，表明重組IL-4-L因子具有增強(qiáng)斑馬魚免疫抗病的能力。
(2)增強(qiáng)鯽魚免疫抗病能力的試驗(yàn) 養(yǎng)殖鯽魚(Carassius auratus)體重為80. 0±5. 2g，置25。C水溫循環(huán)水中飼養(yǎng)一周，確認(rèn)健康后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取實(shí)驗(yàn)魚60余尾，隨機(jī)分成3組，每組20尾，分別于背鰭下注射滅活A(yù)H (4 X 109cfu/ml ， 0. 5ml)、滅活A(yù)H (4 X 109cfu/ml ， 0. 5ml)聯(lián)合重組IL-4-L (5 ii g/尾)以及空白PBS(不免疫的對照組)，經(jīng)免疫接種后的實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)于25 26t:水溫中，30天后用嗜水氣單胞菌BSK-IO菌株進(jìn)行感染攻毒試驗(yàn)，以評價(jià)疫苗的免疫保護(hù)效果以及重組IL-4-L因子對疫苗的免疫"佐劑"效應(yīng)。每尾實(shí)驗(yàn)魚腹腔注射6X 105cfu/mL嗜水氣單胞菌0.2ml，72小時(shí)內(nèi)記錄死亡數(shù)，統(tǒng)計(jì)成活率，計(jì)算相對免疫保護(hù)率(RPS)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果顯示，未免疫的對照組(注射空白PBS)感染AH后，其死亡率平均為65% ±5%，而經(jīng)免疫(注射滅活A(yù)H)的實(shí)驗(yàn)組，其死亡率平均為45% ±5%，可見死亡率降低了 20%，而用重組IL-4-L聯(lián)合免疫(注射滅活A(yù)H+IL-4-L)的實(shí)驗(yàn)組，其死亡率平均達(dá)為30% ±5%，可見死亡率進(jìn)一步得到降低，而其免疫保護(hù)率(53. 8% )與單純注射滅活A(yù)H的實(shí)驗(yàn)組(30. 8% )相比，也有極顯著(P < 0. 01)的提高(參見圖7-B)，表明重組斑馬魚IL-4-L因子具有增強(qiáng)鯽魚免疫抗病的能力，具有在鯽魚病害防治上的應(yīng)用價(jià)值。 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表
SEQ ID NO : 1





















301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 SEQ Met Gly Lys Lys Lys Ala Lys Asn Arg Val Gin
TGATCTGTTACTTGCTGTAAGCCAAATAAATTCAGAGCATTACAAAG
ID NO :2
MetLysThrLeuLeuLeuLeuAlaCysThrValPheValSer
PheThrLeuLysGlyThrAspAlaMetHisLysThrValLeu
GluLeuValLeuGluLeuGluAlaValLeuValAsnProPro
LysLysLysAlaLysGluGluliePheLeuValAspLeuGly
LysGlySerGlyLeuLysCysGluHisAspTyrPheCysGin
GluGluGluMetValLysLysValSerGlyLeuSerGlyVal
PheAspProPheArgThrAspLysLysLeuMetArgAsnLeu
ThrTyrAsnHisGinAspGluLysAsnCysLysLysGlulie
SerHisAlaAlaAspGluAspLeuGluGlulieThrLeuAsp
PheLeuLysAspLeuLeuLysCysValLysAsnlieAsnSer
LysSerProArgProSer
9
權(quán)利要求
一種魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白的用途，其特征是用于制備能提高魚類免疫能力的免疫增強(qiáng)劑，所述魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2. —種魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白的用途，其特征是用于制備預(yù)防魚類疾病的制劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的魚類白細(xì)胞介素_4樣重組蛋白的用途，其特征是用于制備預(yù)防魚類出血性敗血癥的制劑，該制劑由嗜水氣單胞菌全細(xì)胞疫苗和具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的魚類白細(xì)胞介素_4樣重組蛋白組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白的用途用于制備能提高魚類免疫能力的免疫增強(qiáng)劑，該魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。該魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白還能用于制備預(yù)防魚類疾病的制劑，例如用于制備預(yù)防魚類出血性敗血癥的制劑，該制劑由嗜水氣單胞菌全細(xì)胞疫苗和具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的魚類白細(xì)胞介素-4樣重組蛋白組成。
文檔編號(hào)A61P7/00GK101693105SQ20091015351
公開日2010年4月14日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者方瑋, 潘萍萍, 董偉仁, 邵健忠, 項(xiàng)黎新 申請人:浙江大學(xué);